GUA DE PRCTICA DE BIOQUMICA II

LIMA-PERU

2017

1
Coordinador de asignatura:
Mg. Q.F. Anglica Minaya Galarreta

Docentes colaboradores:
Mg. Carlos Cano
Q.F. Daniel Barahona

2
 INDICE

Prctica Pgina

Prctica 1. Introduccin Normas de bioseguridad en el laboratorio 4

Prctica 2. Accin comparativa de las enzimas frente a catalizadores no 7

biolgicos

Prctica 3. Cintica Enzimtica 11

Prctica 4. Identificacin de enzimas en productos biolgicos 15

Prctica 5. Cuantificacin de Glucosa por medio enzimtico 19

Prctica 6. Cuantificacin de cido Pirvico 21

Prctica 7. Cuantificacin de Colesterol 25

Prctica 8. Cuantificacin de HDL-Colesterol 28

Prctica 9. Cuantificacin de Creatinina 31

Prctica 10. Cuantificacin de albmina y Protenas plasmticas 34

Prctica 11. Cuantificacin de urea 37

3
 PRACTICA N 1

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Definicin: Representa el conjunto de reglas, procedimientos operativos y prcticos

adecuados para garantizar que los datos generados por los laboratorios sean confiables.
La relacin entre la BPL y el Sistema de Gestin de Calidad (SGC) tiene un efecto
sinrgico, cualquiera que sea el mbito de aplicacin, puesto que los requisitos
generados del SGC contribuyen a garantizar que se cumplan los requisitos de las BPL
especficas.
La mayora de los requisitos de la BPL se recogen en la norma ISO 9001/2008: tales
como: control de documentos, control de registro, auditoras internas, revisin de
instalaciones por la direccin y personal; con excepcin de otros muy especficos que se
tratan de forma minuciosa con las BPL (ISO 17025), como los relacionados con los
reactivos, medios de cultivo, materiales de referencia, con algunos procesos como la
esterilizacin y la filtracin, los estudios de estabilidad y validacin, monitoreo
ambiental de las reas y el control de los desinfectantes, las caractersticas de los
equipos, la higiene del personal y el retiro de los productos del mercado.
La norma ISO 9001 contempla los requisitos que son vitales para desarrollar e
implementar SGC eficientes que garantice el cumplimiento permanente de los requisitos
de los BPL, as como aquellos que tiene que ver con la concepcin de los SGC y los
principios en que se sustente.
Los BPL constituyen documentos ms especficos del sector, que identifican requisitos
indispensables para el desarrollo de las actividades y procesos relacionados con las
producciones o ensayos, pero con una visin menos integradora y sin abarcar asuntos
indispensables para gestionar eficientemente tales actividades y procesos.
Los requisitos tcnicos para un laboratorio son la confiabilidad y validez de los
resultados, rapidez en la entrega y la entrega adecuada. Y los objetivos de un sistema de
calidad son evitar que ocurran errores e ineficiencias, detecta e identificar los elementos
causantes de los errores, corregir y mejorar los procesos, adems de demostrar con
evidencias que se han cumplido los requisitos.

4
La implementacin exitosa de las Buenas Prcticas de Laboratorio, requiere regulacin
y reconocimiento del rol del elemento humano, en todos los niveles de personal, en el
diseo, implementacin y evaluacin de un Programa de Aseguramiento de Calidad.
Existe una verdadera interrelacin entre las BLP y la norma ISO/IEC 17025: 2005, ya
que ambas trabajan conforme a requisitos relacionados, equipo, materiales,
procedimientos estandarizados, requisitos de todas las actividades.
Los BPL contienen aspectos de bioseguridad que no contemplan las normas ISO/IEC
17025:2005. Por otra parte esta norma contiene requisitos que ayudan a evaluar las
necesidades del cliente: atencin a quejas, encuestas de satisfaccin y un aspecto muy
importante que es la mejora continua, lo que ayuda al crecimiento de las organizaciones.

En el siguiente recuadro los cambios ms significativos en cuanto a estructura entre ISO

9001/: 2008 vs ISO 9001/: 2015.

ISO 9001/: 2008 ISO 9001/: 2015

1. Objeto y campo de aplicacin. 1. Objeto y campo de aplicacin.

2. Normas para tu consulta. 2. Referencias normativas.

3. Trminos y definiciones. 3. Trminos y definiciones.

4. Sistema de gestin de calidad. 4. Contexto de la organizacin.

5. Responsabilidad de la direccin. 5. Liderazgo.

6. Gestin de los recursos. 6. Planificacin.

7. Realizacin del producto. 7. Soporte.

8. Medicin, anlisis y mejora. 8. Operacin.

9. Evaluacin del desempeo.

10. Mejora continua.

Que es ISO:
Organizacin Internacional de Estandarizacin
Sede: Ginebra (Suiza)

5
 Reconocida por ms de 150 pases.
INDECOPI la representa en el Per.
Promueve y elabora normas a nivel Internacional para facilitar el comercio
mundial. La reparacin de las normas internacionales normalmente se realiza a
travs de los comits tcnicos de ISO.

