ANLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS

ANTIGUOS

Andrea SMERLING Eduvigis SOLRZANO, Nancy DAZ, Rafael MONTIEL,

Eduard CHIMENOS y Assumpci MALCOSA

Introduccin

Ya sea como jefe de tribu, curandero, chamn, mago o mdico, a lo largo de la historia el hombre
ha adoptado diferentes formas y mtodos para enfrentarse, conocer y combatir la enfermedad. Ha sido
la curiosidad, el inters o el instinto de supervivencia lo que an hoy moviliza a mirar tanto hacia
delante como hacia atrs en busca de respuestas. Conocer las enfermedades en el pasado, la morbilidad,
el impacto en el ecosistema y los cambios evolutivos hasta llegar a la patologa actual son argumentos de
suficiente peso para sustentar su inters en investigarlos (Campillo, 1993: 21-37)
La importancia del estudio de las diferentes lesiones asociadas a los dientes radica no solo en el
conocimiento de la salud buco-dental de una determinada poblacin, sino en la informacin que aporta
al conocimiento de la dieta y hbitos existentes tanto de las poblaciones actuales como antiguas y
prehistricas (Perea e. al. 2000)
La caries es la ms comn de las enfermedades dentales y es referida con relacin a las
poblaciones arqueolgicas con llLs frecuencia que otras lesiones buco-dentales (Roberts y Manchester,
2000). Otras alteraciones dentales comnmente descritas son los depsitos de sales clcicas en el cuello y
en algunas porciones de la corona de los dientes, producto de la mineralizacin de la placa bacteriana,
constituyendo autnticos clculos. Su presencia se constata en todas las pocas (Campillo, 1993;
Linossier et al. 1996: 1005-1014) e indudablemente influye en el desarrollo de la enfermedad periodontal.
Estudiar el desarrollo de las enfermedades infecciosas orales a travs del tiempo mediante la
observacin de la caries, el clculo dental y su relacin con los agentes microbianos qLle las producen
puede proporcionar una valiosa informacin respecto al origen y subsistencia de estos procesos
(Chilenos y Martnez, 1998: 25-33).
Los estudios paleodontolgicos, al igual que la mayora de estudios paleoantropolgicos son
principalmente morfolgicos. Sin embargo, en las ltimas dos dcadas, el anlisis de ADN se ha
convertido en una herramienta efectiva, verstil y accesible para Lm numeroso grupo de cientficos.
Actualmente, el reciente desarrollo biotecnolgico permite recoger diferentes datos genticos de
poblaci<mes antiguas utilizando restos arqueolgicos. Este nuevo campo de investigacin presenta todas
las potencialidades para poder contribuir sustancialmente a la comprensin de nuestra historia evolutiva
(Capella et al. 2003: 59-64). La capacidad de las biomolculas en el hueso yen los dientes de sobrevivir
largos perodos de enterramiento ha brindado esta oporttmidad.

ADN antiguo

El estudio de secuencias de ADN obtenido de organismos extintos, ADN antiguo (aDNA), abre
nuevas posibilidades en la recuperacin de informacin gentica proveniente del pasado, dando la
oportunidad de analizar la evolucin molecular a travs de largos perodos de tiempo. Actualmente el
grado de desarrollo de esta disciplina ha generado un campo autnomo dentro de la moderna biologa
molecular, definindose corno "arqueologa molecular" (Cooper y Wayne 1998: 49-53; Taylor, 1996: 283-
285).
En general, se trata de un material gentico muy degradado, fragmentado y susceptible de
contaminarse con ADN moderno, por lo que se aplican mtodos particularmente delicados que
554
 APORTAC10NES, METODOLOGAS y DESARROLLO TECNOLGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS POCAS

permiten, a pesar de la naturaleza de las muestras, recuperar pequeos fragmentos de ADN,

