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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
LAB. DE PESQUISAS EM QUMICA INORGNICA E ANALTICA LPQIA

CARACTERIZAO E COMPORTAMENTO SACARIFICANTE DA FLORA

MICROBIANA EMPREGADA NA FABRICAO DA AGUARDENTE DE
MANDIOCA (TIQUIRA)

Mestrando: Diogo Marcelo Lima Ribeiro

Orientador: Prof Dr. Ccero W. B. Bezerra

So Lus - MA
2011
 ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

CARACTERIZAO E COMPORTAMENTO SACARIFICANTE DA FLORA

MICROBIANA EMPREGADA NA FABRICAO DA AGUARDENTE DE
MANDIOCA (TIQUIRA)

Dissertaco de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-Graduaco em Qumica da
Universidade Federal do Maranho como parte
dos requisitos exigidos para a obtenco do ttulo
de Mestre em Qumica Analtica.

Orientador: Prof Dr. Ccero W. B. Bezerra.

So Luis - MA
2011
 iii

Ribeiro, Diogo Marcelo Lima.

Caracterizao e comportamento sacarificante da flora microbiana empregada na

fabricao da aguardente de mandioca (tiquira)/ Diogo Marcelo Lima Ribeiro. So
Lus, 2011.

79 f.

Impresso por computador (fotocpia).

Orientador: Ccero W. B. Bezerra.

 iv

DIOGO MARCELO LIMA RIBEIRO

CARACTERIZAO E COMPORTAMENTO SACARIFICANTE DA FLORA

MICROBIANA EMPREGADA NA FABRICAO DA AGUARDENTE DE
MANDIOCA (TIQUIRA)

Aprovado em ___/___/____

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________
Profo. Dr. Ccero W. B. Bezerra
(Orientador)
Departamento de Qumica - UFMA

_________________________________________
Profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro
Departamento de Biologia - IFMA

________________________________________
Profo. Dr. Maurcio Boscolo
Departamento de Qumica e Cincias Ambientais UNESP-Rio Preto

So Lus - MA
2011
 v

AGRADECIMENTOS

A Deus e a Santa Maria por ter me proporcionado esse momento e iluminado meu
caminho sempre.

Aos meus pais Francisco Ribeiro e Carmem Ribeiro, agradeo o amor, os conselhos, o
incentivo, por sempre acreditarem em mim e por ter me tornado a pessoa que sou.

A minha esposa Luciana, a quem amo, pelo companheirismo, amor, compreenso e

grande ajuda para realizao deste trabalho.

As minhas filhas Luza e Marissa, por me mostrarem o sentido do amor e ser mais um
incentivo para o trmino deste trabalho.

A minha tia Zita (em memria) que sempre contribuiu para o meu crescimento.

Ao meu professor orientador Dr. Ccero W. B. Bezerra, pelo voto de confiana,

incentivo e conhecimento compartilhado durante a realizao deste trabalho.

A minha co-orientadora professora Dra. Cristina de Andrade Monteiro, pela orientao,

por ter percebido que a pesquisa far parte da minha vida e por ter compartilhado seu
vasto conhecimento na rea.

Aos amigos Marinaldo, Patrcia, Jorge, Tmara, Dilana, Ana Cla, Aquiles pelo
incentivo e auxlio durante a realizao dos experimentos.

Aos colegas de curso Thas, Sergiane, Sinara, walria, Shalcher, Erickson pelos
momentos de estudo e descontrao.

Aos alunos de graduao Edmar e David pelo apoio durante a realizao deste projeto.

s professoras Tnia, Larissa, Mariah pela grande ajuda e disposio em me ajudar.

s minhas queridas irms Pollyanna e Ana Paula e sobrinha Gabriela pelo apoio e
contribuio neste trabalho.

A todos que direta ou indiretamente contriburam para o desenvolvimento dessa

pesquisa.
 vi

A melhor maneira que o homem

dispe para se aperfeioar
aproximar-se de Deus.

Pitgoras
 vii

RESUMO

A Tiquira uma bebida alcolica destilada e preparada a partir da sacarificao e

posterior fermentao da mandioca. Os processos de sacarificao e fermentao so
realizados por micro-organismos que se desenvolvem naturalmente nos beijus expostos
ao meio ambiente. O crescimento desses micro-organismos ocorre por um perodo
aproximado de 8 dias e, como so diversas as linhagens coletadas, o rendimento do
processo bem como a qualidade do destilado ficam comprometidos. O objetivo deste
trabalho , portanto, o de contribuir para a obteno de uma maior qualidade da
aguardente de mandioca (Tiquira) produzida no estado do Maranho atravs da
identificao e seleo dos melhores micro-organismos sacarificantes e fermentativos
empregados no processo artesanal. As cepas selecionadas foram submetidas a estudos,
onde identificamos a presena de fungos filamentosos, bactrias e uma levedura. Foram
identificadas 3 (trs) espcies de fungos filamentosos: Aspergillus niger, Aspergillus
flavus e Rhizopus oryzae, os quais foram testados perante o seu poder de esporulao
em diferentes meios de cultura a 30oC, tendo o meio SDA (Saboroud Dextrose gar)
fornecido a melhor composio para o obteno do crescimento dos fungos mais
rapidamente. As amostras de R. oryzae, A. niger, A. flavus e a mistura destes esporos,
que previamente mostraram ser melhores produtoras enzimticas foram selecionadas
para testes de sacarificao do amido para avaliar e confirmar a capacidade de
converso glicose. A cepa R. oryzae alcanou um valor de converso de 78,02% em
mdia utilizando-se uma temperatura padro de 30oC, quantidade de esporos 5,5 x 107,
pH 5 e 50g/l de amido solvel, obtendo o maior rendimento de sacarificao, seguida
pelo A. flavus 71,55% , A. niger 57,17% e mistura dos esporos 48,02%. Portanto,
evidencia-se que a utilizao de micro-organismos filamentosos autctones torna-se
uma opo para uso em sacarificao de amostras amilceas.

Palavras-chave: Amido; Sacarificao; Fungos Filamentosos; Tiquira.

 viii

ABSTRACT

The Tiquira is a distilled alcoholic beverage prepared from the saccharification and
subsequent fermentation of cassava. The processes of saccharification and fermentation
are performed by micro-organisms that grow naturally in beijus exposed to the
environment. The growth of these micro-organisms occurs over a period of
approximately 8 days and as many strains are collected, the process yield and the
quality of distillate are compromised. The objective is therefore to improve the quality
of spirit cassava (Tiquira) produced in the state of Maranho through the identification
and selection of the best micro-organisms and fermentation and saccarifiying employed
in artisanal process. The selected strains were subjected to studies, which identified the
presence of filamentous fungi, bacteria and yeast. We identified three (3) species of
filamentous fungi: Aspergillus niger, Aspergillus flavus and Rhizopus oryzae, which
were tested before their power of sporulation in different culture media at 30oC, and the
SDA medium provided the best composition for obtaining the fungal growth more
quickly. Samples of R.oryzae, A.niger and A.flavus previously shown to be the best
producers were selected for testing enzymatic saccharification of starch to evaluate and
confirm the ability of conversion to glucose. The strain R. oryzae reached a conversion
value of 78.02% on average using a standard temperature of 30oC, amount of 5.5 x 107
spores, pH 5 and 50g/l of soluble starch, giving a greater yield of saccharification,
followed by A.flavus 71.55%, A.niger 57.17% and mixture of spores 48,02%.
Therefore, it is evident that the use of filamentous micro-organisms native becomes an
option for use in starch saccharification samples.

Keywords: Starch; Saccharification; filamentous fungi; tiquira.

 ix

SUMRIO

LISTA DE TABELAS... ............................................................................................................x

LISTA DE FIGURAS... ............................................................................................................xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ........................................................................xii
RESUMO............................. .....................................................................................................vi
ABSTRACT....................... ......................................................................................................vii
CAPTULO 1 INTRODUO ...........................................................................................14
CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA ......................................................................18
2.1 Matria-prima.............. .......................................................................................................18
2.1.1 Mandioca...... ........... .......................................................................................................18
2.1.2 Beiju da mandioca ...........................................................................................................19
2.1.3 Amido............................................................. .................................................................20
2.1.3.1 Gelatinizao do amido ................................................................................................21
2.1.3.2 Estrutura do amido .......................................................................................................22
2.1.3.3 Principais enzimas que agem sobre o amido ................................................................23
2.2 Processamento da tiquira ....................................................................................................25
2.2.1 Agentes da fermentao...................................................................................................26
2.2.1.1 Fungos................ ..........................................................................................................26
2.2.1.2 Leveduras alcolicas ....................................................................................................27
2.2.1.3 Leveduras selvagens . ...................................................................................................29
2.2.1.4 A espcie Sachromyces cerevisiae....... ........................................................................29
2.2.1.5 Fungos filamentosos .....................................................................................................30
2.2.1.5.1 Fungos do gnero Aspergillus ...................................................................................31
2.2.1.5.2 Fungos do gnero Rhizopus.......................................................................................32
2.2.2 Fatores que influenciam no cresimento ...........................................................................33
2.3 Hidrlise enzimtica (Sacarificao)..................................................................................34
2.4 Fermentao (em andamento)............ ................................................................................35
2.5 Destilao............... ............................................................................................................37
CAPTULO 3 MATERIAIS E MTODOS.............................................................................40
3.1 Coleta..................................................................................................................................40
3.2 Isolamento dos micro-organismos......................................................................................40
3.3 Identificao dos micro-organismos...................................................................................41
3.4 Microcultivo............ ...........................................................................................................42
3.5 Conservao das cepas. ......................................................................................................43
3.6 Preparo das solues de esporos de A. niger e A.flavus .....................................................44
3.7 Preparo das solues de esporos Rhizopus. ........................................................................45
3.8 Contagem de esporos de Aspergillus e Rhizopus ...............................................................45
3.9 Sacarificao.......................................................................................................................47
3.11 Anlise do substrato fermentado. .....................................................................................48
3.11.1 Sacarificao..................................................................................................................48
3.11.2 Determinao de glicose...............................................................................................49
3.11.2.1 Curva analtica padro de glicose...............................................................................51
3.12 Rendimento do processo de sacarificao ........................................................................52
CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................................54
 x

4.1 Isolamento e identificao dos Micro-organismos.............................................................54

4.2 Sacarificao.......................................................................................................................57
4.3 Rendimento do processo de sacarificao............... ...........................................................62
CAPTULO 5 CONCLUSES ................................................................................................65
6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS.................................................................66
CAPTULO 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................68
ANEXO 1..................... ............................................................................................................76
ANEXO 2......................... ........................................................................................................77
ANEXO 3........................... ......................................................................................................78
 xi

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Quantidade de glicose (g/l) produzida atravs do processo de 60

sacarificao do amido pelas espcies A.niger, A. flavus, R. oryzae e pela
mistura dos esporos pr selecionadas por sacarificao.

TABELA 2: Rendimento do processo de Sacarificao de uma suspenso de amido 62

50g/l, aps, 192h com uma concentrao de esporos 5,5 x 107 a 30oC.

TABELA 3: Rendimento do processo de Sacarificao encontrado por autores que 64

utilizaram o amido como matria-prima.
 xii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Beiju de Mandioca aps 8 dias de incubao apresentado grandes 20

quantidades de micro-organismos.

