La regulacin de las protenas de choque trmico es esencial para la

supervivencia al fro durante la diapausa de los insectos

La diapausa, la latencia comn a los insectos que invernan, evoca
Un patrn nico de expresin gnica. En la carne volar, la mayora, pero no
Todas, de las protenas de choque trmico de la mosca (Hsps) estn reguladas. los
Diapausa regulado por arriba Hsps incluyen dos miembros de la Hsp70
Familia, un miembro de la familia Hsp60 (TCP-1), al menos cuatro
Miembros de la pequea familia Hsp, y un pequeo pseudogn Hsp.
La expresin de un cognado Hsp70, Hsc70, no est influenciada por la diapausa,
Y Hsp90 es realmente down-regulado durante la diapausa, por lo tanto
La diapausa difiere de las respuestas de estrs comunes que provocan sncronos
Up-regulation de todos los Hsps. La regulacin de la Hsps comienza en
El inicio de la diapausa, persiste durante todo el invierno
Perodo de tiempo y cesa en cuestin de horas despus de que la mosca recibe la
Reiniciar el desarrollo. La regulacin de Hsps parece ser
Comn a la diapausa en especies que representan diversos rdenes de insectos
Incluyendo Diptera, Lepidoptera, Coleoptera e Hymenoptera como
As como en diapasas que se producen en diferentes etapas de desarrollo
(Embrin, larva, pupa, adulto). La supresin de la expresin de Hsp23 y
Hsp70 en moscas utilizando RNAi no alter la decisin de entrar
La diapausa o la duracin de la diapausa, pero tuvo un efecto profundo
En la capacidad de la pupa para sobrevivir a bajas temperaturas. Por lo tanto, proponemos
Que la regulacin de Hsps durante la diapausa es un factor importante
Contribuyendo a la resistencia al fro de los insectos que invernan.
El invierno representa un gran reto para los insectos. Para tener xito
En un ambiente altamente estacional, zona templada, los insectos
Debe limitar el crecimiento y la reproduccin a unos pocos meses
Durante el verano y sobrevivir el resto del ao sin
Alimentarse mientras se enfrenta a los rigores del invierno. El acortamiento de
Da a finales del verano es ampliamente explotado como
Smbolo que seala el advenimiento del invierno. Para la mayora de los insectos,
Da evoca un paro de desarrollo especfico de etapa, conocido
Como diapausa (1-3). Diapause representa un desarrollo alternativo
Va impulsada por patrones nicos de expresin gnica
Que resultan en el secuestro de reservas de nutrientes, supresin
Del metabolismo, una interrupcin o ralentizacin del desarrollo, y
Una mayor tolerancia a las tensiones ambientales tales como
Como temperatura baja (4).
Aunque algunas especies de insectos son tolerantes a la
No pueden tolerar la congelacin del cuerpo y, en cambio, han desarrollado mecanismos
Para evitar la congelacin (5). Los contribuyentes ms conocidos
Prevenir la congelacin incluyen polioles tales como glicerol y el insecto
Trehalosa en la sangre que funcionan coligatoriamente para
El punto de super-enfriamiento del cuerpo y no colagante para estabilizar las protenas
Y las membranas celulares (6). Algunos insectos tambin tienen la
Capacidad para sintetizar protenas anticongelantes, descritas
Los peces antrticos (7), que funcionan no coligatoriamente en la hemolinfa
Para disminuir el punto de sobreenfriamiento del insecto (8). Citoesqueleto
Modificaciones, incluyendo alteraciones que aumentan la elasticidad
De la membrana celular para promover la funcin a baja temperatura,
Tambin son ampliamente explotados por los insectos que
Dao inducido por el fro (9-12).