La ISO / IEC 17025-2005 especifica los requisitos generales para la competencia para
llevar a cabo los ensayos y calibraciones, incluido el muestreo cubre los ensayos y la
calibracin realizada usando mtodos estndar, mtodos no normalizados y mtodos
desarrollados para el laboratorio.

LAS NORMAS BPL

Constituyen en esencia, una filosofa de trabajo, son un sistema de organizacin de todo
lo que de alguna forma interviene en la realizacin de un estudio o procedimiento
encaminado a la investigacin de todo producto qumico o biolgico que pueda tener
impacto sobre la especie humana.
Las normas inciden en como debe trabajar a lo largo de todo el estudio, desde su diseo
hasta el archivo.

6
 PRACTICA N 2
ACCIN COMPARATIVA DE LAS ENZIMAS FRENTE A CATALIZADORES
NO BIOLGICOS

I.- Objetivos.
Comparar la accin cataltica de la catalasa con la de un catalizador
inorgnico como el bixido de manganeso (MnO2) al descomponer en
perxido de hidrgeno (H2O2) a temperatura ambiente.
Observar el efecto de la temperatura sobre la accin cataltica de una
enzima y comparar el mismo efecto de temperatura sobre un catalizador
inorgnico.

II.- Marco terico.

Las enzimas son catalizadores biolgicos de estructura proteica y

producidos por los mismos organismos que las utilizan para realizar sus
propios procesos metablicos. La accin cataltica de una enzima est
sometida a la influencia de factores fsicos como son: el calor, las
radiaciones o factores qumicos como cambios en el pH y en la
concentracin de la enzima, sustrato y la presencia de inhibidores. En
cambio los catalizadores inorgnicos, en algunos casos, no son afectados
por factores fsicos como el calor, por tanto, pueden catalizar una
determinada reaccin pese a cambios en la temperatura.
La reaccin que se presenta en la experiencia a realizar se puede
describir en la siguiente forma:

catalasa
H2O2 H2O + O2

MnO2
H2O2 H2O + O2

II.- Materiales y equipos.

1. Equipos y materiales.
a. 6 tubos de ensayo
b. 2 pipetas de 5 ml y 10 ml
c. Beacker de 400ml
d. Calentador
e. Pinzas para tubo de ensayo
f. Gotero
g. Probeta de 100 ml
7
 h. Esptula
i. Mortero
j. Gasa
k. Espectrofotmetro.
l. Centrifuga.
m.Bao Mara regulado a 37.
n. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
o. Gradillas, baguetas.

2. Reactivos.
a. Perxido de Hidrgeno al 3%
b. Dixido de manganeso.
c. Cianuro de sodio.
d. Papas.
e. Muestra de sangre
f. Agua destilada
g. Hielo

III.- Procedimiento.
1.- Rotular tres tubos de ensayo y agregar a cada uno las
siguientes sustancias:
Tubo N 1: 1 ml de sangre al 10%
Tubo N 2: 1 ml de extracto de papa
Tubo N 3: una pequea porcin de MnO2

2.- Se agrega a cada uno de los tubos 2 ml de H2O2 al 3% . Se

debe observar la intensidad de la reaccin por el burbujeo del
oxgeno y la liberacin el calor.

3.- Preparar 3 tubos de ensayo como en el tem 1 y colocarlos en

un bao mara a ebullicin durante diez minutos, retirarlos y
dejarlos en reposo dentro de un bao mara a temperatura
ambiente durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2 ml de H2O2 al
3%. Comparar el nivel por las burbujas en cada uno de los tubos
y registre en orden creciente la actividad cataltica con base a
este parmetro.

4.- Preparar nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y

colquelos en un bao de hielo durante 10 min. Adicionar a cada
tubo 2 ml H2O2 al 3%. Comparar el nivel alcanzado por las
burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la
actividad cataltica con base en este parmetro.

5.- Preparar nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1,

adicionar a cada tubo uno a 6 gotas de NaCN y dejar en reposo
por 5 min, luego se adiciona 2 ml de H2O2 al 3% a cada tubo.
Comparar el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los

8
 tubos y registrar en orden creciente la actividad cataltica con
base a este parmetro.

IV.- Cuestionario.

1. Explique porque el captopril y el enalapril son ejemplos de

inhibidores competitivos de la enzima conversora de la
angiotensina.
2. Las granadas son fabricadas por la industria militar con un
dispositivo especial de seguridad para que no exploten en el
sitio donde son fabricadas, si no durante el combate, Qu
tipo de enzimas son fabricadas por ciertos rganos que
tienen un comportamiento similar al de las granadas? De
ejemplos.
3. Cul es la importancia mdica de las enzimas?. Mencione
un ejemplo.
4. Defina que son: zimgenos, isozimas, inhibidores
acompetitivos.
5. Qu diferencias hay entre inhibidores orgnicos e
inorgnicos?
6. Qu funcin cumplen las vitaminas hidrosolubles en las
reacciones catalizadas por enzimas?
7. Explique cmo se da el proceso de regulacin de la
actividad enzimtica en el organismo.

