Unidad 8.

Condiciones ambientales para el desarrollo,

inhibicin y destruccin de microorganismos.
Prctica 8. Efecto de los factores ambientales y
qumicos
Objetivos
Describir los efectos de diferentes factores fsicos en el crecimiento de bacterias.

Introduccin
Las bacterias son microorganismos procariotes que presentan una gran diversidad
nutricional y metablica, esto determina su capacidad de poder crecer en ciertos sustratos.
As mismo de poder sobrevivir en un ambiente determinado en presencia de factores que
favorecen o inhiben su desarrollo.

1. Sesin.

Efecto de los agentes ambientales

Materiales

Microorganismos
Bacterias aisladas, resiembra de 24 horas.
Cepas control:
Serratia marcescens
Micrococcus luteus

Equipo y materiales
2 mecheros
1 gradilla
2 bulbos
2 asas
1 varilla de vidrio en L
1 tripie
Charola de metal
1 vaso de pp de 250mL
Campana con lmpara de luz UV
Turbidmetro

Material que deben tener los alumnos

2 pipetas serolgicas de 1mL estriles
4 tubos de 13x100 con 3mL de SSI estril
2 pipetas Pasteur estriles
1 caja de Petri grande estril
Crculos de cartn negro grueso
Papel aluminio

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 1

 Medios de cultivo por equipo
10 tubos de 13x100mm con 3mL de Caldo Nutritivo.
8 tubos de 13x100mm con 3mL de Caldo Nutritivo ajustado a los valores de pH: 3, 5, 7 y 9, dos
tubos por condicin.
10 tubos de 13x100mm con 3mL de Caldo Nutritivo adicionados con NaCl en las
concentraciones: 1%, 4%, 7%, 10% y 15%. Dos tubos de cada condicin.
4 cajas Petri con Agar Nutritivo

Medios de cultivo por grupo

8 tubos de 16x150 con 10mL de agar nutritivo
8 tubos de 16x150 con 10mL de agar nutritivo ms sacarosa 30%

Metodologa

a) Efecto de los factores ambientales en el medio de cultivo.

1. Para cada una de las bacterias aisladas, inocular del cultivo de 24 horas en un tubo
con solucin salina isotnica ajustar a una turbidez semejante a la del tubo 0.5 de la
curva de Mac Farland. Emplear el turbidmetro.
2. Inocular 0.1mL (100mL) en cada uno de los siguientes medios con las siguientes
condiciones:
Medio Condicin Incubacin
Caldo nutritivo Temperatura 4C
Temperatura 28C
Temperatura 37C
Temperatura 42C
Temperatura 55C
Caldo nutritivo pH 3 37C
pH 5 37C
pH 7 37C
pH 9 37C
Caldo nutritivo NaCl 1% 37C
NaCl 4% 37C
NaCl 7% 37C
NaCl 10% 37C
NaCl 15% 37C

3. Incubar durante 48 horas en condiciones aerobias a las temperaturas indicadas.

4. Fundir los medios de Agar Nutritivo con y sin Sacarosa. Cada dos equipos vaciar en dos
cajas Petri grandes. Primero verter el agar con sacarosa, inclinar para formar un
gradiente y dejar solidificar.
5. Ya solidificado el primero, agregar encima el agar sin sacarosa.
6. Marcar la caja en el fondo como + y -.
7. Trazar lneas en la parte de la base de la caja Pretri e inocular las cepas aisladas de la
concentracin mayor a la menor.
8. Incubar a 37C durante 48 horas.

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 2

 + -
+

Inocular las cepas aisladas en estra

recta desde la concentracin mayor
de sacarosa a la menor.

b) Efecto de las radiaciones UV.

1. Seleccionar una de las cepas aisladas para esta prueba y una cepa control (Serratia
marcescens o Micrococcus luteus).
2. De la cepa control, inocular del cultivo de 24 horas en un tubo con solucin salina
isotnica ajustar a una turbidez semejante a la del tubo 0.5 de la curva de Mac Farland.
Emplear el turbidmetro.
3. A partir de cada cepa inocular 2 gotas o 0.1mL en dos cajas Petri con Agar Nutritivo.
Extender con ayuda de una varilla de vidrio.
4. Dividir las 4 cajas de agar Nutritivo (inoculadas con las dos cepas aisladas y dos de la
cepa control) en cuatro cuadrantes con un marcador indeleble y etiquetar como
Control, 15 seg, 30 seg y 45 seg.
5. Radiar cada uno de los cuadrantes en los tiempos establecidos con una lmpara de luz
UV a una distancia aproximada a 50cm. Cubrir el resto de los cuadrantes no radiados
con un crculo de cartn.
6. Envolver en papel aluminio las cajas radiadas de las cepas aisladas y una de las de la
cepa control.
7. Exponer durante media hora la otra caja abierta en la campana a la luz del
laboratorio.
8. Transcurrido el tiempo, etiquetar como fotorreactivada y envolver en papel aluminio.
9. Incubar las 4 cajas durante 24 horas a 37C y otras 24 horas a temperatura ambiente.

