Patologia molecular
Técnicas moleculares para la obtencién
de DNA y reaccion en cadena
de la polimerasa
LI. Catasis y X. Matias-Guiu
Servicio de Anatomia Patoldgica, Hospital de la Santa Crew i Sant Pau, Barcelona.
METODOS DE OBTENCION DEL DNA
En los dltimos afios los avances realizados en el campo de
la genética molecular han mejorado de forma notable el
conccimiento de los mecanismos fisiopatolégicos y el
iagndstico de distintas enfermedades. En el DNA se
encuentra toda Ia informacién genética del individuo; por
tanto, el primer paso para llevar a cabo un estudio de ger
tica molecular implica la obtencién de muestras de écidos
nucleicos, especialmente DNA.
Las técnicas de extraccién de dcidos nucleicos son sen-
cil, pero es importante mantener une sere de precauio.
nes par evitar In deradacin por nucleases durapte la
manipulacisn El objetivo es obtener Ia maxima eantidad y
Ja mayor eilidad posible de DNA. Se han desarrollo
diverts procedimientos o protocolos de extacidntenien-
do en cuenta el orgeno fuente del DNA. En los limos
afios as ests comerciales han desarolad dversos kts de
obtencién del DNA. partic de sangre, todo tipe de tejdos
Y cults ceulaes que pretenden optimizar los proce
nnientos para obtener un maximo de DNA de buena calidad
Yen el menor tiempo posible
A partir de sangre: Las cules nucleades de sangre
periférica son una de las fuentes ms asequiblesy uiliza.
das en medina para la obtencién de DNA genémico. Con
el procedimnto habitual, entre 10 y 30 ml de sangre eco-
gidos sobre icido etlendiaminotevactico (EDTA), que
tena como anticoagulatc, son suficientes para obtener
varios eentos de mirogeamos de DNA ea forma defrag:
menos de una alla de hasta 20 Kb, *
separa los leuocitos ys isan con una soucién que eon.
tiene el detergent ddecisulfto de soio SDS) y la ro.
teinasa K. La poteinasa K es una potesa muy activa del
tipo de a subilsina que se obtiene apt de Triracam
albun esta protease liber el DNA nuclear al medio y
digiere las proteins, Posteionnente, se desprotegiza Ia
nmuesra mediante una deshdrataciony prespitacion de las
protenascelulares provocada con una soucinsturada de
NaCl, y fnalmente se obtiene el DNA por prespitacén
on scohol etlico absoluto (1). Actualmente se pueden
enconra en el mercado kts yaparatos que automatizan la
entrain de DNA de varias muestras ala vez en unas
poces hors
A pane de tis conservados en congelacin: Se
requiee un primer paso de homogencizacién que rompacl
tli y fait a posterior isis de la élules que forman
dl teldo. Después, el tejdo homogenezado se incuba
durante 12 horas con SDS y potenasaK para desnaturali-
Ia extrac
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zar y digerir las proteinas, Posteriormente, el DNA se
somete a una serie de extracciones con fenol y cloroformo
gue tienen como objeto acabar de digerir las proteinas y
separarlas del DNA.
Appattir de tejidos parafinados: El DNA de estas mues-
tases estable durante muchos alos. Se obtienen secciones,
se desparafinan y se incuban durante 72 horas con SDS y
proteinasa K. A partic de aquf el procedimiento es idéntico
al descrito para el caso de tejidos conservados por congela:
ci6n; extraccién con fenol-cloroformo y precipitacién con
tanol absoluto. Para futuros andlisis se ha de tener en cuen-
ta que a veces el DNA gendmico de tejidos incluidos en blo-
ues de parafina se encuentra muy fragmentado, y que, por
ejemplo, es desaconsejable montar reacciones en cadena de
a polimerasa (PCR) para buscar y amplificarfragmentos de
DNA superiores a 300 a 400 pates de bases. También es
importante saber que algunos fijadores (Iiquido de Bouin)