MEDICINA Y CIENCIAS
DE LA SALUD
Identificacin de espermatozoides humanos
en muestras contaminadas con levaduras
Identification of human spermatozoids in samples contaminated with
yeast
Beatriz Reina-Bouvet *
Adriana Beatriz-Pavesi
Cecilia Vicenta-Paparella
Adriana Mara-Ombrella
Universidad Nacional Rosario,
Facultad de Ciencias Bioqumicas
y Farmaceticas Suipacha 531- 2000.
Rosario Santa Fe-. Argentina
*Autora para correspondencia:
beatrizbouvet@arnet.com.ar
Fecha de recepcin:
13 de julio de 2016
Fecha de aceptacin:
3 de enero de 2017
Fotografa elaborada por: Alejandra de Len Rubio
RESUMEN
La violencia sexual es un pro-
blema mundial, y representa
un delito grave que frecuen-
temente es difcil imputar, an-
te la ausencia de testigos. La
valoracin de las muestras de
semen enviadas al laborato-
rio, para la deteccin de es-
permatozoides, es de gran im-
portancia para encontrar al
agresor; sin embargo, la evi-
dencia no es sencilla, por la
presencia de otros organis-
mos y la labilidad esperm-
tica. El objetivo del presen-
te estudio fue identificar es-
permatozoides humanos en
muestras contaminadas con
levaduras. Se aplicaron dife-
rentes tcnicas y recursos
microscpicos. Se selecciona-
ron 46 muestras de semen
fresco. Se dividieron en dos
ISSN 2007-7521. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017)
grupos: G1 normo u oligozoos-
prmicas (n = 28) y G2 azo-
osprmicas (n = 18). Cada
muestra se diluy 1:1 con so-
lucin fisiolgica y se agre-
garon 0.05 mL de suspensin
de levaduras Candida albicans.
Como control, se procesaron
testigos puros de espermato-
zoides (CE) y levaduras (CL).
Las muestras se analizaron
con microscopio ptico (MO),
contraste de fase (CF), de luz
polarizada (LP) y microsco-
pio fluorescente (MF) con di-
ferentes tcnicas de tincin.
El tinte Papanicolaou mostr
mayor eficiencia que el tin-
te hematoxilina verde bri-
llante (P < 0.05) para iden-
tificar espermatozoides con
microscopio ptico. La de-
teccin de elementos refrin-
gentes mostr mayor correla-
CienciaUAT 23
 cin con la presencia de espermatozoides P < 0.001), that the presence of birrefringent
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(CF: r = 0.966; P < 0.001), que la presencia elements (LP: r = 0.737; P < 0.001) and fluo-
de elementos birrefringentes (LP: r = 0.737; rescent elements (MF: r = 0.487, P < 0.05).
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P < 0.001) y elementos fluorescentes (MF:
r = 0.487; P < 0.05). La microscopa con-
focal con tincin de blanco de calcofluor-
azul de Evans y naranja de acridina permi-
ti la identificacin de contaminacin por
levaduras. El empleo de tcnicas microsc-
picas auxiliadas con tcnicas de tincin per-
mite confirmar la presencia de espermato-
zoides enteros o fragmentados en muestras
de semen contaminadas con levaduras.
Confocal microscopy with Evans blue calco-
fluor white stain and acridine orange allowed
the identification of yeast contamination.
The use of microscopic techniques aided by
staining techniques confirms the presence of
whole or fragmented spermatozoa in semen
samples contaminated with yeasts.
KEYWORDS: spermatozoa, yeast, semen, foren-
sic medicine, microscopic techniques.

PALABRAS CLAVE: espermatozoide, levaduras, INTRODUCCIN

semen, medicina legal, tcnicas microscpicas. La violencia sexual consiste en la realiza-
cin de todo acto sexual sin consentimiento
ABSTRACT ni deseo por parte de la vctima e implica
Sexual violence is a global problem, and re- utilizacin de fuerza fsica o intimidacin
presents a serious felony which is often di- (OMS, 2013). Tiene un impacto profundo en
fficult to impute due to the absence of wit- la salud fsica y mental de las vctimas y se
nesses. The evaluation of semen samples encuentra asociada tanto a lesiones fsicas
sent to the laboratory, for the detection of como a un aumento del riesgo de padecer
spermatozoa is of great importance to find una serie de problemas de salud sexual y re-
the aggressor. However the evidence is not productiva, con consecuencias inmediatas y a
simple due to the presence of other orga- largo plazo (Arroyo-Snchez, 2016).
nisms and sperm lability. The objective of
the present study was to identify human Este delito constituye un problema global, tan-
spermatozoa in samples contaminated with to en trminos geogrficos, como en el hecho
yeast. Different techniques and microscopic de que no distingue entre edad y sexo (Corts-
resources were applied and 46 samples of Arboleda y col., 2011). En Amrica Latina es
fresh semen were selected. They were divi- uno de los problemas ms graves de salud p-
ded into two groups: G1 normo or oligozoos- blica por su asociacin con enfermedades ve-
perms (n = 28) and G2 azoosperms (n = 18). nreas, embarazos no deseados y problemas
Each sample was diluted 1:1 with physiolo- psicolgicos (Fernndez-Moreno, 2015). Anual-
gical solution and 0.05 mL of yeast suspen- mente se reportan 87 589 violaciones en
sion Candida albicans was added. As con- Amrica Latina y el Caribe, lo que representa
trols, pure sperm (CE) and pure yeast (CL) aproximadamente 240 denuncias diarias con
were processed. The samples were analyzed una tasa regional de 16.4 por cada 100 000 ha-
with optical microscopy (MO), phase contrast bitantes, segn datos reportados en 2011 a
(CF), polarized light (LP) and fluorescent mi- la Oficina de las Naciones Unidas contra la
croscope (MF) with different staining te- Droga y el Delito (UNODC, por sus siglas en
chniques. Papanicolaou dye showed greater ingls: United Nations Office on Drugs and
efficiency than bright hematoxylin-green dye Crime), por la mayora de los pases, con ex-
(P < 0.01) to identify spermatozoa with an cepcin de Nicaragua (2010), Guatemala y
optical microscope. The presence of refrin- Per (2009), Argentina (2008), Ecuador (2006)
gent elements showed a higher correlation with y Suriname (2004) (Fleitas, 2014). Al respec-
the presence of spermatozoa (LP: r = 0.966; to, el Observatorio de Criminalidad del Minis-

CienciaUAT 24 CienciaUAT. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017). ISSN 2007-7521

terio Pblico del Per (Ministerio Pblico Fis- e involucra delitos de ndole sexual, frecuen-
cala de la Nacin, 2014) report que se re- tes en medicina legal (Tmara, 2013).

