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INSTITUTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
Dissertao de Mestrado
PORTO ALEGRE
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
I
SUMRIO
1. INTRODUO ......................................................................................................... 1
2. ESTADO DA ARTE .................................................................................................. 2
2.1. MFC DEFINIES E CONSIDERAES GERAIS....................................... 3
2.2. CONSERVAO DA ENERGIA BIOLGICA ................................................. 5
2.3. REQUERIMENTOS BSICOS PARA A TRANSFERNCIA DE ELTRONS
PARA O NODO ........................................................................................................ 7
2.4. TRANSFERNCIA DE ELTRONS ATRAVS DE MEDIADORES .............. 8
2.5. TRANSFERNCIA DIRETA DE ELTRONS ................................................... 9
2.6. GEOBACTER ..................................................................................................... 16
2.7. MFC E A BIORREMEDIAO ........................................................................ 18
2.8. LIMITAES DAS MFC ................................................................................... 20
2.8.1 Limitaes catdicas................................................................................. 22
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 26
3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 26
3.2. OBJETIVO ESPECFICO ................................................................................... 27
4. MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 28
4.1. CONSTRUO DAS MFCs .............................................................................. 28
4.1.1. Eletrodos ....................................................................................................... 28
4.1.2. Montagem da MFC....................................................................................... 30
4.2. CRESCIMENTO DAS BACTRIAS ................................................................. 32
4.3. OPERAO DAS CLULAS ............................................................................ 34
4.4. MEDIDAS ELETROQUMICAS ....................................................................... 35
4.4.1 Potencial de circuito aberto (OCP) Open Circuit Potential ....................... 36
4.4.2 Voltametria de varredura linear ..................................................................... 36
4.5. MICROSCOPIA CONFOCAL DE VARREDURA A LASER ......................... 38
4.6. FISH HIBRIDIZAO FLUORESCENTE IN SITU ..................................... 39
5. RESULTADOS E DISCUSSES ........................................................................... 41
5.1. DIFERENAS ENTRE CTODOS DE OXIGNIO E FERRICIANETO....... 46
5.1.1. Voltametria de Varredura Linear (LSV) Linear Sweep Voltametry ......... 46
II
5.2. COMPARAO ENTRE MFCs USANDO G. metallireducens, G.
sulfurreducens E UMA COCULTURA DAS DUAS ESPCIES ............................. 50
5.2.1 Medida da densidade de pilis......................................................................... 54
5.3. TESTES PARA A UTILIZAO DE OUTRAS FONTES DE CARBONO .... 55
6. CONCLUSES........................................................................................................ 59
7. SUJESTES PARA TRABALHOS FUTUROS ..................................................... 59
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 60
III
LISTA DE FIGURAS
IV
Figura 15: Grfico V x t(s) obtido na medida de potencial de circuito aberto ..............36
Figura 16: Voltamograma tpico. A) ctodos com oxignio B) ctodos com
ferricianeto .......................................................................................................................37
Figura 17: Principais etapas da hibridizao fluorescente in situ .................................40
Figura 18: A) Curva de potncia nas respectivas horas de operao e B) Curva de
polarizao nas respectivas horas de operao para a clula constituda por ctodo de O 2
e rea de nodo de 6,0 x 10-4 m2. .....................................................................................42
Figura 19: A) Curva de polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. Ambas as curvas so referentes a clula
constituda por ctodo de O2 e rea de nodo de 4,0 x 10-4 m2, distncia mnima entre
eletrodos e membrana semipermevel. ............................................................................43
Figura 20: A) Curva de polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. Ambas as curvas se referem a clula
constituda por ctodo de O2 e rea de nodo de 1,82 x 10-4 m2. ....................................44
Figura 21: A) Curva polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. As curvas so referentes a clula com
condies otimizadas, ferricianeto no compartimento catdico e rea de 3,6 x 10-5 m2...46
Figura 22: Curvas de polarizao representativas para oxignio no ctodo (linhas
pontilhadas) e ferricianeto (linhas contnuas). Ambas exibem overshoot de potncia
no incio do desenvolvimento que desaparece aps 150 horas de crescimento.
Limitaes na densidade de corrente so comparveis, mas a curva de ferricianeto
aproxima-se muito mais do comportamento ideal. ..........................................................48
Figura 23: Os tringulos representam as MFCs que utilizam ferricianeto no
compartimento andico, enquanto clulas com O2 so representadas por crculos.
Curvas de polarizao representativas so mostradas de forma preenchida e curvas de
densidade de potncia na forma aberta para MFCs utilizando [Fe(CN)6]3 e O2 no
compartimento catdico........................................................................................... 49
Figura 24: Imagem dos biofilmes obtidas por microscpio confocal de varredura a laser.
(A) Biofilme de G. sulfurreducens de espessura de 62,1 m. (B) Biofilme de G.
metallireducens de espessura de 80 m. (C) Cocultura analisada por FISH, em vermelho
G. sulfurreducens e em verde G. metallireducensmetallireducens e G. sulfurreducens 51
V
Figura 25: Curvas de polarizao para MFC utilizando culturas puras de G.
metallireducens. Efeito de overshoot diminui aps 240 horas de operao ................52
Figura 26: Grfico de densidade de potncia atingido e MFC para uma cultura pura de
G. metallireducens em azul e G. sulfurreducens em vermelho .......................................52
Figura 27: Grfico de potncia para uma MFC utilizando uma cocultura de G.
