Universidad de

Colima
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Licenciatura en Biología

Extracción y caracterización enzimática de

amilasas de Aspergillus sp. Aislado de
masa de maíz.

Integrantes

Eduardo Chávez Sahagùn.

Eduardo Duarte Álvarez.
Blanca I. Mendoza Macias.
Adriana M. Montes Picaso.
Joel F. Morfín Méndez.
Marìa Daniela Muñiz Anguiano.
 Tecomán, colima a 19 de junio del 2007

I INTRODUCCIÓN

Las enzimas son proteínas con propiedades catalíticas, es decir que aceleran reacciones
químicas, entre cuyas propiedades se encuentran su gran especificidad y la presencia de
uno o más sitios activos. Las enzimas no solo se encuentran en todos los seres vivos, sino
que además son absolutamente necesarias para la vida.

Las enzimas al ser proteínas están formadas por aminoácidos, sin embargo algunas
requieren de iones inorgánicos (cofactores) y/o de moléculas orgánicas derivadas de
vitaminas (coenzimas) para poder cumplir con su función de catalizadoras.
Así mismo factores ambientales tales como el pH y la temperatura alteran la función de las
enzimas, pudiendo llegar a desnaturalizarse o degradase perdiendo así su función en
condiciones extremas o a catalizar mas eficientemente en ciertas condiciones optimas
particulares a cada enzima. (Nelson y Cox, 2004).

El almidón es un polisacárido constituido principalmente por largas cadenas de glucosa, en

su forma nativa esta constituido por α-amilasa y amilopectina. Es el principal polisacárido de
reserva de origen vegetal, es más abundantemente en semillas de cereales y tubérculos.
(Vargas y Silver, 2002).

Las amilasas son enzimas que hidrolizan el almidón, cortando cadenas de azucares en
cadenas mas cortas, actúan sobre los enlaces α-(1-4) y/o α (1-6). La actividad óptima de las
amilasas se lleva acabo a un pH de 4.8 a 6.5. Si bien las amilasas no cuentan con
coenzimas, si cuentan con un ión de calcio unido covalentemente a cada una de sus
moléculas, dicho ión es necesario para llevar acabo la catálisis. (Vargas A y Silver L, 2002).

Las amilasas pueden ser producidas por una gran variedad de seres vivos que incluyen a
animales, plantas, bacterias y hongos; estos últimos son los organismos más importantes en
su producción a nivel industrial. (Castro, et al).

Una de las características fundamentales de los hongos es su alimentación misma que

realizan por absorción: primero secretan hacia el medio exterior enzimas digestivas
(exoenzimas) que degradan moléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos y lípidos
en moléculas mas pequeñas fáciles de absorber a través de su pared celular y su membrana
plasmática. (Alexopoulos, Mims y Blackwell ,1996)
El género Aspergillus es uno de los grupos de hongos con mayor distribución y con mayor
variedad de formas de alimentación que hay, con un gran arsenal enzimático, y con gran
cantidad de especies saprobias, algunas parásitas de vegetales, animales y humanos;
algunas son de importancia industrial. (Mier y Toriello 2002)

II OBJETIVO

Extraer y caracterizar enzimáticamente las amilasas aisladas de Aspergillus sp. aisladas de

masa de maíz.

III MATERIALES Y MÉTODOS

a) Materiales
1) Material de laboratorio

28 Vasos de precipitado de 40 mL.

4 Vasos de precipitado de 500 mL.
2 Cubas
2 Agitadores
2 Agitadores magnéticos
1 Incubadora
2 Bolsas para esterilizar
15 Cajas de Petri
5 Porta y cubre objetos
2 Embudos
1 Pliego de papel filtro
2 Platos calientes
1 Termómetro
Parafilm
2 Matraces de 500 mL.
3 Espátulas
2 Probetas de 100 y 10 mL.
Papel filtro
1 Balanza analítica
1 Balanza granataria.
1 Cámara de flujo laminar.
1 Mechero de Bunsen
2 asas bacteriológicas
2 agujas de disección
Algodón
Gasas
Cinta
Autoclave
Papel extraza
1potenciometro
1 piceta