En este estudio, proponemos que otra clase de
Agentes, las protenas de choque trmico (Hsps), tambin contribuyen significativamente
A la tolerancia al fro invernal de los insectos. Los Hsps
Son un grupo de protenas notablemente bien descritas que son
Comnmente expresado en respuesta al estrs ambiental. Originalmente
Descrito de Drosophila como una respuesta a la alta temperatura,
Y por lo tanto su nombre, Hsps son regulados por diversos
Incluyendo choque en fro, desecacin, anoxia y exposicin
A una amplia gama de productos qumicos, incluidos metales pesados, etanol y
Otros contaminantes (13-15). Funcionan como chaperones moleculares
Durante perodos de estrs por unin a otras protenas,
Mejorando as los efectos perjudiciales del mal plegado y
Promoviendo el retorno de estas protenas a su nativo
Conformaciones cuando vuelvan a prevalecer condiciones favorables. En la mayora
Casos, los genes que codifican estas protenas son rpidamente up-regulation
Al comienzo de la tensin, concurrente con la regulacin negativa
De la mayora de los otros genes. Cuando regresen condiciones ms favorables, el
Hsps son nuevamente regulados, una caracterstica que es esencial
Porque la expresin de Hsps durante las condiciones no estrs puede conducir
Efectos nocivos, incluido el retraso y el cese de la
Desarrollo (16).
Durante varios aos, hemos sabido que Hsp23, una pequea Hsp (17),
Y Hsp70 (18) estn reguladas progresivamente durante el desarrollo
Diapausa pupal de la mosca de la carne, Sarcophaga crassipalpis,
Pero varias preguntas quedan sin respuesta. Son adicionales
Hsps implicados en la respuesta diapausa? Este vnculo de
Hsp expresin con la diapausa se producen en otras especies? Qu
Funcionan estos Hsps durante la diapausa? En este informe,
Revisar el vnculo entre la diapausa y la expresin de Hsp en la
Carne mosca, la evidencia presente que algunos Hsps adicionales son
Diapause up-regulated, muestran que muchas otras especies de insectos
Tambin up-regular Hsps durante la diapausa, y el uso de RNAi para demostrar
Que la supresin de los Hsps da como resultado una prdida de fro
Tolerancia durante la diapausa del invierno. Por lo tanto, argumentamos que Hsp
Expresin es un componente vital de la defensa de hibernacin
Estrategia de muchos insectos de zonas templadas.
Tabla 1. Hsps identificados en la mosca de la carne, S crassipalpis, y su
Expresin en relacin a la diapausa pupal de hibernacin de la mosca
Todos los Hsps enumerados son inducibles por choque trmico, excepto Hsc70, que es un
Cognato que es constitutivamente expresado.
* Un pequeo Hsp de tamao desconocido.
Resultados y discusin
Up-Regulacin de Hsps durante Fly Diapause. En estudios anteriores,
Inform que tanto una pequea Hsp (Hsp23) y Hsp70 (ahora
Designados como Hsp70A) estn altamente regulados durante la pupa
Diapause en S. crassipalpis (17-19). Esta upregulation de desarrollo
De Hsps ocurre simplemente porque la pupa entra
Diapause y no es una funcin de la tensin de la temperatura. A diferencia de la
La respuesta al estrs cuando se produce un cierre casi
Expresin de otros genes cuando se activan los Hsps, el Hsps
Se expresan simultneamente con otros genes durante la diapausa.
Los intentos para aumentar an ms la expresin de los Hsps con temperatura
Choques u otras tensiones no han tenido xito; as,
Estos dos Hsps parecen ser expresados al mximo durante la diapausa.
Durante la diapausa, un cognado de Hsp70, Hsc70, permanece
Sin cambios en la expresin (18), y Hsp90 est regulada hacia abajo (20).
As, Hsp expresin durante la diapausa proporciona una interesante
Contraste con la respuesta de estrs tpica en la que todos los Hsps son
Regulado. Adems de Hsp23 y Hsp70A, nuestra corriente
Anlisis de hibridacin sustractiva supresora (SSH) revel
Varios Hsps previamente desconocidos que son diapause up-regulation
(Tabla 1): tres nuevos miembros de la pequea familia Hsp, un miembro
De la familia Hsp60, un nuevo miembro de la familia Hsp70, y un
Putativo pseudogene perteneciente a la pequea familia Hsp.