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cibieron 17 763 denuncias por el delito con-

DE LA SALUD
tra la libertad sexual en todo el pas, corres- En medicina legal es esencial rastrear la evi-
pondiendo a la ciudad de Lima una tasa de dencia y tomar muestras del material biol-
37.96 por cada 100 000 habitantes. Adems gico para documentar el presunto contacto
se seala que el 75 % de las vctimas fue- sexual o fsico, as como corroborar la his-
ron menores de edad y que el 34 % fue- toria de la vctima y el presunto agresor, pa-
ron ultrajadas sexualmente (Aguilar-Cabrera, ra recabar informacin que resulte til en
2013; Snchez, 2015). la resolucin del proceso legal. Dentro de la
evidencia que se debe tomar tempranamen-
En Estados Unidos se publicaron estudios que te est la ropa ntima de la vctima, mues-
demuestran ndices significativamente ms al- tras de la cavidad oral en casos donde se ha-
tos de agresin sexual en el ejrcito, en com- ya referido sexo oral como parte de la agre-
paracin con reportes civiles, exacerbando la sin, muestras de las manos y uas, as como
gravedad de este problema (Stander y Thom- muestras de piel (Arroyo-Snchez, 2016).
sen, 2016). Por otro lado, en Mxico, Andra-
de-Rubio (2016), report una asociacin, ya La valoracin mdico legal proporciona evi-
sea como causa o consecuencia, entre la vio- dencia de la agresin tendiente a facilitar
lacin sexual y la migracin de las mujeres la identificacin, enjuiciamiento, condena y
dedicadas al trabajo agrario en Tamaulipas. castigo de los ofensores. A pesar de lo im-
portante que es obtener esta evidencia, de-
Los movimientos feministas no solo han con- be alcanzarse un balance entre la adquisi-
tribuido a visibilizar la discriminacin y vio- cin de las muestras y la atencin de las
lencia contra las mujeres, sino a impulsar dems necesidades de la vctima, en tan-
un proceso de reivindicacin que procura la to que una conducta insensible o forzosa, al
equidad de gnero y la construccin de polti- realizar el examen forense, podra conver-
cas pblicas coherentes con sus necesida- tirse en una segunda violacin (Dickens,
des reales. En este marco, las vctimas cons- 2015).
cientes de sus derechos, asumen los hechos
de violencia sexual no como una valora- En los delitos sexuales, la valoracin mdico
cin social a esconder, sino que realizan las forense se realiza bajo un protocolo estanda-
denuncias pertinentes para procurar la de- rizado. La toma de las muestras, con el con-
tencin del culpable (Afanador-Contreras y sentimiento informado de la vctima, debe
Caballero-Badilla, 2012). A menudo, las vcti- tener en cuenta las caractersticas y cir-
mas que deciden reportar un delito sexual cunstancias en que ocurrieron los hechos
buscan ayuda a travs de la polica, desde y el tiempo transcurrido. En todo momento
donde son remitidas a un centro de salud se debe garantizar la cadena de custodia y
para realizar una valoracin mdica, o in- quedar documentada. An cuando el indi-
cluso las vctimas acuden de manera direc- cio ms categrico es el semen, el no hallaz-
ta a los servicios de salud (Arroyo-Snchez, go del mismo no implica la ausencia de ac-
2016). Estos delitos se caracterizan por la ceso carnal, solo la falta de eyaculacin del
ausencia de testigos, y el laboratorio adquie- autor; de la misma manera, la presencia del
re importancia en la valoracin, siendo el indicio, o sea del semen, no indica presen-
semen el indicio ms importante en este cia del delito, sino solo la realizacin del
tipo de hechos (Espn-Falcn y col., 2008). acto, cobrando importancia la intervencin
El estudio del fluido seminal en qumica fo- y el anlisis del laboratorio forense (Vega-
rense est relacionado con el derecho penal Vega y col., 2014).

Reina-Bouvet y col. (2017). Identificacin de espermatozoides humanos en muestras con levaduras CienciaUAT 25
 El semen est compuesto mayoritariamente rodeado de nueve pares de microtbulos pe-
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por la secrecin de las glndulas sexuales rifricos y permite el desplazamiento con

anexas y un pequeo porcentaje: 2 % a 3 % movimiento ondular de la gameta masculina
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por espermatozoides (Lpez-Garca y col., (WHO, 2010).