metallireducens e G. sulfurreducens ..............................................................................53
Figura 28: Medida da densidade ptica dos pilis das espcies Geobacter ....................55
Figura 29: G. metallireducens inoculada no controle, sem fonte de carbono, em 20
mM de glicerol e no controle com acetato (esquerda para direita) .................................56
Figura 30: G. metallireducens inoculada no controle sem glicerol, 5, 10, 20 e 30 mM
de glicerol (esquerda para direita). Pode-se ver o crescimento de bactrias apenas no
frasco contendo 20 mM de glicerol ................................................................................57
Figura 31: G. metallireducens inoculado no controle com acetato, 12, 14, 16, 18, 20,
22, 24 e 28 mM de glicerol e controle sem fonte de carbono (esquerda para direita). ....57
Figura 32: Densidade ptica (D.O.) das amostras nas respectivas concentraes. 14
mM demosntrou ser a concentrao mais apropriada para o crescimento das bactrias
em glicerol .......................................................................................................................58
VI
LISTA DE TABELAS
VII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
VIII
Fum Fumarato
Mal Malato
OPC Open Circuit Potential Potencial de Circuito Aberto
LSV Linear Sweep Voltammetry Voltametria de Varredura Linear
DNA cido desoxirribonucleico
RNA cido ribonucleico
FISH Fluorescence in situ Hybridization
FITC Isotiocianato de Fluorescena
TRITC Tetrametil rodamina isotiocianato
PBS Soluo tampo salina de fosfato
kDa 1/12 m.a. C12 = 1,66 x 10-24g
tris 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
IX
RESUMO
X
ABSTRACT
Microbial fuel cells aroused interest in recent years due to the application in
water treatment, bioremediation and electricity generation. One of the microorganisms
that has been studied thoroughly for application in microbial fuel cells is the Geobacter
sulfurreducens. This specie of Geobacter, which generates electricity by oxidizing
compounds, showed generate a significant amount of energy due to multiple
mechanisms of extracellular electron transfer through Pilis or c type cytochromes.
Another specie of Geobacter that arouses great interest is the Geobacter
metallireducens by being able to oxidize aromatic compounds and soluble reducing
harmful metals to insoluble harmless. However, the increased power density of these
devices is essential to be competitive with other renewable energy sources.
This present work studied the best configuration aiming the absence of cathodic
limitations to increasing power density of the cells. Measurements have shown that
reduced anode size, location of the electrodes and replacement of oxygen by
ferricyanide, improves the performance of the cells. Comparisons of power density
between pure cultures of G. sulfurreducens and G. metalirreducens and a coculture of
the two species were also made. This comparison showed that G. metallireducens can
be used for bioremediation and also in a microbial fuel cell to produce electricity due
the high power density produced. Direct relationships between the thickness of the
biofilm and the power produced in the three cells have been notice. The specie G.
metallireducens also showed to use glycerol as a carbon source, which may be an
alternative for glycerol consumption.
XI
1. INTRODUO
1
densidade de potncia mxima. Apesar do foco das MFCs ser a utilizao de lodos e
guas residuais como substrato, h a necessidade de um melhor entendimento do
mecanismo de transferncia de eltrons que ocorre neste tipo de clula. Para tanto,
foram utilizadas culturas puras com o intuito de reduzir as variveis em estudo,
possibilitando uma maior compreenso do mecanismo envolvido. Aps definido o
modelo a ser empregado, foi feita uma comparao na produo de potncia entre as
culturas Geobacter sulfurreducens e Geobacter metallireducens e uma cocultura das
duas espcies. A primeira conhecida por produzir uma alta densidade de corrente, a
segunda por suas propriedades biorremediadoras e a combinao das duas espcies
buscando compilar as caractersticas de ambas. Por ltimo, foi feita uma avaliao do
uso de glicerol, resduo da produo de biodiesel, como substrato para as bactrias
estudadas.
Este trabalho destaca-se pelo carter inovador, tanto pela avaliao da melhor
configurao, avaliao do uso de Geobacter metallireducens em clulas de
combustvel microbianas, quanto pela avaliao do uso de glicerol como substrato para
esse tipo de cultura. Apesar de este assunto ser tema de muitas publicaes, atualmente
a abordagem do mesmo no Brasil ainda se encontra em fase inicial.4,5,6
2. ESTADO DA ARTE
2
tecnologias energticas, como na rea de energia fotovoltaica, e a alta complexidade do
sistema acabaram reduzindo o interesse nas MFCs. Apenas no final do sculo XX o
assunto veio tona novamente e pesquisas considerveis comearam a ser realizadas na
rea. O interesse por essa tecnologia e o constante aumento nos estudos da mesma se
deve conscientizao de que os combustveis fsseis so finitos, das consequncias
ambientais emergentes da sua utilizao e da necessidade de desenvolver tecnologias
para um manejo sustentvel do meio ambiente e dos recursos naturais.
3
O desempenho no compartimento andico intrinsecamente dependente da
natureza e taxa do metabolismo anaerbico como tambm da natureza e taxa de
transferncia de eltrons do biofilme microbiano para o nodo. A tarefa fundamental da
clula microbiana transformar um substrato eletroquimicamente inativo e a energia
qumica que este contm em uma forma acessvel para a oxidao e, assim, para
converso em energia eltrica. Para esta transformao usa-se o metabolismo
microbiano, ou mais precisamente o catabolismo microbiano a energia liberada pela
degenerao do substrato.12 Porm a transferncia de eltrons do metabolismo
microbiano para o eletrodo envolve um processo complexo que ser explicado ao longo
deste trabalho.
Os materiais utilizados para a construo do nodo devem ter boa condutividade
eltrica e baixa resistncia eltrica, alta biocompatibilidade, estabilidade qumica e no
podem sofrer corroso. O ctodo deve possuir alto potencial redox e ser fcil de
capturar prtons.
Diversas configuraes so possveis, sendo que estas se diferenciam na
natureza e mecanismo de transferncia de eltrons, podendo ser compostos por um ou
dois compartimentos, possuir ou no membrana semipermevel, utilizar diferentes
tamanhos e materiais nos eletrodos, diferentes substratos ou ainda utilizar sedimentos,
culturas puras ou coculturas de bactrias. Alm disso, podem ser de fluxo contnuo ou
por bateladas e possuir diferentes modelos, sendo que a clula no formato H a mais
utilizada devido ao baixo custo e alta funcionalidade como se pode observar na Figura
2.
4
Figura 2. Clula de combustvel microbiana em formato H. Compartimentos andico e
catdico separados por uma membrana semi permevel.
5
transferncia. Quando esses eltrons so doados para o aceptor de eltrons final da
cadeia respiratria, libera-se uma grande quantidade de energia livre que pode ser usada
para gerar ATP (Trifosfato de adenosina), principal fonte de energia dos seres vivos.