FIGURA 2: Estrutura qumica da molcula de Amilose (a) e Amilopectina (b) 23

FIGURA 3: Ao das Enzimas Amilolticas 24

FIGURA 4: Converso estequiomtrica da glicose a etanol e dixido de carbono 37

FIGURA 5: Etapas da diluio seriada do beiju de mandioca para posterior 41

semeadura em placas de Petri m diferentes meios de cultura
FIGURA 6: Preparo da tcnica adaptada de microcultivo 42

FIGURA 7: Placas de microcultivo aps quatro dias de incubao a 30oC 43

FIGURA 8: Lminas prontas para visualizao ao microscpio ptico 43

FIGURA 9: Ilustrao de tubo de ensaio contendo meio SDA inclinado para 44

repicagem das espcies
FIGURA10: Contagem de esporos em cmera de Neubauer 46

FIGURA11: Fluxograma do processo de isolamento e identificao dos micro- 47

organismos encontrados no beiju de mandioca.
FIGURA12: Sacarificao em frasco (balo) 48

FIGURA13: Anlise do substrato 49

FIGURA14: Teste Somogyi-Nelson para anlise de glicose produzida 51

FIGURA15: Curva Analtica Padro de Glicose 52

FIGURA16: Crescimento das cepas de A.niger, Rhizopus oryzae e A. flavus por 48h 54
em diferentes meios de cultura, a) SDA, b)PDA e c)Ex.Malte a 30oC.
FIGURA17: Imagem do fungo Aspergillus niger obtida por microcultivo em SDA 55
visto ao microscpio ptico (aumento 40X)
FIGURA18: Imagem do fungo Rhizpus oryzae obtida por microultivo em SDA visto 56
ao microscpio ptico (aumento 10x a e 40x b)
FIGURA19: Imagem do fungo Aspergillus Flavus obtida por microcultivo em SDA 56
visto ao microscpio ptico (aumento 40X)
FIGURA20: Resultado da identificao de levedura, sendo o laudo positivo para a 57
espcie Saccharomyces cerevisiae
FIGURA21: Resultados da cintica de sacarificao do amido por um perodo de 61
72h
 xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

o
GL Grau Gay-Lussac
G Gramas
Ml Mililitro
Mg Miligrama
L Litro
V Volume
Alfa
Beta
PET Politereftalato de etileno

SDA Saboroud Dextrose Agar

PDA Potato Dextrose Agar (gar Batata Dextrose)

Ex. Extrato
pH Potencial Hidrogeninico
o
C Graus Celsius
S. Saccharomyces
A. Aspergillus
Spp. Espcie
Sp. Espcies
Rpm Rotao por minuto
H Horas

HUPD Hospital Universitrio Presidente Dutra

R. Rhizopus

OMS Organizao Mundial de Sade

l Microlitro

ART Acares Redutores Totais

 13

Captulo 1
Introduo
 14

1 INTRODUO

A constante busca por fontes renovveis para a produo de energia,

paralela produo e crescente monopolizao da produo do petrleo, tem levado
procura de matrias-primas mais baratas. Um exemplo de alternativa o uso da
mandioca na produo de lcool com a contnua hidrolizao do amido, seja atravs da
aplicao de enzimas comerciais, seja pela cultura de fungo selvagem.
No Brasil, o Maranho o principal produtor da tiquira, com fabricao
concentrada nas cidades de Barreirinhas, Santa Quitria e Humberto de Campos. A
produo da bebida artesanal e sua comercializao se faz no mercado informal, no
havendo dados estatsticos de produo e nenhum registro de produtor no Ministrio da
Agricultura. (VENTURINI FILHO; MENDES, 2003).
De acordo com o Decreto n 2314 de 1997, que regula a padronizao e a
fiscalizao da produo de bebidas no Brasil, a tiquira conceituada como uma bebida
com graduao alcolica de 36 a 540 GL, obtida do destilado alcolico de mandioca
(sacarificado).
Segundo a legislao, a tiquira pode conter at 30g de acar/L. Quando a
quantidade de acar adicionado for superior a 6g/L, a denominao deve ser seguida da
palavra adoada. O coeficiente de congneres (impurezas volteis no etanol) no pode
ser inferior a 200 e nem superior a 650 mg por 100mL de lcool anidro (VENTURINI
FILHO; MENDES, 2003).
A produo de lcool a partir de mandioca, de acordo com Santana (2007),
apresenta algumas dificuldades tcnicas e econmicas. A necessidade de hidrlise do
amido gera elevao dos custos aliada baixa produtividade agrcola, no tornando esse
processo vivel economicamente. Diante disso, o estudo de melhorias no processo
tecnolgico de produo e melhorias agronmicas da cultura so pontos cruciais para
utilizao dessa cultura como fonte de carboidratos para produo de etanol.
Como a mandioca rica em amido, anterior a etapa da fermentao deve
acontecer o processo de sacarificao. Tanto esta, quanto a fermentao so etapas que
acontecem com a participao de micro-organismos. Entretanto, diferentemente da
cachaa, cuja produo usa uma nica espcie (Saccharomyces cerevisiae), na produo
da tiquira, diversas so as linhagens presentes. Como toda produo artesanal, as
cepas so colhidas ao acaso, sobre beijus preparados da massa de
 15

mandioca, e ambientados em atmosfera mida, colocados em local

sombreado, mas suficientemente quente para permitir o crescimento de bolores, cujos
esporos so naturais daquela regio.
No incio, os bolores crescem apenas superficialmente e, depois de alguns
dias o miclio penetra no interior do beiju, hidrolisando o amido atravs da atividade de
enzimas amilolticas exgenas (VENTURINI FILHO; MENDES, 2003). A
sacarificao ocasionada por estes micro-organismos geralmente se d por um perodo
de oito dias. Aps esse tempo, os beijus so cortados e imersos em gua, permanecendo
por mais oito dias at a destilao do vinho.
A importncia destes micro-organismos no processo no pode ser
negligenciada. As diversas linhagens selvagens empregadas nas distintas, mas
concomitantes etapas de sacarificao e fermentao, nem sempre permitem um balano
uniforme dos componentes minoritrios. Com tantos micro-organismos assim, e por um
perodo de oito dias, processos paralelos so esperados, diminuindo o rendimento da
converso e a qualidade do produto.
Assim, o emprego de diversas linhagens inviabiliza a tentativa de controle
da composio dos componentes minoritrios e, por conseguinte, da padronizao da
bebida. Alm do mais, o tempo e o rendimento da produo, parmetros indispensveis
para o controle do processo, perdem o sentindo na prtica.
Segundo Veturini Filho (2005, p.526):

Os amerndios preparavam diversas bebidas a partir de diferentes matrias-

primas, incluindo frutas e amilceos como milho e mandioca. A maioria das
referncias sobre as bebidas, fermentadas ou no, base de mandioca, tm a
regio amaznica como origem, tendo sido a Tiquira descrita como preparada
por ndios do Par e Amazonas.

Para Venturini Filho (2005), a causa desta bebida estar desaparecendo do

Estado do Maranho, o seu processo artesanal, tornando-a sem condies de competir
com os baixos preos da aguardente de cana que vem do sudeste.
O autor coloca ainda que:

A transformao de amido de mandioca em acares (liquefao e

sacarificao) feita por bolores autctones que surgem sobre os beijus. A
fermentao alcolica tambm feita por leveduras selvagens. Esse tipo de
produo tradicional demorado e de baixo rendimento. Para alterar esse
padro, o processo dever ser modernizado, sem alterar as caractersticas da
bebida e sem se tornar complicado demais, com tecnologia adequada as
comunidades rurais (VETURINI FILHO, 2005, p. 526).
 16

Entre as bebidas derivadas da mandioca, apenas a tiquira possui legislao

especfica. Assim como outras aguardentes, a tiquira uma bebida calrica,
principalmente em razo de seu teor alcolico. A graduao alcolica mnima
especificada pelo Ministrio da Agricultura e do Abastecimento (MINISTRIO DA
AGRICULTURA, 2004) de 38% Volume. Entretanto, essa graduao dificilmente
aferida, em razo do nvel artesanal de sua fabricao e da comercializao dispersa.
Assim, como objetivo do presente estudo se faz conveniente a contribuio
para o estabelecimento de um processo ideal de produo da tiquira, atravs da anlise
de sacarificao, para que se possa estabelecer as condies timas de trabalho e
imprimir qualidade ao destilado.
Dentro desse contexto, o objetivo geral do trabalho consiste em contribuir
para a obteno de uma maior qualidade da aguardente de mandioca (Tiquira) produzida
no estado do Maranho atravs da identificao e seleo dos melhores micro-
organismos sacarificantes e fermentativos empregados no processo artesanal e os
objetivos especficos so:

Caracterizar a flora microbiana presente no beiju de mandioca;

Quantificar a atividade sacarificante das espcies isoladas;

Propor um meio eficiente para o crescimento das linhagens;

Acompanhar o processo de Sacarificao enzimtica para verificar

qual fungo filamentoso apresenta maior rendimento;
 17

Captulo 2
Reviso de Literatura
 18

2 REVISO DE LITERATURA

2.1 MATRIA-PRIMA

2.1.1 Mandioca

A Manihot esculenta cranz, bastante conhecida como mandioca, uma raiz

com alto teor de amido bastante cultivada em regies tropicais. originada no Brasil,
especificamente na regio amaznica e se constitui em alimento energtico para mais de
500 milhes de pessoas no mundo, sobretudo em pases em desenvolvimento onde
cultivada por pequenos produtores e com baixa produtividade. Em rea cultivada, a
mandioca ocupa o stimo lugar no mundo (CHIST, 2006).
De acordo com Prado (2002) o Brasil o segundo maior produtor mundial
de mandioca, tambm conhecida como macaxeira, aipim ou castelinha. Esta raiz
cultivada em todos os estados brasileiros, situando-se entre os nove primeiros
produtores agrcolas do pas, em termo de rea cultivada, e o sexto em valor de
produo.
Segundo Santana (2007), a mandioca uma raiz tuberosa da famlia
Euphorbiaceae, rica em amido e muito consumida na dieta brasileira. uma cultura que
pode ser encontrada tanto em terras de alta fertilidade, como o caso do sul do pas,
como no semi-rido, em algumas regies do Nordeste.
Uma parte da produo destinada obteno de farinha ou usada
diretamente no consumo alimentar e o restante destinado industrializao, que
consiste basicamente na extrao de amido. O Brasil ocupa a segunda posio na
produo mundial de mandioca, participando com 12,5% do total. A mandioca
cultivada em todas as regies do pas, assumindo destacada importncia na alimentao
humana e animal, alm de ser utilizada como matria-prima em vrios produtos
industriais (SPIER, 2005).
 19

Devido a sua grande quantidade de carboidratos, a mandioca se apresenta

com grande potencial para a gerao de etanol. Chegou-se a implantar algumas usinas
de lcool de mandioca no Brasil em perodos de grande dificuldade energtica, como
nas dcadas de 1930 e 1970. Enquanto a produo de lcool de cana de acar era
aperfeioada em diversos aspectos tecnolgicos e econmicos, a produo de lcool de
mandioca era abandonada, sem maiores investimentos e estudos (SANTANA, 2007).
Em relao fcula de mandioca, conforme citado por Coelho (2002), ela
considerada o amido de razes e tubrculos, sendo obtida a partir da mandioca lavada,
descascada e ralada para extrao. O bagao e o leite da fcula so separados, sendo o
bagao usado em rao animal e o leite purificado por decantao. A fcula ento
embalada aps a secagem.
A legislao brasileira uma das poucas a distinguir a fcula do amido.
Nestas normas, considera-se o amido a frao extrada da parte area das plantas e a
fcula a frao amilcea extrada das razes, tubrculos e rizomas (AQUARONE et al.,
2001).
Segundo Venturini Filho e Mendes (2003, p.531):

A mandioca se destaca como excelente opo para a fermentao alcolica

por apresentar alto teor de amido, tradio de cultivo em considervel rea do
Brasil, inclusive com capacidade de expanso em solos menos frteis.

2.1.2 Beiju da Mandioca

A matria prima para a produo do beiju a raiz de mandioca ralada e

moda. Embora no tenha sido localizada a composio especfica de massa ralada e
prensada de mandioca usada para fabricao de tiquira, pode-se considerar a
composio como semelhante de outras cultivares de mandioca. Alm da massa ralada
e prensada de razes de mandioca, apenas gua adicionada no momento de diluir os
beijus e preparar o mosto (VENTURINI FILHO, 2005).
No preparo das bebidas base de mandioca, a raiz de mandioca, descascada,
ralada e prensada, usada para fazer os beijus que, depois de cozidos, apresentam o
amido gelificado. A gelificao do amido facilita a ao das enzimas e deve ser
realizada, tanto no processo tradicional como na proposta de um processamento mais
 20

moderno. As enzimas que hidrolisam a fcula (amido) da mandioca e as leveduras que

fermentam esses acares a etanol so de origem autctone.
O beiju uma placa ou cartucho que se consegue com a massa de mandioca
ralada e aquecida sobre uma chapa quente (Figura 1). Em seguida, so dispostos em
prateleiras forradas com palha de banana ou babau onde permanecero at o
desenvolvimento de fungos.

FIGURA 1: Beiju de Mandioca aps 8 dias de incubao apresentado grandes

quantidades de micro-organismos.