2012).
Entre los componentes qumicos del plas-
El 46 % al 80 % del fluido seminal es aporta- ma seminal, el cinc secretado por la glndu-
do por las vesculas seminales, 13 % a 33 % la prosttica, se encuentra en concentracin
es secretado por la glndula prosttica, apro- 100 veces superior al suero sanguneo, reu-
ximadamente 5 % proviene de los testculos niendo las caractersticas suficientes para
y el epiddimo, y 2 % a 5 % de la secrecin ser utilizado como marcador forense de pre-
de las glndulas uretrales y bulbouretrales. sencia de semen (Pavesi y col., 2010). La
En cuanto a la composicin qumica del se- fosfatasa cida prosttica (FAP), es sinteti-
men, contiene mayoritariamente cido ctri- zada por la glndula prosttica y secretada
co, aminocidos libres, fructosa, fibringeno, en el semen durante la eyaculacin. La ac-
enzimas, fosfatidilcolina, carnitina, prostaglan- tividad de FAP est incrementada en el flui-
dinas, potasio y cinc (Carma, 2010). do seminal y es detectable aun en muestras
sometidas a condiciones desfavorables, co-
El elemento fundamental en la identifica- mo la exposicin a temperaturas elevadas;
cin del fluido seminal es el hallazgo del su determinacin es un recurso aplicable a
espermatozoide, compuesto por cabeza, seg- la bsqueda de semen, adquiriendo impor-
mento intercalar o intermedio y cola o fla- tancia como marcador forense en casos de
gelo. La cabeza presenta forma ovalada vis- muestras azoosprmicas (no contienen esper-
ta de frente y piriforme de perfil; mide de matozoides) u oligozoosprmicas (concentra-
4 m a 5 m de longitud y 2.5 m a 3.5 m cin espermtica menor a 15 millones por
de ancho. Contiene el ncleo haploide con mL de semen) (Pavesi y col., 2008). Otro
cromatina compacta altamente resistente a marcador de presencia de fluido seminal es
la digestin, el acrosoma en la parte an- la determinacin de la enzima lactato des-
terior y un par de centrolos detrs del hidrogenasa (LDH), cuya actividad en plas-
ncleo (distal y proximal). El acrosoma es ma seminal es superior al valor en suero y
una estructura tipo capuchn, contiene enzi- adems, la isoenzima LDH C4 es especfica
mas hidrolticas como hialuronidasa, acrosina, del epitelio seminal (Pavesi y col., 2011). La
fosfatasa cida y neuraminidasa, que facili- deteccin de componentes del fluido semi-
tan la penetracin del espermatozoide a la nal es importante, sin embargo, el diagns-
zona pelcida del ovocito (WHO, 2010). El tico de certeza de la presencia de semen es
segmento intercalar es una regin cilndrica el hallazgo de al menos un espermatozoide.
estrecha, de 5 m de longitud, que une la
cabeza con la cola o flagelo, y contiene la Aunque el hecho de no observar un esper-
carga mitocondrial que provee la ener- matozoide en las muestras examinadas no
ga necesaria (ATP) para la movilidad del excluye la presencia de semen, dado que
espermatozoide (WHO, 2010). La cola o por la fragilidad del espermatozoide a ni-
flagelo es una estructura importante para vel del segmento intercalar pueden apare-
la movilidad del espermatozoide. Tiene una cer slo cabezas espermticas, que debido
longitud de 40 m a 50 m, desenrollada y a su morfologa ovoide y longitud de 4 m
uniforme. En la parte central del flagelo y a 5 m, pueden confundirse con levaduras
en toda su extensin se encuentra el axo- en las observaciones microscpicas en fres-
nema o filamento axial, que es un sistema co, e incluso con coloracin de Gram-Nicolle,
microtubular formado por un par central ya que los espermatozoides se colorean co-

CienciaUAT 26 CienciaUAT. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017). ISSN 2007-7521

mo Gram negativos y las levaduras son Gram men normo u oligozoosprmicas con con-
variables. centracin espermtica entre 10 millones

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por mL y 30 millones por mL de semen; y

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Ante la elevada frecuencia de muestras fo- G2 (n = 18) muestras seminales azoosprmi-
renses clasificadas como presuntivas, es un cas: sin espermatozoides y slo contenan
desafo buscar mtodos confiables que per- fluido seminal. Se tom 1 mL de cada una
mitan corroborar la presencia de cabezas de las muestras y se diluy en proporcin
de espermatozoides, logrando un punto de in- 1:1 con solucin fisiolgica. A cada tubo se
flexin en la qumica forense, dado que el le adicionaron 0.05 mL de suspensin de le-
hallazgo certero de cabezas de espermato- vaduras Candida albicans, conteniendo 20 mi-
zoides permite confirmar la presencia de se- llones de clulas/mL, contadas utilizando una
men y adems en las cabezas espermti- cmara de Neubauer (bright-line HBG, Ger-
cas se encuentra el cido desoxirribonuclei- many) provenientes de un cultivo en medio
co (ADN), permitiendo la identificacin del Sabouraud-glucosa. Como control de la ob-
agresor. Por otra parte, el no hallazgo de es- servacin microscpica de las clulas a iden-
permatozoides en el material proveniente de tificar (espermatozoides y levaduras), se pro-
una violacin puede deberse a que el cau- cesaron testigos puros, consistentes en: una
sante del delito es azoosprmico o puede ha- muestra con espermatozoides en concentra-
ber utilizado preservativo, y es otra de las cin de 20 millones de espermatozoides/mL
situaciones en las que un ensayo de labo- en solucin fisiolgica (CE) y una muestra
ratorio puede dar resultado negativo (Tma- con levaduras en concentracin de 20 millo-
ra, 2013; Turvey, 2014). nes de clulas/mL en el mismo medio (CL)
(Guarner y Brandt, 2011; Villarroel-Rodrguez y
El objetivo de este estudio fue reconocer es- Santa-Cruz-Rodrguez, 2011). Todas las mues-
permatozoides humanos en muestras conta- tras analizadas se procesaron por duplicado
minadas con levaduras. y como resultados se tomaron los promedios
de los porcentajes de espermatozoides y de
MATERIALES Y MTODOS levaduras hallados en los duplicados. Se apli-
Se trabaj con muestras seminales provenien- caron diferentes tinciones y recursos micros-
tes de pacientes del Laboratorio Mixto de cpicos con el fin de identificar con certeza
Reproduccin de las Facultades de Ciencias espermatozoides y levaduras.
Bioqumicas y Farmacuticas y de Ciencias
Mdicas de la Universidad Nacional de Ro- Identificacin de espermatozoides aplicando
sario, radicado en el Hospital Provincial del microscopio ptico
Centenario de la ciudad de Rosario en la Se analiz la eficiencia de las tinciones he-
provincia de Santa Fe de la Repblica Ar- matoxilina verde brillante y Papanicolaou pa-
gentina. El proyecto fue revisado y aproba- ra identificar la presencia de espermatozoides,
do por evaluadores designados por la Secre- a travs de sus caractersticas morfolgicas,
tara de Ciencia y Tecnologa y el Comi- en muestras normo u oligozoosprmicas (G1);
t de tica de dicha Secretara. Todos los pa- adems, se analizaron las muestras azoospr-
cientes entregaron su consentimiento infor- micas (G2) y los controles de espermatozoi-
mado, para que el remanente de la mues- des y levaduras, para evaluar resultados fal-
tra de semen, luego de procesar e informar sos positivos y falsos negativos (WHO, 2010;
las determinaciones indicadas por el mdi- Brito y col., 2011). Se trabaj con 0.5 mL de
co solicitante, se utilicen con este prop- las muestras, las cuales, se centrifugaron du-
sito. Se seleccionaron 46 muestras de se- rante 10 min a 250 xg. Se descart el sobre-
men fresco, que se dividieron en dos grupos: nadante y con el sedimento se realizaron dos
G1 (n = 28) integrado por muestras de se- extendidos en portaobjetos que se fijaron con