Eltrons provenientes do NADH so transferidos para transportadores de
eltrons, como por exemplo, quinonas, via complexo NADH1, o qual desloca e eleva o
gradiente de prtons. Dependendo do envolvimento de oxidantes exgenos (aceptor de
eltrons final) duas principais vias metablicas podem ser distinguidas: respirao ou
fermentao.13
O processo de fermentao uma forma biolgica de desproporcionalizao a
qual ocorre na ausncia de oxidantes exgenos. Parte do substrato orgnico serve de
aceptor de eltrons e tornar-se reduzida, enquanto outra parte oxidada.14 Em
comparao aos outros processos, a fermentao o processo com o menor ganho
energtico pelo organismo. Esta baixa utilizao de energia acompanhada pela
oxidao incompleta do substrato, deixando a maior parte do seu contedo energtico
no utilizado, na forma de produtos da fermentao ricos energeticamente. A
fermentao o processo utilizado em biorreatores, por exemplo, porm devido ao
baixo ganho energtico no interessante para as clulas de combustvel microbianas.
Na respirao, os eltrons obtidos na oxidao do substrato so transferidos via
cascata redox, a cadeia respiratria a energia decresce gradualmente e finalmente
transferida para um aceptor de eltrons final. Quanto mais positivo for o potencial redox
do aceptor de eltrons final, maior a energia ganha pelo organismo:
6
inorgnicos, so utilizados. Nitrato, sulfato, dixido de carbono (metanognese), ons
metlicos como Fe+3, envolvidos em processos biogeoqumicos, e fumarato so
exemplos desses aceptores.12
A principal diferena na produo de eletricidade microbiana em clulas de
combustvel contra processos bioqumicos naturais, tais como reduo de fumarato a
succinato, que eltrons so transferidos para um eletrodo ao invs de um aceptor de
eltrons natural.
Uma vez que eletrodos so slidos que no podem penetrar na clula bacteriana,
requerido que eltrons sejam transferidos de dentro para fora da membrana celular
microbiana tanto por contato fsico de componentes reduzidos como atravs do
deslocamento de eltrons atravs da membrana utilizando uma enzima redox ligada
mesma. Em relao aos mecanismos, a transferncia de eltrons fora da clula deve
resultar em espcies eletroativas que so capazes de ligar eletronicamente a clula
bacteriana ao eletrodo. Estas espcies devem ser, por exemplo, transportadores redox
solveis, uma protena redox da membrana externa ou um metablito primrio da
reduo que so denominados mediadores, pois fazem a ligao com o eletrodo,
fazendo a transferncia de eltrons para o mesmo.
Para uma transferncia de eltrons eficiente, necessrio que a espcie
mediadora seja capaz de estabelecer um contato fsico com a superfcie do eletrodo; seja
eletroquimicamente ativa (possuir um baixo potencial de reduo quando entrar em
contato com a superfcie do eletrodo) e possua um potencial padro parecido com o
potencial de reduo do substrato ou ao menos significativamente negativo em
comparao ao aceptor de eltrons final.12-14
Diferentes mecanismos de transferncia de eltrons foram identificados e
estudados at o momento. Para uma classificao bsica, dois tipos de mecanismos
podem ser identificados: transferncia de eltrons por mediadores (MET), no qual o
mediador uma espcie redox solvel, ou via transferncia direta de eltrons (DET) o
7
qual procede atravs de uma protena redox que est ligada a membrana da clula
microbiana.12
8
Figura 3. Transferncia de eltrons atravs da reduo de mediadores de eltrons
solveis liberados pelas clulas. Molculas na forma oxidada so reduzidas na
superfcie externa da clula e estas espcies reduzidas doam eltrons para o eletrodo17.
9
de eltrons uma caracterstica da condio fisiolgica especfica de espcies
Geobacter. A capacidade de troca de eltrons com seu ambiente extracelular define o
nicho ecolgico nico desta espcie e uma caracterstica importante das muitas
aplicaes prticas deste gnero. O processo realizado por meio de mecanismos
nicos que ainda no foram descritos em qualquer outro organismo.
O sistema de transferncia de eltrons para um aceptor externo clula composto
por uma srie de citocromos do tipo c, protenas com estrutura multi-heme, associados
com a membrana interna, o periplasma e a membrana externa, interagem para
transferirem eltrons para a superfcie da membrana externa. Dessa forma, a
transferncia direta de eltrons ocorre atravs de um contato fsico da membrana celular
bacteriana ou mais precisamente de uma organela da membrana com o aceptor de
eltrons final ou o nodo, sem difuso de espcies redox envolvidas na transferncia de
eltrons da clula para o aceptor de eltrons final, ou seja, sem a presena de
mediadores.18
As estruturas multi-heme (Figura 4), compostos do tipo porfirina que so molculas
orgnicas com uma estrutura geral de macrociclo tetrapirrlico, ligados por ligaes
metnicas, que possui no seu centro um espao apropriado para acomodar um on
metlico. Especificamente na estrutura heme, essas molculas possuem um tomo
central de ferro que se alterna entre o estado reduzido, ferroso, (+2) e o estado oxidado,
(+3) durante o transporte de eltrons, desempenhando um importante papel na
transferncia de eltrons e compe a estrutura do citocromo do tipo c.
10
Figura 4. Estrutura heme composta por um tomo central de Fe.
11
aceptores de eltrons alternativos, bem como estudos de deleo de gene (perda de um
ou mais nucleotdeos), identificaram diversos citocromos do tipo c localizados na
superfcie externa das clulas da espcie G. sulfurreducens que podem ser os
responsveis por fazer este contato eltrico com aceptores de eltrons externos clula,
como por exemplo, eletrodos, entre eles destacaram-se OmcB, OmcE, OmcS e
OmcZ.25,26
O citocromo OmcB tem uma massa molecular de 89 kDa, uma estrutura composta
por 12 hemes e um potencial redox mdio de 190 mV, porm alguns de seus hemes
possuem potencial mais negativo. OmcB est incorporado na membrana externa, com
uma parte da molcula exposta na superfcie exterior da clula.27 Considerando que o
OmcB integra a membrana externa, diversos citocromos do tipo c da espcie G.
sulfurreducens se encontram totalmente expostos na superfcie exterior da clula. A
partir da deleo deste gene foi possvel verificar que este responsvel pela reduo de
citrato de Fe (III) e xido de Fe (III), porm as cepas mutantes, que tiveram o gene
deletado, mostraram se adaptar e passaram a reduzir citrato de Fe (III), mas no xido
de Fe (III).