habitualmente menores de 200 pares de bases (pb). Por ello resulta necesario establecer criterios estrictos
de esterilizacin que garanticen la autenticidad de los resultados obtenidos, siendo imprescindible un
laboratorio exclusivamente dedicado al trabajo de aDNA y la consecuente separacin fsica de los
procesos de pre-PCR, que implica la extraccin y preparacin de la reaccin de amplificacin y post-PCR
destinado al anlisis de las muestras amplificadas (Ibdem).
Las dificultades inherentes a la utilizacin de PCR al amplificar pequeas cantidades de ADN
daado estn siendo an consideradas, en particular el riesgo de contaminacin y accidentes en el
proceso de amplificacin, dando lugar a resultados falso-positivos (Martnez et al. 1999: 195-213; Paabo,
1989: 1939-1943; Paabo et al. 1989: 9709-12). Se han llevado a cabo numerosas adaptaciones en los
procedimientos de extraccin de ADN, eliminacin de inhibidores a travs de pasos de purificacin y
protocolos de PCR con la finalidad de aumentar la calidad y cantidad del producto amplificado (Pusch et
al. 2002: 351-364; Montiel, 2001; Malgosa et al. 2005)

Streptococcus mutans

La caries dental es, actualmente, una de las enfermedades ms prevalentes que padece el hombre
moderno. Esta prevalencia ha ido aumentando progresivamente con el avance de la civilizacin
coincidiendo con el incremento en el consumo de azcar de caa y harinas refinadas (Roberts y
Manchester, 2000; Lerman, 1942: 29-36).
Dcadas de estudios epidemiolgicos, bioqumicos y experimentales con animales han implicado
a Streptococcus mutans como el principal agente causal de la caries dental humana. Aunque 200-300
especies bacterianas se encuentran asociadas a la placa dental, solo la presencia del Streptococcus mutans
ha sido consistentemente ligada a la formacin de la caries (Sato et al. 2003: 66-69; Lindhe, 2001; Dzagana
et al. 2002: 14434-14439). La elevada potencialidad cariognica de S. mutans es parcialmente atribuible a
su capacidad de acumularse sobre los dientes mediante la formacin de glucanos extracelulares
(dextranos) sintetzados a partir de la sacarosa, predominantemente polmeros, que se forman a partir de
una mitad de la molcula de sacarosa por glicosiltransferasas presentes en la superficie del
microorganismo.
El Streptococcus mutans es un gran productor de la enzima dextranasa (Dex), la cual hidroliza las
uniones de las molculas de glucanos sintetizados por la glucosiltransferasa Por consiguiente, la Dex
sera un importante factor de virulencia (Morisaki et al. 2002: 223-227; Igarashi et al. 2001: 341-348;
Igarashi et al. 1996: 294-298). Precisamente el gen responsable de este enzima se ha utilizado con
frecuencia para identificar y diferenciar el Streptococcus mutans. Recientemente, la utilizacin de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la secuencia gentica de la dextranasa ha sido
desarrollada y aplicada con xito para la identificacin de este microorganismo (Redmo et al. 2003: 24-29;
Igarashi et al. 1996: 294-298).
El objetivo de este trabajo consiste en optimizar la tcnica de extraccin y amplificacin del ADN
de Streptococcus mutans antiguo a partir de restos antiguos, siendo este integrante del grupo mutans el
organismo principalmente implicado en el desarrollo de la caries y componente de la placa bacteriana. A
partir del material gentico extrado en distintas muestras se pretende observar la eventual
homogeneidad o heterogeneidad de las secuencias

555
 ANLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS

Material y mtodos

Muestras

Se han analizado un total de 24 muestras pertenecientes a distintas series arqueolgicas espaolas

custodiadas en el laboratorio de Paleoantropologa de la Universidad Autnoma de Barcelona:

S'Illot des Porros (Mallorca): siglo VI-II aC.

Can Reiners (Mallorca): siglo VII.
Esglesia San Pere (Terrassa, Barcelona): siglos V-XII.
Coleccin UAB (Granollers ,Barcelona): principios de siglo XX).
Adems, dos grupos dentales de:
Tlatelolco: Ciudad de Mxico, Post-clsico Tardo, siglo XV- principios del siglo XVI.
Los Olmos: Hidalgo,Colonial Tardo, siglo XIX.