Reina-Bouvet y col. (2017). Identificacin de espermatozoides humanos en muestras con levaduras CienciaUAT 27
 etanol-ter (1:1); y se aplicaron las respec- terna. El anlisis de birrefringencia de los
MEDICINA Y CIENCIAS

tivas tinciones, utilizando colorantes nuevos, espermatozoides mediante la aplicacin de

para evitar el arrastre de material prove- microscopa con LP es una herramienta adi-
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niente de coloraciones previas. Los exten- cional que permite evaluar la organizacin
didos teidos se evaluaron con microscopio de los organelos situados en la cabeza y el
ptico (Leitz Laborlux 11, Germany) y obje- flagelo espermtico. El ncleo espermtico
tivo de inmersin (1000x). Se consider: maduro presenta birrefringencia intrnseca
asociada con sus filamentos proteicos orde-
Resultado positivo: hallazgo de al menos un es- nados y orientados longitudinalmente. La or-
permatozoide completo. ganizacin microtubular del axonema y de
Resultado presuntivo: solo se observan cabe- las mitocondrias en la pieza intermedia tam-
zas. bin presentan birrefringencia (Gianaroli y
Resultado negativo: no se observan clulas es- col., 2010).
permticas.
Se compararon los resultados obtenidos con En el anlisis con microscopio de fluores-
ambas tinciones aplicando la prueba Chi cencia (MF) (Nikon Eclipse 50 i, Japn) se
cuadrado (2). utiliz el fluorocromo naranja de acridina, el
cual, por sus caractersticas metacromticas,
Identificacin de espermatozoides y levadu- al intercalarse como monmero entre las
ras aplicando microscopio con contraste de dos cadenas del ADN nuclear de las cabe-
fases, luz polarizada y de fluorescencia zas de los espermatozoides, presenta un mxi-
Se trabaj con las muestras de los grupos G1 mo de excitacin a 502 nm y de emisin a
y G2 provenientes de diluciones de semen a 525 nm, que se observa de color verde si el
las que se agreg suspensin de levaduras. ADN se encuentra nativo y anaranjado si se
Como control de la observacin microscpi- encuentra desnaturalizado. En dichas condi-
ca se procesaron testigos puros de esperma- ciones, las levaduras no producen interfe-
tozoides (CE) y de levaduras (CL). Se toma- rencia. Por otra parte, este mismo fluoro-
ron 0.5 mL de cada muestra y se centrifu- cromo puede asociarse con el cido ribo-
garon 10 min a 250 xg. Se descart el sobre- nucleico (ARN) fngico, y bajo condiciones
nadante y se coloc una gota del sedimen- de excitacin de 460 nm y de emisin a
to entre porta y cubre objeto, se aplicaron dis- 550 nm emite una fluorescencia roja, la cual
tintos recursos microscpicos. fue analizada pero no reportada, para con-
firmar que las muestras no presentaban in-
Mediante microscopa con contraste de fa- terferencia cromticas durante su anlisis.
ses (CF) utilizando microscopio (Zeiss 37081,
Germany) se determin el porcentaje de ele- En este anlisis se trabaj solo con 23 de
mentos refringentes (espermatozoides) y opa- las 28 muestras disponibles por cuestiones
cos (levaduras). tcnicas. Se midi el grado de asociacin de
las tres variables CF, LP y MF con el n-
Con microscopio ptico (Leitz Laborlux 11, mero de espermatozoides a travs del coefi-
Germany) y colocando polarizadores en los ciente de correlacin de rangos Spearman.
oculares y en el objetivo, para generar luz
polarizada (LP), se identificaron espermato- Identificacin de levaduras aplicando mi-
zoides y/o cabezas espermticas. La tcnica croscopa confocal con blanco de calcofluor-
se fundamenta en las caractersticas birre- azul de Evans y naranja de acridina
fringentes que presenta el espermatozoide El microscopio confocal (MFC) emplea una
como consecuencia de las propiedades ani- tcnica ptica de imagen para incrementar
sotrpicas de su textura protoplsmica in- el contraste o reconstruir imgenes tridimen-

CienciaUAT 28 CienciaUAT. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017). ISSN 2007-7521

