PRACTICA 1

PROTEINAS

INTRODUCCIN
Dada la compleja estructura proteica y por lo tanto su elevado peso
molecular, las protenas son consideradas como macromolculas. Este carcter
macromolecular, determina una serie de propiedades que posibilitan el
aislamiento y anlisis de las protenas.
Lo anterior determina que las protenas sean incapaces de atravesar
membranas semipermeables, lo que posibilita que en una solucin en donde
existen protenas y otros constituyentes de menor peso molecular
(aminocidos, monosacridos, urea, creatinina, sales, iones, etc.), las primeras
pueden ser separadas al no poder pasar a travs de los poros de las
membranas semipermeables; en tanto que los otros constituyentes, de menor
peso molecular pasarn sin problema alguno.
En el experimento 1, se aplicar esta propiedad, para aislar las protenas
del suero sanguneo. Igualmente se identificarn los 2 grandes tipos de
protenas del suero sanguneo (albmina y globulina) por su solubilidad en el
agua y en soluciones salinas diluidas.
De otro lado, las protenas tienen un rol muy destacado en el control del
pH celular y extracelular. Esta accin amortiguadora se explica por la presencia
de grupos ionizables en las cadenas laterales de los aminocidos, los cuales
son capaces de fijar protones y evitar que el pH baje; o ceder protones al medio
para neutralizar los oxihidrilos y evitar de este modo que el pH aumente (Figura
1).
La concentracin de hidrogeniones en el medio en que se encuentra
disuelta una protena, determina importantes variaciones en la carga elctrica
de la misma. En general, una protena se carga positivamente cuando se
encuentra disuelta en un medio de pH inferior al de su punto isoelctrico (PI);
en tanto que se carga negativamente cuando el pH del medio en que se
encuentra es superior al valor de su PI.
El punto isoelctrico de las protenas con un alto contenido en
aminocidos bsicos (histidina, lisina y arginina), es alto, como el caso del
citocromo c, que tiene un valor de PI de 10.7. Cuando una protena tiene un
alto contenido en aminocidos dicarboxlicos (asprtico y glutmico), tendrn
un PI bajo, como el caso de la pepsina que tiene un PI cercano a 1. En general,
la mayor parte de las protenas globulares tienen un PI que vara entre 5.0 y
9.0.
Cuando la protena est en un medio de pH que coincide con el valor de
su PI, no slo es incapaz de migrar en un campo elctrico sino que su
solubilidad llega al mnimo, incluso algunas llegan a precipitar, como lo
apreciaremos en el experimento 2..
Un aspecto muy importante que debe tenerse en cuenta al hablar de las
protenas, es que la actividad biolgica de estas macromolculas depende de
la integridad de su estructura en todos los niveles de estructuracin. Cuando
esta estructura se ve afectada, como cuando la protena se despliega o se
pliega en forma diferente a la protena nativa, se dice que la protena se ha
desnaturalizado y en esta situacin, la funcin biolgica de la protena, se
pierde. En esta prctica ( Experimento 3) comprobaremos, como la
desnaturalizacin de una protena (catalasa) determina la perdida de su funcin
catalizadora.

Figura 1.- Mecanismo de accin de los grupos ionizables de los aminocidos

para explicar la accin tampn de las protenas

La separacin electrofortica de las protenas del suero constituye un

procedimiento muy utilizado para el diagnstico de diversas enfermedades. Al
tomar las fracciones proteicas del suero , diferente intensidad de carga al ser
puestas a determinado pH, se podrn separar por su velocidad de migracin en
un campo elctrico.

RELACIN DE EXPERIMENTOS

1. Separacin de protenas por dilisis.

2. Estudio de la solubilidad de la casena a diferentes pH
3.-Desnaturalizacin de las protenas y actividad biolgica
EXPERIMENTO 1
SEPARACION DE PROTEINAS POR DIALISIS
Objetivos
1. En base al carcter macromolecular de las protenas utilizar un mtodo para
separarlas de otros componentes de menor peso molecular.
2. Estudiar el efecto de la fuerza inica sobre la solubilidad de las protenas
del suero sanguneo.
3. Constatar la accin del cido tricloroactico (TCA) como agente precipitante
de las protenas.

Mtodo
Dilisis del suero sanguneo utilizando como membrana semipermeable una
bolsa de celofn.

Procedimiento

1. Medir en el interior de una bolsa de celofn, 5 ml. de suero sanguneo y

cerrar la bolsa.
2. Colocar la bolsa de celofn en el interior de un beaker conteniendo agua
destilada, la misma que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).
3. Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a
un tubo de centrfuga y centrifugar por 5 minutos a 2500 rpm.
4. Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y aadirle 5 ml. de cido
tricloroactico al 10%. Observar lo que sucede.
5. Trate de disolver el precipitado que qued en el tubo de centrfuga
utilizando agua destilada; de no ser posible, aada unas gotas de NaCl al
10% y observe si dio resultado.