Uno de los pequeos Hsps (clon ScD-7H7, GenBank adhesin
no. EF103577) es un clon de longitud completa de 1,123 pb, con un pico de 665 pb
ORF que codifica una protena de 25 kDa con mayor similitud con Drosophila
Hsp27. La segunda pequea Hsp (clon ScD-9D11, GenBank
De adhesin no. F103578) se ha compilado a partir de tres
Clones La secuencia de longitud completa es de 851 pb, con un ORF de 483 pb
Codificando una protena de 18 kDa que se parece ms a Drosophila
Hsp23. Finalmente, un clon parcial de 431 pb (clon ScD-7H10, GenBank
Nmero de adhesin EF103579) incluye los materiales altamente conservados
\ Alpha - cristalina y una porcin de la regin ms variable 3 \
Del dominio conservado. Los tres genes muestran una alta similitud con
Previamente descrito S. crassipalpis Hsp23 dentro de la \ alpha - cristalina
Pero son considerablemente menos similares en las regiones de
lado. Los tres nuevos pequeos Hsps fueron regulados durante la diapausa
(Figura 1). Un cuarto miembro de la pequea familia Hsp, aislado
Mientras se revisa una membrana previamente enriquecida con diapausa
CDNA (19) con el clon original de Hsp23 como sonda, es
Un clon de 1,101 pb (nmero de acceso GenBank AF156162) que es
Posiblemente un pseudogene de Hsp23. Aunque esta transcripcin
99% de identidad con Hsp23 empezando justo aguas abajo del inicio
Codn, no hay homologa en sentido ascendente. El primer inicio posible
Codn producira una protena deducida de 13 kDa, y una gama de
Los experimentos han fallado en demostrar una Hsp de este tamao en S.
Crassipalpis. Este putativo pseudogene tambin fue altamente expresado

Higo. 1. El desarrollo de la regulacin de varios Hsps (tres pequeos Hsps, un

Miembro de la familia Hsp60, y una nueva forma de Hsp70) durante la diapausa pupal en la
Mosca de la carne, S. crassipalpis, basada en la hibridacin Northern blot. ND, nondiapausing
Pupas mantenidas a 20 C; D, pupas diapausing mantenidas durante 20 Das a 20 C

Durante la diapausia. Aunque pseudogenes son incapaces de codificar

Protenas, no podemos descartar la posibilidad de que este pseudogene
Permanece fisiolgicamente activo, regulando la expresin de su
Homlogos activos (21).
Nuestro tamizaje SSH tambin identific una nueva familia Hsp involucrada
En diapausa. Clon ScD - 6A1 (GenBank nmero de acceso EF103581)
Es un clon de 580 pb con alta similitud con una protena T de complejo-1
(TCP-1) que contiene chaperonina de la familia Hsp60. Lo deducido
192-aa secuencia muestra identidad sustancial y similitud
A TCP-1 de Drosophila (90% y 97%, respectivamente), como
As como similitud sustancial con el camarn de salmuera ms distante,
Artemia franciscana (74% de identidad y 85% de similitud). A pesar de que
Expresado en individuos no dispausivos, las transcripciones de este gen
Fueron moderadamente reguladas en diapausing pupas (Fig. 1).
Finalmente, nuestra biblioteca SSH contena un clon parcial de un
Miembro adicional de la familia Hsp70, denominada Hsp70B. los
El clon ScD-5B11 de 640 pb (GenBank n de acceso EF103580)
Incluye el 3? De la ORF y se extiende a travs de la poliA
cola. Aunque el nuevo miembro de la familia Hsp70 es bastante similar a
La descrita anteriormente (18) dentro de la ORF (93% similar
A nivel de cidos nucleicos), tambin presenta grandes diferencias:
Son inserciones de 30 y 12 pb dentro del ORF y no hay
Similitudes en el 3? UTR, con la excepcin de la similitud
Longitud (272 pb frente a 277 pb), la secuencia seal poliA y la
PoliA cola. Aunque las inserciones no son idnticas a ninguna de las
Cinco secuencias de Hsp70 descritas de Drosophila, inserciones similares
Se registran en el GenBank para el roble japons silkmoth
Antheraea yamamai y dos especies de garrapatas (Ixodes scapularis and
Dermacentor variabilis). Northern blot hibridacin utilizando highstringency
Y el clon ScD-5B11 como una sonda produjo un nico
Banda que fue regulada durante la diapausa (Fig. 1).
Patrn de expresin a lo largo de la diapausa. La presencia de mRNAs
Codificacin de la Hsps est estrechamente vinculado a la latencia entera
perodo. Como se muestra en la Fig. 2A, expresin de Hsp23 y Hsp70
Comienza 5 das despus de la puparacin, un tiempo que marca el inicio de la pupa
Diapause, y los mRNAs estn presentes hasta el desarrollo adulto
(Fig. 2 B y C). Aproximadamente 60 d despus del inicio
De la diapausa, las pupas entran en un periodo de desarrollo postdiapausia.