sionales utilizando un colimador para elimi-
nar la luz desenfocada o destellos de la len-
te, en especmenes que son ms gruesos que
el plano focal (Saldaa y col., 2010). La aper-
tura localizada delante del fotomultiplicador
evita el pasaje de fluorescencia de las re-
giones de la muestra que no estn en fo-
co, la luz que proviene de regiones localiza-
das por encima o por debajo del plano focal
no converge en el orificio y no es detecta-
da por el fotomultiplicador (Saldaa y col.,
2010).
La aplicacin de MCF, al eliminar la luz
procedente de los planos fuera de foco, per-
mite observar imgenes con alta resolucin,
nitidez y contraste. Se pueden utilizar vari-
os fluorocromos y obtener seales sin sola-
pamiento, generando mltiples imgenes de
cada uno de los fluorocromos superpuestas
en una imagen nica (Snchez-Armendriz
y col., 2013). Se aplic MCF para identifi-
car levaduras que son frecuentes contami-
nantes de las muestras forenses donde se
investiga presencia de semen. Se utiliz una
solucin en proporcin 1:1 de dos fluoro-
cromos: a) blanco de calcofluor 1.0 g/L y
azul de Evans 0.5 g/L, que emite fluorescen-
cia azul en presencia de levaduras (ARN).
El blanco de calcofluor tie de color azul
las paredes celulares que contienen quitina,
celulosa y otros polisacridos con uniones
-1,4 (Vzquez y col., 2016). Cuando se em-
plea la luz UV, las paredes fngicas emi-
ten fluorescencia de color entre verde bri-
llante y azul, mientras que otros materia-
les fluorescen de color rojizo-amarronado;
b) naranja de acridina 0.01 % en buffer fos-
fato salino (PBS, por sus siglas en ingls
phosphate buffered saline) que emite fluo-
rescencia verde en presencia de cabezas es-
permticas (ADN). Esta tcnica microscpi-
ca utiliza iluminacin puntual, en un pla-
no ptico conjugado frente del detector, por
lo que elimina la informacin ubicada fuera
del plano focal, registrando solamente la luz
que est dentro de este plano (Alberts y col.,
2006). Adems es sensible, especfica, brin-
Reina-Bouvet y col. (2017). Identificacin de espermatozoides humanos en muestras con levaduras
da imgenes tridimensionales con elevada
resolucin y es utilizada con creciente fre-
MEDICINA Y CIENCIAS
cuencia para estudios micolgicos (Forbes y
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col., 2009; Snchez-Armendriz y col., 2013).
Se analizaron por separado 0.5 mL de mues-
tras correspondientes a los grupos G1 y G2as
como CE y CL. Se centrifugaron durante 10 min
a 250 xg. Luego de descartar el sobrenadan-
te se agreg al sedimento de cada muestra
0.05 mL de la solucin compuesta por los
2 fluorocromos (a:b) y se analiz con el mi-
croscopio confocal Nikon Eclipse TE-2000-E
(Japn). El anlisis estadstico de los pro-
medios de los porcentajes de clulas azules,
indicadoras de presencia de levaduras, entre
los grupos; se realiz aplicando la prueba
t - Student.
RESULTADOS
La tincin de hematoxilina verde brillante
permiti identificar slo 8 muestras positi-
vas (28.6 %) del total de 28 analizadas del
Grupo 1 (normo u oligozoosprmicas), y dio
4 resultados negativos (Tabla 1). La tin-
cin Papanicolaou permiti identificar como
positivas al 50 % de las muestras, y como
presuntivas al otro 50 %, sin arrojar mues-
tras negativas. En el grupo G2 se obtuvie-
ron resultados negativos aplicando ambas tin-
ciones en las 18 (100 %) muestras analizadas.
El anlisis de las muestras control confir-
m que ambas tinciones daban positivo en
presencia de espermatozoides y negativo en
presencia de levaduras. Estos resultados in-
dicaron que las dos tinciones pueden utili-
zarse para la bsqueda de espermatozoides
en muestras biolgicas contaminadas por le-
vaduras, pero la tincin de Papanicolaou ofre-
ce mayor sensibilidad (P < 0.05).
En cuanto al anlisis de las muestras semi-
nales, con distintos recursos microscpicos,
para reconocer espermatozoides en mues-
tras contaminadas con levaduras, se analiz
la correlacin de las variables con el por-
centaje de elementos refringentes (CF) (Fi-
gura 1A), el porcentaje de elementos birre-
CienciaUAT 29
 Tabla 1. Identificacin de espermatozoides aplicando microscopio ptico con las tinciones hemato-
xilina verde brillante y Papanicolaou.
MEDICINA Y CIENCIAS

Table 1. Spermatozoa identification applying optical microscope with the bright hematoxylin-green
DE LA SALUD

and Papanicolaou stains.

Hematoxilina
Identificacin Dictamen Papanicolaou
Espermatozoides
Positivo 14 (50.0 %) 8 (28.6 %)
completos
Cabezas Presuntivo 14 (50.0 %) 16 (57.1 %)
Negativo Negativo 0 4 (14.3%)
Espermatozoides
Positivo 0 0
completos
Cabezas Presuntivo 0 0

Negativo Negativo 18 (100 %) 18 (100 %)

Espermatozoides
Positivo 1 (100 %) 1 (100 %)
completos
Negativo Negativo 0 0
Espermatozoides
Positivo 0 0
completos
Negativo Negativo 1 (100 %) 1 (100 %)

fringentes (LP) (Figura 1B) y el porcentaje
de elementos fluorescentes (MF) (Figura 1C)
con el nmero de espermatozoides observa-
dos en las muestras. Aplicando el coeficien-
te de correlacin de rangos Spearman, se en-
contr que, si bien las tres variables corre-
lacionan con el nmero de espermatozoi-
des en forma directa y significativa, el ma-
yor coeficiente se observ con la variable
porcentaje de elementos refringentes obteni-
do por CF (r = 0.966), indicando una fuerte
asociacin con el nmero de espermato-
zoides (P < 0.001) (Figura 1A). Estos resul-
tados demostraron que mediante la aplica-
cin de CF es posible identificar esperma-
tozoides en presencia de levaduras, brindan-
do informacin importante en el esclareci-
miento de casos periciales donde se investi-
ga la presencia de semen humano. Se en-
contr tambin un nivel ms bajo de aso-
ciacin (aunque significativo) para el anlisis
de LP (r = 0.737; P < 0.001) (Figura 1B) y
MF (r = 0.487; P < 0.05) (Figura 1C) por lo que
no son tcnicas adecuadas cuando se bus-
ca alto nivel de discriminacin en el labo-
ratorio, especialmente al tratarse del escla-
recimiento de delitos graves.
En las muestras seminales y controles ana-
lizados con MCF, y la tincin blanco de cal
cofluor-azul de Evans y naranja de acridina
para identificar levaduras en presencia de
espermatozoides, se observ en G2 solo clu-
las azules (100 %) indicadoras de presencia
de levaduras, como en la muestra CL. Mien-
tras que G1 present menor porcentaje de c-
lulas azules (22.62 %), porque adems de le-
vaduras las muestras contenan espermato-
zoides. En la muestra CE no se observaron
clulas azules. Se aplic la prueba t Student
para evaluar la diferencia entre los prome-
dios de los porcentajes de clulas azules in-

CienciaUAT 30 CienciaUAT. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017). ISSN 2007-7521

Figura 1. Identificacin de espermatozoides por tcnicas microscpicas analizando elementos refrin-
gentes, birrefringentes y fluorescentes.

MEDICINA Y CIENCIAS
Figure 1. Spermatozoa identification by microscopy techniques analyzing the refringent, birrefringent

DE LA SALUD
and fluorescent elements.