9
 PRACTICA N 2
INFORME EN CLASE

ACCIN COMPARATIVA DE LAS ENZIMAS FRENTE A CATALIZADORES NO BIOLGICOS

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

10
 PRCTICA N 3
CINTICA ENZIMTICA - FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA

Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de acelerar
las reacciones qumicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su
actividad es afectada por diversos factores: concentracin de sustrato, pH, concentracin
de enzima, temperatura, inhibidores, fuerza inica, constante dielctrica, etc.

Efecto de la concentracin del sustrato

La velocidad de una reaccin catalizada por enzimas es dependiente de la concentracin

del sustrato. Esta dependencia es lineal cuando la concentracin de sustrato es menor
que el valor Km, perdindose esta relacin cuando la concentracin es muy cercana a
Km, para finalmente tornarse independiente de la concentracin de sustrato.

El experimento se realizar utilizando la enzima Fosfatasa cida de hgado de pollo,

enzima que tiene la propiedad de hidrolizar el p-nitrofenil fosfato en medio cido
formando como productos de la reaccin fosfato inorgnico y p-nitrofenol. Este ltimo
compuesto absorbe a 405 nm. Con tal propsito se prepararn los siguientes medios de
reaccin:

B-1 1 B-2 2 B-3 3 B-4 4

mL. Tampn citrato 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.1M pH 5.0
mL. p-nitrofenil 0.2 0.2 0.4 0.4 ---- ---- ---- ----
fosfato 0.001 M
mL. p-nitrofenil ---- ---- ---- ---- 0.1 0.1 0.2 0.2
fosfato 0.01 M
mL. agua destilada 0.8 0.7 0.6 0.5 0.9 0.8 0.8 0.7

Colocar los tubos en bao mara a 37 C durante 2 minutos, luego adicionar la enzima
conforme se indica a continuacin:

mL. de enzima ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1

11
Detener la reaccin EXACTAMENTE a los 2 minutos, mediante la adicin de 1 mL de
NaOH 1 N. Leer en el espectrofotmetro a 405 nm

Determinar la velocidad de reaccin de cada uno de los tubos y luego graficar:

a.- velocidad en funcin de la concentracin de sustrato.

b.- 1/v versus 1/[S].
c.- Calcular los valores de Vmax y Km de la enzima.

Determinar la velocidad mxima y el Km de la enzima utilizando ambos grficos.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA

La velocidad de una reaccin enzimtica depende directamente de la concentracin de

enzima. Los experimentos deben realizarse en condiciones de velocidad inicial. Para
este propsito se preparan los siguientes medios de reaccin:

B 1 2 3

mL. de tampn citrato 0.1 M pH 5.0 1.0 1.0 1.0 1.0

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01 M 0.2 0.2 0.2 0.2
mL. agua destilada 0.8 0.75 0.7 0.65

Los tubos de ensayo se incubarn durante 2 minutos a 37 C a cuyo trmino se

adicionar la enzima, que dar inicio a la reaccin.

mL. de enzima ---- 0.05 0.1 0.15

Se colocarn nuevamente los tubos en el bao mara durante 2 minutos

EXACTAMENTE y se detendr la reaccin mediante la adicin de 1 mL de NaOH 1 N.
Se leern las densidades pticas a 405 nm.

Graficar la actividad enzimtica o la velocidad de la reaccin en funcin de la

concentracin de enzima expresada como mL de enzima.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.-

El pH del medio de reaccin afecta la velocidad con que una enzima cataliza una
reaccin. La variacin en la velocidad de catlisis ocurre debido a que el pH puede
afectar la estabilidad de la enzima, los grupos ionizables en la enzima, los grupos
ionizables del sustrato, etc. Con la finalidad de observar este efecto se prepararn los
siguientes medios de reaccin:

12
 pH

3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

mL. tampn citrato 0.1M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
mL. p-nitrofenil fosfato 0.01M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
mL. de agua destilada 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7

Colocar los tubos en el bao mara a 37 C durante 2 minutos e iniciar la reaccin

mediante la adicin de la enzima:

mL. de enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

La reaccin se detiene transcurridos EXACTAMENTE 2 minutos, mediante la adicin

de 1 mL de NaOH 1 N, luego leer en el espectrofotmetro a 405 nm.
Graficar actividad enzimtica en funcin del pH.

13
 PRACTICA N 3
INFORME EN CLASE

CINTICA ENZIMTICA

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

14
 PRACTICA N 4

IDENTIFICACION DE ENZIMAS EN PRODUCTOS BIOLOGICOS

I. Objetivos:

1. Demostrar la forma en que una enzima es especfica para cierto sustrato.

2. Identificar el sustrato en una reaccin enzima-sustrato.
3. Usar ciertas pruebas de nutrientes para demostrar la presencia de almidn y
protenas.