Durante el perodo postdiapausa, las pupas no iniciarn
Desarrollo si se mantienen a baja temperatura, pero se

Higo. 2. Los patrones temporales de la expresin de Hsp23 y Hsp70 en S. crassipalpis muestran

que los Hsps se activan al inicio de la diapausa pupal, continan expresndose a lo largo de la
dia- pausa y el perodo postdiapausa y se desactivan pocas horas despus de que las pupas
reciben una seal para Reanudar el desarrollo. (A) Expresin en el inicio y fase temprana de la
diapausa pupal (la diapausa comienza 5d despus de la formacin del pupario). (B) Durante el
desarrollo tardo de la diapausa y postdiapausa (la postdiapausa comienza 60 das despus de
la formacin del pupario). Adaptado de Hayward et al. (47). (C) Disminucin rpida en la
expresin de Hsp23 y Hsp70 cuando la diapausa pupal se termina artificialmente por la
aplicacin de hexano. Adaptado de Yocum et al. (17) y Rinehart et al. (18). ND, nondiapausing
pupas; RE, etapa del ojo rojo del desarrollo del adulto del pharate. El 28s se utiliz como el gen
de control.
Totalmente capaz de hacerlo si se transfiere a altas temperaturas.
Bajo condiciones de campo, estas moscas entran normalmente en la postdiapausa
A principios de enero, pero las bajas temperaturas que
Prevalecen durante el invierno suprimen el desarrollo hasta que las temperaturas del suelo
En la primavera (22). Los ARNm de Hsp no disminuyen al
El final de la diapausa verdadera perodo, pero persisten en la postdiapausa
(Figura 2B). Diapause en esta especie puede
Se puede terminar fcilmente con la aplicacin de un disolvente orgnico
Tal como hexano, y cuando se termina la diapausa de esta manera,
Los ARNm de Hsp disminuyen en 6-12 h (Fig. 2C). As, la expresin
Del Hsps se enciende en el mismo principio de la diapausa,
Y los ARNm estn presentes a lo largo de la diapausa y la postdiapausa
Y disminuyen horas despus de que la seal que inicia la adultez
Desarrollo.
Los Perfiles de Protenas Revelan Adicional smHsps que son Diapause UpRegulated.
Cuando se utiliz electroforesis bidimensional para
Comparar las protenas cerebrales en diapausing y nondiapausing pupas
De S. crassipalpis, las protenas ms abundantes que eran nicas
A los cerebros de las pupas diapausing result ser Hsps (23). Como
Mostrado en la Fig. 3, dos de la diapausa up-regulado protenas fueron
Identificados como miembros de la familia Hsp70, y seis fueron identificados
Como smHsps. Este enfoque confirma as que los ARNm en
Las familias Hsp, de hecho, se estn traduciendo en protenas y
Revela la presencia de al menos dos diapause-upregulated adicionales
SmHsps no observado previamente.
Hsp70 Up-Regulacin en otras especies durante la diapausa. Para determinar
Qu tan comn es la regulacin de la
Hsps podra ser, hemos examinado Hsp70 expresin en una serie de
Otros insectos, representando diferentes rdenes y diferentes etapas
De la diapausa. En las cinco especies adicionales reportadas aqu, Hsp70
Fue regulada durante la diapausa (Fig. 4). Diapause en ambos
Rhagoletis suavis y Rhagoletis pomonella es similar a la de S.
Crassipalpis en que tambin son dipterans que entran en un facultativo
(Ambientalmente programada) como pupas. Hsp70 fue
Tambin diapause up-regulation en tres especies de lepidpteros con
Diversos programas de diapausa: el obligado (programado genticamente,
Ms que bajo control ambiental) embrionario
Diapause de Lymantria dispar, la diapausa larvaria facultativa de
Ostrinia nubilalis, y la diapausa pupa facultativa de Manduca
Sexta
Despus de nuestros informes iniciales sobre la regulacin de la diapausa
Hsp23 y Hsp70 (17, 18), se observ que Hsps estaban reguladas positivamente
Durante la diapausa en varias especies adicionales, incluyendo
Adult diapause del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa
Decemlineata (24), diapasas pupas de la abeja solitaria, Megachile
Rotundata (25) y el gusano de la cebolla Delia antiqua (26), larval
Diapausa de la barrena del tallo del arroz Chilo suppressalis (27), y
La diapausa embrionaria del silkmoth Bombyx mori (28). Estas
Informes publicados, junto con nuestros datos sobre cinco
Especies, proporcionan evidencia de que los Hsps estn comnmente regulados
Durante la diapausa en diversos taxones de insectos, incluyendo Diptera, Lepidoptera,
Coleoptera, y Himenpteros y en diapasas que
Ocurren en estadios embrionarios, larvales, pupas y adultos.