O citocromo OmcS um citocromo do tipo c composto de seis hemes com uma
massa molecular de 47 kDa e com um potencial de reduo mdio de 212 mV, mais
negativo que os citocromos do tipo c localizados no periplasma.27 O OmcS mostrou-se
envolvido em biofilmes finos gerando baixos nveis de corrente. provvel que o
OmcS seja o principal responsvel por fazer o contato eltrico com a superfcie
relativamente plana do eletrodo, porm a corrente produzida nesses estudos iniciais foi
bastante baixa.72
O OmcE outro citocromo do tipo c que se encontra na superfcie externa da
clula, mas sua localizao especfica ainda no foi determinada. Como ainda no foi
isolado, h apenas uma previso de que sua massa molecular seja em torno de 32 kDa e
que possua uma estrutura de quatro hemes. Estudos de padro de expresso bem como a
deleo do gene sugerem que o OmcE desempenha um papel na transferncia de
eltrons extracelular em cepas selvagens, porm as clulas so capazes de se adaptar
com a perda do mesmo. Em contraste ao OmcE e OmcS, o OmcZ no necessrio para
a reduo de Fe (III) insolvel. No entanto, de todos citocromos de G. sulfurreducens
estudados at o momento, apenas o OmcZ parece ser de fundamental importncia em
12
biofilmes que produzem elevados nveis de corrente.26 O OmcZ uma protena
hidrofbica com uma massa molecular de 30 kDa. Possui uma estrutura composta por
oito hemes, que abrange uma ampla gama de potenciais de reduo (- 420 mV a - 60
mV) e cujo potencial de reduo mdio de - 220 mV. A deleo do gene OmcZ,
segundo Nevin et al, claramente inibe a produo de corrente, assim como a eliminao
de outro gene que reduz a expresso de OmcZ na superfcie externa da clula.28
Anlises de voltametria cclica demonstraram um aumento da resistncia transferncia
de eltrons para o eletrodo em linhagens deficientes em OmcZ. A deleo de genes de
outros tipos de citocromos do tipo c localizados na superfcie externa da clula no
demonstraram uma resposta semelhante.29 Assim, evidncias em diversas linhas
sugerem que o citocromo OmcZ a chave para a transferncia de eltrons entre
biofilmes de G. sulfurreducens e o nodo, porm maiores investigaes das
propriedades que servem unicamente ao OmcZ para este fim so necessrias, alm do
entendimento da sua relao com Fe (III) j que o mesmo no demonstrou ser
necessrio para a reduo deste composto.
Considerando que os citocromos necessitam estar em contato direto com o
eletrodo para fazer a transferncia de eltrons para o mesmo, a capacidade de produo
de corrente da monocamada de clulas em contato direto com a superfcie do eletrodo
limitada pelo espao disponvel para os microrganismos acessarem esta superfcie.
Maiores densidades de corrente (corrente produzida por rea do eletrodo) so possveis
a partir de biofilmes eletricamente condutivos, os quais permitirem mltiplas camadas
de clulas contribuam para a produo de corrente. Conforme citado anteriormente,
biofilmes da maioria dos organismos agem como isolantes ao invs de condutores,
porm o mesmo no observado para o gnero Geobacter.
A possibilidade da existncia de um biofilme condutor foi primeiramente
proposta a partir de estudos de produo de corrente em biofilmes de G. sulfurreducens
e subsequentemente confirmada por medidas diretas.30,31 Em sistemas nos quais se pode
observar a formao de um biofilme espesso no nodo, a potncia foi de at dez vezes
superior. A alta condutividade de biofilmes de G. sulfurreducens que so capazes de
produzir corrente mesmo na distncia de mltiplas clulas em relao ao nodo,
contribui para a alta produo de corrente.30,32 As evidncias sugerem que a
condutividade do biofilme pode ser atribuda a uma densa rede de pilis que so
13
filamentos similares a flagelos, porm responsveis pela conduo de eltrons, que
formam uma nano rede (Figura 5) com uma condutividade semelhante condutividade
metlica, responsvel pela transferncia de eltrons a longa distncia atravs do
biofilme.30,32
14
de difrao de raio-X dos pilis sugerem sobreposio -.31 Dessa forma uma hiptese
de que os aminocidos aromticos que formam a protena estejam alinhados ao longo da
superfcie externa do pili de modo a fornecer a sobreposio -.
Na Figura 6a e 6b pode-se visualizar a nano rede formada pelos pilis bem como
o mecanismo de transferncia de eltrons proposto.
15
2.6 GEOBACTER
16
As espcies Geobacter desempenham um papel importante na degradao de
uma diversidade de contaminantes orgnicos em guas subterrneas, tanto atravs de
atenuaes naturais quanto por estratgias usando a engenharia de biorremediao. A
habilidade das espcies Geobacter em transferir eltrons para eletrodos tem inspirado
diversas novas estratgias para produzir bioenergia e promover a biorremediao. Uma
importante caracterstica desse gnero a capacidade de se associar a microrganismos
metanognicos formando coculturas sob condies em que podem contribuir
significantemente para a converso de dejetos orgnicos ou hidrocarbonetos em metano.
A capacidade fisiolgica caracterstica da espcie Geobacter em acoplar a
oxidao de compostos orgnicos reduo de Fe (III) permite a esta espcie preencher
um nicho chave na cadeia alimentar microbiana anaerbia de ambientes sedimentares
como sedimentos aquticos, pntanos, arrozais e ambientes do subsolo nos quais a
reduo de Fe (III) desempenha um papel importante como aceptor de eltrons final. A
Geobacter foi detectada em diversos ambientes como aquferos contaminados com
petrleo, lixiviados de aterros, ambientes contaminados com cidos orgnicos, solos
contaminados e sedimentos aquticos, sedimentos subsuperficiais contaminados por
urnio tratado com produtos orgnicos para promover a reduo do metal, ambientes
subsuperficiais com altas concentraes de arsnio, turfa e ambientes contaminados
com compostos clorados dentre outros.72
A G. metallireducens, primeiramente denominada GS-15, foi a primeira espcie
Geobacter a ser isolada como cultura pura. O desenvolvimento recente de um sistema
gentico para G. metallireducens35 foi provavelmente o que voltou a ateno a este
organismo para elucidar a fisiologia de novas propriedades importantes, como a
degradao anaerbica de benzeno. Esta espcie foi a primeira espcie Geobacter
descoberta que possui a propriedade de degradar compostos aromticos e o primeiro
microrganismo de qualquer tipo de cultura pura que se sabe, capaz de degradar
hidrocarbonetos aromticos. Um interesse particular referente a esta espcie a
habilidade de degradar benzeno, sendo que esta a nica espcie como cultura pura
cujo mecanismo anaerbico de degradao foi reportado.