II. Materiales y equipos.

1. Equipos y materiales.
3 tubos de ensayo cada uno con 2ml de gelatina solidificada
Papel toalla
3 tubos de ensayos vacos
Gradilla
6ml de solucin de almidn
Lpiz de marcar vidrio
Solucin de yodo lugol
Ablandador de carne
2 agitadores
Saliva
Bao de agua de 37C
Vaso qumico de 100ml.
Termmetro
10ml de agua destilada
Hornillo
Probeta de 10ml.

III. Procedimiento.

A. Prepara una tabla para anotar datos. A la izquierda prepara una lista de (a)
tubos de ensayo de 1 al 6 (b) el sustrato gelatina o almidn (c) la
sustancia que se aade (d) loa cambios. Anota tus observaciones en el lugar
correspondiente a medida que realices los pasos del experimento

B. En el vaso, recoge saliva de varios estudiantes hasta completar 5ml. Aade

5ml de agua destilada a la saliva.

C. Pide a tu facilitador 3 tubos de ensayo cada uno con 2ml de gelatina

solidificada. Con el lpiz de cera rotula los tubos 1, 2 y 3. Aade 2ml de
15
 solucin de saliva al tubo 2. Al tubo 3, aade suficiente ablandador para
cubrir la superficie de la gelatina.

D. 3 minutos despus de aadir la solucin de saliva y el ablandador de carne a

sus tubos con gelatina, pica suavemente la superficie con un agitador.
Limpia el agitador con papel toalla cada vez que piques un tubo. Repite la
actividad a intervalos de 1 minuto hasta que veas un cambio de en la
superficie de la gelatina en cualquier tubo

E. Anota en la tabla cualquier cambio que observes en la gelatina

F. Limpia los 3 tubos y con un lpiz de cera rotlalos como 4, 5 y 6. Usa la

probeta para poner 2ml de almidn en solucin en cada tubo

G. Haz en cada tubo con almidn lo que indica la lmina B:. Usa papel toalla
para limpiar el agitador una vez que hayas mezclado el almidn en cada
tubo. Calienta los tubos en el bao de agua de 37C. Observa la tercera figura
para que veas la forma de calentar los tubos. Aade yodo, saliva ms yodo y
ablandador ms yodo, segn indica la segunda figura. que tambin da las
cantidades a usar.

H. En una tabla de datos, anota cualquier cambio que observes en los tubos de
almidn, luego de tratarlos con yodo, saliva y ablandador.

16
 I. Sigue la instrucciones de tu facilitador para disponer los materiales usados

IV. Cuestionario.

1. El color observado en el tubo 4 indica la presencia de almidn. De los tubos

5 y 6 cul no muestra presencia de almidn?
2. En cul de los tubos con gelatina, es la superficie distinta a la de la gelatina
del tubo 1?
3. De acuerdo con tus observaciones en esta actividad, cul es la fuente de la
enzima que reacciona con el almidn? Con la protena? Ofrece evidencia
que respalde tus respuestas.
4. Identifica los sustratos usados en esta actividad.
5. Cmo muestra esta actividad los efectos de las enzimas sobre los sustratos?

17
 PRACTICA N 4
INFORME EN CLASE

IDENTIFICACION DE ENZIMAS EN PRODUCTOS BIOLOGICOS

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

18
 PRACTICA N 5

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE

La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un indicio, que
podra permitir diagnosticar diversas patologas: diabetes mellitus, mixedema,
hipopituitarismo, etc.

Determinacin enzimtica de glucosa en sangre (Mtodo de Trinder).

La determinacin enzimtica de glucosa sangunea se realiza utilizando 2 enzimas:

glucosa oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalticas en presencia de apropiados
reactivos qumicos, permitirn la formacin de un compuesto coloreado que es
directamente proporcional a la glucosa existente en el medio de reaccin.

Glucosa oxidasa

Glucosa + H2O + 02 Acido glucnico + H2O2

Peroxidasa

2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O

Preparar los siguientes medios de ensayo:

B X St

Suero o plasma ---- 20 L ----

Standard ---- ---- 20 L
Reactivo de trabajo (mL) 2.0 2.0 2.0

Incubar en bao mara a 37 C durante 10 minutos y leer en el espectrofotmetro a 505

nm.

19
 PRACTICA N 5
INFORME EN CLASE

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

20
 PRACTICA N 6

CUANTIFICACIN DE CIDO PIRVICO

I.- Marco terico.

El cido pirvico es un compuesto orgnico clave en el metabolismo. Es el
producto final de la gluclisis, una ruta metablicauniversal en la que la glucosa se
escinde en dos molculas de piruvato y se origina energa (2 molculas de ATP). El
cido pirvico as formado puede seguir dos caminos:

1. Si hay suficiente suministro de oxgeno, el cido pirvico es descarboxilado en

la matriz de la mitocondria por el complejo enzimtico piruvato
deshidrogenasa rindiendo CO2 y acetil coenzima A que es el inicio de una serie
de reacciones llamada ciclo de Krebs, seguida de la fosforilacin oxidativa.
2. Si no hay suficiente cantidad de oxgeno disponible o el organismo es incapaz de
continuar con el proceso oxidativo, el piruvato sigue una ruta anaerbica,
la fermentacin. En esta va, el piruvato se reduce, permitiendo regenerar las
molculas de NAD+ consumidas en los procesos anteriores. Los animales son
capaces de realizar la fermentacin lctica cuyo producto es cido lctico. Las
bacterias y levaduras son ms verstiles, y pueden realizar otras fermentaciones,
como la fermentacin alcohlica, cuyo producto es etanol. En la conversin
en lactato, interviene la enzima lactato deshidrogenasa y la coenzima NADH; en
la fermentacin alcohlica el piruvato es convertido primero en acetaldehdo y
luego en etanol y dixido de carbono, interviniendo las enzimas piruvato
descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, as como la coenzimaNADH.