Resultados
1. Escriba si observ precipitado en el interior de la bolsa y a qu puede
corresponder.

2. Qu observ al aadir el cido tricloroactico al 10%?

3. Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada?.
__________________ Qu ocurri al aadir el Na Cl al 10%?

INTERROGANTES
1. Por qu es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto
tiempo?
2. Cul es el fundamento de la precipitacin de las protenas por el cido
tricloactico?
3. Con qu experimento(s)podra Ud. demostrar que las protenas no
difundieron a travs de la bolsa de celofn?
4. Complete la siguiente Tabla:

ALBMINA GLOBULINAS
Solubilidad en el agua
Solubilidad en soluciones salinas
diluidas

EXPERIMENTO 2
ESTUDIO DE LA SOLUBILIDAD DE LA CASENA A DIFERENTES pH
Objetivos
1. Demostrar como varia la solubilidad de una protena en funcin del pH
2. Precisar las alteraciones que ocurren en la solubilidad dla caserna cuando
se encuentra en un medio de pH cercano al valor de su PI.
3. Determinar experimentalmente el PI aproximado de una protena, como la
casena.
Mtodo
Apreciar la solubilidad de la casena en medios de diferente pH.

Procedimiento
1. Rotular una serie de 9 tubos de ensayo, del 1 al 9
2. En el tubo 1 medir 9 ml. de cido actico 0.178 N.
3. En el tubo 2 medir 9 ml. de la solucin de cido actico preparada
mezclando 10 ml. de cido actico 0.178 N y 10ml de agua destilada.
4. En el tubo 3 medir 9 ml de la solucin de cido actico obtenida al mezclar
10 ml. de la solucin anterior con 10 ml de agua destilada.
5. Proceder sucesivamente con la misma dilucin progresiva, hasta completar
los 9 tubos.
6. A cada uno de los 9 tubos, aada 1 ml. de la solucin de casena al 0.5% en
acetato de sodio 0.1 N.
7. Mezclar bien y observar la turbidez o precipitacin, inmediatamente y a los
15 minutos.
8. Con ayuda del papel indicador estime el pH en cada uno de loa tubos.
Expresin de Resultados

Anote sus resultados en la siguiente Tabla

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Relacin SAL/CIDO

pH (terico)

pH (estimado con papel indicador

Precipitacin o insolubilidad a los
15' (cruces 0-5)

INTERROGANTES
1. Cul es el PI de la casena? Fundamente su respuesta.
________

2. Se altera la estructura primaria de las protenas, cuando se encuentra a un

pH que coincide con el valor de su PI? ____ Fundamente su respuesta.
3. Por qu precipita la casena en su PI? Es este proceso reversible?
4. El PI de la ureasa es 5.0 ser mayor su solubilidad si se encuentra disuelta
en un tampn acetato 4.7 o si se encuentra disuelta en un tampn fosfato
7.8. Por qu?

EXPERIMENTO 3
DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Objetivos
1. Verificar como la desnaturalizacin de la protena, determina la prdida de
su actividad biolgica.
2. Verificar la accin de varios agentes desnaturalizantes.
Mtodo
Estudio de la actividad de la catalasa de los hemates en presencia de diversos
agentes desnaturalizantes.
Procedimiento
1. Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0.1 ml. de
sangre diluida (una gota de sangre en 100 ml. de agua destilada), 0.1 ml. de
sangre diluida hervida, sangre diluida en presencia de urea 8M y sangre
diluida en SDS al 3 % (0.1 mil.)
2. Medir encada tubo 5 ml. de perxido de hidrgeno 0.05 M y Mezclar.
3. Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un
circuito de papel filtro y tomar el tiempo que toma en cada tubo para subir
 hasta la superficie.
Expresin de Resultados
Complete la siguiente Tabla.

TUBO 1 2 3 4 5
Tiempo que tarda en subir
el papel hasta la
superficie

INTERROGANTES
1. Escriba el mecanismo de accin de la urea 8M, SDS y DTT.
2. Escriba la reaccin qumica catalizada por la catalasa:
3. Es la catalasa una protena simple o conjugada? Fundamente su
respuesta.
4. Con qu experimento (s) podra demostrar que la desnaturalizacin no
afecta la estructura primaria de la protena?
5. Qu importancia podra tener en clnica la bsqueda de actividad
catalsica en la orina?