2.1.3 Amido

O amido o produto final do processo fotossinttico e constitui reserva de

carbono nas plantas. Sua formao ocorre devido atividade combinatria de algumas
enzimas, tanto nas organelas fotossinteticamente ativas, onde o amido reserva
temporria, quanto nos amiloplastos de rgos de reserva (MENEZES , 1980).
Segundo Bobbio e Bobbio (2003), o amido constitui a mais importante
reserva de nutrio de todas as plantas superiores ocorrendo principalmente em
sementes, tubrculos, rizomas e bulbos. Ocorre tambm em algas e, pelo fato de ser
facilmente hidrolisado e digerido, um dos elementos mais importantes da alimentao
humana.
O amido a substncia que proporciona de 70 a 80% das calorias
consumidas pelos seres humanos. As mais importantes fontes potenciais do amido so
 21

os gros de cereais (40 a 90% do seu peso seco), legumes (30 a 70% do seu peso seco) e
os tubrculos (65 a 85% do seu peso seco). O amido, na natureza, encontrado como
grnulos ou gros. Estes so relativamente densos ou insolveis e se hidratam
deficientemente em gua fria (FENNEMA, 2000).
Para Magro (2005), as matrias amilceas e feculentas so fermentadas aps
uma hidrlise, denominada sacarificao, atravs da qual o amido infermentescvel
transformado em acares fermentescveis.
Conforme Nigam e Singh (1995), o amido pode ser facilmente hidrolisado
usando enzimas amilolticas, sendo que essas enzimas podem ser facilmente produzidas
por micro-organismos.
O amido de mandioca tem algumas vantagens em comparao a outros tipos
de amidos como, por exemplo, a facilidade de hidrlise (AYERNOR et al., 2002).

2.1.3.1 Gelatinizao do amido

O fenmeno de gelatinizao ou gelificao do amido extremamente

importante para vrios alimentos. Grnulos de amido nativo so insolveis em gua
abaixo de sua temperatura de gelificao. Eles expandem um pouco em gua fria (10-
20%), devido difuso e absoro de gua dentro das regies amorfas, entretanto, esta
expanso reversvel pela secagem (BILIADERIS, 1991).
De acordo com Morrison (1995), nas zonas amorfas os componentes que
expandem so amilose e um pouco de amilopectina. Essa expanso limitada por ser
severamente restringida pelas camadas essencialmente contnuas de amilopectina
cristalina. Este autor considera que esse grau de expanso seja reversvel porque as
camadas cristalinas no so perturbadas.
Na presena de gua e calor os grnulos de amido expandem-se embebendo
gua. Com o aquecimento, a temperatura de gelatinizao atingida e uma pasta
formada.
Leonel et al. (2002) avaliando as propriedades da pasta de amido de batata e
mandioca, avaliadas pelo rpido visco mostraram temperatura de pasta de (64,80C e
66,70C) respectivamente.
 22

2.1.3.2 Estrutura do Amido

O amido constitudo por uma mistura de dois polissacardeos

denominados amilose e amilopectina, em propores que variam entre os amidos
procedentes de diferentes espcies vegetais e, mesmo entre amidos provenientes da
mesma espcie, as propores de amilose e de amilopectina variam de acordo com o
grau de maturao das plantas. As propores de amilose e amilopectina influem na
viscosidade e no poder de gelificao do amido (BOBBIO; BOBBIO, 2003).
Continuando a descrio sobre a estrutura do amido, Lehninger (1999)
destaca que o amido possui dois tipos de polmeros da glicose, a amilose e a
amilopectina. O primeiro consiste em cadeias longas, que acreditava-se serem no
ramificadas de unidades de D-glicose unidas por ligaes -1,4. Tais cadeias variam em
peso molecular de uns poucos milhares at 500.000. A amilopectina tambm tem peso
molecular alto (at 1 milho), porm altamente ramificada. As ligaes glicosdicas
unindo os resduos de glicose nas cadeias de amilopectina so -1,4, mais os pontos de
ramificao, que ocorrem entre cada 24 e 30 resduos, so ligaes -1,6.
Conn e Stumpf (1975) relatam que a amilose, um dos componentes do
amido e fcula, formada por unidades de D-glicose unidas linearmente por ligaes -
1,4, possuindo uma extremidade redutora e uma no-redutora.
A amilopectina um polissacardeo ramificado, na sua molcula, cadeias
mais curtas de glicose unidas por ligaes -1,4 so unidas tambm entre si por ligaes
-1,6.
A amilose apresenta a propriedade de absorver at 25 vezes seu peso em
gua. A amilopectina, de cada 20 a 30 molculas de glicose ocorre um ponto de
ramificao. Essa caracterstica a torna menos suscetvel ao de algumas enzimas do
que a amilose, o que um fator importante para explicar a ao das enzimas sobre o
amido e sua aplicao em processos industriais (CEREDA, 2001).
O amido um hidratado de carbono, composto por carbono, hidrognio e
oxignio na proporo de 6:10:5 de forma geral (C6H10O5). As unidades de glicose
esto ligadas entre si pelo C1 e C4 atravs de oxignio, formando uma ligao glicdica
(WHISTER; DANIEL, 1984).
 23

FIGURA 2: Estrutura qumica da molcula de Amilose (a) e Amilopectina (b).

2.1.3.3 Principais enzimas que agem sobre o amido

Segundo Rosas (2003), as enzimas so substncias orgnicas especficas

compostas por polmeros de aminocidos, que atuam como catalisadores no
metabolismo dos seres vivos.
As enzimas so denominadas de acordo com o substrato sobre o qual atuam,
portanto, o termo amilase indica a ao sobre o amido (amilo), que contm dois tipos de
polissacardeos: a amilose (15-20%) e a amilopectina (80-85%) (HARGER et al.,
1982).
Aquarone et al. (2001) destacam que as enzimas podem ser obtidas de
fontes animais (pancreatina, pepsina, renina, catalase), de fontes vegetais (papana,
bromelina, ficina, amilases do malte) ou a partir de micro-organismos.
Para Reed (1975), as enzimas responsveis pela degradao do amido esto
amplamente distribudas na natureza. Entre elas esto as amilases, que atuam sobre o
amido, glicognio e polissacardeos para hidrolisar as ligaes -1,4.
As amilases podem ser divididas em trs grupos: as -amilases, as quais
rompem as ligaes no interior do substrato (endoamilases); as -amilases, que
hidrolisam unidades das extremidades no redutoras do substrato (exoamilases); e as
 24

glucoamilases (amiloglucosidase), as quais liberam unidades de glicose do terminal

no-redutor das molculas do substrato.
Segundo Conn e Stumpf (1975), a -amilase hidrolisa a cadeia linear da
amilose, atacando ao acaso as ligaes -1,4 por toda a cadeia, produzindo uma mistura
de maltose e glicose. A -amilase, ataca a extremidade no-redutora da amilose,
resultando em sucessivas unidades de maltose.
A amilopectina tambm pode ser atacada por -amilase e -amilase, mas as
ligaes -1,4 prximas das ramificaes da amilopectina, e as ligaes -1,6 no so
hidrolisadas por essas enzimas. Portanto, um ncleo condensado e ramificado, obtido da
amilopectina original - denominado dextrina limite - o produto dessas enzimas. Outra
enzima, a -1,6 glicosidase ir hidrolisar a amilopectina at uma mistura de glicose e
maltose (CONN; STUMPF, 1975).
De acordo com Fujii et al. (1988), citados por Leonel e Cabello (2003), a
amiloglucosidase uma enzima sacarificante utilizada para produzir glicose a partir do
amido, hidrolisando ligaes tipo -1,4 e -1,6. A ao da amiloglucosidase lenta no
ataque inicial amilose, pois sendo uma exoenzima, s atua a partir da extremidade
no-redutora e no penetra no interior da estrutura helicoidal da amilose.
A Figura 3 apresenta a ao das enzimas amilolticas sobre uma molcula de
amido.

FIGURA 3: Ao das Enzimas Amilolticas

FONTE: SPIER (2005)
 25

A amiloglicosidase , em sua maior parte, produzida por espcies de fungos

do gnero Aspergillus e Rhizopus, sendo que dentre essas, a amiloglucosidase de
Aspergillus mais termoestvel. A amiloglicosidase catalisa eficientemente a hidrlise
do amido dentro de uma faixa estreita de temperatura (SANTOS, 2006).

2.2 Processamento da Tiquira

Segundo Venturini Filho (2005), so necessrias 3 (trs) etapas principais

para produo de lcool a partir do amido: a gelificao do amido com a posterior
sacarificao a acares, a fermentao alcolica e a destilao. A sacarificao feita
por bolores e a fermentao por leveduras, ambas da flora autctone.

Pesagem das razes: tem objetivo de calcular o pagamento e de controlar o

rendimento da produo.

Descascamento e lavagem das razes: tem por objetivo a retirada da casca

marrom apenas, pois a entrecasca possui amido que pode ser convertido em
acares e lcool. Sendo feito mo.

Ralao: fragmenta a raz, expe o amido e facilita a retirada do excesso de

umidade na prensagem.

Prensagem: tem por finalidade a remoo do excesso de umidade. Retira parte

da gua de constituio da raiz e facilita a confeco dos beijus.

Gelificao do amido: a gelificao permite que a enzima tenha acesso ao

amido para transform-lo em acares. A gelificao deve ser feita
temperatura acima de 70oC. Com a gelificao, o grnulo perde a Cristalinidade,
sua estrutura se abre, as cadeias em espiral se esticam e a viscosidade aumenta.

Sacarificao: na sacarificao, as ligaes do amido so rompidas. Quanto

mais completo esse rompimento, maior o rendimento em acares. Na
converso, h aumento do rendimento, pois a reao incorpora uma molcula de
gua por ligao rompida.
 26

Preparo do mosto: o preparo do mosto feito simplesmente por diluio dos

acares com gua, sem complementaes.

Fermentao: ocorre por leveduras autctones.

Destilao: feita em alambiques de cermica ou cobre. Pode ser usado um

alcometro para estabelecer o teor alcolico final e o final do processo de
destilao.

Engarrafamento: feito em garrafas de vidro em geral de cor clara. Podem ser

usadas garrafas de refrigerante vazias, tipo PET.

2.2.1 Agentes da Fermentao

2.2.1.1 Fungos

Pelczar (1998) define os fungos como sendo organismos eucariticos no-

fotossintticos, possuindo parede celular, com algumas excees. Eles obtm seu
alimento por absoro e no possuem clorofila. Enquanto muitos fungos so
unicelulares, alguns so multicelulares e macroscpicos.
De acordo com Teixeira et al. (1999) os fungos em relao nutrio,
acumulam glicognio como substncias de reserva e tm forma de vida diversificada
indo desde saprobiontes, comensal, simbiontes e parasitas.
Os fungos formam esporos, que so dispersos por corrente de ar. Todos se
caracterizam pela nutrio atravs da absoro e, com exceo das leveduras (que so
geralmente unicelulares), a maioria produz um miclio bem desenvolvido constitudo de
hifas septadas ou cenocticas. As clulas mveis no so encontradas em fungos
terrestres.
Compreendendo tanto os bolores quanto as leveduras segundo Roitman et
al. (1988), os fungos so micro-organismos de alta importncia na conservao dos
alimentos. Considerando-se inicialmente apenas as leveduras, cabe lembrar que a
ocorrncia de espcies patognicas em alimentos praticamente desconhecida, sua
 27

importncia residindo muito mais no fato de serem eventuais agentes de deteriorao

em alimentos nos quais apresentam condies timas de desenvolvimento.
interessante observar que, dependendo do tipo de alimento e suas caractersticas bsicas,
uma mesma espcie de levedura pode ser considerada benfica e essencial ao processo
tecnolgico, ao passo que, em outro produto, ela pode se constituir em agente de
deteriorao.
De acordo com o mesmo autor, a visualizao do crescimento de bolores
devida ao desenvolvimento do miclio fngico, constitudo de um aglomerado
intrincado de hifas, com aspecto varivel, de seco e pulverulento a mido e gelatinoso,
compacto ou pouco denso, com aparncia cotonosa. O miclio usualmente incolor,
embora em algumas espcies haja produo de pigmentos, conferindo-lhe uma
tonalidade vermelha, amarela, castanha, cinza ou preta.
Em muitos bolores, as diferentes coloraes das colnias so decorrentes da
macia produo de esporos assexuais, como os condios e esporangisporos,
resultando em coloraes verde, verde-azulada, laranja, castanha, cinza ou preta;
particularmente nos gneros Penicillum, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, essas coloraes
so caractersticas e auxiliares na identificao de gneros e espcies.