El cido lctico, un intermediario del metabolismo anaerbico de los hidratos de

carbono, proviene principalmente del msculo esqueltico, cerebro, piel, mdula
renal y eritrocitos. La concentracin de lactato en la sangre depender del balance
entre su produccin en estos tejidos y su metabolismo en hgado y riones.
Aproximadamente el 65% del lactato generado es utilizado por el hgado
principalmente en el proceso de gluconeognesis. Cuando la concentracin de
lactato es mayor a 18 mg/dL (2 mmol/L) el clearence heptico de lactato se satura
aumentando su nivel en sangre. Un ejemplo concreto sucede durante el ejercicio
prolongado en el que los niveles de lactato pueden aumentar significativamente. El
aumento de lactato en sangre asociado a una disminucin del pH arterial recibe el
nombre de acidosis lctica. La disminucin de la oxigenacin tisular (hipoxia) es la
causa ms comn de acidosis lctica por ejemplo hipoxia secundaria a diferentes
condiciones clnicas como shock, neumona, hemorragia aguda, edema pulmonar e
insuficiencia cardaca congestiva. Tambin se han registrado casos de acidosis
lctica en necrosis heptica, neoplasmas, linfomas, varias formas de leucemia, la
deficiencia de tiamina y en la cetoacidosis diabtica. Otras causas de acidosis
lctica incluye la infusin intravenosa de ciertas sustancias como fructosa, sorbitol,
epinefrina y la ingesta incrementada de alcohol y/o acetominofeno. Los niveles de
lactato en el lquido cefalorraqudeo (LCR) son similares a sus niveles en sangre,
pero en presencia de patologas del SNC la concentracin de lactato en LCR vara
21
 en forma independiente observndose un aumento de los niveles de lactato en
lquido cefalorraqudeo (LCR) en meningitis bacteriana, hipocapnia, hidrocefalia,
abscesos cerebrales, isquemia cerebral y/o cualquier condicin clnica asociada a
una oxigenacin reducida del cerebro, inflamacin y/o presin intracraneal
aumentada.

I.- Fundamento del mtodo.

El lactato de la muestra es oxidado por la enzima especfica lactato oxidasa (LOD).
El perxido de hidrgeno formado en esta reaccin es luego utilizado por la
peroxidasa (POD) para generar un cromgeno.

LOD

L-lactato + 02 cido pirvico + H2O2

POD

H2O2 + 4-AF + TOOS cromgeno + 2 H2O

La intensidad cromtica del complejo formado es directamente proporcional a la

concentracin de L-lactato en la muestra y se determina midiendo el aumento de
absorbancia a 540-550 nm.

III.- Materiales y equipos.

1. Equipos y materiales.
a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga.
c. Bao Mara regulado a 37 C.
d. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
e. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
f. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 5 ml.
g. Gradillas, baguetas.

2. Reactivos.
a. Reactivo A: TOOS 3,5 mM; ascorbato oxidasa (pepino) 30 U/ mL;
buffer fosfato 100 mM pH 7,8, azida sdica < 0.1%.
b. Reactivo B: 4-aminoantipirina 5 mM; lactato oxidasa
(microorganismos) 10 U/mL; peroxidasa (rbano picante) 24
U/mL; buffer fosfato 100 mM pH 7,8, azida sdica < 0,1%.
c. Estndar: solucin de lactato a 2g/L.
22
IV.- Procedimiento.
a. En una gradilla disponer 3 tubos de prueba de 13 x 100 ml.,
marcarlos con las letras S (Standard ); P (problema ) y B (blanco ) y
proceder como sigue :

B S P
Standard - 20 ul -
Suero - - 20 ul
Reactivo A 1.75 ml 1.75 ml 1.75 ml
Incubar durante 120 segundos a 37o C. Leer absorbancia a
540-550 nm (blanco de muestra).
Reactivo B 350 uL 350 uL 350 uL
Incubar durante 300 segundos a 37o C. Leer absorbancia a
540-550 nm (concentracin de lactato).

b. Calcular la concentracin de colesterol en g/L aplicando la siguiente

frmula

g / L = lectura del problema x 2

lectura del Standard

Valores de referencia.