(CF)

r = 0. 966
P < 0. 001
(LP)

r = 0. 737
P < 0. 001
(MF)

r = 0. 487
P < 0. 05

Reina-Bouvet y col. (2017). Identificacin de espermatozoides humanos en muestras con levaduras CienciaUAT 31
 dicadoras de levaduras entre los grupos G1 y los marcadores de las glndulas anexas co-
MEDICINA Y CIENCIAS

G2 y se hall diferencia estadsticamente sig- mo FAP y cinc, que adquieren relevancia en

nificativa (P < 0.001) (Tabla 2). Estos resul- casos de delitos sexuales realizados por suje-
DE LA SALUD

tados indicaron que la metodologa aplicada tos azoosprmicos (Pavesi y col., 2008; 2010).
contribuye al reconocimiento de levaduras Adems, Tmara (2013), estudi la aplica-
que son frecuentes contaminantes del mate- cin de diferentes mtodos y recursos anal-
rial que se recoge en las pericias forenses; ticos, segn las disponibilidades de cada labo-
siendo un recurso microscpico confiable en ratorio para el reconocimiento e identificacin
la resolucin de casos periciales que involu- de manchas de semen (Tmara, 2013).
cran abuso sexual, donde muchas veces, por
las condiciones adversas a las que son so- En el presente estudio, la tincin de hema-
metidas las muestras, es difcil determinar si toxilina verde brillante permiti la deteccin
son levaduras o cabezas espermticas. positiva de semen en el 85.7 % de las 28
muestras del G1, pero solo permiti detec-
DISCUSIN tar espermatozoides completos en el 28.6 %
La Criminalstica es una ciencia de carc- de las muestras (dictamen positivo). La tin-
ter emprico e interdisciplinario, donde se in- cin de Papanicolaou fue ms eficiente, de-
tegran mtodos y tcnicas para verificar, exa- terminando semen en el 100 % de las mues-
minar y analizar vestigios, indicios y evi- tras analizadas y cabezas espermticas (es-
dencias de toda ndole y origen, dejados por permatozoides incompletos: dictamen presun-
cualquier individuo, sea ste presunto o cul- tivo) en el 50 % de las muestras. Estos por-
pable de la comisin de un delito (Ccaza-Za- centajes son mayores a los reportados por
pana, 2013). El semen est constituido por las Quispe-Mayta y col. (2010), quienes lograron
secreciones provenientes de los testculos, el la deteccin positiva de semen en 60 % de
epiddimo, la glndula prosttica, las vesculas los casos evaluados, aplicando la combinacin
seminales, las glndulas de Cowper y de Litre. de tres mtodos para pesquisar fluido seminal
en muestras forenses, en 37 % de los casos
El estudio de manchas de semen tiene gran detectaron presencia de fosfatasa cida, en
importancia en criminalstica, ya que consti- 35 % encontraron antgeno prosttico espe-
tuye una prueba precisa y est asociada a cfico, y espermatozoides en 25 %, aplican-
crmenes de ndole sexual. El reconocimien- do tincin Fast Nuclear Red (Quispe-Mayta y
to es sencillo en manchas seminales de re- col., 2010).
ciente data, pero se complica al transcurrir
el tiempo (Tmara, 2013). Si bien, el hallaz- El hallazgo de un espermatozoide es un es-
go de un espermatozoide es diagnstico ge- tndar de oro en la ciencia forense, pero este
nrico de semen en qumica forense (Tra- caso no es de alta frecuencia, debido a la
tado de Criminalstica, 2007), es importante labilidad del espermatozoide frente a cam-
recordar que pueden no hallarse espermato- bios osmticos y a la deshidratacin, que trae
zoides en casos de violaciones realizadas por como consecuencia la observacin de slo
sujetos azoosprmicos e incluso oligozoospr- cabezas de los mismos (Khaldi y col., 2004).
micos, y en estas situaciones el estudio de El espermatozoide es una clula con carac-
marcadores bioqumicos del fluido seminal tersticas morfolgicas especiales, y aplican-
contribuye a esclarecer el delito (Pavesi y col.,
do diferentes coloraciones se observa inten-
2008; 2010; 2011). samente teido el ncleo y en forma tenue
el acrosoma (WHO, 2010). Estas peculiarida-
La mayora de las investigaciones se foca- des pueden no ser ptimas en circunstan-
lizaron en la bsqueda de los espermatozoi- cias donde el material estuvo expuesto a con-
des (Quispe-Mayta y col., 2010), seguidos por diciones desfavorables y en presencia de con-

CienciaUAT 32 CienciaUAT. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017). ISSN 2007-7521

 Tabla 2. Microscopio confocal: porcentaje de levaduras.
Table 2. Confocal microscope: yeast percentage.

MEDICINA Y CIENCIAS
DE LA SALUD
Grupo 2 Control Control
(azoosprmicas) espermatozoides levaduras (CL)
levaduras (%) (CE) levaduras levaduras (%)
(n= 18) (%) (n=1) (n = 1)
Blanco de
calcofluor-azul de
22.62 10.9 100.00 0.00 0.00 100.00 0.00
Evans + naranja
de acridina
Valores promedio y desviacin estndar.

taminantes como las levaduras. En dichas en el reconocimiento de levaduras, los resul-

condiciones se observan solo cabezas esper- tados del presente trabajo son comparables
mticas y debido a sus caractersticas mor- a los de Snchez-Armendriz y col. (2013),
folgicas pueden confundirse con levaduras autores que evaluaron la aplicacin de es-
en las observaciones microscpicas en fres- ta tincin en el diagnstico de onicomi-
co e incluso aplicando coloracin de Gram- cosis y encontraron 65 % de pruebas po-
Nicolle. sitivas para levaduras aplicando blanco de
calcofluor-azul de Evans. Adems, Vzquez y
En este trabajo se aplicaron tcnicas micros- col. (2016), utilizaron blanco de calcofluor
cpicas especiales como CF, LP y MF para para estimar la biomasa fngica en mues-
identificar espermatozoides en muestras con- tras de suelo y obtuvieron resultados sen-
taminadas con levaduras. Los resultados mos- sibles a los cambios climatolgicos y compa-
traron buena correlacin con LP (P < 0.001) rables con los obtenidos por otros autores
y son coincidentes con las conclusiones de que haban aplicado metodologas ms sofis-
Collodel y col. (2013), quienes evaluaron ticadas en la identificacin de hongos (Vz-
los espermatozoides con microscopio ptico, quez y col., 2016). Otra tcnica utilizada es
empleando tincin Papanicolaou, LP y mi- la de hidrxido de potasio negro de clorazol
croscopa electrnica de transmisin, encon- que dio el 47 % de resultados positivos ob-
trando buena correlacin con LP (P < 0.01). tenidos (Collodel y col., 2013; Snchez-Ar-
Por otra parte, si bien Collodel y col. (2013), mendriz y col., 2013).
aplicaron los recursos microscpicos men-
cionados, no trabajaron con CF, que es una Disponer de una tcnica que permita recono-
de las metodologas empleadas en el pre- cer levaduras, que son contaminantes frecuen-
sente estudio, en la cual, se obtuvo el ma- tes en las muestras periciales relacionadas
yor coeficiente de correlacin (r = 0.966; con delitos sexuales sometidas a condiciones
P < 0.001) (Figura 1A). ambientales desfavorables, es un aporte im-
portante a la hora de tener que definir si se
Otras de las tecnologas aplicadas fueron la est en presencia de cabezas espermticas
MCF y las tinciones blanco de calcofluor- o son levaduras que contaminan la muestra
azul de Evans y naranja de acridina, median- (Pavesi y col., 2015). Y la confirmacin de la
te las cuales, se logr identificar las levadu- presencia de semen en materiales sometidos
ras presentes en las muestras (P = 000). En a condiciones desfavorables, a travs de la
cuanto a la confiabilidad que demuestra la apli- utilizacin de distintas tinciones y recursos
cacin de blanco de calcofluor-azul de Evans microscpicos, brinda un alto grado de cer-