2) Reactivos

Extracto de levadura (BECTON DICKNSON DE MÉXICO S.A. DE C.V)

Agar nutritivo (BECTON DICKISON DE MÉXICO S.A. DE C.V)
Peptona de caseína (BECTON DICKISON DE MÉXICO S.A. DE C.V)
Cloruro de sodio (QUÍMICA DINÁMICA S.A DE C.V MONTERREY N.L)
Dextrosa Monohidratada (J.T BARRER S.A DE C.V XALOSTOC, MÉXICO)
Fécula de maíz (UNILEVER DE MEXICO, S DE R.L. DE C.V)
Ácido clorhídrico (ANAL Y TAKA DE MÉXICO S.A DE C.V. PM 36.46 g/mol)
Acetato de sodio (FERMONT, PM: 136.08 g/mol)
Glicerina (HYCEL DE MÉXICO SA. DE C.V, PM: 92.09 g/mol, 99.5%)
Alcohol al 70%
Agua
Tween 80

3) Material Biológico

Masa de maíz
Almidón soluble
Salvado de trigo

b) Métodos
1) Preparación de soluciones
-Agua con glicerina al 10% v/v

%v/v = v soluto/ v solución * 100

v soluto = 10 mL *100/ 100
v soluto = 10 mL.

En un matraz Erlenmeyer se colocaron 10 mL. de glicerina y 90 mL. de agua, lo cual se agito

en un plato caliente.

-Medio YPD
Extracto de levadura 15% p/v
% p/v = masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (1.5%) (250 mL.)/100
Masa de extracto de levadura =3.75 g

-Peptóna de Caseína al 2% p/v

% p/v = masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (2%) (250 mL.)/100
Masa de peptóna = 5 g

-Dextrosa al 2% p/v
% p/v = masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (2%) (250 mL.)/100
Masa de dextrosa = 5 g

-NaCl al 5% p/v
% p/v = masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (5%) (250 mL.)/100
Masa de NaCl = 12.5 g

-Agar-agar al 2% p/v
% p/v = masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (2%) (250 mL.)/100
Masa de Agar - agar = 5 g

En un matraz Erlenmeyer se agregaron 250 mL de agua junto con 3.75 g de extracto de

levadura, 5 g de peptona de caseína, 5 g de dextrosa 5 g de agar – agar y 12.5 g de NaCl,
se mezcló con un agitador magnético, posteriormente se esterilizó en la autoclave y se vertió
en 10 cajas de Petri.

-NaCl al 1% p/v
% p/v = masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (1%) (600 mL.)/100
Masa de NaCl =6 g

En un vaso de precipitado se agregaron 600 ml de agua junto con 6 g de NaCl, se disolvió

usando un agitador magnético

-Fécula de Maíz
Se agregaron 60 g de fécula de maíz (maizena) en 500 mL de agua, de mezcló utilizando un
agitador magnético.

-Tween 80 al 0.1% v/v

% v/v= volumen de soluto / v solución * 100
Volumen soluto= (0.1%) (500 mL.)/100
Volumen de Tween 80 = 0.5 mL

En un matraz Erlenmeyer se mezclaron 0.5 mL de Tween 80 con 500 mL de de agua.

Posteriormente se esterilizó en la autoclave.