Plasma

Sangre venosa: 4,5 - 19,8 mg/dL

Sangre arterial: < 11,3 mg/dL LCR

Neonatos: 10 - 60 mg/dL 3-10 das: 10 - 40 mg/dL > 10 das y

adultos: 10 - 25 mg/dL

CONVERSION DE UNIDADES: 1 mg/dL x 0,111 = 1 mmol/L

23
 PRACTICA N 6
INFORME EN CLASE

CUANTIFICACION DE ACIDO PIRVICO

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

24
 PRACTICA N 7
DETERMINACION DE COLESTEROL EN SUERO SANGUINEO

I.- Marco terico.

La determinacin de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnstica
limitada. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la
formacin de ateromas dado que las complicaciones arteriosclerticas
prevalecen en individuos hipercolesterolmicos. Estudios epidemiolgicos
demuestran que el riesgo de contraer enfermedad cardaca coronaria para
individuos de ms de 40 aos con colesterolemia menor a 2,10 g/l es 3 veces
menor que entre individuos con ms de 2,30 g/l y 6 veces menor que entre
individuos con ms de 2,60 g.

II.- Fundamento del mtodo.

III.- Materiales y equipos.

1. Equipos y materiales.
h. Espectrofotmetro.
i. Centrifuga.
j. Bao Mara regulado a 37 C.
k. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
l. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
m. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 5 ml.
n. Gradillas, baguetas.

2. Reactivos.
d. Reactivo A: solucin de 4-aminobenzofenbona (4-AF) 25mmol/l.
e. Reactivo B: solucin de fenol 55 mmol/L
f. Reactivo C: solucin de lipasa fungal 300 U/ml, colesterol oxidasa
(CHOD) 3 U/ml y peroxidasa (POD) 20 U/ml.
g. Estndar: solucin de colesterol equivalente a 2g/L.
h. Reactivo de trabajo: segn el volumen de trabajo (50 ml), colocar en
una probeta 50 partes de agua destilada, 5 partes del reactivo A, 5
partes del reactivo B y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar
dos partes de reactivo C previamente homogenizado, rotular y usar.

25
IV.- Procedimiento.
c. En una gradilla disponer 3 tubos de prueba de 13 x 100 ml.,
marcarlos con las letras S (Standard ); P (problema ) y B (blanco ) y
proceder como sigue :

B S P
Standard - 20 ul -
Suero - - 20 ul
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Mezclar e incubar 15 minutos a 37C. Luego leer en el
espectrofotmetro a 505 nm.

d. Calcular la concentracin de colesterol en g/L aplicando la siguiente

frmula

g / L = lectura del problema x 2

lectura del Standard

CONVERSION DE UNIDADES
Colesterol (g/l) = colesterol (mg/dl) x 0,01
Colesterol (mmol/l) = colesterol (g/l) x 2,59
Colesterol (g/l) = colesterol (mmol/l) x 0,39

Valores de referencia. 3.87 6.71 mmol/L

V.- Cuestionario.

1. Se requiere de ayuno para realizar la determinacin de colesterol

en sangre?
2. Cul es la implicancia clnica de cuantificar colesterol en suero
sanguneo?

26
 PRACTICA N 7
INFORME EN CLASE

DETERMINACION DE COLESTEROL EN SUERO SANGUINEO

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

4. Objetivos

5. Resultados

6. Conclusiones

27
 PRACTICA N 8
DETERMINACION DE HDL- COLESTEROL EN SUERO SANGUINEO

I.- Marco terico.

Las lipoprotenas plasmticas son partculas esfricas que contienen
cantidades variables de colesterol, triglicridos, fosfolpidos y protenas.
Estas partculas solubilizan y transportan el colesterol en el torrente
sanguneo.
La proporcin relativa de protena y lpido determina la densidad de estas
lipoprotenas. La funcin principal de las lipoprotenas de alta densidad o
HDL (high-density-lipoprotein) en el metabolismo lipdico es la
captacin y transporte de colesterol desde los tejidos perifricos al hgado
en un proceso conocido como transporte reverso de colesterol
(mecanismo cardioprotectivo).
El HDL colesterol bajo, est asociado con un alto riesgo de enfermedad
cardaca. Por este motivo la determinacin de
HDL colesterol es una herramienta til en la identificacin de individuos
de alto riesgo.

II.- Fundamento del mtodo.

Las lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan
precipitando selectivamente las lipoprotenas de baja y muy baja
densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de sulfato de dextrn de
PM 50.000 en presencia de iones Mg
En el sobrenadante separado por centrifugacin, quedan las HDL y se
realiza la determinacin del colesterol ligado a las mismas, empleando el
sistema enzimtico Colesterol oxidasa/ Peroxidasa con colorimetra
segn Trinder (Fenol/4-Aminobenzoifenona)

III.- Materiales y equipos.

1. Equipos y materiales.
o. Espectrofotmetro.
p. Centrifuga.
q. Bao Mara regulado a 37 C.
r. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
s. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
t. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 5 ml.
u. Gradillas, baguetas.