Los dientes presentaban distintas lesiones: caries oclusal, caries cervical, dentina perifrica a caries
(dentina desorganizada) y clculo, obtenindose el material de cada una de ellas.

Prevencin de contaminacin

Se tomaron estrictas precauciones para evitar la contaminacin durante los procesos de

extraccin y PCR para garantizar la fiabilidad de los resultados. Los mismos fueron realizados en
laboratorios independientes diferenciando proceso de extraccin y post-PCR. Los reactivos fueron
preparados con soluciones estriles e instrumental de vidrio, siendo todo el material autoclavado dos
veces e irradiado con rayos UV (254 nm) antes de su utilizacin. La manipulacin durante todo el trabajo
en laboratorio se realiz con guantes desechables, que se fueron cambiando frecuentemente en los
diferentes pasos durante todo el proceso, indumentaria estril y mascarillas. En todos los proceso de
extraccin y de amplificacin fueron incluidos controles de contaminacin.

Extraccin de ADN, Tratamiento de las muestras

Dado que el objetivo primordial de este trabajo ha sido la optimizacin de una tcnica que
permita amplificar ADN de Streptococcus mutans de restos antiguos, algunos pasos fueron modificndose
a lo largo de todo el estudio en funcin de los resultados, con el objeto de aumentar la eficiencia del
mtodo.
Este trabajo se realiz siguiendo la metodologa bsica y utilizada habitualmente en el
laboratorio de ADN antiguo de la Unidad de Antropologa, Departamento de Biologa Animal, Biologa
Vegetal y Ecologa. UAB (Malgosa et al. 2005). Las extracciones se realizaron en grupos de 3 a 6 muestras
y un control negativo que contiene solo los reactivos (blanco de extraccin o KE), para el control de la
contaminacin.

Obtencin de las muestras

Las muestras de caries, dentina y clculo dental se obtuvieron dentro de una campana de flujo
laminar, utilizando un juego de instrumental diferente (frceps, fresas redondas para instrumental
rotatorio, pinza de algodn) para cada una de las muestras (Figs. 1, 2 Y3). El clculo dental se obtuvo de
556
 APORTACIONES, METODOLOG[AS y DESARROLLO TECNOLGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS POCAS

forma manual, utilizando curetas Gracey de periodoncia; la caries y la dentina con instrwnental
rotatorio: piedras de diamante y fresas redondas de carburo de tungsteno.
El aislamiento de ADN se realiz por una lisis previa con EDTA (quelante de cationes divalentes)
para desestabilizar las membranas e inhibir las DNAsas, y un detergente que produce finalmente la lisis
de la membrana citoplasmtica (SDS), constituyendo esto el tampn de extraccin, al cual se le incorpora
proteinasa K (Rodrguez et al. 2002: 80-88). Siguiendo este principio, se colocaron 5 mI de tampn de
extraccin y 50 111 de proteinasa K en cada tubo, incluyendo el blanco de extraccin (KE), el cual se trat
como una muestra ms. Algunas de las muestras se lavaron con EDTA previo a la colocacin del
tampn. Las muestras fueron incubadas a 37 durante toda la noche.
La extraccin de ADN se realiz en tres pasos con fenal, fenal-cloroformo y cloroformo, Este
proceso se consigue mediante cinco etapas de centrifugacin de entre 45 y 60 minutos en el cual los
lpidos quedan en el fenal (fase orgnica), los cidos nucleicos en la fase acuosa y las protenas en la
interfase. El cloroformo contribuye a retirar todo el fenal de la fase acuosa. Posteriormente se realiza el
filtrado y la concentracin utilizando centricn 30 (Millipore). El extracto as obtenido se almacena a
4C durante 3 das quedando preparado para su amplificacin mediante PCR.
Los primers utilizados han sido diseados en nuestro laboratorio a efectos de este trabajo. Se
trata de un fragmento de 12~ pb especfico para la especie S. mutans, que se corresponde con el gen de la
dextranasa. Los primers fueron diseados con el programa PrimerDesign v. 1.10 (Napiwotzki, 1995) La
seleccin final de los primers se bas en el anlisis de primer-dimers, utilizando el programa Primer
(Montiel, 2001) y verificando las posibilidades de hibridacin con secuencias de otras especies mediante
el programa BLAST 2.2.9 (Altschul et al. 1997: 3389-3402) en el GenBank.
El proceso de PCR se llev a cabo siguiendo los principios bifsicos de amplificacin adaptados
para aDNA. El programa del termociclador consisti de un ciclo inicial de desnaturalizacin de 5
minutos a 94 C, 39 ciclos de desnaturalizacin de 50 segundos a 94 C, 1 minuto a temperatura de
"annealing" (hibridacin o emparejamiento de primer) optimizada entre 54 y 56 C y finalmente
estandarizada en 55; y 1 minuto de extensin a 72 C, terminando con un ciclo de extensin final de 5
minutos a 72 C, finalizando con la temperatura de almacenamiento a 4 C. El producto amplificado fue
analizado por medio de electroforesis en gel de agarosa a13% y visualizado a travs de UV. (Fig. 4)