Pero, claramente, la regulacin positiva de Hsp no est asociada con la diapausa
En todas las especies de insectos. Los Hsps no parecen estar regulados
Durante la diapausa adulta de Drosophila triauraria (29, 30), en larvas
Diapausa de la mosca Lucilia sericata (31), o en la diapausa adulta
Del mosquito Culex pipiens (32). Hsp up-regulation parece
Ser ms comunes en las dia- patias preadultas que en las adultas (reproductivas)
Diapasas Aunque una forma de Hsp70 est regulada positivamente
Durante la diapausa adulta de L. decemlineata, la regulacin positiva es
Mucho ms modesto que lo visto en diapasas que ocurren en el preadulto
Etapas. Tambin es evidente que los mismos Hsps no son consistentemente
Involucrados en la diapausa. Aunque la Hsp90 est regulada negativamente en pupas
Diapausa de S. crassipalpis (20), est regulada en las diapasas
Tanto de D. antiqua (26) como de C. suppressalis (27).
La asociacin de Hsps con la detencin del desarrollo se extiende
Ms all de los insectos. La expresin de Hsp es fuertemente regulada durante
Dormancies que van desde encystment en el camarn de salmuera, Artemia
Franciscana (33), y las etapas quiescentes del agua dulce
Esponja, Spongilla lacustris (34), a hibernacin de mamferos (35,
36), y pequeos Hsps son regulados hasta durante la latencia en un
Nmero de tejidos vegetales incluyendo semillas (37-39), parnquima
Clulas (40) y tejido de corteza (41). Adems, los organismos polares
Incluidas las larvas de la mosca antrtica terrestre, Belgica
La Antrtida (42), un pez antrtico, Trematomus bernacchii, (43),
Y un ciliado marino antrtico, Euplotes focardii (44), continuamente
Expresar Hsps. Por lo tanto, Hsps parecen ser ampliamente utilizados por
Organismos sometidos a ambientes fros.
Funcin Hsp Durante Diapause. La inyeccin de Hsp70 o Hsp23
DsRNA en vagabundeo larvas de tercer estadio suprimido expresin
De estos genes (Fig. 5A) y dio lugar a la prdida previsible de
Tolerancia al calor en pupas nondiapausing (Fi gramo. 5B). Aunque la prdida de tolerancia al
calor fue evidente despus de la inyeccin de Hsp70dsRNA o Hsp23 dsRNA, el efecto de Hsp70
dsRNA fue ms pronuncia. En pupa diapausing joven (10-15 das en diapausa),
Higo. 3. Gel bidimensional que representa protenas cerebrales de pupas diapausing de S.
crassipalpis. Las protenas numeradas, que son nicas o ms
Abundantes en el cerebro diapausing, son todas las protenas de choque trmico. Los nmeros
a la derecha del gel representan los marcadores de tamao kilodalton. ND, nondiapausa; D,
diapausa.
Adaptado de Li et al. 2007.
Desafiado con una exposicin de 24 horas a 15 C, Hsp70 dsRNA causado
Una prdida dramtica de la tolerancia al fro, pero dsRNA Hsp23 fue
Ineficaz (figura 5C). En esta etapa temprana de la diapausa, la frialdad
An no se ha desarrollado completamente, pero en 20-25
Das, la dureza fra de la diapausa de las pupas es mucho ms
Robusto (45), y en estas pupas ms viejas, el RNAi dirigido contra
Ya sea Hsp70 o Hsp23 dio lugar a una prdida significativa de fro
tolerancia. Por lo tanto, concluir que Hsp up-regulacin, junto con
Sntesis del glicerol crioprotector (45) y modificaciones de
Las membranas celulares (11), contribuyen significativamente al
Tolerancia al fro de la diapausing pupa de la mosca de la carne. El papel bien conocido
De Hsps en el mantenimiento de la integridad funcional de las protenas crticas es
Higo. 4. Evidencia de que la Hsp70 est regulada positivamente durante la diapausa en varios
insectos adicionales que representan diferentes rdenes y diferentes etapas de la diapausa.