2.2.1.2 Leveduras Alcolicas

Conforme Hammond (1995), com o progresso da tecnologia de bebidas, as

linhagens de levedura foram sendo selecionadas segundo caractersticas desejveis ao
processo e ao produto. A produtividade e a eficincia de fermentao, a tolerncia ao
etanol e temperatura, a resistncia s altas concentraes de acares, a habilidade de
flocular e de produzir ou no certos componentes do aroma das bebidas e a propriedade
de produzir metablitos anti-contaminantes (carter Killer) so constantes fontes de
interesse.
No se usa mais qualquer levedura para produzir o lcool industrial ou uma
bebida fermentada; no apenas esto excludos os tipos selvagens, mas tambm
necessrio utilizar uma cepa apropriada.
Venturini Filho e Mendes (2003) definem as leveduras como sendo fungos
pertencentes s classes dos Ascomicetos, Basidiomicetos ou Deuteromicetos. Ao
 28

contrrio dos bolores, os autores afirmam que as leveduras so normalmente

unicelulares, apresentando clulas de forma oval, elptica ou arredondada. Possuem
parede celular rgida, membrana citoplasmtica e as organelas normalmente encontradas
nas clulas superiores, tais como ncleo, mitocndria, retculo endoplasmtico, etc.
De acordo com os mesmos autores, as leveduras multiplicam-se por via
sexual e assexual. A via assexual de multiplicao a mais utilizada pelas leveduras nos
processos industriais de fermentao. As leveduras dependem, para o seu
desenvolvimento e sobrevivncia, de carbono orgnico, principalmente na forma de
carboidratos. Quanto ao ambiente, as leveduras se desenvolvem numa ampla faixa de
temperatura, sendo que o intervalo timo de crescimento situa-se entre 20-30oC. Em
relao variao de pH, os limites esto entre 2,2 - 8,0. Esses micro-organismos
apresentam tambm elevada resistncia osmtica.
As leveduras so micro-organismos saprfitas que exigem uma fonte de
carbono elaborada glicose ou outro acar que fornece a energia qumica e o
esqueleto carbnico de suas estruturas celulares, constitudas predominantemente de
carbono, oxignio e hidrognio (AQUARONE et al., 2001).
Embora as leveduras possam diferir bastante em suas caractersticas
fisiolgicas, aquelas de importncia em alimentos tm grandes caractersticas em
comum. De modo geral, as leveduras requerem menos umidade que a maioria das
bactrias e mais umidade que a maioria dos bolores. As leveduras multiplicam-se
melhor quando esto em aerobiose, mas os tipos fermentativos multiplicam-se bem
tambm em anaerobiose. Acares so as melhores fontes de energia, embora leveduras
oxidativas sejam capazes de oxidar cidos e orgnicos a lcool (FRANCO;
LANDGRAF, 2005; NOVAES et al.,1974; LIMA et al., 1975).
A levedura utilizada no processo deve apresentar determinadas
caractersticas que garantam o rendimento fermentativo. A massa de clulas para se
iniciar a fermentao denomina-se p-de-cuba, p-de-fermentao, levedo alcolico ou
fermento, e dever estar ativa e em quantidade adequada, para que o processo ocorra de
modo satisfatrio.

2.2.1.3 Leveduras Selvagens

 29

Para Venturini Filho; Mendes (2003), leveduras selvagens so aquelas que

so estranhas ao processo de fermentao alcolica, podendo ser da mesma espcie ou
no em relao levedura de processo. Sua presena no processo fermentativo
resultado de contaminao. Essas leveduras causam queda no rendimento e na
produtividade da fermentao, bem como na qualidade do produto final.

2.2.1.4 A Espcie Saccharomyces cerevisiae

Segundo Lodder (1970), a Saccharomyces cerevisiae largamente

disseminada na natureza, porm, esta espcie mais frequentemente associada com
fermentaes industriais, em particular as fermentaes para produo de bebidas
alcolicas e etanol carburante. A espcie tambm empregada na produo de levedura
de panificao.
Em funo de sua grande disponibilidade na forma de levedura prensada,
essas leveduras so extensivamente empregadas como fonte de obteno de uma grande
variedade de enzimas. utilizado, tambm, como material bsico para a maioria dos
estudos fundamentais sobre gentica de leveduras.
As clulas da Saccharomyces cerevisiae possuem geralmente formato
elipside, sendo que o maior dimetro das clulas varia entre 5 e 10 m e o menor
dimetro varia entre 1 a 7 m. A mdia dos volumes celulares de 29 ou 55 m3 para as
clulas haplides e diplides, respectivamente, e o tamanho celular aumenta de acordo
com a maturao da clula (FELDMANN, 2005).
As colnias de S. cerevisiae so de colorao branca ou creme, de aspecto
cremoso, possuem reproduo vegetativa por brotamento e podem possuir pseudo-hifas
simples, apresentam ascos persistentes contendo quatro ou mais ascsporos, redondos
ou ovais (BARNETT et al., 2000).
As leveduras do gnero Saccharomyces, que tradicionalmente so utilizadas
na produo de etanol, no possuem habilidade de hidrolisar amido (LIU et al.,2004).
Guedes et al. (1994), relatam que a S. cerevisiae tem rpido crescimento
celular, alta tolerncia a etanol e uma eficiente produo de etanol, constituda por
48% de protenas de qualidade e tem sido associada por sculos produo de bebidas e
alimentos.
 30

2.2.1.5 Fungos Filamentosos

Os fungos filamentosos microscpios so predominantemente

pluricelulares, apresentam miclio areo, possuem reproduo sexuada e/ou assexuada.
Sua estrutura morfolgica fundamental a hifa, que pode ser uni ou multinucleada,
septada ou conoctica, sendo que o seu conjunto constitui o que denominamos de
miclio. Seus esporos ou condios, estruturas reprodutivas de origem sexuada ou
assexuada respectivamente, so oriundos da especializao de seu miclio em rgos ou
sistemas reprodutivos podendo ser endgeno ou exgeno (LACAZ, 1992).
Conhecidos vulgarmente como bolores ou mofos, os fungos filamentosos
elaboram numerosos metablitos, alguns de grande interesse industrial, tais como:
enzimas, alcois, cidos, pigmentos corantes, polissacardeos, esteris, substncias
antibiticas (penicilina, notatina, flavicina) e algumas bastantes complexas como a
ergotinina (CARVALHO, 1999).
Segundo Neder (1992), os fungos se reproduzem por meio de esporos. Em
condies favorveis, o esporo absorve gua, aumenta de tamanho e germina emitindo
um tubo germinal, que se alonga por crescimento da extremidade distal e se tornam
filamentosos longos que se ramificam. Cada filamento chamado de hifa.
Ao continuar o crescimento, a hifa pode ser dividida em uma cadeia de
clulas pela formao de paredes transversais ou septos. Esses septos dividem as hifas e
clulas unicelulares e multicelulares. As hifas que so divididas por septos so
chamadas de septadas.
Alguns fungos, entretanto, no desenvolvem paredes celulares, formando as
hifas no-septadas. Em tais hifas o protoplasma corre livremente atravs dos filamentos
e, neste caso, so chamadas cenocticas.
Continuando o crescimento, as hifas podem se ramificar diversas vezes e se
entrelaar, formando uma estrutura chamada miclio. A parte do miclio que penetra no
substrato, digerindo-o e absorvendo-o, conhecida como miclio vegetativo; a parte
que responsvel pela produo de esporo e usualmente se estende para o ar chamado
miclio reprodutivo.
 31

O miclio reprodutivo e seus esporos variam grandemente nas diferentes

espcies de fungos e servem para classific-los e identific-los. Como resultado do
crescimento, uma colnia filamentosa formada. O tipo de miclio encontrado na
colnia filamentosa de grande importncia para distinguir a classe de fungo (NEDER,
1992).
A estrutura produtora de esporo chamada esporforo. Quando a
extremidade terminal do esporforo forma um saco, esse chamado esporngio e o
esporforo de esporangiforo. Os esporos contidos em tais estruturas so denominados
esporangisporos. Quando estes esto maduros, o esporngio se rompe pela presso
interna ou desenvolvido por enzimas secretadas, e ento os esporangisporos so
libertados (NEDER,1992).
Quando os esporos no esto contidos dentro de membranas, isto , nascem
livres, o esporforo chamado conidiforo. O esporo recebe o nome de condio. Os
condios variam bastante em tamanho, forma, cor, nmero de septos, bem como as
clulas dos conidiforos que os originam.

2.2.1.5.1 Fungos do gnero Aspergillus

O Aspergillus niger, como sugere seu nome, um fungo filamentoso negro

comumente denominado como mofo negro (WAINWRIGHT, 1995). De acordo com
Prado (2002) o A. niger apresenta como caractersticas particulares colnias brancas a
amarelo plido, mais rapidamente forma milhares de esporos. Os condios so esfricos,
medem de 3 a 5 m e tornam-se rugosos ao atingir a maturao. O A. niger apresenta
hifas finas, septadas e conidiforos com vesculas recobertas por condios negros.
Este grupo de fungos filamentosos com um grande nmero de espcies
possui caractersticas que os fazem micro-organismos ideais para aplicaes industriais
como: boa capacidade de fermentao e altos nveis de secreo de enzimas
(JAAFARU, 2007).
Kaaij (2007) relata que algumas espcies de Aspergillus, tais como,
Aspergillus fumigatus e Aspergillus flavus so patgenos oportunistas para homens e
animais. A maioria das infeces sistmicas em humanos encontrada em pacientes
 32

imunodeprimidos. Outras espcies, como o A. niger, so bem conhecidas por sua

utilizao na produo de alimentos e na biotecnologia moderna.
Segundo o mesmo autor, o A. niger um fungo comum do solo, observado
como um bolor negro em frutas e outros alimentos. Embora esta espcie seja geralmente
no patognica, inalao de grande quantidade de esporos pode levar a doena
pulmonar (aspergilose). Ingesto oral de A. niger foi considerada como inofensiva pela
OMS (Organizao Mundial de Sade), o qual abriu a oportunidade para sua utilizao
na produo industrial de cidos, produtos farmacuticos e de enzimas.
O uso do A. niger apresenta algumas vantagens em relao a outros fungos,
como facilidade de manipulao, sua habilidade de fermentar uma grande variedade de
matrias-primas de baixo custo e produzir rendimentos elevados de bioprodutos.

2.2.1.5.2 Fungos do gnero Rhizopus

O prefixo rhizo relacionado s razes, o sufixo pus deve-se aos

rizides da base dos esporangisporos ou das hifas que so caractersticos de algumas
espcies desse gnero.
O fungo do gnero Rhizopus pertence ao filo Eumycophyta. Fungos
pertencentes a este gnero so considerados fungos verdadeiros. O corpo desses fungos
formado por numerosos filamentos denominados hifas, formando um emaranhado que
se chama miclio. O Rhizopus spp. pertence ao grupo dos ficomicetos, desenolvem-se
sobre matria orgnica mida, constituindo o bolor com colorao preta. Apresentam
miclio ramificado e desorganizado (USA, 2004).
Segundo Carta (1999), estes fungos esto espalhados pelo solo,
especialmente em terrenos turfosos ou midos, no estrume, na poeira do ar, em
alimentos e nos utenslios em condies higinicas precrias.
De acordo com o mesmo autor, a reproduo efetua-se por germinao de
esporos. Os esporos maduros so liberados dos aparelhos esporferos e disseminados.
Um esporo germina e libera um filamento ou hifa que cresce, para dar um novo miclio.
Seus esporos so de natureza assexuada.
 33

2.2.2 Fatores que influenciam no crescimento dos fungos

Os fungos apresentam grande capacidade de colonizao e explorao de

substratos orgnicos vivos em decomposio. Essa capacidade diferenciada de
explorao dos substratos est intimamente relacionada com as caractersticas
ambientais e fsicas a que o fungo exposto, bem como s exigncias nutricionais
inerentes de cada espcie fngica, fundamentais para o seu desenvolvimento (SIDRIM;
MOREIRA, 1999).
Os fungos necessitam de condies mnimas necessrias para o seu
crescimento. Essas condies so os fatores nutricionais e os fatores fsicos.
Na produo de amilases por fungos e bactrias, o efeito da fonte de
carbono na induo e represso da enzima muito importante como fonte de regulao
da biossntese. Amido e substncias amilceas tm sido descritos como os substratos
mais adequados para a alta produtividade de amilases (CHERRY et al., 2004; SAXENA
et al., 2007).
Para produo de biomassa de determinado produto de interesse industrial
ou para pesquisa, deve-se exercer um cuidadoso controle nas condies que permitam o
desenvolvimento mximo do micro-organismo.
Para o seu desenvolvimento e sobrevivncia de acordo com Venturini Filho
e Mendes (2003), as leveduras necessitam de carbono, principalmente na forma de
carboidratos e estes nas formas de monossacardeos ou dissacardeos.
O nitrognio utilizado pelo fungo na sntese de cidos nuclicos, algumas
vitaminas, aminocidos, protenas e enzimas, sendo considerado como macroelemento
de fundamental importncia para o seu metabolismo. Naturalmente, o nitrognio
encontrado no solo na forma de nitrato ou amnio, sendo ambos absorvidos pelo fungo
no momento em que so requeridos nos processos metablicos. Porm, quando o fungo
cultivado em laboratrio, se o meio e cultura in natura no fornecer uma quantidade
necessria desse nutriente, uma suplementao deve ser realizada. As fontes de
 34

nitrognio podem ser inorgnicas na forma de sais de nitritos, nitratos ou amnio, ou

orgnicas na forma de uria, aminocidos ou extrato de levedura. A utilizao destes
compostos depende do tipo de micro-organismo utilizado (PUTZKE; PUTZKE, 2004).