Secuencias del producto amplificado

El producto de PCR obtenido fue purificado con el fin de eliminar los residuos del tampn de
extraccin as como de los primers, siguiendo la metodologa de Montiel (2001), modificando
temperaturas y tiempos, lo que contribuy a obtener un producto purificado de mejor calidad. El
producto purificado, se secuenci en el Servicio de Secuenciacin de la Unidad de Microbiologa de la
UAB, utilizando un secuenciador automtico Alf-express (Phannacia) (Fig. 5). Las secuencias fueron
alineadas utilizando la base de datos del GenBank (NCBI) con el programa BLAST (Ibidem)
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.

Resultados

Al ser sta la primera experiencia en el aislamiento de ADN de S. mutans en restos antiguos,

muchos de los pasos del protocolo de extraccin fueron modificndose a fin de obtener mejores
resultados. Se realizaron 8 extracciones en grupos de entre 3 y 6 muestras. La temperatura de
hibridacin de los primers o annealing se estipul en 55 C y 2111 de ADN en suspensin, como el
volumen indicado a utilizar en las amplificaciones.

557
 ANLlsrs DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS

Una vez confirmada la posibilidad de recuperar el ADN del microorganismo, los procedimientos
se orientaron a mejorar la calidad del producto final.

Limpieza previa de la muestra

Un grupo de extraccin de 5 muestras no se lavaron con hipoclorito de sodio antes de comenzar

el procedimiento; solo fueron limpiadas con un cepillo de dientes y aclaradas con agua destilada, para
eliminar los restos de material provenientes de la excavacin, en estos casos, no se obtuvo resultados
positivos. Tal vez, restos de material orgnico de la excavacin actuaron como inhibidores del la PCR, y
de esta forma inutilizaron las muestras.
Estas muestras tambin se amplificaron con primers especficos de diferentes fragmentos de
ADN mitocondrial (humano) especialmente diseados para aDNA (125 pb) con el fin de verificar la
presencia de ADN (careciendo de importancia el origen de ste) y as constatar de que las muestras
fueran viables y considerarlas como resultados negativos, pero tampoco hubo resultados, confirmando
la hiptesis de la presencia de gran cantidad de sustancias inhibidoras de la PCR. La metodologa
utilizada fue ligeramente distinta y podra haber influido en la eficiencia de la extraccin.
El lavado con EDTA tampoco fue determinante en la obtencin de resultados.