Las hibridaciones Northern blot se basan en clones Hsp70 desarrollados para cada especie. L.
dispar (Lepidoptera) tiene una diapausa obligada como embrin tardo (pharate
Larva de primer estadio), y la comparacin se hace entre un embrin enfriado de diapausing y
uno que acaba de terminar la diapausa. O. nubilalis (Lepidoptera)
Diapasas durante su ltimo instante larvario en respuesta a la corta duracin del da ya la baja
temperatura; La comparacin se realiza entre larvas no dispa- ragiosas criadas a larga distancia
Da versus larvas de diapausing criadas a corta jornada. R. suavis y R. pomonella (Diptera)
tienen una diapausa pupa facultativa; La comparacin se hace
Entre pupas en diapausa y aquellas que han terminado la diapausa. M. sexta (Lepidoptera)
diapaus como una pupa en respuesta a la corta duracin del da. Aqu el
Se hace una comparacin entre una pupa diapausing criada a una corta duracin de da frente
a una pupa nondiapausing criada a largo da.
Higo. 5. El RNAi demuestra que la supresin de la expresin de Hsp23 y Hsp70 da lugar a una
prdida de tolerancia tanto al calor como al fro. (A) Supresin de Hsp23 y Hsp70
En moscas de carne que se inyectaron como larvas errantes de tercer estadio con 1,0 g de
ARNdb y luego se sometieron a choques trmicos de 45C de varias duraciones.
(B) Reduccin de la tolerancia al calor de las moscas inyectadas con dsRNA y luego expuestas a
25 C (temperatura de elevacin), 40 C durante 2 h, 45 C durante 1 h, o 40 C durante 2 h y
Despus a 45 C durante 1 h. Significa? SE de tres repeticiones de 15 individuos cada una. (C)
Reduccin de la tolerancia al fro en diapausing pupas inyectadas como errante de tercer
estadio
Larvas con dsRNA. La supervivencia de pupas despus de una exposicin de 24 h a 15 C se
evalu 10-15 d o 20-25 d despus del inicio de la diapausa pupal. Significa? SE de tres
Repeticiones de 15 individuos cada uno. (D y E) Incidencia y duracin de Diapause en moscas
inyectadas con dsRNA de Hsp23 (D) o dsRNA de Hsp70 (E) como tercer estadio errante
Larvas Significa? SE de tres repeticiones de 25 individuos cada una. Sarcotoxina dsRNA se
utiliz como el control en B-E. Los asteriscos indican diferencias significativas
En la prueba de Tukey de los medios de los mnimos cuadrados.
Es probable que sea tan importante a baja temperatura ya que es alta
temperatura.
Tambin probamos la posibilidad de que la expresin de Hsps puede
Afectan la decisin de entrar en la diapausa o la duracin de la diapausa.
El RNAi dirigido contra Hsp23 (Figura 5D) o Hsp70 (Figura 5E)
Ni alter la incidencia de la diapausa pupal ni afect la
Las pupas permanecieron en diapausa.
Consideramos probable que la regulacin de Hsps tambin proporcione
Un mecanismo de "respaldo" que garantice que el desarrollo
Permanecen detenidos durante la diapausa. En la mayora de los casos, la expresin de
Hsps es incompatible con la progresin del desarrollo. Sobreexpresin
De Hsp70 resulta en un retraso de la progresin del ciclo celular
(16) y una disminucin del desarrollo en Drosophila melanogaster
(46), y hemos demostrado que la aparicin de adultos
El desarrollo se retrasa cuando se producen Hsps (47). Nosotros
Sospecha que la presencia de Hsps durante la diapausa no slo
Contribuye a la mejora de la tolerancia al fro, pero tambin
Proporciona un mecanismo secundario para asegurar que el desarrollo
Sigue detenido.