2.3 Hidrlise Enzimtica (Sacarificao)

A necessidade de sacarificar os amilceos, segundo Surmely et al. (2003),

decorre do fato de que os agentes de fermentao no possuem enzimas amilolticas.
Na concepo do mesmo autor, a sacarificao o processo de
transformao do amido ou fcula infermentescvel em acares fermentescveis.
Realiza-se por via qumica ou biolgica. A sacarificao biolgica se faz por ao
enzimtica do malte ou pela ao dos micro-organismos de certos fungos.
Alm do amido, as enzimas so os agentes mais importantes nas reaes de
hidrlise. Aquelas usadas no processo de hidrlise chamadas enzimas amilolticas so
compostos de natureza protica que atuam como catalisadores biolgicos em todas as
reaes metablicas energeticamente possveis e aceleram essas reaes por ativao
especfica (CHAPLIN; BUCKE, 1990).
Atribui-se a Bechner, no sculo 17, a afirmao de que somente os lquidos
aucarados so capazes de entrar em fermentao alcolica. Ao contrrio do que
pensavam alguns pesquisadores que o antecederam, para Bechner o lcool se formava
durante o processo de fermentao, julgando erradamente, no entanto, a necessidade de
ar para causar o fenmeno que ele considerava semelhante combusto (ROITMAM, et
al., 1988).
Carioca e Arora (1984) destacam que a hidrlise do amido pode ser
realizada pelas vias qumicas ou enzimticas, sendo o processo enzimtico o mais
vantajoso. Por esta razo, diferentes micro-organismos com propriedades amilolticas
tm sido estudados. A hidrlise microbiana pode ser feita usando fungos com
propriedades amilolticas.
Embora a hidrlise cida de biomassa seja eficiente e relativamente barata
gera resduos poluentes e produtos que inibem a fermentao posterior. Por isso, a
sacarificao enzimtica tem sido objetivo da maior parte dos estudos. O processo
enzimtico oferece potencial de reduo de custos em longo prazo, pois possvel se
 35

atingir rendimentos prximos dos estequiomtricos e em condies menos crticas de

temperaturas, presso e agressividade qumica, alm do processo ser menos poluente.
No entanto, no estgio do desenvolvimento atual, o processo ainda economicamente
invivel o que justifica o interesse pelo estudo das variveis que afetam o processo
(RABELO, 2007).
Os produtos de converso enzimtica do amido vo da glicose a dextrinas
de peso molecular elevado. A matria-prima para obteno dos hidrolisados o amido,
polissacardeo constitudo de cadeias retas e ramificadas onde cada molcula formada
de vrias centenas de unidades de glicose, ligadas entre si (SURMELY et al., 2003).
A hidrlise do amido pode ser realizada atravs do uso de enzimas, tais
como a -amilase e a amiloglicosidase (AMG). A primeira atua no interior da cadeia de
amido, quebrando-a em oligossacardeos de menor peso molecular. A amiloglicosidase,
por sua vez, atua nos extremos da molcula, liberando unidades sucessivas de glicose
(TROVATI; GIORDANO).
A excreo de enzimas amilolticas, traz como vantagem a reduo de custo,
permitindo que as etapas de sacarificao (hidrlise do amido em glicose) e fermentao
sejam realizadas concomitantemente, melhorando a eficincia de converso do amido
(TUBB, 1986).

2.4 Fermentao

A fermentao uma ferramenta muita utilizada nos processos industriais e

apresenta importncia crescente em diversos setores da economia. Muitas empresas por
todo o mundo fabricam produtos obtidos atravs de processos fermentativos, tais como:
cidos orgnicos, aminocidos, vitaminas, biopolmeros, solventes, enzimas, bebidas
alcolicas, alimentos, entre outros (BORZANI et al., 2001)
A fermentao alcolica o processo bioqumico, que ocorre no citoplasma
da levedura alcolica, responsvel pela transformao de acar em lcool etlico. Esse
processo bioqumico realizado por mais de uma dezena de enzimas, e pode ser
considerada como a oxidao anaerbica parcial, da glicose, por ao de leveduras, com
a produo final de lcool etlico e anidrido carbnico, alm de outros produtos
 36

secundrios. um processo de grande importncia, no qual so obtidos todos os alcois

industriais e todas as bebidas alcolicas, destiladas e no destiladas e, como produto
secundrio, o gs carbnico. ainda utilizado na produo de leveduras de panificao
e na obteno de leveduras prensadas.
Alves (2000) descreve que a fermentao pode ser definida como todos os
processos no qual micro-organismos capitalizam a converso de uma dada substncia
num determinado produto com aplicao direta de leveduras em meios naturais ou
sintticos.
A via fermentativa a maneira mais importante para a produo de lcool
etlico no Brasil. Mesmo que se venha a ter disponibilidade de derivados de petrleo
que permitam a produo de lcool de sntese, a via fermentativa ainda ser de grande
importncia para a produo de lcool potvel, sob a forma de aguardentes
(AQUARONE et al., 2001).
Os primeiros estudos envolvendo o mecanismo da fermentao alcolica
relacionavam-se apenas formao dos produtos inicial e final. Entretanto, o primeiro a
efetuar um estudo quantitativo da fermentao alcolica foi provavelmente Lavoisier,
em 1789, seguido de Gay Lussac, que formulou a equao que julgava representar o
fenmeno qumico da fermentao alcolica. Obteve, a partir de 45 partes de glicose, 23
partes de lcool e 22 partes de CO2 (gs carbnico). Coube a Pasteur, a partir de 1857, a
explicao clara sobre a natureza da fermentao alcolica, atribuindo-se a seres vivos,
as leveduras, como agentes causais (ROITMAN et al., 1988).
Louis Pasteur mostrou que a fermentao diretamente provocada pelo
processo vital de pequeninos organismos. possvel controlar os processos de
fermentao numa forma cientfica exata pelo entendimento da atividade dos micro-
organismos e pelo reconhecimento de que diversas leveduras, por exemplo, atuam
diferentemente e de que as condies do meio afetam de maneira bsica a ao de uma
mesma cepa (SHREVE; BRINK JR., 2008).
Os mesmos autores relatam que o emprego de micro-organismos para
converter uma substncia em outra uma cincia assiduamente estudada e aplicada de
maneira enrgica. Embora a fermentao de frutos at lcool seja conhecida de culturas
primitivas e a fabricao de diversas bebidas de frutos e de cereais seja bem conhecida
h vrios sculos, somente a gerao passada veio reconhecer a ampla aplicao deste
procedimento. Atualmente os cientistas esto dirigindo os processos vitais dos
fermentos, das bactrias e dos fungos para a produo de substncias qumicas.
 37

Na fermentao alcolica de acares, por ao de leveduras, os principais

produtos obtidos em propores equimolares so o etanol e o dixido de carbono
(Figura 4). Esse mecanismo foi quantificado pela primeira vez por Gay-Lussac, onde
100Kg de glicose rendem 51,1Kg de etanol e 48,9Kg de dixido de carbono. O
rendimento terico de 51,1% em massa conhecido como coeficiente de Gay-Lussac e
o dado bsico na eficincia de converso (JACKMAN, 1991).

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

MM = 180g/mol MM= 92g/mol MM= 88g/mol

FIGURA 4: Converso estequiomtrica da glicose a etanol e dixido de carbono.

De acordo com Assncio (2002) as reaes realizadas pelos micro-

organismos vivos so, na sua grande maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a
velocidade das mesmas compatveis com as exigncias metablicas. As leveduras
produzem as invertases que catalisam a hidrlise da sacarose at glicose e frutose,
resultando em mistura equimolecular destes acares que so absorvidos pelas clulas.
Roitman et al. (1998) relatam que para o bom desempenho de uma
fermentao, deve-se estar atento aos fatores que podem influenciar o rendimento, o que
se inicia, desde o preparo do inculo, para que a fermentao se desenvolva como o
mnimo de risco e com a cultura-me mais homognea possvel, at a etapa final de
recuperao do produto.

2.5 Destilao

Segundo Venturini Filho e Mendes (2003, p.548):

A destilao um processo de separao de componentes de uma mistura que

est baseado na volatilidade de cada um desses componentes, numa dada
temperatura e presso. Na destilao, a mistura aquecida at a ebulio,
sendo que os vapores so resfriados at sua condensao. Se a mistura bem
heterognea, composta por dois lquidos imiscveis, o destilado ser
constitudo pelo lquido mais voltil.
 38

De acordo com o mesmo autor, no processo e fabricao de lcool a partir

da mandioca, o lquido a ser destilado o mosto fermentado ou vinho. Esta mistura
composta por componentes que coexistem na fase gasosa, lquida e slida. O principal
componente gasoso o CO2 formado na fermentao alcolica do mosto. A fase
lquida, mais importante em termos quantitativos, constituda por gua (88-93%),
etanol (7-12%) e outros constituintes secundrios, representados quimicamente por
aldedos, cidos orgnicos, steres, alcois superiores, glicerol, furfural, etc; na fase
slida encontram-se os slidos insolveis, constitudos por clulas de leveduras e
bactrias, bagacilho, etc. e os slidos insolveis ou extrato de vinho, representados
pelos sais minerais, acares no fermentados, acares infermentescveis, dentre
outros.
De acordo com Faria et al. (2003), a destilao para obteno de aguardente
deve ser fracionada em trs partes distintas para retirada de compostos indesejveis:

Cabea: a primeira frao destilada e contm a maior proporo de compostos
mais volteis, devendo ser separada do produto final;

Corao: a segunda frao. Trata-se da aguardente como tal;

Cauda: a ltima frao e, contm como a cabea, elementos menos volteis e
compostos indesejveis, devendo ser separada do produto final.
Lopes (1987) destaca que quimicamente o lcool etlico hidratado no
apresenta diferena quanto s matrias-primas utilizadas como cana-de-acar, cereais,
mandioca e batata-doce. As diferenas esto restritas s impurezas que acompanham o
lcool, que so caractersticas de cada matria-prima e o grau de purificao pelo qual
passou o produto.
 39

Captulo 3
Materiais e Mtodos
 40

3 MATERIAIS E MTODOS

Os experimentos deste trabalho foram realizados no laboratrio de

Micologia (Ncleo de Doenas Endmicas e Parasitrias) localizado no UNICEUMA e
nas instalaes do programa de ps-graduao em Qumica Analtica, LPQIA
(Laboratrio de Pesquisa em Qumica Inorgnica Aplicada) da Universidade Federal do
Maranho.

3.1 Coleta

As amostras de beijus mofados foram adquiridas diretamente de alambiques

do interior do Estado, Humberto de Campos e Boiada (Povoado prximo de
Barreirinhas), identificadas, ambientadas (em sacos plsticos) e conduzidas at o
Laboratrio de Micologia (Ncleo de Doenas endmicas e parasitrias), UNICEUMA.