Respecto al volumen del extracto

En algunos casos el volumen final de extraccin superaba el volumen ideal. Tal vez partculas de
muestra que no hubieran sido lo suficientemente disueltas en el tampn de extraccin obstruyeron parte
de la membrana del centricn 30 impidiendo de esta forma un total filtrado. Se decidi re-concentrar
estas muestras. Este proceso consiste en repetir la fase de centrifugado en iguales condiciones. En este
paso, si bien se obtiene un ADN ms concentrado, tambin se corre el riesgo de aumentar la
concentracin de los inhibidores de la PCR, adems, otro riesgo de la reconcentracin es el de la
contaminacin. Es por esto que es preciso reconcentrar tambin el blanco de extraccin. Como se ha
citado anteriormente, el blanco de extraccin para el control de la contaminacin es tratado como una
muestra ms.
A pesar de estas consideraciones, de las tres muestras reconcentradas dos amplificaron con muy buenas
bandas. Esto podra indicar que la reconcentracin sera una opcin a tener en cuenta. Cuando el
volumen de la muestra sobrepasara excesivamente los 25.11, y si los resultados no fueran ptimos, la
posibilidad de no perder estas muestras justificara el riesgo de una reconcentracin.

Reamplificacin

Tres de las muestras que resultaron positivas se re-amplificaron, a fin de conseguir mejor calidad
de bandas. Este proceso consiste en volver a someter el producto ya amplificado al termociclador (PCR)
con iguales caractersticas (master mix y programa de PCR), no obstante, los resultados no fueron
significativos.

Resultados finales

De un total de 24 muestras, de las cuales 5 fueron inutilizadas por la presencia de inhibidores, se

obtuvieron resultados positivos en 11
8 de las muestras que resultaron positivas, se purificaron y fueron secuenciadas. Las secuencias
obtenidas se introdujeron en la base de datos BLAST para alinearlas con las secuencias del S. mutans y
558
 APORTAClONES, METODOLOGAS Y DESARROLLO TECNOLGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS POCAS

de otros microorganismos depositados en esta base de datos, resultando secuencias homlogas slo con
el Streptococcus mutans en un 95%.

Discusin

El ADN acumula daos bioqumicos con el transcurso del tiempo y en consecuencia la molcula
se degrada, alterndose la secuencia y la informacin gentica (Lanteri y Contalonieri). Algunos autores
afirman que la asociacin ntima del ADN con molculas ms resistentes puede protegerlo de la
degradacin. Diversos anlisis confirman la capacidad del ADN para asociarse con superficies
minerales, y que esta unin puede conferirle una proteccin hasta 100 veces mayor contra las DNAsas.
Por lo tanto, el ADN no se perdera con la mineralizacin en el proceso de fosilizacin, sino que sera
absorbido en los minerales que reemplazan a las biomolculas. En concreto se ha propuesto (persson,
1992: 33-34; Tuross, 1993; Nielsen et al. 1994) que el ADN se preserva mejor en tejidos con alto contenido
de hidroxiapatita. El ADN presenta una gran afinidad por este compuesto (Sambrook et al. 1989) al que
podra unirse con gran rapidez, quedando protegido de las enzimas lticas. Esto podra explicar por qu
el ADN sobrevive mejor en los dientes (Gusta et al. 1994: 13) ya que el esmalte y la dentina presentan un
alto contenido de hidroxiapatita
En principio, el ADN'recuperado de dientes puede proceder tanto del propio individuo como de
aquellos agentes bacterianos que colonizan la cavidad bucal por lo que es posible "a priori" identificar
bacterias de la flora bucal como Streptococcus mutans. La identificacin molecular de microorganismos
est basada en diferentes estudios en los cuales se ha demostrado que es posible la recuperacin de
material gentico antiguo de organismos patgenos en suficiente calidad y cantidad utilizando primers
especficos y obteniendo productos de amplificacin de aproximadamente 100-200 pb que proporcionan
una alta sensibilidad tcnica para detectar aDNA (Perea et al. 2002; Zink et al. 2003: 359-367; Baron et al.
1996: 667-671; Zink et al. 2001: 355-356; Montiel et al. 2003: 413-414; Solrzano et al. 2003).
De todas las bacterias bucales, los estreptococos han sido los ms exhaustivamente estudiados.
Actualmente es indiscutible el rol de Streptococcus mutans en el inicio y avance de la caries dental
(Linossier et al. 1996: 1005-1014; Sato et al. 2003: 66-69; Lindhe 2001; Dragana et al. 14434-14439; Morisaki
et al. 2002: 223-227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348; 1996: 294-298; Redmo et al. 2003: 24-29).
Distintos estudios han demostrado la especificidad en la obtencin de ADN de Streptococcus mutans en
muestras actuales utilizando primers que amplifican fragmentos del gen de la dextranasa (Morisaki et al.
2002: 223-227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348; 1996: 294-298; Redmo et al. 2003: 24-29).
La molcula de dextranasa esta constituida por un pptido (Sp), una regin estable (CR) y dos
regiones variables (nVR y cVR). La regin estable es la responsable de la actividad enzimatica, y se
observa homologa de esta regin con el resto de Streptococci (S. dowenei, S. salivarius, S. sobrinus, etc)
(Igarashi et al. 2001: 341-348). En contraste, las regiones variables no presentan homologa, el tamao de
nVR y eVR es diferente entre las especies y no son funcionalmente importantes (Morisaki et al. 2002: 223-
227; Igarashi et al. 2002: 193-196; 2001: 341-348). As pues las diferencias en la constitucin de la
dextranasa permiten obtener un producto amplificado especfico de Streptococcus mutans, en estas
regiones.
La regin amplificada (344-467) no presenta homologas significativas con secuencias de ninguna
otra especie, segn anlisis con el programa BLAST 2.2.9 (Altschul et al. 1997: 3389-3402) en el GenBank.
En este gen, aparentemente no existen dominios conservados, segn anlisis con el programa RF
Finder del NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/ gorf.html). Sumado a esto, la alineacin
de las secuencias obtenidas a partir del producto amplificado con respecto al genoma de Streptococcus
mutans, utilizando la base de datos BLAST (Altschul et al. 1997: 3389-3402)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) presenta una homologa del 95%.
559
 ANLISIS DE ADN DE STREPTOCOCClIS MlITANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS

