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Ciencias Biolgicas
ISSN: 0253-5688
editorial.cenic@cnic.edu.cu
Centro Nacional de Investigaciones Cientficas
Cuba
Prez Silva, Rosa Mara; Camacho Pozo, Miladis I.; Gmez Montes de Oca, Jos Manuel; balos
Rodrguez, Arelis; Vias, M.; Cantero Moreno, Domingo
Aislamiento y seleccin de una cepa bacteriana degradadora de hidrocarburos a partir de suelos
contaminados con petrleo
Revista CENIC. Ciencias Biolgicas, vol. 39, nm. 1, enero-abril, 2008, pp. 44-51
Centro Nacional de Investigaciones Cientficas
Ciudad de La Habana, Cuba
Rosa Mara Prez Silva, Miladis I. Camacho Pozo, Jos Manuel Gmez Montes de Oca,* Areli
balos Rodrguez, M. Vias** y Domingo Cantero Moreno.*
Centro de Estudios de Biotecnologa Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Santiago de Cub
Cdigo Postal 90500, Cuba. Correo electrnico: rmaria@cebi.uo.edu.cu *Departamento de Ingeniera Qumica, Tecnologa de lo
Alimentos, Tecnologa del Medio Ambiente, Universidad de Cdiz, Espaa Cdigo Postal 11510. Correo electrnico: josemanue
montesdeoca@uca.es. **Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Barcelona, Espaa.
RESUMEN. El conocimiento cientfico acerca del papel que desempean los microorganismos en el tratamiento de agentes co
minantes del medio ambiente como el petrleo, es esencial para prevenir y controlar los daos que puedan ocasionar los derra
o fugas de estos contaminantes. La degradacin de petrleo es un proceso que puede ocurrir de forma natural por los micr
ganismos nativos de las zonas contaminadas aprovechando sus rutas metablicas. Por esta razn, en estos momentos se pr
que los microorganismos pueden ofrecer esta posibilidad en tecnologas basadas en el uso de estos en la remediacin d
contaminacin ambiental por petrleo y sus derivados. En el presente trabajo, se estudi la biodegradacin de petrleo por ce
aisladas de suelos contaminados con petrleo, mediante un aislamiento realizado por enriquecimiento secuencial utili
do petrleo Mesa 30/Puerto escondido (80 : 20) como nica fuente de carbono y energa. Se aislaron 9 cepas bacterianas, c
Gram negativas y cuatro Gram positivas, que fueron identificadas segn el Manual Bergeys, 1994. Las pruebas bioqum
evaluadas confirmaron que las cepas aisladas AT14, AT15, AT16, AT17 y AT18 corresponden a Pseudomonas aeruginosa
este estudio, se seleccion la cepa Pseudomonas aeruginosa AT18, por mostrar mayor crecimiento sobre petrleo como
fuente de carbono y energa al obtenerse 1,83 g/L de biomasa celular, lo que representa un 57 % de biodegradacin de petr
ABSTRACT. The scientific understanding about the role microorganisms carry out in the treatment of polluting agents of
environment as to oil, are essential to prevent or to control the damages that can cause the spills or flights of these. The degr
tion of oil is a process that can happen in natural form by native microorganisms of contaminated zone whenever they have
appropriate metabolic routes. For that reason in this moment to improve that the microorganisms can offer these possibilitie
technologies based on the use in the remediation of the contamination are being developed. In the present work the biode
dation of petroleum by isolated strain of soil contaminated of petroleum was studied. The isolation was carried out by sequen
enrichment using as carbon and energy source petroleum crude Mesa 30/Puerto Escondido (80 : 20). Nine bacterial strains w
isolated, of which five were negative Gram and four positive Gram, which were identified by the Bergey`s Manual, 1
The biochemistry test confirmed that the isolated strains AT14, AT15, AT16, AT17 and AT18 belong to Pseudomonas aerugin
In this study the Pseudomonas aeruginosa AT18 was selected to show high growth in oil as one source of carbon and energ
obtain 1.83 g L -1 of cell biomass which represents 57 % of biodegradation of oil.