Conclusiones
Proporcionamos pruebas de que numerosos Hsps son de desarrollo
Up-regulado durante la diapausa pupal de hibernacin de la carne
Mosca, S. crassipalpis. Aunque anteriormente sabamos que Hsp70 y
Las Hsp23 fueron reguladas positivamente durante la diapausa de la mosca de la carne, ahora
mostramos
Que una forma adicional de Hsp70, un miembro de la familia Hsp60,
Y tres smHsps adicionales son diapause regulado arriba, y un
Estudio de la protemica sugiere que al menos seis smHsps son diapause
Regulado. El hecho de que los Hsps estn regulados no slo
Diapausing pupa de la mosca de la carne pero tambin durante diapause en una variedad de
Especies de insectos que representan diferentes rdenes y diferentes diapausas
Que las Hsps son actores clave en la
Respuesta de muchos insectos. El uso de RNAi para suprimir la expresin
De Hsp23 y Hsp70 demuestra que la supresin de estos genes
No altera la decisin de entrar en la diapausa ni afecta a la
Duracin de la diapausa, pero tiene un efecto profundo en
Reduciendo la tolerancia al fro de las pupas diapausing.
De varias maneras importantes, la respuesta Hsp que observamos durante
Diapausa difiere significativamente de la respuesta tpica al estrs que
Ha sido bien documentado para Hsps. (I) Los Hsps son de desarrollo
Up-regulado durante la diapausa en lugar de ser inducido
Por el estrs ambiental. Ii) La reglamentacin vigente persiste
Muchos meses, presumiblemente 9-10 meses bajo condiciones de campo
En lugar de los breves intervalos que caracterizan el estrs
respuesta. (Iii) En la respuesta al estrs, la mayora de los otros genes son
Down-regulado cuando los Hsps estn regulados, pero, en diapause,
Los ARNm Hsps se estn transcribiendo simultneamente con
Otras transcripciones. (Iv) A diferencia de la mayora de las respuestas al estrs que
Regulacin sincrnica de todo el conjunto de Hsps, durante
Diapause, Hsp70, Hsp60, y los smHsps estn todos regulados,
Pero Hsp90 es en realidad regulada a la baja, lo que sugiere una interesante
Dicotoma de la funcin en ciertos Hsps bajo estos dos
circunstancias.
La riqueza de Hsps que son up-regulation tambin plantea sin respuesta
Preguntas sobre las contribuciones especficas de cada Hsp.
Por qu hay tantos smHsps? Es esta redundancia, o no
Cada uno tiene una funcin especfica? Lo ms probable es que los diferentes smHsps
Estn interactuando de manera diferente con grupos especficos de protenas (48).
El hecho de que el RNAi dirigido contra Hsp23 tiene menos impacto en
Tolerancia al fro que RNAi dirigida contra Hsp70 ya sugiere
Que estos dos Hsp contribuyen a la tolerancia al fro en
diferentes caminos.
El descubrimiento de que un miembro de la familia Hsp60, TCP-1, es
Regulado durante la diapausa de la mosca de la carne es intrigante porque el
La protena TCP-1 acta como una subunidad de chaperonina citoslica que contiene
TCP-1 (CCT), un gran complejo que facilita la
Plegado adecuado de protenas del citoesqueleto tales como tubulina, actina,
Y centractina (49-51). Se han realizado varios enlaces directos
Entre TCP-1 y la supervivencia en fro. En la levadura, TCP-1 es upregulated
Por choque en fro (52), y un mutante sensible al fro fue
Inform que el resultado de la mutacin de TCP-1 (53]. Ms recientemente,
La regulacin positiva de TCP-1 se ha asociado con el fro
Resistencia al mosquito de la cebolla, D. antiqua (54), y
Implicados en la diapausa del camarn de salmuera, A. franciscana, donde
Se encuentra en asociacin con microtbulos en los quistes no desarrollados
(55). Una relacin entre la estabilidad de los microtbulos y la supervivencia en fro es
Observado en varios poikilotherms adaptados a ambientes fros
(56-58), y una serie de ajustes del citoesqueleto estn asociados
Con diapausa de insecto (25, 59-61). Nuestros datos, mostrando el upregulation
De una chaperonina especfica de microtbulos durante la diapausa,
Destacan la importancia de la estabilidad citoesqueltica durante
Diapausa y baja temperatura de supervivencia.
La resistencia al fro es un componente del programa de diapausa
Mosca de carne (62). Las pupas que entran en diapausa son considerablemente ms
Tolerantes a las bajas temperaturas que sus homlogos no-desparejados,
Y los principales ajustes bioqumicos previamente reconocidos
Como contribuyendo a esta resistencia al fro incluyen la acumulacin
Del glicerol crioprotector (45) y las modificaciones de las grasas
cidos en la membrana celular (11). A estos, ahora argumentamos
La adicin de Hsps como contribuyentes principales a la tolerancia al fro en
Diapausing pupas de mosca y las etapas de invierno de otros insectos.