3.2 Isolamento dos micro-organismos

Foram retirados pedaos dos beijus (vrios pedaos do beiju tentando-se

obter uma mxima uniformidade, sendo selecionado tambm por coloraes diferentes)
e triturados para posterior pesagem. Em seguida, 1g da farinha foi dissolvida em 150 ml
de gua destilada em um Erlenmeyer. A suspenso foi deixada em agitao constante
por 15 minutos, num agitador magntico. A seguir, procedeu-se 5 diluies, (10-1, 10-2,
10-3, 10-4, 10-5 ) em tubos de ensaio previamente estreis (121oC por 15 minutos em
autoclave) contendo gua destilada (Figura 5).
Retirou-se 300l das diluies e semeou-se em placas de Petri contendo
diferentes meios de cultura: Potato Dextrose gar (PDA), Saboroud Dextrose gar
 41

(SDA) e Extrato Malte solidificado e estril (121oC por 15 minutos em autoclave) e

posteriormente incubadas temperatura de 30oC por 3-4 dias, para se obter o melhor
crescimento.
Os fungos crescidos foram isolados em tubos de ensaio contendo 10ml de
meio SDA. Aps o crescimento das colnias, esporos das mesmas foram utilizados para
a realizao da tcnica de microcultivo para identificao dos gneros e espcies
filamentosas (LACAZ et al., 2002; BARNETT; HUNTER, 1972).

FIGURA 5: Etapas da diluio seriada do beiju de mandioca para posterior

semeadura em placas de Petri em diferentes meios de cultura.

3.3 Identificao dos micro-organismos

A identificao de gneros e/ou espcies filamentosas foi realizada por

caractersticas macroscpicas (textura, topografia e pigmento do verso e reverso da
colnia) e microscpicas. As caractersticas microscpicas foram realizadas atravs do
microscpio ptico, seguindo as classificaes de LACAZ et al., 2002; BARNETT;
HUNTER, 1972; SIDRIM; MOREIRA, 1999.
 42

Para anlise macroscpica, os fungos isolados foram inoculados por ponto

central em placas de Petri contendo meio SDA.
A anlise microscpica foi realizada pela tcnica de microcultivo em
lamnulas (Figura 6), uma adaptao da tcnica tradicional de microcultivo em lminas
(LACAZ et al., 2002), com relao a uso de material alternativo (lminas, lamnulas,
algodo e canudos em forma de V para suporte das lminas) e quantidade de meio de
cultivo empregada.

FIGURA 6: Preparo da tcnica adaptada de microcultivo

3.4 Microcultivo

Para a verificao das caractersticas morfolgicas das linhagens por

microcultivo, foram preparadas placas contendo uma fina camada de meio SDA. Aps
autoclavadas a 121oC por 15 minutos, o meio foi cortado em quadrinhos de 1x1 cm, e
com uma pina estril foram transferidos para a lmina sobre o algodo contido na placa
previamente esterilizada (Figura 7). Pequenas pores do miclio da cultura de R.
oryzae, A.niger e A.flavus (separadamente) foram semeadas nas bordas do meio de
cultura em forma de quadrado, com o auxlio de uma ala de nquel-cromo e o meio
coberto com a lamnula estril. O algodo no fundo da placa foi umedecido com gua
estril. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por 4 dias.
 43

FIGURA 7: Placas de microcultivo aps quatro dias de incubao a 30oC.

Aps a incubao, a lamnula foi retirada, o meio descartado e a lmina

corada com azul de algodo lactofenol (Composio: 20ml de cido ltico; 20g de
fenol: 20ml de glicerina; 20ml de gua destilada e 0,05g de azul de algodo). As
lamnulas foram usadas para cobrir o crescimento das culturas e depois fixadas com
esmalte, como mostra a Figura 8.

FIGURA 8: Lminas prontas para visualizao ao microscpio ptico.

3.5 Conservao das cepas

O mtodo utilizado para conservao das cepas foi repicagem em SDA. O

meio foi preparado diluindo-o em gua destilada. O meio foi distribudo em tubos de
20ml a razo de 10ml por tubo, autoclavado a 121oC por 15 minutos. Aps a
 44

esterilizao, o meio foi solidificado dentro de tubos em posio inclinada conforme

mostra a Figura 9. Os tubos inoculados foram incubados a temperatura de 30oC por 4
dias (Rhizopus, Aspergillus flavus e niger) e posteriormente conservados a 4oC por 3
meses.

FIGURA 9: Ilustrao de tubo de ensaio contendo meio SDA inclinado para

repicagem das espcies.

3.6 Preparo das solues de esporos de Aspergillus niger e flavus

Os esporos dos fungos do gnero Aspergillus foram produzidos em placas

de Petri estreis contendo o meio SDA. O meio foi esterilizado a 121oC durante 15
minutos. Depois de resfriado (45-55oC) o meio foi inoculado em superfcie a partir de
uma cepa repicada, incubada por 4 dias temperatura de 30oC at completa esporulao
conforme Socool (1992); Costa (1996); Prado (2002).
Os esporos foram recuperados da superfcie do meio utilizando-se 10ml de
gua destilada estril. Depois de adicionada a soluo sobre os esporos, com a ajuda de
uma esptula estril foi realizada a raspagem destes esporos. A suspenso obtida foi
conservada a 4oC por at 30 dias.
 45

3.7 Preparo das solues de esporos de Rhizopus

Aps a distribuio e solidificao do SDA esterilizado em placas de Petri

previamente esterilizadas, procedeu-se a semeadura das cepas nas placas que
posteriormente foram incubadas temperatura de 30oC por 4 dias.
Aps esse perodo, a biomassa de fungo formada (miclio) na superfcie do
meio contido na placa foi totalmente retirada com auxlio de uma ala de platina,
adicionando-as em tubos contendo 20 ml de gua deionizada estril e 0,2 % de tween
80, que foram agitados por 15 minutos.

3.8 Contagem de esporos de Aspergillus e Rhizopus

A concentrao de esporos na suspenso obtida foi calculada pela contagem

em microscpio usando cmera de Neubauer. De acordo com Vieira (2000) a cmara de
Neubauer consiste em uma lmina de microscopia, bem mais alta do que uma lmina
normal, onde existe uma cmara gravada de vidro. Ao lado da cmara existem dois
suportes que mantm uma lamnula especial de quartzo exatamente a 10-1 mm acima do
cho da cmara. Assim, quando se coloca uma soluo na cmara e se cobre a mesma
com a lamnula, a profundidade de soluo conhecida.
Para contagem, foram preparadas diluies sucessivas da suspenso de
esporos e adicionada sobre a Cmara de Neubauer, com uma pipeta Pasteur. Foram
contados todos os esporos presentes nos quadrculos impares, conforme a Figura 10. A
contagem foi realizada em triplicata para cada diluio preparada (SPIER, 2005).
Os clculos so mostrados no Anexo 2.
O resultado foi obtido usando a equao (1) e expresso em nmeros de
esporos por ml de suspenso.

N
 46

Onde:

F= fator de diluio (inverso da diluio)

N= nmero de esporos por ml de suspenso (esporos/ml)
ne = nmero total de esporos contados
nq= nmero de quadrculos contados
vq= volume do quadrculo: 4x10-6

FIGURA 10: Contagem de esporos em cmera de Neubauer.

A Figura 11 apresenta as etapas de preparo do beiju de mandioca para

identificao de micro-organismos.
 47

Beiju

Triturao

1g da farinha em 150ml de

Agitao 15min

Diluies (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5)

Cada diluio semeada em placa de

Petri

Isolados em tubos de
ensaio

Microcultivo

Identificao em

Fungos filamentosos Levedura Bactrias

FIGURA 11: Fluxograma do processo de isolamento e identificao dos micro-

organismos encontrados no beiju de mandioca.

3.9 Sacarificao

A sacarificao foi conduzida em frasco balo de fundo chato de 250ml sob

repouso contendo 120ml de soluo de fcula de mandioca (Figura 12). Este
permaneceu em repouso em estufa, a 30oC durante 72 e 192 horas, sendo retirada
alquotas em intervalos de 12h para as devidas anlises.
Utilizou-se uma concentrao de 5% de fcula de mandioca comercial da
marca Amafil e uma soluo a 10% de KNO3. A soluo foi esterilizada a 121oC por 15
minutos para ocorrer a gelatinizao do amido. As inoculaes das sacarificaes para
 48

obteno de glicose foram feitas utilizando-se uma soluo de esporos na concentrao

de 5,5 x 107 esporos/g de amido, reproduzindo a concentrao tima obtida por SPIER
(2005).
Aps a gelatinizao, adicionou-se 5,5x107 esporos/g fcula - fungo
filamentoso (Agente Sacarificante).

FIGURA 12: Sacarificao em frasco (balo).

3.11 Anlise do Substrato Fermentado

3.11.1 Sacarificao

Retirou-se 5 ml de amostra a qual foi misturada a 50 ml de gua deionizada.

Colocou-se sob agitao contnua durante 30 minutos. Em seguida foi filtrada para a
remoo dos slidos obtendo-se um extrato claro. O extrato obtido foi Centrifugado a
3000 rpm durante 15 minutos e o sobrenadante foi utilizado para determinar os
acares redutores e consumo do amido.
 49

FIGURA 13: Anlise do substrato.

3.11.2 Determinao de glicose

A determinao de acares redutores foi realizada pelo mtodo

espectrofotomtrico de Somogyi-Nelson (NELSON, 1994; SOMOGYI, 1945). Este
mtodo baseia-se na reduo estequiomtrica do Cu2+ a Cu+1, com formao de xido
cuproso (Cu2O), o qual forma um complexo corado como o agente cromognico,
enquanto o acar oxidado a cido orgnico. O Cu+1 , ento, complexado com o
reativo de Nelson (arsenomolibdato) que tem um cromforo, produzindo uma colorao
azul cuja intensidade proporcional a quantidade de acares redutores existentes.
 50

Pipetou-se 1,0ml do material neutralizado com NaOH 1M e filtrou-se,

transferindo-se para tubo de ensaio e acrescentando-se 1,0ml do reativo de Somogyi.
Levou-se ao banho-maria fervente por 10 min. Foi retirado do banho e resfriou-se em
gua corrente. Acrescentou-se 1,0ml do reativo de Nelson e 7,0ml de gua, agitou-se e
fez-se a leitura no espectrofotmetro a 535nm.
O mtodo utilizado para anlise de glicose eficiente em comparao a
trabalhos j publicados utilizando o mtodo como padro. O maior problema
encontrado a necessidade de grandes diluies.
Utilizando os mtodos Somogyi-Nelson (1945) e cromatografia lquida para
quantificao de glicose, Souza (2005) mostrou que o coeficiente de correlao (R2) foi
0,9231 indicando que a percentagem da variao explicada pelo mtodo foi de 92,31%
para os valores de glicose.
Determinando os teores de acares totais em alimentos por comparao
entre o mtodo colorimtrico e o titulomtrico (Somogyi-Nelson; Lane-Eynon; Fenol-
Sulfrico), Demiate et al. (2002) chegaram concluso que tanto as amostras de
concentraes conhecidas quanto em amostras de sucos de ma e refrigerantes, os
mtodos utilizados no apresentaram diferena significativa ao nvel de 1% de
significncia. Portanto, qualquer dos mtodos avaliados pode ser usado na quantificao
de acares redutores e totais em alimentos, com a obteno de resultados confiveis e
seguros.
A Figura 14 demonstra diferentes coloraes para diferentes quantidades de
glicose produzidas (seta no sentido da ordem crescente de glicose na mostra). A
preparao que h uma maior quantidade de glicose na amostra, utilizando-se diluies
idnticas para os devidos intervalos de tempo, nota-se coloraes mais intensas, sendo
constatado no espectrofotmetro que quanto mais intensa a colorao, maior a
quantidade de glicose produzida.
 51

FIGURA 14: Teste Somogyi-Nelson para anlise de glicose produzida.