Depois da reduo de Fe (III), a transferncia de eltrons para os eletrodos a
forma de respirao mais estudada para espcies Geobacter. Esta, e as espcies
similares Desulfuromonas e Geopsychrobacter foram os primeiros microrganismos
17
descobertos capazes de conservar energia para suportar seu crescimento a partir da
oxidao de matria orgnica com transferncia de eltrons para eletrodos e aparentam
ser os organismos mais eficazes a realizarem esta forma de respirao.72
Os organismos Geobacter so os mais abundantes que colonizam eletrodos em
culturas mistas inoculadas ou comunidades naturais, especialmente sob condies
estritamente anaerbias. Dentre as espcies Geobacter a mais abundante a Geobacter
sulfurreducens, o que consistente com a descoberta de que as cepas de G.
sulfurreducens produzem as maiores densidades de corrente dentre as culturas puras,
acompanhada pela alta eficincia de Coulomb. Isto lhes proporciona uma alta
competitividade na colonizao de eletrodos. Foram reportadas densidades de potncia
em clulas de combustvel microbianas36-39 utilizando culturas puras de G.
sulfurreducens que variam entre 0,09 mW/m2, 1,2 W/m2, 1,9 W/m2 e 3,9 W/m2. Para
MFCs utilizando guas residuais os valores de densidade de potncia encontrados na
literatura40-43 foram de 19,36 mW/m2, 148 mW/m2, 1430 mW/m2 e 1540 mW/m2. Os
estudos utilizando G. metallireducens se concentram essencialmente em suas
propriedades biorremediadoras, mas as poucas MFCs encontradas na literatura que
utilizam esse microrganismo apresentaram densidade de potncia mxima44,45 de 40
mW/m2 e 80 100 mW/m2.
19
mecanismo pode ser utilizado para descontaminao de guas com outros
contaminantes como solventes clorados por meio de desclorao redutiva.18, 72
Apesar das MFCs terem recebido crescente ateno nos ltimos anos devido a suas
aplicaes para o tratamento de guas residuais, biorremediao e gerao de
eletricidade, um aumento na densidade de energia necessrio para que se tornem
competitivas com outras fontes de energia renovvel. O limite superior da potncia
atingida nas MFCs ainda no conhecido por causa da alta resistncia interna que limita
a densidade de potncia mxima. Diversos tipos de MFCs foram comparadas em
relao densidade de potncia mxima onde MFCs que utilizaram substratos e
microrganismos semelhantes apresentam diferena de at uma ordem de magnitude
neste parmetro.43 Isto demonstra que o desempenho da MFC determinado por fatores
relativos configurao do reator o qual limitado por fatores que aumentam a
resistncia interna, como por exemplo, a demanda de gua e nutrientes inorgnicos,
assim como diferenas no material usado nos eletrodos e na configurao propriamente
dita do reator. Para permitir a operao das MFCs com todo o potencial cataltico dos
microrganismos necessrio que haja uma otimizao em termos da configurao do
reator e dos eletrlitos com o intuito de reduzir a resistncia interna.
O desempenho das MFCs, assim como de outras clulas de combustvel,
determinado pela corrente, densidade de potncia e taxa de oxidao do combustvel.
Diferentes fatores podem influenciar na taxa de oxidao de combustvel includo a
atividade cataltica no nodo, difuso do substrato (combustvel), difuso e consumo de
prtons e eltrons que juntos caracterizam a resistncia interna da clula.
Nas MFCs, a taxa de consumo de prtons no ctodo maior do que a taxa de
transferncia destes atravs da membrana.52 As clulas de combustvel microbianas
empregam uma variedade de compostos inorgnicos necessrios para o crescimento das
bactrias, alm do substrato. Estes compostos dissociados na fase aquosa geram ctions
como K+, Na+, NH4+, Mg2+ e Ca2+ entre outros. A concentrao desses ctions na
ordem de 105 vezes maior que a concentrao de prtons em pH neutro. Estes ctions
20
podem interferir no transporte de prtons atravs da membrana. Alm disso, o uso de
uma soluo aquosa como eletrlito tambm interfere na transferncia de prtons.52
A reduo de oxignio no ctodo a reao mais utilizada no compartimento
catdico por sua disponibilidade infinita e sem custo na forma de ar. No entanto, a
cintica da reduo do oxignio em MFCs muito lenta e tem motivado o
desenvolvimento de novas estruturas catdicas bem como ctodos revestidos por
catalisadores metlicos com o intuito de acelerar essa reao.
21
nenhuma medida quantitativa de como cada nova condio pode remover estas
limitaes, ao invs de apenas diminu-las, foi desenvolvida.
Como j mencionado anteriormente, densidade de potncia o dado principal com o
qual as condies das MFCs so comparadas. As densidades de potncia continuam
aumentando quando o tamanho do nodo reduzido em at 40%,52 ou quando o
tamanho do ctodo aumentado53-55, evidncia que o ctodo, mesmo na presena de
catalisadores, continua limitado cineticamente. Estudos usando MFCs com tamanhos
similares produzem densidades de potncia que chegam a se diferenciar em at uma
ordem de magnitude.56 Isto sugere que a taxa biocataltica mxima que ocorre no nodo
continua desconhecida e qualquer esforo para medir o desempenho do nodo, retorna
em informaes sobre o ctodo.