Reina-Bouvet y col. (2017). Identificacin de espermatozoides humanos en muestras con levaduras CienciaUAT 33
 teza, aunque solo se observen cabezas esper-
MEDICINA Y CIENCIAS
mticas, lo que facilita el trabajo parcial.
DE LA SALUD
CONCLUSIONES
El diagnstico genrico del semen se ha de-
tenido en su evolucin, debido a la falta de
aplicacin de tcnicas adecuadas y moder-
nas que aporten mayor credibilidad al ha-
llazgo. La aplicacin de diferentes tinciones
y recursos microscpicos superadores de la
microscopia ptica, como el contraste de fa-
REFERENCIAS
Afanador-Contreras, M. I. y Caballero-Badilla, M. C. (2012).
La violencia sexual contra las mujeres. Un enfoque desde la
criminologa, la victimologa y el derecho. Refexin Poltica.
14(27): 122-133.
Aguilar-Cabrera, D. A. (2013). Una realidad insostenible en
el Per, en Apuntes sobre la violacin sexual contra menores
de edad. [En lnea]. Disponible en: http://larepublica.pe/05-10-
2013/acusados-de-violacion-impunes-ante-la-ley. Fecha de con-
sulta: 28 de noviembre de 2016.
Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff,
M., and Walter, P. (2006). Introduccin a la Biologa Celular.
Buenos Aires: Panamericana. 10 Pp.
Andrade-Rubio, K. L. (2016). Vctimas de trata: mujeres
migrantes, trabajo agrario y acoso sexual en Tamaulipas. Cien-
ciaUAT. 11(1): 28-36.
Arroyo-Snchez, G. (2016). Valoracin Mdico Legal de la
vctima de delito sexual. Medicina Legal de Costa Rica. 33(1):
126-132.
Brito, L. F., Greene, L. M., Kelleman, A., Knobbe, M., and
Turner, R. (2011). Effect of method and clinician on stallion
sperm morphology evaluation. Theriogenology. 76(4): 745-750.
Carma, I. (2010). Mtodos de Reconocimiento, Identifi-
cacin e Individualizacin de manchas de semen. [En lnea].
Disponible en: http://www.criminalistica.net/.../index.php?...me
todos-de-reconocimiento-identificacion-e-i. Fecha de consulta:
31 de marzo de 2017.
Ccaza-Zapana, J. E. (2013). La nueva criminalstica, en
Sociedad Mexicana de Criminologa captulo Nuevo Len, A.C.
[En lnea]. Disponible en: http//:www.somecrimnl.es.tl. Fecha de
consulta: 2 de julio de 2016.
Collodel, G., Iacoponi, F., Mazzi, L., Terzuoli, G., Pascarelli,
N. A., and Moretti, E. (2013). Light, polarizing, and trans-
mission electron microscopy: three methods for the evalua-
tion of sperm quality. Systems biology in reproductive me-
CienciaUAT 34 CienciaUAT. 12(1): 23-35 (Jul - Dic 2017). ISSN 2007-7521
ses, luz polarizada y microscopia fluorescen-
te con naranja de acridina como fluorocro-
mo, contribuyen al esclarecimiento de mu-
chos casos periciales. La microscopia confo-
cal combinando blanco de calcofluor y azul
de Evans permiti detectar la presencia de
levaduras que son frecuentes contaminantes
de las muestras forenses. Los recursos pre-
sentados en este estudio contribuyen al diag-
nstico de casos periciales de violacin ca-
racterizados como positivos y presuntivos.
dicine. 59(1): 27-33.
Corts-Arboleda, M. R., Cantn-Duarte, J. y Cantn-Corts,
D. (2011). Naturaleza de los abusos sexuales a menores y
consecuencias en la salud mental de las vctimas. Gaeta
Sanitaria. 25(2): 157165.
Dickens, B. (2015). Ethical issues after sexual assault. B. In-
ternational Journal of Gynecology and Obstetrics. 128: 187-188.
Espn-Falcn, J. C., Valladares-Gonzlez, A. M., Abad-Araujo,
J. C., Presno-Labrador, C. P. y Gener-Arencibia, N. (2008). La
violencia un problema de salud. Revista Cubana de Medici-
na General Integral. 24(4): 1-6.
Fernndez-Moreno, S. Y. (2015). Postura de la Red Lati-
noamericana de Gnero y Salud Colectiva de ALAMES fren-
te a la cobertura universal de salud. Ciudad de La Habana.
Revista Cubana Salud Pblica. 41(2): 349-350.
Fleitas, D. M. (2014). Delito y violencia en Amrica Latina
y el Caribe: Perfil de los pases de la regin. Ciudad Autnoma
de Buenos Aires: Edicin de la Asociacin para el Anlisis
de Polticas Pblicas. 25 Pp.
Forbes, B. A., Scottn, E. G., and Weissfeld, A. S. (2009).
Bailey y Scott Diagnstico Microbiolgico. Buenos Aires: Pana-
mericana. 705 Pp.
Gianaroli, L., Magli, M. C., Ferraretti, A. P., Crippa, A.,
Lappi, M., Capitani, S., and Baccetti, B. (2010). Birrefringen-
ce characteristics in sperm head sallow for the selection of
reacted spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection.
Fertility and Sterility. 93(3): 807-813.
Guarner, J. and Brandt, M. E. (2011). Histopathologic diag-
nosis of fungal infections in the 21st century. Clinical micro-
biology reviews. 24(2): 247-280.
Khaldi, N., Miras, A., Botti, K., Benali, L., and Gromb, S.
(2004). Evaluation of three rapid detection methods for
the forensic identification of seminal fluid in rape cases.
Journal of Forensic Science. 49(4): 1-5.
 Lpez-Garca, M. J., Urbano-Felice, A. y Crdenas-Poveda-
no, M. (2012). Manual de laboratorio para anlisis del se-