formar o hacer ambas cosas a estos contaminantes. ricos en petrleo, es una estrategia eficiente para evaluar la
Bsicamente la biorremediacin permite acelerar los adaptacin y supervivencia de cepas tolerantes a elevadas
procesos biodegradativos que de forma natural ocurren concentraciones de petrleo. Los resultados de estas prue-
en los ecosistemas contaminados. Las comunidades bas confirman la seleccin de las cepas ms tolerantes y
microbianas en ecosistemas contaminados tienden a ser adaptadas, dependiendo de estas el xito en las siguientes
dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar etapas de tratamiento tanto de suelos como de aguas con-
o de sobrevivir a compuestos txicos. Sin embargo, taminadas con petrleo.11
cuando las bacterias Gram negativas (Ej. Pseudomonas En la industria del petrleo, la presencia de compuestos
aeruginosa) dominan el sistema (como es frecuente en pesados constituye un problema tanto para la extraccin
el caso de ambientes contaminados con hidrocarburos), como para la transportacin y refinacin, siendo mayores los
el conocimiento derivado de los biomarcadores lipdicos daos al medio ambiente, lo que implica disminucin del
se limita al estado nutricional o fisiolgico de la comu- beneficio econmico reportado por los petrleos con estas
nidad bacteriana ms que a su diversidad. caractersticas.12 En este caso, se encuentra la mayora de los
El estudio de la diversidad microbiana y de la petrleos cubanos. Existen bacterias indgenas del petrleo
dinmica de sus poblaciones en consorcios biodegra- capaces de utilizarlo para su crecimiento y mantenimiento
dadores, esta creciendo notablemente en el rea de la conocidas como bacterias degradadoras de hidrocarburos
ecologa microbiana, lo cual ha permitido profundizar Dentro de ellas, se encuentran las del gnero Pseudomonas
en el conocimiento acerca de la composicin de las que se caracterizan por su versatilidad metablica. Su fun-
comunidades presentes en suelos contaminados, as cin es convertir sustratos habitualmente no degradables
como su evolucin durante los procesos de biodegra- en metabolitos fcilmente asimilables o que puedan ser
dacin, para determinar cules son los microorganis- atacados por enzimas codificadas cromosmicamente.
mos capaces de adaptarse y de explorar los hbitats Es por ello que el presente trabajo tuvo como objeti-
contaminados. Asimismo, teniendo en cuenta que el vos fundamentales aislar e identificar cepas bacterianas
metabolismo de sustratos orgnicos en sistemas natu- con capacidad para biodegradar fracciones de petrleo
rales se produce mediante interacciones metablicas y seleccionar la de mayor capacidad biodegradadora
complejas con la participacin de microorganismos como una alternativa para la solucin de los problemas
diferentes, es necesario estudiar las poblaciones mi- de contaminacin generados por este mineral en la in-
crobianas presentes en el suelo de la forma ms repre- dustria petrolera cubana.
sentativa posible. Sin embargo, la mayor parte de los
microorganismos presentes en muestras ambientales MATERIALES Y METODOS
no se pueden cultivar en medios de cultivo en el labo- Origen y toma de las muestras
ratorio (solamente un 0,1a un 0,01 % son cultivables) y Las muestras fueron tomadas de suelos contamina-
los que son cultivables pueden no ser representativos dos con petrleo en los alrededores del primer reservorio
de la poblacin presente en la muestra.3-6 del sistema de tratamiento de residuos en la Refinera
Se ha estudiado, mediante tcnicas moleculares la del Petrleo Hermanos Daz en Santiago de Cuba, las
estructura y composicin de comunidades microbianas cuales fueron conservadas en frascos mbar estriles y
asociadas a ambientes contaminados por crudos de procesados dentro de las 24 h de su colecta.
petrleo;7-10 el uso de estas tcnicas provee una apreciacin
clara de varias caractersticas importantes de las comu- Aislamiento y seleccin de cepas degradadoras de
nidades, especficamente la biomasa viable, la estructura petrleo
de la comunidad y el estado nutricional o la presencia de El aislamiento de cepas bacterianas degradadoras de
respuestas a estrs en bacterias Gram negativas. petrleo se llev a cabo por el mtodo de enriquecimiento
La seleccin de microorganismos a travs de pruebas secuencial, empleando como fuente de carbono y energa
sucesivas de crecimiento poblacional en cultivos puros crudo de petrleo Mesa 30/Puerto Escondido (Fig. 1).
5d 5d 5d 5d 5d
30 C 150 r/min 30 C 150 r/min 30 C 150 r/min 30 C 150 r/min 30 C 150 r/min
Aisalmiento
de colonias
Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 39, No. 1, 2008.