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 3

2. Sesin.

Resultados del efecto de los agentes ambientales

Materiales

Por equipo
1 gradilla

Por grupo
Turbidmetro.

Metodologa

a) Resultados del efecto de los factores ambientales en el medio de cultivo.

1. Determinar la turbidez de cada uno de los tubos y graficar para obtener la

temperatura ptima de crecimiento, el Ph ptimo y la mejor concentracin de NaCl.
2. Observar ele efecto de la concentracin de Sacarosa en el crecimiento de las cepas
aisladas, esquematizar los resultados.

b) Resultados del efecto de las radiaciones UV.

1. Comparar el crecimiento y la pigmentacin de la cepa control en los diferentes

tiempos de radiacin tanto en la caja con fotorreactivada como en la no
fotorreactivada. Expresar el resultado en porcentajes de crecimiento y pigmentacin.
2. Realizar las mismas observaciones (no pigmento) en la cepa aislada. Comparar entre
ambas cepas la capacidad de recuperacin.
3. Hacer una tabla y esquematizar los resultados.

3. Sesin.

Efecto de los agentes qumicos

Materiales

Microorganismos
Bacterias aisladas, resiembra de 24 horas.
Muestra superficial de la Columna
Cepas control:
Escherichia coli (10536)
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Candida albicans

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 4

 Equipo y materiales
2 mecheros
1 gradilla
2 bulbos
2 asas
1 varilla de vidrio en L
Turbidmetro
1 vaso de pp de 250mL

Material que deben tener los alumnos

2 pipetas serolgicas de 1mL estriles
4 tubos de 13x100 con 3mL de SSI estril
2 pipetas Pasteur estriles
1 caja petri de vidrio con 30 discos de papel filtro grueso de 7mm de dimetro estriles
1 pinzas de punta roma

Reactivos por equipo (sugerencias)

Solucin de Cristal Violeta 1% en solucin acuosa.
Solucin de Verde de Malaquita 1% en solucin acuosa.
Solucin de antibitico.
Etanol 96%.
Isopropanol 70%.
Benzal.
Yodo 1% (isodine).
Solucin de hipoclorito 5%.
Triclosan (enjuague bucal).
Solucin de vinagre de caa 1%.
Solucin de manzanilla (gotas oftlmicas).
Alimento probitico (yogurt natural o yacult).
CuSO4 1%.

Medios de cultivo por equipo

4 cajas Petri con Agar Mueller Hinton

Medios de cultivo por grupo

1 matraz de 250mL con 100mL de Agar Mueller Hinton
12 tubos de 16x150mm con 9mL de Caldo para antibiticos # 3.
Solucin estndar de cloramfenicol 500 g/mL estril.
4 cajas de Petri con Agar para antibiticos #3 o Mueller Hinton.

Metodologa

a) Efecto de los agentes qumicos.

1. A partir de los cultivos de las cepas aisladas, resuspender en SSI y ajustar a una turbidez
semejante a la del tubo 0.5 de la curva de Mac Farland. Emplear el turbidmetro.
2. A partir de cada cepa inocular 2 gotas o 0.1mL en dos cajas Petri con Agar Mueller
Hinton. Extender con ayuda de una varilla de vidrio.
3. Colocar unas gotas de los agentes qumicos en vasos desechables.

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 5

 4. Impregnar los discos de papel en las soluciones y dejar escurrir junto al mechero. Tener
cuidado con las soluciones alcohlicas.
5. Depositar 5 discos de papel previamente impregnados con diferentes soluciones sobre
la superficie del agar de cada una de las cajas de inoculadas con la cepa aislada.
Distribuir el resto de los discos.
6. Repetir los agentes qumicos para la otra cepa.
7. Incubar las cajas durante 24 horas a 37C. Al trmino de la incubacin marcar con un
marcador indeleble la zona de inhibicin e incubar a temperatura ambiente durante
otro periodo de 48 horas y posteriormente refrigerar.

b) Produccin de sustancias antimicrobianas.