Estos resultados pueden considerarse vlidos teniendo en cuenta las condiciones experimentales
estrictas del laboratorio que permiten evitar riesgos y garantizar los resultados.
En primer lugar, se han tomado medidas de prevencin de contaminacin con ADN de
microorganismos modernos, de la inhibicin de la Taq polimerasa durante el proceso de PCR y de la
amplificacin de productos no especficos: esterilizacin extrema de todo el material, lavado de las
muestras con hipoclorito de sodio yagua antes de su manipulacin, y procesamiento paralelo de
numerosos blancos de control. Debe tenerse en cuenta adems que en el laboratorio de aADN de la UAB
jams se haba trabajado con Streptococcus mutans antes de esta experiencia.
En base a estos resultados estamos en condiciones de afirmar que el aislamiento de ADN de
Streptococcus mutans en restos antiguos es posible. Dado que no se ha manipulado jams informacin
gentica de este microorganismo en nuestro laboratorio, los resultados positivos obtenidos se deben a la
presencia de ADN en las muestras procesadas. Por otro lado, las modificaciones realizadas al protocolo
de extraccin del laboratorio de aDNA de la U.AB. con la finalidad de optimizar la recuperacin de
ADN de Streptococcus mutans mejoraron la calidad del producto amplificado.
Hasta la fecha no se ha encontrado en la literatura ninguna prueba que especifique la obtencin
de ADN de bacterias de la cavidad bucal en restos antiguos. Dado que el aislamiento de ADN de
Streptococcus mutans en estos restos es posible, se establece en el presente estudio experimental el primer
precedente del aislamiento de este microorganismo en restos antiguos.

