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Patologia molecular Técnicas moleculares para la obtencién de DNA y reaccion en cadena de la polimerasa LI. Catasis y X. Matias-Guiu Servicio de Anatomia Patoldgica, Hospital de la Santa Crew i Sant Pau, Barcelona. METODOS DE OBTENCION DEL DNA En los dltimos afios los avances realizados en el campo de la genética molecular han mejorado de forma notable el conccimiento de los mecanismos fisiopatolégicos y el iagndstico de distintas enfermedades. En el DNA se encuentra toda Ia informacién genética del individuo; por tanto, el primer paso para llevar a cabo un estudio de ger tica molecular implica la obtencién de muestras de écidos nucleicos, especialmente DNA. Las técnicas de extraccién de dcidos nucleicos son sen- cil, pero es importante mantener une sere de precauio. nes par evitar In deradacin por nucleases durapte la manipulacisn El objetivo es obtener Ia maxima eantidad y Ja mayor eilidad posible de DNA. Se han desarrollo diverts procedimientos o protocolos de extacidntenien- do en cuenta el orgeno fuente del DNA. En los limos afios as ests comerciales han desarolad dversos kts de obtencién del DNA. partic de sangre, todo tipe de tejdos Y cults ceulaes que pretenden optimizar los proce nnientos para obtener un maximo de DNA de buena calidad Yen el menor tiempo posible A partir de sangre: Las cules nucleades de sangre periférica son una de las fuentes ms asequiblesy uiliza. das en medina para la obtencién de DNA genémico. Con el procedimnto habitual, entre 10 y 30 ml de sangre eco- gidos sobre icido etlendiaminotevactico (EDTA), que tena como anticoagulatc, son suficientes para obtener varios eentos de mirogeamos de DNA ea forma defrag: menos de una alla de hasta 20 Kb, * separa los leuocitos ys isan con una soucién que eon. tiene el detergent ddecisulfto de soio SDS) y la ro. teinasa K. La poteinasa K es una potesa muy activa del tipo de a subilsina que se obtiene apt de Triracam albun esta protease liber el DNA nuclear al medio y digiere las proteins, Posteionnente, se desprotegiza Ia nmuesra mediante una deshdrataciony prespitacion de las protenascelulares provocada con una soucinsturada de NaCl, y fnalmente se obtiene el DNA por prespitacén on scohol etlico absoluto (1). Actualmente se pueden enconra en el mercado kts yaparatos que automatizan la entrain de DNA de varias muestras ala vez en unas poces hors A pane de tis conservados en congelacin: Se requiee un primer paso de homogencizacién que rompacl tli y fait a posterior isis de la élules que forman dl teldo. Después, el tejdo homogenezado se incuba durante 12 horas con SDS y potenasaK para desnaturali- Ia extrac 103 - LL Catan y X. Matis Goo zar y digerir las proteinas, Posteriormente, el DNA se somete a una serie de extracciones con fenol y cloroformo gue tienen como objeto acabar de digerir las proteinas y separarlas del DNA. Appattir de tejidos parafinados: El DNA de estas mues- tases estable durante muchos alos. Se obtienen secciones, se desparafinan y se incuban durante 72 horas con SDS y proteinasa K. A partic de aquf el procedimiento es idéntico al descrito para el caso de tejidos conservados por congela: ci6n; extraccién con fenol-cloroformo y precipitacién con tanol absoluto. Para futuros andlisis se ha de tener en cuen- ta que a veces el DNA gendmico de tejidos incluidos en blo- ues de parafina se encuentra muy fragmentado, y que, por ejemplo, es desaconsejable montar reacciones en cadena de a polimerasa (PCR) para buscar y amplificarfragmentos de DNA superiores a 300 a 400 pates de bases. También es importante saber que algunos fijadores (Iiquido de Bouin)

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