2. Reactivos.
i. Reactivo A: solucin de sulfato de dextrn (PM 50.000) 0,032
mmol/l
j. Reactivo B: solucin de cloruro de magnesio 1,5 M

28
 k. Reactivo de trabajo: preparacin: en el frasco provisto, medir 2,5 ml
de Reactivo A y 2,5 ml de Reactivo B. Mezclar por inversin y
colocar fecha de preparacin. Pueden prepararse cantidades menores
de acuerdo a las necesidades, respetando la proporcin 1 + 1 para
ambos reactivos.

IV.- Procedimiento.
e. En un tubo medir 0,5 ml (500 ul) de muestra, y agregar 50 ul de
Reactivo Precipitante. Homogeneizar agitando (sin invertir) durante
20 segundos y dejar 30-40 minutos en refrigerador (2-10 C) o 15
minutos en bao de agua a la misma temperatura. No colocar en
congelador. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. Usar el
sobrenadante lmpido como muestra. E n 3 t u b o s m a r c a d o s
B, S y D colocar

B S D
Standard - - 100 ul
Suero - 20 ul -
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Mezclar e incubar 5 minutos a 37C. Luego leer en el
espectrofotmetro a 505 nm.

f. Calcular la concentracin de colesterol en g/L aplicando la siguiente

frmula

g / L = lectura del problema x 2

lectura del Standard

Valores de referencia. 0.40 0.60 g/L

V.- Cuestionario.

3. Se requiere de ayuno para realizar la determinacin de HDL-

colesterol en sangre?
4. Cul es la implicancia clnica de cuantificar HDL-colesterol en
suero sanguneo?

29
 PRACTICA N 8
INFORME EN CLASE

DETERMINACION DE HDL-COLESTEROL EN SUERO SANGUINEO

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

30
 PRACTICA N 9

CUANTIFICACIN DE CREATININA

I.- Marco terico.

La creatinina, compuesto sumamente difusible, se elimina del organismo
casi exclusivamente por filtracin renal. Su determinacin en suero, as
como el clearance de creatinina endgena constituyen parmetros
importantes para el diagnstico de diversas afecciones renales. Sin
embargo, debido a los problemas prcticos inherentes a la determinacin
del clea-rance (recoleccin de orina en nios, etc.), la determinacin de
creatinina srica es ms utilizada como ndice de funcionalismo renal.

II.- Fundamento del mtodo.

La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado,
previa desproteinizacin con cido pcrico, obtenindose un cromgeno
que se mide a 510 nm.

III.- Materiales y equipos.

1. Equipos y materiales.
a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga.
c. Bao Mara regulado a 37 C.
d. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
e. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
f. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 5 ml.
g. Gradillas, baguetas.

2. Reactivos.
a. Reactivo A: cido pcrico 41,4 mmol/l
b. Reactivo B: buffer glicina/NaOH 1 mol/l.
c. Estndar: solucin de creatinina 20 mg/l.

IV.- Procedimiento.

a. En caso de que la muestra a utilizar sea suero, debe efectuarse una

desproteinizacin de la siguiente manera: a 0,7 ml de suero agregar
3,5 ml de Reactivo A. Mezclar por inversin. Dejar reposar 10
minutos y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como mnimo.
En tubos marcados B (Blanco), S (Standard), Ds y Do (Desconocidos
suero y orina), colocar:

31
 B S Ds Do
Desproteinizado - - 3 ml -
Estndar - 0.5 ml -
Orina diluida (1:50) - - - 0.5 ml
Agua destilada 1 ml 0.5 ml - 0.5 ml
Reactivo A 2 ml 2ml - 2ml
Reactivo B 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar por inversin. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Luego leer en espectrofotmetro a 510 nm o en fotocolormetro con
filtro verde (500-540 nm), llevando a cero el aparato con agua
destilada

b. Calcular la concentracin de colesterol en mg/l aplicando la siguiente

frmula

mg / l = lectura del problema x 20

lectura del Standard

Valores de referencia.

Suero: 8 a 14 mg/l
Orina: 0,9 a 1,5 g/24 horas

32
 PRACTICA N 9
INFORME EN CLASE

CUANTIFICACIN DE CREATININA

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

33
 PRACTICA N 10
DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS

Las protenas plasmticas cumplen diversas funciones que son muy importantes para un
apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Pueden cumplir funciones de
transporte, catalticas, coagulacin, etc. Su determinacin cuantitativa es muy til para el
diagnstico de algunas patologas como: desnutricin, deshidratacin, cirrosis, etc.

Determinacin de protenas plasmticas total (Mtodo de Biuret)

La determinacin de las protenas totales se realiza utilizando iones cpricos que en

medio alcalino reacciona con las protenas formando compuestos de coordinacin de color
violeta, cuyo pico de mxima absorcin es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la
concentracin de protenas.

Preparar los siguientes medios de reaccin:

B X St

Agua destilada 50 L ---- ----

Suero ---- 50 L ----
Standard de protenas ---- ---- 50 L
Reactivo EDTA/Cu (mL) 3.5 3.5 3.5

Incubar durante 15 minutos a 37 C y leer en el espectrofotmetro a 540 nm.