3.11.2.1 Curva analtica padro de glicose

Pesou-se 1,0g de glicose P.A anidro e completou-se com gua a 100,0 ml.
Retirou-se do balo: 0,2 - 0,4 - 0,6 - 0,8 e 1,0 ml e transferiu-se para balo volumtrico
de 100,0 ml, para se obter solues a 2, 4, 6, 8, 10 mg/100ml. Retirou-se de cada balo
volumtrico 1,0ml da soluo de glicose e transferiu-se para tubos de ensaio,
acrescentando 1,0ml do reativo de Somogyi. Levou-se ao banho-maria fervente durante
10min tampando os tubos com rolhas. Retirou-se do banho e resfriou-se com gua
corrente. Acrescentou-se 1,0ml do reativo de Nelson e 7,0ml de gua destilada. Agitou-
se os tubos e fez-se a leitura a 535nm.
As curvas padro foram construdas em grficos cartesianos e as equaes
da reta que correlaciona as medidas da absorbncia com as concentraes conhecidas de
glicose foram determinadas.
O preparo das solues do reativo de Somogyi e Nelson so mostrados no
Anexo 3.
A Figura 15 mostra a curva de calibrao obtida para concentraes
conhecidas de glicose em funo das absorbncias e tambm a equao da reta que foi
 52

utilizada para determinar as concentraes de acares livres presentes nos

experimentos.
A equao da reta da curva foi a seguinte: y= 0,037X + 0,0468 (R2=0,9954),
esta equao da reta foi utilizada para o processo de sacarificao, para quantificar a
concentrao de glicose no processo.

FIGURA 15: Curva Analtica Padro de Glicose

3.12 Rendimento do processo de sacarificao

O rendimento do processo de sacarificao foi definido como a

porcentagem de amido que foi removida da soluo e transformada em glicose.
Considerando um fator de converso de 90% (a quantidade de amido na fcula de
mandioca comercial AMAFIL corresponde a 90%), assumiu-se que 100g de amido
produzem 100g de glicose (CABELLO e SAITO 2006). O resultado foi obtido
utilizando a equao 2:

Rendimento% = conc. Glicose no hirolisado x 100

conc. do amido x 0,9
 53

Captulo 4
Resultados e Discusso
 54

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Isolamento e identificao dos Micro-organismos

Os micro-organismos encontrados nos beijus de mandioca provenientes de

alambiques do interior do Estado foram purificados e identificados, dos quais
predominaram trs espcies de fungos filamentosos (Aspergillus niger, Aspergillus
flavus e Rhizopus oryzae), muitas bactrias (as quais no foram identificadas) e uma
levedura (Saccharomyces cerevisiae).
A Figura 16 apresenta o crescimento das culturas destes fungos em
diferentes meios de cultura a 30oC. O tempo total de monitoramento do crescimento foi
de 48h durante os quais pode-se observar: colorao, textura, topografia e mudana de
cor do meio de cultura, caractersticas estas muito importantes para identificao
macroscpicas destes fungos.
Em todos os trs casos o miclio cresceu rapidamente em 24 horas no meio
Saboroud, apresentando crescimento moderado em PDA e Ex. Malte, sendo a espcie R.
oryzae a que mostrou maior crescimento, atingindo completamente o dimetro da placa
de Petri em menor tempo.
 55

FIGURA 16: Crescimento das cepas de A. niger, R. oryzae e A. flavus por 48h em
diferentes meios de cultura, a) SDA, b)PDA e c)Ex.Malte a 30oC.

As chaves de identificao consultadas foram as de LACAZ et al., 2002;

BARNETT; HUNTER, 1972; SIDRIM; MOREIRA, 1999.
Todas as linhagens em estudo apresentaram desenvolvimento na
temperatura de 300C dentro de 24 horas. Spier (2005), trabalhando com cepas de
Aspergillus e Rhizopus obteve como temperatura tima de crescimento 300C para todos
os ensaios. Ao estudar a influncia de temperatura para o crescimento do Rhizopus
Oryzae LPB 627, Soccol (1992) obteve a mais rpida velocidade de crescimento
temperatura de 300C aps testar temperaturas de 22o, 25o, 30o, 36o e 41oC.
Em funo deste resultado obtido, ficou definido que a temperatura de
incubao das linhagens de 30oC seria a utilizada nos experimentos posteriores.
A Figura 17 mostra a cultura de Aspergillus niger, produtor de enzimas
observado em microscpio ptico.

FIGURA 17: Imagem do fungo Aspergillus niger obtida por microcultivo em SDA
visto ao microscpio ptico (aumento 400X).

As Figuras 18 e 19 mostram a cultura de R. oryzae e A. flavus

respectivamente, tambm produtoras de enzimas amilolticas, observadas em
microscpio ptico:
 56

FIGURA 17: Imagem do fungo Rhizopus oryzae obtida por microcultivo em SDA visto
ao microscpio ptico (aumento 100x a e 400x b).

FIGURA 18: Imagem do fungo Aspergillus flavus obtida por microcultivo em PDA
visto ao microscpio ptico (aumento 400X).

De acordo com os estudos de Park et al. (1982), a flora natural de beijus

coletados em 3 diferentes unidades de fabricao de tiquira no maranho prximas da
capital e encontraram Aspergillus niger e Paecilomyces sp. como espcies
predominantes , sendo tambm encontrada quantidade moderada de Rhizopus sp. e
Neurospora. Jalavicharana (1950), estudando a microflora do ragi (arroz), verificou a
presena de espcies Aspergillus, Mucor, Rhizopus e Penicillium, sendo predominante o
Aspergillus flavus.
Os resultados obtidos por estes autores foram semelhantes aos encontrados
nesta pesquisa. Isto seria esperado, pois entende-se que fungos espalham-se na natureza
atravs de vrias vias de disperso como o ar atmosfrico, gua, insetos, homem e
outros animais. Porm, em cada localidade ser encontrado linhagens e concentraes
diferentes de fungos.
 57

Testes realizados no laboratrio de microbiologia do HUPD (Hospital

Universitrio Presidente Dutra), para quinze amostragens de possveis leveduras
inoculadas em tubos inclinados, mostraram a presena de quatorze bactrias e uma
levedura, a qual foi identificada, apresentando como resultado a levedura
Saccharomyces cerevisiae (Figura 20).

FIGURA 20: Resultado da identificao de levedura, sendo o laudo positivo para a

espcie Saccharomyces cerevisiae (99%).

4.2 Sacarificao

A sacarificao em frascos (balo) foi realizada com o intuito de avaliar

quais as cepas dos fungos filamentosos pr-selecionadas a partir do crescimento em
placas so maiores produtoras de enzimas capazes de converter o amido em glicose, e
definir a cepa padro para a continuidade deste trabalho de pesquisa.
Todas as linhagens de fungos filamentosos em estudo encontradas no beiju
hidrolisaram o amido, verificado pela produo de glicose pelo mtodo de Somogyi-
Nelson.
As amostras de R. oryzae, A. niger, A. flavus e a mistura de ambas, que
previamente mostraram ser melhores produtoras enzimticas foram selecionadas para
 58

testes de sacarificao do amido para avaliar e confirmar a capacidade de converso

glicose.
Para a padronizao da quantificao de esporos utilizou-se uma taxa de
esporos de 5,5x107 esporos/g fcula, esta quantidade mostrou-se eficiente para a
produo de enzimas sacarificantes, podendo ser observado uma grande quantidade de
converso do amido.
De acordo com Soccol (1994) e Raimbault e Alazard (1980), a taxa de
inoculao dos esporos deve ser suficiente para assegurar uma inoculao homognea
do substrato e tambm um incio de crescimento rpido de modo a evitar uma eventual
competio com os contaminantes. No entanto a taxa de inoculao no dever ser
muito elevada, pois uma alta densidade de esporos pode provocar um fenmeno de
inibio e reduo da porcentagem de germinao.
Oriol (1987) trabalhando com Aspergillus niger descreveu que taxas de
inoculao de cerca de 106 a 107 esporos/g de suporte so suficientes para um bom
crescimento dessa espcie de fungo. Barrios et al. (1988) observaram fenmenos de
inibio da germinao dos esporos quando taxas de inoculao superior a 108
esporos/g de substrato so utilizadas.
Todos os ensaios realizados nesta pesquisa, mostraram uma variao de pH
em torno de 5,0 5,5 sem a adio de cidos ou bases para a sua padronizao,
tomando-se o pH 5~5,5 como padro para todas as anlises realizadas. Estes valores de
pH so aqueles dos meios de culturas utilizados para o crescimento de fungos.
Conforme Soccol (1992), o fungo tem uma capacidade de crescimento,
embora limitada, em condies extremas de acidez e alcalinidade. Essa caracterstica
de extrema importncia para os processos fermentativos, pois mostram que nessas
condies a grande maioria das bactrias responsveis pelas contaminaes dos
processos fermentativos so inibidas.
Singh et al. (2009), em estudo de otimizao das condies de sacarificao
de palha de trigo com celulases produzidas por Aspergillus heteromorphus, obtiveram
maiores resultados de ART (Acares redutores totais) a pH 5,0. Krishna et al. (1997)
realizaram hidrlise de folhas de Antigonum leptotus e palha de cana-de-acar a pH
4,5. Chen et al. (2007) trabalharam com condies de pH 4,8 na hidrlise enzimtica de
sabugo de milho, obtendo 79% de rendimento.
 59

A quantidade de nitrognio adicionado (10% em relao massa do amido)

ao meio de cultivo foi ideal, pois os micro-organismos cresceram o suficiente para
produzir o metablito de interesse.
A adio de KNO3 nas amostras foi de extrema importncia para o processo,
pois na ausncia de nitrognio, as cepas selecionadas no produziam de forma linear e
nem satisfatria enzimas capazes de converter o amido em glicose. Nestas condies,
em 48 horas de sacarificao, as espcies perdiam capacidade de converso do amido
glicose.
De acordo com Soccol et al. (2005), a produo de amiloglucosidase por
fungos, onde o substrato suplementado com fontes de nitrognio (natureza orgnica ou
inorgnica), praticada com sucesso para aumentar os rendimentos de amiloglucosidase
em sacarificao. As fontes de nitrognio podem ser componentes como sais de nitrato,
amnio ou uria.
Os micro-organismos no assimilam diretamente molculas complexas
como o caso do amido, um polissacardeo. No havendo outro componente
assimilvel no meio, o micro-organismo passa a sintetizar aquelas enzimas especficas
que degradam o substrato complexo em molculas mais simples - neste caso as amilases
- para que estas convertam o amido (fcula) em acares assimilveis garantindo assim
o crescimento e desenvolvimento do micro-organismo.
A importncia da determinao da concentrao de acares est ligada
capacidade de metabolismo de substrato pelo fungo. A produo de acares a partir do
amido demonstra o potencial que a cepa tem para hidrolisar o amido, produzindo acar
fermentescvel.
A Tabela 01 apresenta os resultados da produo de glicose obtidos por
sacarificao em frascos (balo) para cepas de A.niger, A. flavus, R. oryzae e a mistura
dos esporos.
 60

TABELA 01- Quantidade de glicose (g/l) produzida atravs do processo de

sacarificao do amido pelas espcies A.niger, A. flavus, R.oryzae e
pela mistura dos esporos pr selecionadas por sacarificao.

Espcies de
Produo de glicose (g/l) / Tempo de crescimento (horas)
fungos
filamentosos
12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h

A. niger 0,33 0,14 0,48 0,04 0,77 0,01 1,09 0,05 1,65 0,12 2,520,40

A. flavus 0,56 0,30 0,72 0,16 0,86 0,02 1,54 0,05 2,60 0,14 3,58 0,64

R. oryzae 1,44 0,17 2,26 0,07 3,52 0,03 5,31 0,31 6,90 0,09 8,14 0,13
Mistura
dos 0,110,09 0,280,08 2,120,12 1,670,24 1,790,25 2,340,16
esporos
7
NOTAS: Condies de cultura: taxa de inoculao: 5,5 x 10 esporos/ g fcula de mandioca;
0
temperatura 30 C, 72 h de sacarificao; pH 5,0; 5.0% de fcula de mandioca, 10% de KNO3. A
porcentagem de KNO3 foi calculada em relao quantidade de fcula de mandioca.

Observou-se que os resultados para a produo de glicose foram superiores

para R. oryzae em todos os intervalos de tempo, apresentando maior variao. Notou-se
durante o experimento, que a partir do primeiro dia de sacarificao houve uma reduo
considervel da viscosidade do mosto de R. oryzae e A. flavus sendo pouco observado
no mosto contendo A. niger.
Misturando os esporos de ambos os fungos percebeu-se um decrscimo a
partir de 36h de produo de glicose, a competio destes fungos para se adequarem ao
meio (requerendo mais nitrognio para seu desenvolvimento) influenciou a converso
do amido glicose.
A cepa R. oryzae apresentou uma maior atividade enzimtica, pois
utilizando-se os mesmos aspectos para todos os ensaios, a concentrao de glicose
sempre foi mais elevada. Este resultado interessante, pois estudos j relacionados
sobre a atividade enzimtica de cepas de fungos filamentosos, mostraram o A.niger
como principal agente sacarificante LE MENSE et al. (1947); TEIXEIRA (1950),
entretanto, neste trabalho tem-se que levar em considerao o fato de todas as cepas
estudadas serem selvagens. A Figura 21 ilustra os comportamentos destas cepas no
decorrer da sacarificao.
 61

A. niger
A. flavus
R. oryzae
Mistura

FIGURA 21: Resultados da cintica de sacarificao do amido por um perodo de 72h.