(0,1 mol L -1, pH = 7,2) sin llegar a tocar la muestra. Se la fuente de carbono insoluble para su degradacin.23
realizarn dos lavados de 10 min . Luego, se realiz la As, en la biodegradacin de hidrocarburos, se utilizan
fijacin con OsO4 1 % (disolucin estabilizadora de bacterias con elevada capacidad degradativa, entre
cacodilato 0,2 mol L-1 de OsO4 2 %) durante 1 h . Final- estas: Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alca-
mente, se realiz el secado con acetona (50, 70, 90 y ligenes, Nocardia, Vibrio, Micrococcus, Pseudomonas
100 %) durante 20 a 30 min . Se deshidrat y se sec por el aeruginosa, Bacillus, etc.24
mtodo del punto crtico, se recubri con una capa fina de Del enriquecimiento realizado, se aislaron 9 cepas
oro mediante el sistema de pulverizacin catdico (Jeol bacterianas, de las cuales cinco fueron Gram negati-
JFC-1100) y la observacin se realiz en un microscopio vas y cuatro Gram positivas. Se escogieron las cepas
electrnico FIE Quanta-200 marca Philips. de bacterias Gram negativas para el estudio en la
degradacin del petrleo Mesa 30/Puerto Escondido
Biodegradacin de petrleo por Pseudomonas aeru- las cuales presentaron morfologa bacilar y olor dul-
ginosa AT18 (CCEBI 1044) zn caracterstico del gnero Pseudomonas. A partir
La biodegradacin de petrleo por la cepa Pseudomonas de estos resultados, se procedi a la identificacin
aeruginosa AT18 (CCEBI 1044) se estudi en un perodo de utilizando diferentes ensayos clsicos presuntivos y
20 d (480 h) y se dio seguimiento cada 5 d (120 h) empleando confirmativos (Tabla 1).
como medio de cultivo el medio mineral descrito anterior- La aparicin del color rojo, indic la fermentacin
mente. Para ello, se inocularon en matraces erlenmeyers de la lactosa en el Agar McConkey por la bacteria, medio
estriles de 300 mL, 100 mL de medio mineral y un 2 % (v/v) de cultivo donde se favorece, adems, el crecimiento de
de una suspensin celular de Pseudomonas aeruginosa bacterias Gram negativas.
AT18 (DO600 nm 2) obtenido del pellet centrifugado (10 min, La permanencia de coloracin roja (bsico) en el me-
5 000 r min-1 ) en fase exponencial. El medio de cultivo fue dio Kliger, indic la no fermentacin de glucosa y lactosa
preparado a partir de disoluciones concentradas de cada y la ausencia de puntos negros en el medio indic la no
uno de sus componentes, esterilizadas durante 20 min produccin de gas (H2S).
a 120 C y 101 325 Pa (1 atm). Como fuente de carbono se Al observar diariamente los tubos hasta los catorce
utiliz 0,2 % (v/v) del crudo de petrleo Mesa 30/Puerto das, en la prueba O/F, el viraje de color azul verdoso a
escondido (80 : 20), procedente de la planta refinadora de amarillo, indica que el microorganismo ha producido
petrleo Hermanos Daz. El medio se ajust en todos acidez a partir del azcar, se consider como +/-, es
los casos a siete unidades de pH con NaOH 2 mol/L . decir, que el microorganismo acta sobre la glucosa
Los cultivos fueron incubados durante 480 h en un agitador de forma oxidativa (O) mientras que no presenta acti-
orbital a 150 r min-1 y 30 C . vidad fermentativa (F), lo que presume el aislamiento
de cepas de Pseudomonas sp. al poseer esta bacteria un
RESULTADOS Y DISCUSION metabolismo oxidativo.
Aislamiento e identificacin de las cepas aisladas La pigmentacin del medio del cultivo King A y B
Se conoce que las bacterias son el grupo microbiano indic la produccin de un pigmento siderforo de color
ms verstil en la biodegradacin de hidrocarburos; el azul (piocianina) y de un pigmento amarillo verdoso
96 % de las aisladas de medios lquidos (lagos, ros y (pioverdina). La capacidad para producir pigmentos
lagunas) presentan capacidad de crecer y emulsificar como pioverdina (fluorescena) y piocianina es una
hidrocarburos derivados del petrleo, 21 y el enrique- caracterstica importante para la identificacin de es-
cimiento del medio favorece esta actividad. Entre los pecies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran slo
gneros ms estudiados destacan bacterias del gnero fluorescena (ej. P. fluorescens) y otras ambos pigmentos
Pseudomonas y Bacillus. Estos gneros pueden crecer (ej. P. aeruginosa). La piocianina solamente es producida
en las interfases y producir exopolmeros para adherir- por Pseudomonas aeruginosa.
se. Algunas, tambin utilizan estructuras celulares su- El ensayo citocromo-oxidasa pone de manifiesto
perficiales especficas como los pili y las fimbrias.22 Otras la presencia de esta enzima con la aparicin de una
bacterias producen tensoactivos y bioemulsificantes coloracin prpura sobre la lnea de inoculacin. Pseu-
que disminuyen la tensin superficial entre el petrleo domonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo capaz
y el medio acuoso, facilitando el acceso microbiano a de producir esta enzima.