men, en Omnia Science. [En lnea]. Disponible en: http://www.
omniascience.com/scholar/index.php/scholar/article/download
/4/6. Fecha de consulta: 17 de octubre de 2013.
Ministerio Pblico Fiscala de la Nacin Lima, Per
(2014). Vctimas de feminicidios registrados en Per-julio
2014. Estadsticas sobre Feminicidio segn las caractersti-
cas de las vctimas y el presunto victimario-julio 2014. [En
lnea]. Disponible en: http://www.portal.mpfn.gob.pe/boletin_in
formativo/infoestadfeminicidio. Fecha de consulta: 30 de mar-
zo de 2017.
OMS, Organizacin Mundial de la Salud (2013). Informe
de la OMS destaca que la violencia contra la mujer es un
problema de salud global de proporciones epidmicas. Nue-
vas guas de prctica clnica y de polticas lanzadas para
orientar la respuesta del sector salud, en Comunicado de
prensa 20 de junio de 2013 Ginebra. [En lnea]. Disponi-
ble en: http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2013/vio
lence_against_women_20130620/en/. Fecha de consulta: 30
de marzo de 2017.
Pavesi, A., Ombrella, A., Cadierno, A., Kuverling, L., Man-
silla, R., Paparella, C. y Bouvet, B. (2015). Aplicacin del mi-
croscopio confocal para la identificacin de espermatozoi-
des o cabezas espermticas en presencia de levaduras con fi-
nes forenses. Revista de la Asociacin Bioqumica Argentina.
71(1): 80.
Pavesi, A., Paparella, C., Bouvet, B., and Pituelli, N. (2008).
Prostatic acid phosfatase activity in basal seminal plasma and
post exposition to hight temperature. Biocell. 32(3): 29.
Pavesi, A., Paparella, C., and Bouvet, B. (2011). Lactate
deshidrogenase: activity in human seminal plasma. Biocell.
35(2): 179.
Pavesi, A, Servidio, A., Paparella, C., Girolami, H. y Bouvet,
B. (2010). Valoracin de cinc en manchas seminales y su
aplicacin en la prctica forense. CienciaUAT. 4(3): 69-73.
Quispe-Mayta, S., Tarifa-Espinoza, S., Solz-Pacheco, R., and
Sierra-Gareca, A. (2010). Investigacin forense del fluido
seminal en vctimas de violencia sexual, por el Laboratorio
de Biologa Forense. BIOFARBO. 18(2): 91-99.
Saldaa, C., Morales-Tlalpan, V., and Castao, V. N. (2010).
Confocal microscopy: from fundamental optics to innova-
tive applications. In A. Mndez-Vilas and J. Daz (Eds.), Mi-
croscopy: science, technology, applications and education. [En
lnea]. Disponible en: http://www.formatex.info/microscopy4/13
50-1355.pdf. Fecha de consulta: 3 de noviembre de 2016.
Snchez, R. (2015). Abuso sexual en menores de edad, pro-
blema de salud pblica. Unif. Av. Psicol. 23(1): 62.
Reina-Bouvet y col. (2017). Identificacin de espermatozoides humanos en muestras con levaduras
Snchez-Armendriz, K., FernndezMartnez, R. F., More-
MEDICINA Y CIENCIAS
no-Morales, M. E., Villegas-Acosta, L., Meneses-Gonzlez, F.
y ArenasGuzmn, R. (2013). Sensibilidad y especificidad del
DE LA SALUD
examen directo micolgico con blanco de calcofluor para el
diagnstico de onicomicosis. Medicina Cutnea Ibero-Latino-
Americana. 41(6): 261-266.
Stander, V. A. y Thomsen, C. J. (2016). El acoso sexual
y asalto en el ejrcito de Estados Unidos: Un examen de las
tendencias de poltica y de investigacin. Medicina Militar.
181: 20-27.
Tmara, K. L. (2013). Reconocimiento e identificacin de
manchas de semen en diferentes soportes de inters forense.
[En lnea]. Disponible en: http://guzlop-editoras.com/web_des
/bio01/bioforense/pld0638.pdf. Fecha de consulta: 12 de agos-
to de 2013.
Tratado de Criminalstica de la Polica Federal Argentina
(2007). La qumica Analtica en la Investigacin del Delito.
[En lnea]. Disponible en: http://doggy.blogcindario.com/2007
/09/00008investigacion-de-espermios.html. Fecha de consulta:
2 de abril de 2017.
Turvey, B. F. (2014). Forensic victimilogy examining vio-
lent crime. Victims in investigative and Legal Context. Rei-
no Unido: Elseiver. 546 Pp.
Vzquez, M. B., Amodeo, M. R. y Bianchinotti, M. V. (2016).
Estimacin de la biomasa fngica en un suelo del sudoeste
de la provincia de Buenos Aires (Argentina) con una tin-
cin directa con Blanco de Calcofluor. Revista Argentina de
Microbiologa. 48(3): 252-258.
Vega-Vega, C., Navarro-Escayola, E. y Edo-Gil, J. C. (2014).
Protocolo de actuacin mdico forense en los delitos con-
tra la libertad sexual. Revista Espaola de Medicina Legal.
40(3): 120-128.
Villarroel-Rodrguez, P. y Santa Cruz-Rodrguez, A. (2011).
Identificacin de especies de levaduras del gnero Candi-
da aislados de exudados vaginales de pacientes en el Hospi-
tal Materno Germn Urqudi. Gaceta Mdica Boliviana. 34(2):
84-86.
WHO, World Health Organization (2010). WHO labora-
tory manual for the examination of human semen and sperm
servical-mucus interaction. [En lnea]. Disponible en: www.
cnrha.msssi.gob.es/bioetica/pdf/semen_humano.pdf. Fecha de
consulta: 30 de marzo de 2017.
CienciaUAT 35