Spier (2005), estudando as atividades da -amilase e da amiloglucosidase de

espcies de Rhizopus (R. oryzae, R. formosa, e R. arrhizus) por 48h em intervalos de
12h , verificou que resultados para a produo de -amilase foram semelhantes entre as
espcies analisadas, entretanto, em relao produo de amiloglucosidase, observou-se
que a espcie R. oryzae LPB168 demonstrou produo de amiloglucosidase mais
elevada. A concentrao de -amilase e da amiloglucosidase, est diretamente
relacionada com a quantidade de glicose. Continuando o estudo, Spier (2005)
demonstrou que cepas de A.niger obtiveram maior produo de amiloglucosidase nas
mesmas condies de estudo, consequentemente uma maior produo de glicose.
Para ocorrer a quebra das ligaes -1,4 e -1,6 do amido gelatinizado, so
necessrias enzimas amilolticas, enzimas estas produzidas por fungos filamentosos,
como conseqncia, uma maior produo de glicose sugere uma maior produo de
enzimas.
No processo de hidrlise da batata-doce por meio de clulas imobilizadas,
segundo a avaliao de Souza (2005), utilizando em conjunto as enzimas -amilase/
amiloglucosidase em diferentes propores, foram obtidas concentraes de glicose no
hidrolisado de: 0/50=25,123g/l; 0/100=31,672g/l; 50/0=37,433g/l; 50/50=122,768g/l;
50/100=128,703g/l numa concentrao inicial de farinha de batata-doce a 10%, esta
 62

descreve que a associao entre -amilase e amiloglucosidase se mostrou

imprescindvel e os maiores valores de concentrao de glicose foram obtidos para a
relao -amilase e amiloglucosidase, em microlitros, de 50:50.

4.3 Rendimento do processo de sacarificao

O fator de converso relaciona a quantidade de acares redutores

produzidos concentrao de amido consumido.
A Tabela 02 apresenta os ensaios realizados e seus respectivos valores de
rendimento do processo de sacarificao. Nota-se que o rendimento da hidrlise do
amido para o R. oryzae alcanou um valor de converso de 78,02% em mdia (30oC e
50g/l de amido solvel), obtendo o maior rendimento de sacarificao, seguida pelo A.
flavus 71,55%, A. niger 57,17% e pela mistura dos esporos 48,02% . Lima et al. (2001)
afirmam que no possvel a completa hidrlise do amido por e -amilases, pois elas
no conseguem quebrar ligaes -1,6 das amilopectinas, que um polmero de glicose
semelhante amilose, diferenciando destas por suas ramificaes.
O bom rendimento da sacarificao pode ser explicado por esse aspecto,
pois os componentes majoritrios do amido so a amilose e a amilopectina, sendo a
amilopectina em torno de 70% da composio, as e -amilases produzidas pelos
fungos e a amiloglucosidase, convertem as cadeias de amilose e amilopectina
respectivamente.
TABELA 02: Rendimento do processo de Sacarificao de uma suspenso de amido
50g/l aps 192h com uma concentrao de esporos 5,5 x 107 a 30oC.

Ensaio Glicose Rendimento da

Sacarificao (g/l) Sacarificao (%)
(Espcie)

A.niger 25,73 57,17

A.flavus 32,20 71,55

R. oryzae 35,11 78,02

Mistura dos esporos 21,61 48,02

 63

Santana et al. (2007), utilizando amilases comerciais do tipo FORILASE

NTL, chegaram a obter valores de rendimento de sacarificao prximos a 80% no
ensaio a 450C com 22,07g/l de amido solvel presente inicialmente.
Neves (2004), estudando a produo de lcool a partir de crueira de
mandioca, um resduo da produo da farinha, promoveu a hidrlise utilizando
amilase Termamyl 120L e amiloglucosidase AMG 300L comerciais ambas da
Novozymes. O hidrolisado obtido apresentou 97,49% de glicose, 1,35% de maltose e
1,16% de dextrinas, o autor justificou o alto poder de converso devido uso da
amiloglucosidase, que capaz de quebrar as ligaes (1,6) e (1,4), gerando grandes
quantidades de glicose.
J Augustini et al. (2008), produzindo um hidrolisado a partir do amido de
mandioca por enzimas presentes na batata doce e quantificando os teores de acares
redutores pelo mtodo de Somogyi-Nelson, verificaram uma converso de 26% do
amido em acares redutores.
Banzon et al,. (1949) realizaram experincias utilizando farelo embolorado
na sacarificao do amido de mandioca, utilizando 10% desse resduo e obtiveram um
rendimento terico entre 80-85%.
Ejiofor et al. (1996) obtiveram aproximadamente 80,7% de glicose no
hidrolisado do amido proveniente de guas residuais do processamento de mandioca,
utilizando enzimas microbianas -amilase e glucoamilase. O restante dos acares
compreendia malto-oligossacardeos, principalmente maltose e isomaltose.
Estes resultados esto de acordo com Vieira (2004) que descreve a hidrlise
como um desdobramento total das molculas do amido que, so transformadas
primeiramente em dextrinas pela ao da -amilase e finalmente em glicose por ao da
amiloglucosidase.
A tabela 03 apresenta o rendimento de sacarificao encontrado pelos
autores acima, com suas respectivas enzimas sacarificantes.
 64

TABELA 03: Rendimento do processo de Sacarificao encontrado por autores que

utilizaram o amido como matria prima.

Autores Enzimas utilizadas Rendimento da

Sacarificao (%)
Santana et al. (2007) FORILASE NTL 80%
Neves (2004) Termamyl 120L e AMG 300L 97,49%
Augustini et al. (2008) Enzimas da batata doce 26%
Banzon et al. (1949) Farelo emborolado 80-85%
Ejiofor et al. (1996) Enzimas -amilase e glucoamilase 80,7%

Pode-se considerar que os resultados encontrados nesta pesquisa mostram

um timo rendimento de sacarificao pela espcie R. oryzae, valores estes um pouco
abaixo dos valores encontrados pelos autores supracitados. Entretanto deve-se levar em
considerao que se utilizou as enzimas naturais, diretamente produzidas pelos micro-
organismos ensaiados, j a maioria dos resultados obtidos pelos outros autores foram
provenientes de experimentos que usaram enzimas comerciais.
 65

Captulo 5
Concluses
 66

5 CONCLUSES

Dentre os trs meios de cultura (PDA, SDA e Ex. Malte) utilizados para o
crescimento dos fungos isolados do beiju de mandioca, o meio de cultura SDA,
apresentou um resultado mais satisfatrio, o qual foi utilizado nos repiques das
culturas. Os fungos filamentosos encontrados foram: Aspergillus niger,
Aspergillus flavus e Rhizopus oryzae alm da levedura Saccharomyces
cerevisiae e vrias bactrias que no foram identificadas.

A amostra do fungo filamentoso Rhizopus oryzae demonstrou maior capacidade

de converso de amido em glicose visto pela sacarificao de fcula de
mandioca quando comparada produo das outras cepas do gnero Aspergillus.

A converso do amido em glicose apresentou boa eficincia de hidrlise em

comparao com resultados existentes na literatura. O uso de fungos selvagens
produtores de esporos se mostrou vivel para o uso em sacarificao. Obteve-se
uma quantidade mxima de glicose de 35,11g/l para o R. oryzae seguido de
32,20 g/l A. flavus, 25,73 g/l A. niger e 21,61 pela mistura dos esporos em 192h
utilizando-se 50g/l de fcula e mandioca.

O rendimento da sacarificao atingiu uma produo mxima para a amostra de

R. oryzae, obtendo um percentual de 78,02%, com este resultado possvel
afirmar que a utilizao de esporos de R. oryzae so viveis para sua utilizao
em sacarificao do amido de mandioca. Podemos confirmar ento que a
utilizao de micro-organismos filamentosos selvagens torna-se uma opo para
uso em sacarificao de mostras amilceas.

Quando utilizado KNO3 (10%), esporos na quantidade de (5,5 x 107) e um pH 5

na sacarificao, ocasionou uma maior produo de glicose.
 67

6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

Estudar a produo de enzimas amilolticas -amilase e amiloglucosidase a

partir dos fungos filamentosos encontrados;

Estudar as condies ideais para a produo (otimizao das condies fsicas e

qumicas de cultivo) e extrao dessas enzimas produzidas por fungos
selvagens;

Realizar uma anlise preliminar do custo de produo das enzimas -amilase e

amiloglucosidase;

Influncia do tipo de fungo nas caractersticas da bebida;

Estudar todos os carboidratos presentes no hidrolisado.

 68

Captulo 7
Referncias Bibliogrficas
 69

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 77

ANEXO 1 Reagentes, materiais e equipamentos

Tabela 03: Relao de reagentes, materiais e equipamentos

Reagentes, materiais e equipamentos Fabricante

SDA-Sabouraud Dextrose gar HIMEDIA
PDA-Potato Dextrose gar HIMEDIA
Malt extract gar HIMEDIA
Fosfato dissdico heptahidratado-Na2HPO4.7H2O LAFAN
Tartarato duplo de sdio e potssio-KNaC4H4O6 AUDAZ
Hidrxido de sdio-NaOH LAFAN
Sulfato de cobre-CuSO4 DINMICA
Sulfato de sdio-Na2SO4 LAFAN
Molibdato de amnio-(NH4)6Mo7O24 AUDAZ
cido sulfrico-H2SO4 LAFAN
Arseniato de sdio ISOFAR
Glicose-C6H12O6 LAFAN
Tween 80 AMRESCO
Agitador de tubos AP56 PHOENIX
Balana analtica FA-2104N BIOPRECISA
Centrifuga BabyI 206 FANEM
Autoclave vertical AV-75 PHOENIX
Microscpio ptico Eclipse E100 NIKON
Agitador magntico 78HW-1 BROMIXER
Estufa bacteriolgica BOD Q-315M QUIMIS
Banho maria com circulao MA159 MARCONI
Espectrofotmetro UV-VIS UV-2550 SHIMADZU
Papel filtro qualitativo QUALITY
Pipeta automtica regulvel DIGIPET
PRECICOLOR
Cmara de Neubauer
HBG
Fcula de mandioca AMAFIL
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ANEXO 2 Clculo da contagem de esporos usando a cmara de Neubauer

Clculo da contagem de esporos usando a cmara de Neubauer

Considerando-se que a cmara de Neubauer contm 25 quadrculos. Entre a cmara e a lamnula, forma-
se um filme lquido da diluio preparada de 0,1mm de espessura. A dimenso de cada quadrculo de
0,2mm x 0,2mm. Portanto, em cada quadrculo temos o volume de 4x10-6 ml:

Equivalncias: 1ml 1cm3

1ml 1000 mm3

Xml 0,004 mm3

X= 0,004 mm3 4x10-6

1000 mm3 1ml

Portanto, em um quadrculo temos 4x10-6 ml

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ANEXO 3 Preparo das solues de Somogyi-Nelson

Reativo de Somogyi: Pesou-se 28g de NaHPO4 e adicionou-se 40g de tartarato duplo de sdio e potssio
em 700ml de gua. Adicionou-se 100 ml de NaOH 1N. Gotejou-se 80 ml de soluo de CuSO4 5H2O a
10%, sob agitao constante. Juntou-se 180g de Na2SO4 e completou-se o volume com gua a 1000 ml.
Deixou-se em repouso por dois dias e filtrou-se em papel qualitativo, guardando o reativo em frasco
escuro a 37o C.

Reativo de Nelson: Pesou-se 50g de (NH4)6Mo7O24. 4H2O e dissolveu-se em 800ml de gua. Adicionou-
se 52 ml de H2SO4 concentrado. Juntou-se 6g de hidrognio arseniato de sdio dissolvidos em 50 ml de
gua. Completou-se o volume a 1000 ml. Deixando em frasco escuro por dois dias e conservando a 37o C.