Tabla 2. Crecimiento de cepas de Pseudomonas aeruginosa sobre petrleo y sobre medio salino
con naftaleno durante 120 h de incubacin.
Cepa Crecimiento
ha descrito una gran variedad de gneros bacterianos En la primera etapa, se deben degradar las fracciones
degradadores de HAPs, que incluyen: Achromobacter, ms sencillas del crudo: n-alcanos y parafinas de cadenas
Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas, Agrobacte- cortas, las cuales se incorporan por oxidaciones sucesivas a
rium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinc- travs de la -oxidacin.36 Los hidrocarburos alifticos son
kia, Burkholderia, Comamonas,Corynebacterium, los que se degradan con la mayor rapidez, se oxidan sus mo-
Flavobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mo- lculas y se incrementa su solubilidad. La mayora de los
raxella, Mycobacterium, Neptunomonas, Nocardia, microorganismos convierten el n-alcano al correspondiente
Paenibacillus, Porphyrobacter, Pseudomonas, Rals- alcohol terminal por medio de mono-oxigenasas, la cual
tonia, Rhodococcus, Sphingomonas, Streptomyces, hidroliza el carbono terminal mayoritariamente mediante
Vibrio y Xanthomonas, segn la base de datos publi- la utilizacin del tomo de una molcula de oxgeno como
cada por la Universidad de Michigan, que rene cepas aceptor terminal de electrones.32 Esto explica que la velo-
degradadoras de molculas orgnicas. Es necesario cidad de crecimiento diuxico que presenta Pseudomonas
un buen conocimiento y control de la eliminacin de aeruginosa AT18 sobre petrleo (Fig. 3) puede deberse a
los HAPs en los ecosistemas terrestres y acuticos las caractersticas de este sustrato (mezcla compleja cre-
por los microorganismos para aplicarlo a tecnologas cimiento en esta primera fase sea 10 veces mayor que en
de biorremediacin. la segunda fase exponencial, en la cual presumiblemente
Como se observa en la tabla 2, las cepas AT14 y AT15 se degraden las fracciones ms pesadas (isoprenoides, al-
no crecen sobre naftaleno; mientras que las cepas AT16, canos de cadenas largas de ms de 20 tomos de carbono
AT17 y AT18 mostraron crecimiento positivo sobre la cicloalcanos y aromticos). Varios estudios reportan bio-
fuente de carbono. El halo de degradacin en la cepa degradacin de los hidrocarburos aromticos y n-alcanos
P. aeruginosa AT18 fue el de mayor dimetro ( > 1 cm), bajo condiciones aerbicas .37-39
el cual se debe a la ruptura del anillo y formacin de los De acuerdo con el comportamiento de los porcenta-
intermediarios de oxidacin. jes de biodegradacin de petrleo a las 120, 240, 360 y
Dado los resultados (Tabla 2), se seleccion la cepa 480 h de cultivo por la cepa Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa AT18 para el estudio de biodegra- AT18 (Fig. 3), se pudo constatar que se incrementa del
dacin de hidrocarburos, a la cual se le realiz el anlisis de 50 % a las 120 h al 57 % a las 480 h de cultivo, siendo
secuencias del gen que codifica para el 16S ARNr y anlisis el incremento pequeo, el cual disminuye a medida que
de los cidos grasos, cuyos resultados demostraron que la aumenta el tiempo de incubacin, resultado este que se
cepa aislada es 100 % Pseudomonas aeruginosa, con un corresponde con el consumo de petrleo (g L -1 ) en los
total de 1 482 pares de bases segn BLATSN.17 diferentes tiempos analizados (Tabla 3).