Quando corrente gerada por uma clula de combustvel, uma parte do potencial
do ctodo usado para vencer a barreira de ativao, esse potencial chamado de perda
por ativao catdica (cathodic activation losses).54
A perda por ativao catdica resulta em uma caracterstica exponencial
formando perdas na curva corrente x tenso (i x V) em baixas densidades de corrente
(Figura 8). medida que corrente consumida pela MFC, a perda por ativao aumenta
e resulta em um potencial de clula menor. A perda por ativao catdica domina o
desempenho das MFCs e a magnitude desta perda depende da cintica da reao de
reduo. A cintica pode ser melhorada com a diminuio da barreira de ativao
atravs do aumentando da rea de interface da reao, aumento da temperatura e
concentrao do oxidante.54
22
Figura 8. A) Esquema das perdas de tenso para o compartimento catdico no qual pode
ser visualizadas perdas por ativao, hmicas e por transporte de massa. B) Uma curva
de potncia tpica.
V = i x R(hmica) (3)
23
Onde i a corrente (A) e R(hmica) a resistncia hmica () da MFC. A
resistncia catdica uma combinao da resistncia inica (Rinica) e eletrnica, Reletr e
leva em considerao a resistncia dos eltrons, eletrlito e interconexes:
R = l (5)
AK
24
Como j mencionado anteriormente, a reduo de oxignio no ctodo a reao
catdica mais comum em MFCs. Dois caminhos podem ocorrer durante a oxidao
catdica do oxignio. O caminho desejado a produo de gua (Equao 6):
25
reposio e difunde atravs da membrana em longos tempos de operao o que pode
reduzir o desempenho da MFC.
Outra causa que colabora para a reduo no desempenho das MFC a perda
hmica intrnseca membrana semipermevel, que apresenta uma resistncia ao
transporte de prtons. Esta membrana semipermevel funciona como um eletrlito
slido, permitindo o fluxo de prtons do nodo para o ctodo e no conduz eltrons. A
magnitude da resistncia pode ser mitigada otimizando as propriedades fsicas e o tipo
de membrana. A espessura e a rea superficial da membrana afetam a resistncia ao
transporte de prtons. O efeito da espessura da membrana no desempenho da MFC
ainda no foi reportado, porm previsto que membranas mais finas produzam menores
perdas hmicas como resultado da menor resistncia transferncia de prtons e fluxo
mais rpido. Entretanto, essas tendem uma pequena quantidade de substrato passando
pela membrana. Devido a sua alta condutividade a ctions, Nafion, um polmero
sinttico tetrafluoretileno sulfonado com espessura de poro de <5 nm, tem sido usado
extensivamente como membrana semipermevel em MFC. A estabilidade do Nafion a
longo prazo desconhecida e pode ser comprometida pela degradao por substncias
qumicas e por oxidao biolgica nos compartimentos andico e catdico. Condies
de operao como, por exemplo, temperatura ambiente, pH neutro e presena de ons
com carga positiva alm de prtons podem reprimir a funcionalidade do Nafion.48
Outros polmeros esto em desenvolvimento e sendo testados para substituio
do Nafion, que o componente de maior custo nas MFCs, porm este ainda o mais
utilizado neste tipo de sistema.
3. OBJETIVOS
26
oxignio no ctodo a reao mais utilizada no compartimento catdico. No entanto, a
cintica desta reao em MFCs muito lenta, o que motiva este estudo a realizar uma
comparao com diferentes tipos de ctodos e comparar o desempenho dos mesmos. A
densidade de potncia a principal medida com a qual as condies das MFCs so
comparadas e sero utilizadas como parmetro neste trabalho.
Para que as MFCs desempenhem um papel mais importante como fontes
renovveis de energia, uma compreenso fundamental dos processos que ocorrem no
nodo, bem como no ctodo, deve ser desenvolvida. A fim de compreender as
limitaes cinticas dos biofilmes associadas ao nodo, as limitaes cinticas no
ctodo da MFC devem ser removidas. Para isso optou-se pela utilizao de culturas
puras para a eliminar interferentes.
Aps a otimizao do desempenho das clulas, este trabalho busca fazer a
avaliao da possibilidade de utilizao das propriedades biorremediadoras da espcie
G. metallireducens em uma MFC. O objetivo avaliar se a espcie produz uma
densidade de corrente competitiva com relao a G. sulfurreducens, bem como avaliar
se estas duas espcies so capazes de utilizar glicerol, subproduto proveniente da
produo de biodiesel, como substrato de modo a tratar os resduos provenientes da
produo de biodiesel e produzindo eletricidade. Tambm se busca avaliar o
comportamento de uma cocultura utilizando as duas espcies.
O objetivo geral deste trabalho ser alcanado atravs das seguintes aes:
Construo e otimizao e prottipo, buscando o melhor desempenho quando
avaliada a densidade de potncia;
27
4. MATERIAIS E MTODOS
4.1.1. Eletrodos
28
Figura 9. Fio de ao inoxidvel sobre parte traseira do eletrodo de Ti/Au que constitui o
nodo.
Figura 10. Eletrodo de ouro (nodo) com parte frontal parcialmente coberta com
silicone. Quadrado de 0,6 cm de lado de Au exposto.
29
Para a construo do ctodo, um fio de titnio foi lixado e costurado em um
pedao de tecido de carbono (Fuelcellstore.com) de 6 cm x 6 cm dobrado ao meio duas
vezes (Figura 11).
30
Figura 12. Eletrodos conectados a clula.
Figura 13. Clulas fixadas com grampo de plstico, separadas pela membrana semi
permevel
31
4.2. CRESCIMENTO DAS BACTRIAS
32
sucedida. Foram testados os meios de cultura descritos pelos fornecedores ATCC,
DSMZ e descrito em uma publicao de Summer ET AL.71 As cepas fornecidas pela
DSMZ foram reidratadas e inoculadas nos 3 meios de cultura diferentes, sendo que as
bactrias apresentaram crescimento em 5 dias no meio de cultura descrito por Summer
denominado Media I, e tempos maiores para o meio recomendado por DSMZ e ATCC.
O crescimento das bactrias foi acompanhado por medidas de densidade ptica, porm
quando h uma grande densidade bacteriana a colorao do meio muda de marrom para
uma aparncia esbranquiada, o que alterou totalmente a curva de densidade ptica que
estava sendo traada. Ao mesmo tempo a mudana na aparncia deixa claro quando as
bactrias esto se desenvolvendo descartando a necessidade de um acompanhamento
por medidas de densidade ptica.