BIBLIOGRAFA

ALTSCHUL, S., MADDEN, T., SCHFFER, A, ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. y LIPMAN, D.
(1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.
Nucleic Acids Research 25: 3389-3402.
BARON, H., HUMMEL, S. y HERRMANN, B. (1996): Mycobacterium tuberculosis. Complex DNA in
Ancient Human Bones. Joumal of Archaeological Science 23: 667-671.
CAMPILLO, D. (1993): Paleopatologa. Los primeros vestigios de la enfermedad. Barcelona.
CAPELU, C, TSCHENTSCHER, E, y PASCAU, Y.L (2003): "Ancient" protocols for the crime scene?
Similarities and differences between forensic genetics and ancient DNA analysis. Forensic Science
In tema tional 131: 59-64
CHIMENOS, E. y MARTNEZ PREZ-PREZ, A (1990): Antecedentes prehistricos de la enfermedad
periodontal. Avances en Periodoncia 2: 149-154.
CHIMENOS, E., y CALLEJAS, J. (1998): Perspectiva evolutiva del clculo dental. Anales de
Odontoestomatologa 1: 25-33.
COOPER, A y WAYNE, R (1998): News uses for old DNA Current Opinion in Biotechnology 9: 49-53.
DRAGANA, A, McSHAN, W., McLAUGHUN, R, GORANA, S., CHANG, J., CARSON, M.,
PRIMEAUX, Ch., TIAN, R, KENTON, S., JIA, H, UN, S., QIAN, Y., U, S., ZHU, H., NAJAR, F., LAI,
H., WHITE, J., ROE, B. Y FERRETTI, J. (2002): Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a
cariogenic dental pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (22): 14434-14439.
GUSTA, D. De, COOK, Ch. y SENSABAUGH, G. (1994): Dentin is a source of ancient DNA Ancient
DNA Newsletter 2(1): 13.
HANDT, O., KRINGS, M., WARD, RH. y PBO, S. (1996): The Retrieval of Ancient Human DNA
Sequences. American Joumal ofHuman Genetics 59: 368-376
IGARASHI T., MORISAKI, H., YAMAMOTO, A, y GOTO, N. (1996): Direct detection of Streptococcus
mutans in human dental plaque by polymerase chain reaction. Oral Microbiology and Immunology 11(5):
294-8.
560
 APORTACIONES, METODOLOGAS Y DESARROLLO TECNOLGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS POCAS

- (2001): Nucleotide Sequence and Molecular Characterization of a Dextranase Gene from