La mayor degradacin de petrleo tuvo lugar a las
Degradacin de petrleo por Pseudomonas aerugino- 120 h de incubacin (50 %), para finalmente, alcanzar una
sa AT18 (CCEBI 1044) actividad biodegradativa de (57 2,5) % a las 480 h de
La degradacin del crudo de petrleo por Pseudo- incubacin (Fig. 3). La disminucin de la cantidad pro-
monas aeruginosa AT18, se estudi durante 480 h de medio de petrleo por da puede deberse a la inhibicin
incubacin. Ella es capaz de crecer sobre petrleo como por toxicidad de la fuente de carbono, a la degradacin
nica fuente de carbono y energa (Fig. 3), con lo que incompleta y a compuestos txicos que se formen como
se alcanza 0,93 g L1 de biomasa celular a los 420 h de resultado de la degradacin del parental.38 Pseudomonas
cultivo. La figura 4 muestra un crecimiento diuxico, aeruginosa AT10 degrad en 20 d de incubacin solo el 50 %
caracterstico de la asimilacin de dos o ms fuentes de la fraccin aliftica del crudo ligero Casablanca.40
de carbono.35 La primera fase de crecimiento se inicia El perfil cromatogrfico de la muestra (b), mostr
entre las 24 y 36 h de incubacin hasta las 72 h, tiempo una marcada diferencia con el cromatograma control
en el que se alcanza 0,31 g L -1 de biomasa celular. En las [Fig. 4(a)] Pseudomonas aeruginosa AT18 degrad toda
36 h que dur esta primera fase, la velocidad especfica la fraccin aliftica de los alcanos e isoprenoides com-
de crecimiento () fue de 3,5 10-2 h-1. Finalmente, se prendida entre C8 y C40 [Fig. 4(b)]. La degradacin de
observa una segunda fase exponencial entre las 96 y los n-alcanos, ocurre aerbicamente por oxidaciones
480 h de incubacin con una de 2,4 10-3 h-1 y 0,95 g L -1 sucesivas de las molculas hasta la formacin de cido
de biomasa celular. carboxlico correspondiente, el cual es incorpora-
Se observ que a medida que aumenta el tiempo dis- do directamente en la -oxidacin. La va oxidativa ms
minuye la velocidad de crecimiento. Este hecho sugiere comn es la oxidacin terminal: alcano (C-C) alcohol
una mayor complejidad de las fracciones de petrleo (C-OH) --- aldehdo (C=O) --- cido carboxlico (COOH)
que comienzan a degradarse en las diferentes fases ---- oxidacin.41-42
de crecimiento.
CONCLUSIONES
tt (h)
(h)
0 100 200 300 400
Despus de haber analizado todas las muestras
100 200 300 400
75
75 1,2 recogidas de los suelos contaminados con petrleo de
(%)
0,9
Biodegradacin (%)
60
60
Crecimiento
0,9
Biodegradatcin
(Mcel/mL)
Crecimiento
45
45 Tabla 3. Consumo de petrleo por Pseudomonas aeru-
0,6
0,6
30
30 ginosa AT18.
15
15 0,3
0,3
00 00 Tiempo (h) g L1 g L1 d1
0 12
12 24
24 36
36 48
48 120 2,04 0,12 0,41 0,12
t (h) t (h)
Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 39, No. 1, 2008.
150
150 biodegradation of bioemulsifier from Corybacterium
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10 20
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30 40
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colonizar nichos y ambientes inhspitos en los que degrading Variovorax strain. Applied and Environme
son escasos los nutrimentos y que otros organismos no Microbiology, 69, 1532, 2003.
pueden asimilar. Las cepas aisladas fueron capaces de 22. Merino F. Estudio de microorganismos productore
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La 15. Escuela Internacional de Ciencia y Tecnologa de Materiales se llevar cabo en el Instituto de Ciencia y
Tecnologa de Materiales de la Universidad de la Habana, Cuba, del 7 al 18 de julio de 2008.
Este instituto fue creado en 1985 con el nombre de Instituto de Materiales y Reactivos, en estos 24 aos de creado
ha hecho una contribucin importante a la Ciencia de Materiales del pas, siendo sede del programa doctoral y de
maestra en dicha especialidad.
La Escuela en esta ocasin contar con los cursos siguientes:
1) Obtencin de metales.
Coordinador: Dr Guillermo Samalea.
Participacin del profesor Fathi Habashi, Canad.
2) Mediciones elctricas y magnticas de materiales electrocermicos.
Coordinador: Dr. Francisco Caldern. Se espera la participacin de profesores de la red internacional
de ferrolctricos.
3) Nuevas aplicaciones del procesado lser de materiales.
Coordinador: Dr. Luis Ponce. Con la participacin de profesores de Espaa y Mxico.
4) Procesos de corrosin en climas tropicales insulares.
Coordinador: Dr. Francisco Corvo. Se espera la participacin de profesores de Mxico.
5) Estimacin prctica de la incertidumbre en Qumica Analtica.
Coordinador: Dr. Manuel lvarez Prieto.
6) Miscelas: obtencin y caracterizacin qumica y estructural.
Coordinador: Prof. Louis Charles Menorval (Francia)
Comit Organizador
Dr. Carlos Rodrguez Castellanos
Dr. Ernesto Estvez Rams
Dr.Gerardo Rodrguez Fuentes
Dra. Beatriz Concepcin Rosabal
Sra. Lisette Navarrete Quesada