-Solución de almidón tamponada:

Almidón 0.05% p/v
% P/V= masa del soluto/v solución * 100
Masa del soluto= (0.05%) (250 mL.)/100
Masa de almidón =0.125 g

-Acetato de sodio (CH3COONa) 0.1M

n= (M) ((Lslon)
n = (0.1 M) (.25 L)
n= 0.025 moles

m= (PM) (n)
m= (0.025 moles) (82 g/mol)
m = 2.05 g de CH3COONa
-NaCl (0.15M)
n= (M) (Lslon)
n = (0.15M)(.25L)
n= 0.0375 moles

m= (PM) (n)
m= (0.0375moles) (58.453 g/mol)
m = 2.19g de NaCl

En un matraz Erlenmeyer se colocó 250 mL de agua estéril, 2.19 g NaCl, 2.05 de

CH3COONa y 0.125 g de almidón, se disolvieron y mezclaron usando agitador magnético.

2) Aislamiento del hongo

Se aisló el hongo apartir de masa de maíz mediante los siguientes métodos:

a) Cámara húmeda

El método de cámara húmeda se lleva acabo con la colocación de un caballete (sobre un

triangulo de cristal se coloca un porta objetos, fijándolo con cinta adhesiva) dentro de una
caja de Petri a la cual se agregó 20 mL. de agua con glicerina al 10% v/v, los cuales ya
habían sido previamente esterilizados durante 15 min. a 15 libras de presión, por ultimo se
coloco una pequeña muestra de masa de maíz. La preparación antes descrita se incubó
durante 5 días a 28 °C.

b) Medio de cultivo YPD

A cinco cajas de Petri esterilizadas se les agrego 20mL de YPD, una vez gelificado este,
se coloco una pequeña muestra de masa de maíz a cada caja de petri, este proceso se
realizó en una cámara de flujo laminar .Se incubaron durante 7 días a 28 °C (Castro, Navas,
Caro, Piñeros).

3) Identificación del hongo

 Se realizó por medio de un cultivo monospórico (la finalidad de este fue para que el
crecimiento del hongo fuera en las paredes del cubre y portaobjetos para una fácil
observación en el microscopio), el cual consistió en poner un trozo de YPD sobre el
portaobjetos que esta fijado al caballete y encima se colocó un cubreobjetos. Una vez
realizado lo anteriormente descrito, con una aguja de disección estéril se tomo un muestra de
nuestro hongo y fue inoculado por los cuatro lados del trozo de YPD, cada vez que se
tomaba muestra del hongo se esterilizaba la aguja de disección, dichas preparaciones se
incubaron a 28 °C durante 3 días.

Una vez obtenido el crecimiento del hongo fue observado en el microscopio, para ello
tuvimos que separar el cubre y el portaobjetos, a los cuales se les añadió unas gotas de
hidróxido de sodio para el aclaración de las estructuras morfológicas, después fueron
observadas en el microscopio y se hicieron las comparaciones con imágenes y
características del Aspergillus sp. descritas en manuales, libros y artículos.

Una vez identificado en hongo, se resembró en 5 cajas de YPD, para mayor obtención de
esporas, así mismos se sembraron otras 5 cajas con esporas de otra sepa de Aspergillus
aislada por otro equipo. Después del crecimiento las esporas obtenidas de cada sepa fueron
suspendidas por separado en tween 80 al 0.1%. (Castro, Navas, Caro, Piñeros).

4) Expresión de las amilasas

Se esterilizaron dos bolsas con 395 g salvado de trigo en la autoclave por 15 min. a
121°C, una vez enfriado el salvado, cada una de las bolsas fue inoculada con las esporas de
ambas sepas respectivamente e incubadas por 7 días a 28°C (Castro, Navas, Caro,
Piñeros).

5) Extracción de la enzima

Las enzimas fueron extraídas del salvado de trigo mediante la utilización de una solución
de cloruro de sodio. Se tomaron 100g del salvado de trigo y se colocaron en un vaso de
precipitado con 295 militros de solución de cloruro de sodio, posteriormente la mezcla fue
agitada durante 24 hrs. a 8° C. Luego se filtro la mezcla utilizando un embudo y papel filtro,
se tomaron 70 mL. Del filtrado y se repartió en 14 fracciones de 5 mL, el proceso se repitió
por separado para ambas sepas aisladas, obteniendo así un total de 28 fracciones de
extracto enzimático (14 de cada cepa) (Castro, Navas, Caro, Piñeros).