Streptococcus downei. Microbiology and Immunology 45 (5): 341-348.
- (2002): An essential amino acid residue for catalytic activity of the dextranase of Streptococcus mutans.
Oral Microbiology and Immunology 17: 193-196.
LINOSSIER, A, GAJARDO, M. y OLAVARRIA, J. (1996): Paleomicrobiological study in dental calculus:
Streptococcus mutans. Scanning Microscopy 10(4): 1005-1014.
LERMAN, S. (1942): Historia de la Odontologa. Buenos Aires: 29-36.
LANTERI, A Y CONFALONIERI, AV. <http://www.raulybarra.com/notijoya/archivosnotijoya3
/3amba c adn.htm>
LINDHE, J. (2001): Periodontologa clnica e implantologa odontolgica. Madrid.
MALGOSA, A, MONTIEL, R, DAZ, N., SOLORZANO, E., SMERLING, A, ISIDRO, A, GARCA, e y
SIMN, M. (2005): Ancient DNA: A modern look at the infections of the pasto Recent Research
Development in Microbiology. Kenala (e.p.)
MARTNEZ-LABARGA, e y RICKARDS, O. (1999): La utilizacin del DNA antiguo en la investigacin
de la historia evolutiva humana. Revista Espaola de Antropologa Biolgica 20: 195-213.
MONTIEL, R (2001): Estudio diacrnico de la Variabilidad del DNA Mitocondrial en Poblacin Catalana (Tesis
Doctoral indita). Univer~idad Autnoma de Barcelona.
MONTIEL, R, GARCA, e, CAADAS, M., ISIDRO, A, GUIJO J., MALGOSA, A (2003): DNA
sequences of Micobacterium laprae recovered from ancient bones. FEMS Microbiology Letters 266: 413-
414.
MORISAKI, H., IGARASHI, T, YAMAMOTO, A y GOTO, N. (2002): Analysis of dextran-binding
domain of the dextranase of Streptococcus mutans. Letters in Applied Microbiology 35: 223-227.
NAPIWOTZKI, J. y BECKER, A (1995): <http://www.chemie.uni-marburg.de/~becker/pdhome.html>
NIELSEN H., ENBERG J. Y THUESEN 1. (1944): DNA from Artic human burials. En B. Herrmann y S.
Hummel (eds.): Ancient DNA. Nueva York: 122-140.
PBO, S. (1989): Ancient DNA: Extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic
amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences 89: 1939-1943.
PBO, S., HIGUCHI R. y WILSON A (1989): Ancient DNA and the Polymerase Chain Reaction. The
Joumal of Biological Chemistry 264(17): 9709-9712.
PEREA, B., SNCHEZ, J.A y DOMNGUEZ, S. (2002): Antropologa y paleontologa dentarias. Madrid.
PERSSON P. A method to recover DNA from ancient bone. Ancient DNA Newsletter 1992,1(1): 33-34.
PUSCH e, KAYADEMIR T, PRANGENBERG K, CONARD, N., CZARNETZKI, A, y BLIN, N. (2002):
Documenting ancient DNA quality via alpha satellite amplification and assessment of clone sequence
diversity. Journal of Applied Genetics 43(3): 351-364.
REDMO EMANUELSSON, 1.M., CARLSSON, P., HAMBERG, K, BRATTHALL, D. (2003): Tracing
genotypes of mutans streptococci on tooth sites by random amplified polymorphic DNA (RAPD)
analysis. Oral Microbiology and Immunologtj 18: 24-29.
ROBERTS, Ch., Y MANCHESTER, K (2000): Arqueologa de la enfermedad. Madrid.
RODRGUEZ PREZ, J.e, RODRGUEZ ESPARRAGN, F., TORRES, M. Y HERNNDEZ PEREA O.
(2002): Genes y enfermedad renal. Generalidades. Genes candidatos. Nefrologa XXII (supl.1): 80-88.
SAMBROOK, J., FRITSCH, E. Y MANIATIS T (1989): Molecular cloning: a laboratory manual. NuevaYork
(2a ).
SATO, T, MATSUYAMA, J., KUMAGAI, T, MAYANAGI, G., YAMAURA, M., WASHIO, J. Y
TAKAHASHI, N. (2003): Nested PCR for detection of mutans streptococci in dental plaque. Letters in
Applied Microbiology 37: 66-69.

561
 ANLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS

SOLRZANO, E., DAZ, N., MONTIEL, R., CAADAS, M.P., ISIDRO, A Y MALCOSA A (2003):
Anlisis molecular de casos de treponematosis congnita en individuos neonatales del siglo XVI
(Huelva-Espaa). XIII Congreso de la Sociedad Espaola de Antropologa Biolgica. Oviedo.
TAYLOR, P. (1996): Reproducibility of Ancient DNA Sequences from Extinct Pleistocene Fauna.
Molecular Biology and Evolution 13(1): 283-285.
TUROSS, N. (1993): The other molecules in ancient bone: noncollagenous proteins and DNA En J.
Lambert y G. Crupe (eds.): Prehistoric human bone. Archaeology at the molecular level. Berln: 275-292.
ZINK, A, HAAS, CH., REISCHL, U, SZEIMIES, U, NERLICH, A. (2001): Molecular analysis of skeletal
tuberculosis in an ancient Egyptian population. Journal ofMedical Microbiology 50: 355-366.
ZINK, A, SOLA, CH., REISCHL, U, CRABNER, W., RASTOCI, N., WOLF, H., y NERLICH G. (2003):
Characterization of Micobacterium tuberculosis Complex DNAs from Egyptian Mummies by
Spoligotyping. Journal ofClinical Microbiology enero-2003: 359-367.

562
APORTACIONES, METODOLOGAS Y DESARROLLO TECNOLGICO. OTROS ESTUDIOS, OTRAS POCAS

Figura 1

Figura 2

Figura 3

563
 ANLISIS DE ADN DE STREPTOCOCCUS MUTANS RECUPERADO EN RESTOS HUMANOS ANTIGUOS

Figura 4

.
Figura 5

564