Determinacin de albmina

La albmina reacciona con el Bromo cresolsulfonftalena a pH 3.8 formando un compuesto

coloreado que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:

B St X

Suero estndar ---- 10 L ----

Suero ---- ----- 10 L
Reactivo BCF (mL) 3.5 3.5 3.5

34
Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer en el
espectrofotmetro a 625 nm.

Cuestionario.

1. Cules son las manifestaciones patolgicas cuando los niveles de

protenas totales y albumina estn por sobre y por debajo de los
niveles referenciales normales?
2. Se requiere de ayuno para realizar la determinacin de albumina y
protenas totales en sangre?
3. Por qu el reactivo de BCF est a pH 3.8 si el pH de la sangre es
de 7.4?
4. Por qu se usa EDTA para determinar protenas totales en sangre?

35
 PRACTICA N 10
INFORME EN CLASE

DETERMINACION DE ALBUMINA Y PROTEINAS TOTALES

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

36
 PRACTICA N 11
DETERMINACION DE UREA EN SUERO

I.- Marco terico.

La rea es el metabolito final del metabolismo de las protenas, es
excretada en grandes cantidades por la orina. Su excrecin es la
funcin principal del rin, representando por s sola bastante ms de
la mitad del residuo slido de la orina. Usualmente constituye del 80
al 90% del nitrgeno total; El cuerpo produce en promedio 25 a 30
gramos de urea al da algo ms en personas que comen dieta rica en
protenas, menos en personas con dieta pobre en protenas Toda esta
urea debe eliminarse por orina; de lo contrario se acumular en
lquidos corporales.

Los dos factores principales que establecen el ritmo de excrecin de

urea son: 1) la concentracin de urea en el plasma, y 2) la intensidad
de filtracin glomerular. Estos factores aumentan la concentracin de
rea.

En general, la cantidad de rea que pasa por los tbulos y va a la

orina es aproximadamente proporcional a la carga de rea que penetra
en los tbulos proximales, en promedio 50 a 60%. Sin embargo, esto
solo es cierto cuando la intensidad de filtracin glomerular es
normal.

Cuando la intensidad de filtracin glomerular es muy baja, el filtrado

persiste en los tbulos por largo tiempo, antes de acabar en la orina.

Como todos los tbulos son por lo menos ligeramente permeables a la

urea, cuanto ms tiempo persista el liquido tubular en los tbulos,
mayor reabsorcin de rea hacia la sangre; la proporcin de rea
filtrada que llega a la orina disminuye considerablemente.

Por otra parte, cuando la filtracin glomerular es muy intensa, el

liquido pasa a travs del sistema tubular tan rpidamente que se
reasorbe muy poca rea. Por lo tanto con intensidad de filtracin
glomerular muy elevada, casi el 100% de rea pasa a la orina.

Es importante destacar que en aquellos pacientes con insuficiencia

renal se debe conservar la intensidad de filtrado glomerular en valores
altos, debido a que cuando esta disminuye demasiado, se incrementa
la rea en sangre.

37
 II.- Materiales y equipos.
1. Equipos y materiales.
p. Espectrofotmetro.
q. Centrifuga.
r. Bao Mara regulado a 37.
s. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
t. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
u. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 1 , 5 y 10 ml.
v. Gradillas, baguetas.

2. Reactivos.
h. Reactivo 1: contiene fenol y nitroprusiato de sodio.
i. Reactivo 2: contiene una solucin concentrada de
hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio.
j. Ureasa en solucin.
k. Standard de rea solucin de rea 60 mg / dL.

III.- Procedimiento.
a. En una gradilla disponer 3 tubos de prueba de 13 x 100 ml.,
marcarlos con las letras S (standard ); P (problema ) y B (blanco ) y
proceder como sigue :

B S P
Standard - 20ul -
Suero - - 20ul
Ureasa I gota I gota Igota
Mezclar por agitacin suave e incubar x 10 minutos a 37C
Luego agregar
Reactivo N 1 mL. 1 1 1
Reactivo N 2 mL. 1 1 1
Mezclar por agitacin suave e incubar x 10 minutos a 37C
Luego agregar
Agua destilada mL 10 10 10
b. Mezclar y dejar reposar 5 minutos y leer a 530 nn.
c. Calcular la concentracin de rea en mg/dL aplicando la siguiente
frmula

mg / dL = lectura del problema x 60

lectura del Standard

Valores de referencia. De 20 a 45 mg / dL.

38
IV.- Cuestionario.

8. Explique porque para obtener mg/dL, se multiplica por 60.

9. Cmo se convierte el N urico en urea y, viceversa?
10. Grafique la interrelacin del ciclo de la urea con el ciclo de Krebs.
11. Indique que enzimas actan en la mitocondria, y cules en el
citoplasma, en el ciclo de la rea.
12. Se requiere de ayuno para realizar la determinacin de rea en
sangre?

39
 PRACTICA N 11
INFORME EN CLASE

DETERMINACION DE UREA EN SUERO

Apellidos Nombre(s) Mesa N Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

40