A partir desses resultados Media I foi definido como o meio de cultura padro
para G. metallireducens. Media I preparado utilizando-se os seguintes reagentes:
KH2PO4 (0,2 g/L), K2HPO4 (0,22 g/L), NH4Cl (0,2 g/L), KCl (0,38 g/L), NaCl (0,36
g/L), CaCl2 x 2H2O (0,04 g/L), MgSO4 x 7H2O (0,1 g/L), NaHCO3 (1,8 g/L), Na2CO3
(0,5 g/L), trao de vitaminas e minerais (10 mL), citrato de Fe(III) (13,7 g/L) e acetato
de sdio (1,64 g/L).
O meio foi degaseificado e autoclavado da mesma forma descrita para o meio
utilizado nas G. sulfurreducens. Como cuidado adicional, Media I foi protegido da luz
devido a decomposio por exposio a luz sofrida por citrato de Fe(III).
Com o objetivo de comparar o desempenho dos dois tipos de bactrias utilizadas
bem como utilizar uma cocultura das duas espcies, foi necessrio testar o
desenvolvimento da G. sulfurreducens no meio usado para G. metallireducens, j que o
contrrio no seria possvel visto que a ltima no utiliza fumarato como aceptor de
eltrons, contido no meio da primeira.
O desempenho da G. sulfurreducens se mostrou satisfatrio utilizando-se Media
I, no mostrando diferenas no desenvolvimento bacteriano quando comparado com o
meio proposto pela DSMZ. A partir desta informao foi possvel realizar os
experimentos descritos no item 5.2 utilizando Media I em todas as condies.
33
4.3 OPERAO DAS CLULAS
34
Figura 14: Entupimento da membrana semipermevel pela alta concentrao de
ferricianeto.
35
4.4.1 Potencial de circuito aberto (OCP) Open Circuit Potential
Pode-se verificar que depois de ocorrido certo tempo o sistema atinge o estado
estacionrio (linha contnua). Esse o potencial de circuito aberto de interesse. Este
experimento deve ser realizado sempre antes das medidas de LSV, pois o valor obtido
utilizado como parmetro no experimento citado.
36
de 1 mV/s e foi realizada uma varredura de 0 V ao potencial obtido com o circuito
aberto. A corrente que se desenvolve na clula ento registrada em funo do tempo e,
portanto, como uma funo do potencial aplicado. A partir desses dados um
voltamograma obtido (grfico da corrente em funo do potencial aplicado)
semelhante Figura 16.
Figura 16. Voltamograma tpico para: A) ctodos com oxignio B) ctodos com
ferricianeto.
A corrente mxima esperada (com um desvio para cima) deve ser atribuda, pois
ir afetar a sensibilidade da medida.
37
A partir dos valores de corrente e voltagem obtidos neste experimento pode-se
construir as curvas de polarizao e potncia das clulas.
O sistema conhecido como microscopia confocal utiliza uma fonte de laser para
promover a excitao dos fluorforos. Atravs de um conjunto de lentes o microscpio
capaz de focar um cone de luz laser em uma profundidade predeterminada da amostra
a ser estudada. Mudando-se o ponto focal (mantida a profundidade) possvel iluminar
todo o plano em estudo, ponto a ponto. Ao retornar pelo mesmo caminho ptico, a luz
devida a fluorescncia separada utilizando-se um conjunto de espelhos chamados
divisor de luz. Em seguida a luz separada passa por um pequeno orifcio, chamado
pinhole, capaz de separar a luz proveniente do ponto focado, eliminando a luz emitida
por pontos fora de foco. Com isso s a luz dos pontos em foco registrada, com a ajuda
de tubos fotomultiplicadores. Estes sinais gerados pelas fotomultiplicadoras so
processados por um computador e assim imagens bidimensionais extremamente
precisas podem ser construdas. A obteno de imagens sucessivas de diferentes planos
da mesma amostra possibilita construir imagens tridimensionais e imagens
tridimensionais em movimento. O inconveniente dessa tcnica a degradao dos
fluorforos, o que leva utilizao do confocal para o estudo de fenmenos mais
rpidos, no caso de espcimes vivos, ou para estudar detalhes internos das clulas em
espcimes vivos ou fixados.
Nesse trabalho a tcnica de microscopia confocal de varredura a laser foi usada
para analisar os biofilmes formados no nodo, utilizando um microscpio confocal
modelo LSM 780 da Carl Zeiss Microscopy. Antes de serem analisados, os biofilmes
passaram por um processo de fixao, imersos em soluo de 5% de
formaldedo/glutaraldedo de um dia para outro, desidratados em solues de etanol a
25%, 50%, 75% e 95% respectivamente e embebidos em soluo de agarose a 0,1%.
Aps este processo, os biofilmes foram imersos em 50 M de isotiocianato de
fluorescena (FITC) em PBS (soluo tampo salina de fosfato) e analisados usando
uma excitao 2-photon com um comprimento de onda de 820 nm. A espessura e a
morfologia do biofilme foram analisadas usando o software ImageJ.
38
4.6. FISH HIBRIDIZAO FLUORESCENTE IN SITU
40
muitos ribossomos, esse alvo naturalmente amplificado podendo atingir um nmero
de 100.000 cpias por clula.
As sondas utilizadas em FISH so oligonucleotdeos entre 15 e 30 bases com
nica molcula fluorescente ligada covalentemente ao 5-terminal. Neste trabalho
utilizou-se uma sonda do 16S rRNA das espcies estudadas. Os fluorocromos utilizados
foram isotiocianato de fluorecina (FITC), para G. metallireducens e um derivado das
rodaminas, TetramethylRhodamineIsothiocyanate (TRITC) para G. sulfurreducens
(Tabela II).
5 RESULTADOS E DISCUSSES
41
foi construda no houve preocupao com a distncia entre os eletrodos e o ctodo
utilizado foi de oxignio.
42
construdas, visto que houve um aumento de potncia aps a utilizao desse
procedimento. A densidade de potncia mxima atingida foi de 0,16 W/m2, sendo que a
rea de nodo foi reduzida de 6,0 x 10-4 m2 para 4,0 x 10-4 m2. O ctodo utilizado foi de
oxignio.