1. Colocar 0.1mL de la muestra superficial de la columna en una caja de Petri vacia.

2. Fundir el Agar Mueller Hinton que se encuentra en el matraz de 250mL.
3. Cuando el medio de cultivo est fundido, fluido y a una temperatura de 45C, verter en
cada una de las cajas.
4. Dejar solidificar.
5. Trazar 1 estra recta en la superficie del medio con cada uno de los siguientes
microorganismos: Escherichia coli (10536), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus y Candida albicans.
6. Dejar que se absorban los cultivos en las placas y despus invertirlas.
7. Incubar a 28 C y revisar a las 24 y 48 horas.

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus
Escherichia coli

Candida albicans

c) Efecto de la concentracin de antibiticos.

1. Inocular 0.1mL (100mL) de la suspensin de Escherichia coli en 6 tubos de Caldo para

antibiticos # 3.
2. Hacer lo mismo con la suspensin de Pseudomonas aeruginosa en otros 4 tubos.
3. Etiquetar los tubos como: control, 5 g/mL, 15 g/mL, 30 g/mL, 40 g/mL y 50 g/mL
para cada una de las cepas.

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 6

 4. Agregar 1mL de cada solucin estndar de cloramfenicol para tener la concentracin
deseada.
5. Incubar durante 24 horas a 37C.
6. Dividir una caja de agar para antibiticos #3 en seis cuadrantes para cada una de las
cepas y etiquetar los cuadrantes como: Control, 5 g/mL, 15 g/mL, 30 g/mL, 40
g/mL y 50 g/mL.
7. Inocular por estra recta de cada uno de los tubos para ambas cepas.
8. Refrigerar los tubos.
9. Incubar las cajas durante 24 horas a 37C.

4. Sesin.

Resultados del efecto de los agentes qumicos

Materiales

Por equipo
1 gradilla

Por grupo
Turbidmetro.

Metodologa

a) Resultados del efecto de los agentes qumicos.

1. Medir para cada uno de los compuestos probados, el halo de inhibicin a las 24 y 72
horas.
2. Observar el crecimiento o disminucin del halo en la segunda lectura.
3. Explicar los mecanismos de accin para cada uno de los agente qumicos empleados.
4. Verter los resultados en la siguiente tabla.

Agente Uso Principio Mecanismo Resultados a Resultados a

comercial activo de Accin las 24 horas las 72 horas.
Alcohol 96 Antisptico
Merthiolate Antisptico
Cloralex Desinfectante Cl-
Violeta de Antisptico
genciana

b) Resultados de la produccin de sustancias antimicrobianas.

1. Observar si el crecimiento de alguno de los microorganismos de prueba fue

interrumpido por el crecimiento de otro microorganismo que se obtuvo de la columna.
2. Esquematizar los resultados.

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 7

c) Efecto de la concentracin de antibiticos.

1. Observar y comparar el crecimiento en tubos y en cajas.

2. Determinar la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y la Concentracin Mnima
Bactericida (CMB) para cada bacteria.

Disposicin de desechos
1. El material plstico como las cajas de Petri desechables, papel filtro y palillos de
madera debern colocarse en los contenedores de incineracin previamente
atadas con masking las cajas de Petri.
2. Esterilizar en autoclave el material de vidrio y posteriormente lavar.

Bibliografa complementaria
Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual.
7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005
Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition.
Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock Biologa de los microorganismos.
10 edicin, Prentice Hall Iberia. Espaa. QR41.2 B75318 2004.
Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6 th edition.
McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005
Ramrez-Gama, R. M., B. Luna Milln, O. Velsquez Madrazo, L. Vierna Garca, A. Meja
Chvez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernndez Gmez, I. Mggenburg, A. Camacho Cruz y M
del C. Urza Hernndez. 2006. Manual de Prcticas de Microbiologa General. 5
edicin. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Schaechter Moselio, Ingraham John L. and Neidhardt Frederick C. 2006. Microbe.
American Society for Microbiology. USA. QR41.2 S288
Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology : an
introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007

ME1515 - 2010/2 - Prctica 8 - pgina 8