6) Actividad enzimática:

Cada uno de los grupos de extractos enzimáticos fueron divididos en dos grupos de
siete fracciones (cada fracción contenía 5 mL), a cada uno de los cuales se les aplicaron 10
mL de solución taponada de almidón (almidón 0.5% p/v, pH 5) y 10 mL de fécula de maíz
comercial respectivamente (así que tenemos siete fracciones de cada cepa con solución
taponada y otras siete con solución de fécula de maíz comercial).
Posteriormente fueron incubadas a 37 °C durante: 1,5 10,30,60, 90 y 120 minutos,
extrayendo al termino de cada periodo una fracción incubada con almidón y otra con fécula
de cada cepa respectivamente, aplicando entonces a las muestras extraídas lugol y
comparando la coloración obtenida con muestras de solución de fécula y de almidón sin
extracto enzimático y coloreadas con lugol.

IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se tiño una muestra de solución de fécula de maíz y una muestra con solución de
almidón tamponada con lugol, en la muestra de solución de fécula de maíz se
observó una coloración púrpura obscura y en la solución tamponada una coloración
café claro, sin embargo a las muestras a las que si se les aplico el extracto
enzimático se observo que conforme pasaba el tiempo las muestras incubadas
adquirían una coloración mas clara progresivamente, debido a la acción de las
amilasas.

En primer lugar se sabe que la amilosa, componente del almidón en solución

acuosa adquiere una estructura en forma de espiral, al aplicar lugol el yodo contenido
en este interactúa con la parte interna del espiral de la amilosa provocando una
coloración púrpura oscura. (Xiaochun , Houtman Y Atalla Almidón soluble
, 1996).

Al interactuar la amilasa con el almidón, corta las cadenas del mismo en segmentos
más cortos, como consecuencia hay menos lugol interactuando con la parte interna
del espiral que forme cada cadena, causando que sea apreciable una coloración más
tenue.
Observado el proceso anteriormente mencionado significa que hay actividad
amilolitica con el almidón, así mismo al observarse la disminución de la coloración,
sabemos que sigue actuando continuamente la amilasa.

V CONCLUSIÓN
Los hongos del genero Aspergillus son capaces de producir amilasas, mismas que
pueden ser extraídas y observada su actividad in-vitro.

VI BIBLIOGRAFÍA

- Stryer B. T (2002) Bioquímica. Editorial Reverte. SA. 5ta edición, Barcelona pp.196-
222.

- Roskosk R. (2001) Bioquímica. Editorial MCGraw-Hill interamericana, México,

pp.100, 101.

- Alexopoulos C.J., Mims C.W., Blackwell M., (1996). Editorial John Wiley y Sons,
INC. 4a edition, Canadá. pp. 28

-Nelson D.L. y M.M. Cox (2004) Lehninger principios de bioquímica. Editorial omega.
4ª edición, España. pp. 190-215.

-Mier T, Toriello C, Ulloa M, (2002) Hongos microscópicos saprobios y parásitos:

métodos de laboratorio. Editorial UAM-Xochimilco, 1era edición, México, pp. 29

- Castro C, Navas C, Caro O, Piñeros Y. Obtención de amilasas fúngicas a partir de

Aspergillus sp. aislado en semillas de lentejas. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo
Lozano, Bogotá, Colombia.

- Apaza V, Silver L, (2002) Selección y evaluación del genero Bacillus productoras de

amilasa en cultivo sumergido, Universidad Nacional de San Marcos, Perú.

- Xiaochun Y, Houtman C, Atalla R. H. (1996) The complex of amylase and iodine;

Chemical Engineering Department, University of Wisconsin, Forest Products
Laboratory, One Gifford Pinchot Dr., Madison.