43
Na construo da clula representada pela Figura 20 a rea do nodo foi
reduzida para 1,82 x 10-4 m2, pois foi notado que uma diminuio na rea do nodo
produziu um aumento na densidade de corrente, o que nos mostra as curvas de
polarizao e potncia da clula. A densidade de potncia mxima passou para 0,51
W/m2 com a utilizao de ctodo de oxignio.
44
As demais clulas construdas tiveram a rea do nodo reduzida at que a
reduo do tamanho do nodo no implicasse em um aumento de potncia. O oxignio
no compartimento catdico foi substitudo por ferricianeto, o que aumentou
consideravelmente os valores de potncia mxima obtidos. A clula referente Figura
21 possui todas estas condies otimizadas e ferricianeto no compartimento catdico. A
rea do nodo foi de 3,6 x 10-5 m2 e a potncia mxima obtida foi de 2,61 W/m2.
45
Figura 21. A) Curva polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. As curvas so referentes a clula com
condies otimizadas, ferricianeto no compartimento catdico e rea de 3,6 x 10-5 m2.
A seguir feita uma avaliao dos resultados obtidos com as clulas construdas.
47
Assim, possvel que neste perodo de overshoots o biofilme esteja em
desenvolvimento e por isso no tenha sido reportado, pois ocorre no incio do
crescimento, quando em sua maioria os grupos de pesquisa no realizam medidas
eletroqumicas.
48
serem atribudas ao alto OCP resultante da reduo do [Fe(CN)6]3-, a diferena de
desempenho entre as duas condies apenas aumenta com o aumento da voltagem vs.
OCP. Curvas de polarizao e potncia representativas para MFCs so mostradas na
Figura 23.
49
na corrente. A menor diferena na curva de polarizao ocorre no potencial do circuito
aberto e na densidade de corrente final.
50
Figura 24. Imagens dos biofilmes obtidas por microscpio confocal de varredura a laser.
(A) Biofilme de G. sulfurreducens de espessura de 62,1 m. (B) Biofilme de G.
metallireducens de espessura de 80 m. (C) Cocultura analisada por FISH, em vermelho
G. sulfurreducens e em verde G. metallireducens.
O valor de potncia atingido foi superior ao citado na literatura para clulas que
utilizam O2 no compartimento catdico, mas corresponde a potncia mdia obtida nos
experimentos realizados no grupo de pesquisa com as condies da clula otimizadas
(reduo das limitaes catdicas atingidas com a diminuio do tamanho do nodo e
utilizao de [Fe(CN)6]3- no compartimento catdico).
A clula cultivada com G. metallireducens demorou mais tempo para alcanar o
estado estacionrio, o que se pode concluir pela presena de overshoots nas curvas de
polarizao (Figura 25). Como consequncia, o pico de potncia foi atingido aps 240
horas de operao, quando a clula apresentou potncia de 3,61 W/m2.
51
Figura 25. Curvas de polarizao para MFC utilizando culturas puras de G.
metallireducens. Efeito de overshoot diminui aps 240 horas de operao.
Figura 26. Grfico de densidade de potncia atingido e MFC para uma cultura pura de
G. metallireducens em azul e G. sulfurreducens em vermelho.
52
O biofilme presente no nodo foi fixado aps 336 horas de operao
apresentando uma espessura de 80 m (Figura 24B). O experimento demonstrou que G.
metallireducens alm de poder ser utilizada para biorremediao apresenta uma
potncia elevada, podendo ser usada tambm em clulas de combustvel microbianas
para a produo de eletricidade.
A clula inoculada com as duas espcies apresentou biofilme com espessura de
apenas 8 m (Figura 24C) e potncia mxima de 0,016 W/m2 (Figura 27), muito baixa
se comparada s clulas inoculadas com culturas puras.
Figura 27. Grfico de potncia para uma MFC utilizando uma cocultura de G.
metallireducens e G. sulfurreducens
53
biofilme. Alm disso, pode-se perceber uma relao direta entre a espessura do biofilme
e a potncia produzida nas trs clulas.
54
Figura 28: Medida da densidade ptica dos pilis das espcies Geobacter
55
Primeiramente foram preparados 4 frascos de 80 mL cada com meio de cultura
especfico (Media I) abstraindo-se o doador de eltrons acetato. Citrato de Fe(III) foi
utilizado como aceptor de eltrons. O material usado bem como o meio de cultura,
foram previamente autoclavados. Glicerol foi utilizado como fonte de carbono, porm
teve que ser adicionado ao meio de cultura aps o processo de esterilizao em
autoclave por sofrer decomposio ao calor. 5, 10, 20 e 30 mM de glicerol foram
injetados respectivamente a cada frasco a partir de uma soluo me de glicerol 50%
que foi injetada ao meio de cultura atravs de um filtro estril de 20 m de espessura
para eliminar qualquer possibilidade de contaminao. A cada frasco foi adicionado 8
mL G. metallireducens previamente cultivadas. Dois frascos de controle tambm foram
preparados, um utilizando 20 mM de acetato como fonte de carbono e outro sem doador
de eltrons. Em ambos os frascos foram adicionados 8 mL de bactrias. Todo o
procedimento foi realizado dentro de uma cmara anaerbica. O mesmo experimento foi
repetido para G. sulfurreducens.
O meio de cultura inicialmente de cor marrom escuro, torna-se turvo, mudando
inicialmente para amarelo claro e em seguida tornando-se esbranquiado quando h
crescimento de bactrias. Na Figura 29 e Figura 30 pode-se verificar o crescimento de
G. metallireducens no controle contendo acetato, como esperado, alm de crescimento
da bactria no meio contendo 20 mM de glicerol, depois de 7 dias de inoculao.
56
Figura 30. G. metallireducens inoculada no controle sem glicerol, 5, 10, 20 e 30 mM de
glicerol (esquerda para direita). Pode-se ver o crescimento de bactrias apenas no frasco
contendo 20 mM de glicerol
Figura 31. G. metallireducens inoculado no controle com acetato, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24 e 28 mM de glicerol e controle sem fonte de carbono (esquerda para direita).
57
de inoculao (Figura 32).
Figura 32. Densidade ptica (D.O.) das amostras nas respectivas concentraes. 14 mM
demosntrou ser a concentrao mais apropriada para o crescimento das bactrias em
glicerol.
58
porm pode ser modificado a partir de alteraes realizadas nas configuraes do
equipamento.
6. CONCLUSES
59
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