Western Blot

1 ELECTROFORESIS
1 .1 Preparacin de Geles de Poliacrilamida

Se prepara un juego de cristales para gel previamente limpios con alcohol y secos. Se montan en
el soporte para cristales cuidando que queden alineados y con la pestaa hacia adelante.

Llevar a cabo la preparacin de los geles de acuerdo al orden y cantidades presentadas en la tabla
1. Esperar de 10 a 12 minutos a que cada porcin gelifique agregando una delgada capa de agua
despus de la fraccin al 18% y 9% misma que ser desechada al trmino de la gelificacin de cada
una. Despus de agregar la fraccin al 6% se coloca una peineta para la formacin de los canales.

1 2 3
18% 9% 6%
Agua miliQ 0.325 mL 0.99 mL 0.68 mL
Acrilamida 1.5 mL 0.69 mL 0.17 mL
Tris 88 0.625 mL 0.575 mL 0.125 mL
SDS 0.025 mL 0.023 mL 0.01 mL
APS 0.025 mL 0.023 mL 0.01 mL
Temed 0.001 mL 0.0014 mL 0.001 mL
Tabla 1

Se desmonta el gel del soporte y se coloca en una cmara de electroforesis. Se monta una base de
acrlico en la contraparte de la cmara y se deposita el buffer para electroforesis asegurndose
que no existan fugas, si existen fugas se desmonta el gel y la contraparte para ajustarse y volver a
montarse. Se coloca un flotador para asegurar que se mantenga la porcin de buffer en la cmara.

1 .2 Preparacin de las muestras

1.2.1 A cada muestra se agregan 100L de solucin de lisis, se resuspende adecuadamente con
pipeta y se incuba a 4C por 10 minutos.

1.2.2 Se centrifuga a 13500 RPM a 8C por 10 minutos.

1 .3 Preparacin de la Curva de Calibracin

Preparar en una placa para espectrofotmetro EPOCH soluciones con diferentes concentraciones
de Albumina de Suero Bobino (BSA) de acuerdo a la tabla 2. Tomar 5L de cada solucin
preparada y despositarlo en un espacio vacio. Colocar en diferentes espacios 5 L de cada una de
las muestras a analizar. Tanto a las diluciones de BSA como a las muestras de anlisis se agregan
250 L del Reactivo de Bradford. Se hace la lectura de absorbancias en el Espectrofotmetro
EPOCH a 595 nm y se calcula mediante regresin lineal las concentraciones asociadas a las
muestras de anlisis.
Tubo Volumen a Agregar L Tomar de Volumen del Diluente [C] final g/mL
1 20 Stock BSA 2mg/mL 0 2000
2 30 Stock 10 1500
3 20 Stock 20 1000
4 20 Tubo 2 20 750
5 20 Tubo 3 20 500
6 20 Tubo 5 20 250
7 20 Tubo 6 20 125
8 0 - 20 0
Tabla 2

1.4 Carga de muestras y corrida

A cada muestra se coloca buffer de corrida en proporcin 1:5 y se pone a bao Mara por 5
minutos. Se coloca en cada carril la cantidad equivalente a 30 g de protena adems de un
marcador de pesos moleculares Spectra HR.

Se monta un sistema de enfriamiento para la cmara de electroforesis y se ajusta un voltaje de 60

V. Se dejan correr las muestras aproximadamente 18 hrs.

2 TRANSFERENCIA
Desmontar la cmara de electroforesis y separar los cristales del gel en una porcin de buffer de
transferencia TBS. Se sumerge una membrana de PVDF en alcohol etlico al 80% durante 1 minuto
y despus se sumerge en buffer de transferencia durante 1 minuto.

Se coloca la membrana y el gel como lo indica la figura 1.

Se coloca en la cmara de electroforesis adicionando buffer de transferencia TBS, se ajusta a 60-

70V y se deja correr durante 4 hrs.

Figura 1.
 3 BLOQUEO DE MEMBRANA
Se desmonta la cmara de electroforesis y se coloca la membrana de PVDF en una solucin de PBS
Tween al 0.1%. Se hace un lavado con agitacin suave por 10 minutos. Se coloca la membrana en
50mL de una solucin PBS-Tween con Leche al 3% para llevar a cabo el bloqueo de la membrana.

4 ADICIN DE ANTICUERPOS
Se hace una preparacin de 3-5 mL del anticuerpo de inters en una solucin PBS-T con leche al
1% .

Se coloca la membrana de PVDF en una bolsa de plstico sellada por 3 de sus lados y se eliminan
las burbujas presentes, a continuacin se agrega la solucin de anticuerpos y se sella la bolsa por
calor asegurndose que la solucin no se salga de la bolsa.

Se deja en incubacin a 4C en una superficie plana durante 12 hrs.

Despus del periodo de incubacin el anticuerpo primario puede ser recuperado mientras que la
membrana se debe lavar por triplicado con solucin PBS-T con leche al 1%. Cada periodo ser con
agitacin y durante 10 minutos.

Se hace una preparacin de 15mL del anticuerpo secundario (Ab marcado con peroxidasa de
rbano), se coloca la membrana de PVDF en una bolsa de plstico sellada por 3 de sus lados, se
eliminan las burbujas presentes, a continuacin se agrega la solucin de anticuerpos y se sella la
bolsa por calor asegurndose que la solucin no se salga de la bolsa.

Se incuba 30 minutos a temperatura ambiente con agitacin suave.

Despus del periodo de incubacin el anticuerpo secundario puede ser recuperado mientras que
la membrana se debe lavar por triplicado con solucin PBS-T con leche al 1%. Cada periodo ser
con agitacin y durante 10 minutos.

5 REVELADO
La membrana se moja uniformemente con una solucin de Luminol-Peroxido de Hidrgeno 1:3.

La membrana se lee en un Tansiluminador para identificar las bandas asociadas a la protena de

inters as como el marcador de pesos moleculares.