Materiales y mtodos
Cra de la mosca. Las moscas se obtuvieron de un laboratorio establecido
Colonia de la mosca de la carne, S. crassipalpis Macquart, criado bajo
Nondiapausing condiciones de longitud de da largo (15: 9, luz / oscuridad) en
25C. Las pupas de Diapausing se obtuvieron levantando adultos del
Generacin de padres a corta jornada (12:12; luz / oscuridad) a 25 C
Y larvas a 12:12 luz / oscuridad a 20 C, como se describe (63). Cuando
Se realizaron comparaciones directas entre la no-dispausa y la diapausacin
Moscas, los dos grupos se criaron como larvas a 20 C mientras
Manteniendo sus respectivos regmenes de luz. Terminar artificialmente
Diapausa, se retir el oprculo del pupario y se aadieron 5 l de
Hexano se aplic directamente a la cabeza pupa (64).
Hibridacin Sustractiva Supresora. Clones de la mayora de los nuevos identificados
Hsps inform en este estudio se obtuvieron por supresin
Hibridacin sustractiva (SSH), restando cDNA de la no-dispausa
Pupas (5 das despus de la puparacin, el desarrollo
Etapa equivalente a la diapausa) de la de las pupas que haban sido
En diapausa durante 20 d, como se describe para el mosquito Culex pipiens
(61). En resumen, grupos de ARN de 20 individuos fueron creados por
Utilizando el Reactivo TRIzol (Invitrogen, Ca Rlsbad, CA), el cDNA se sintetiz usando el kit de
sntesis de cDNA de BD SMART PCR (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), y la sustraccin se
realiz usando un kit de sustraccin de cDNA de PCR de BD (BDBiosciences). Se us un kit de
clonacin TOPO TA (Invitrogen) para clonacin y se seleccionaron aleatoriamente las colonias
para la secuenciacin. Hibridacin Northern Blot. Las muestras de ARN utilizado en la
hibridacin de Northernblot consistan en 20 g de ARN total aislado de tres pupas usando el
reactivo TRIzol siguiendo el protocolo estndar. Las muestras se desnaturalizaron por calor
antes de separacin electrofortica en gel de formaldehdo 0,41M de agarosa al 1,5% ,
Minnetonka, MN) mediante el uso de un Turbo-Blotter (Schleicher & Schuell, Florham Park,
NJ), y se reticula mediante irradiacin UV. Los clones de inters weredigoxigenina (DIG)
marcado usando DIG-alta solucin de primera (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los
clones de longitud completa se usaron para todas las transferencias de Northern excepto para
aquellos confirmando la supresin de genes por RNAi. Para las transferencias de RNAi
Northern, las sondas se hicieron a partir de la porcin del clon que no se us como placa para
la sntesis de ARNds (bases 1-570 para Hsp23 y bases1-743 para Hsp70). En todos los casos, las
sondas resultantes se utilizaron entonces en hibridacin Northern blot utilizando el Dig High
PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche Applied Science) siguiendo el protocolo
estndar. BioMax Chemiluminescencefilm (Kodak, Rochester, NY) se expuso entonces a la
transferencia blotfor seal de deteccin. La carga igual de muestras fue confirmada por
eliminacin alcalina de la membrana usando NaOH 0,2 M, SDS al 0,1%, seguido de reprobing
con una sonda de rRNA de 28 s. Todos los Northernblots se realizaron por triplicado. Hsp70 de
otros insectos. Se obtuvo un clon parcial de Hsp70 a partir de los siguientes insectos usando
cebadores de PCR diseados a partir de secuencias de insectos conservadas siguiendo el
protocolo establecido (32). Los productos de PCR resultantes se clonaron y secuenciaron
posteriormente. Se desarrollaron clones parciales para el nogal huskmaggot R. suavis
(GenBank n de registro EF103585), el gypsymoth, Lymantria dispar (GenBank n de entrada
EF103582), la barrenadora europea del maz, Ostrinia nubilalis (GenBank n de acceso
F103583) y el gusano de tabaco , M. sexta (GenBankaccession n AF533366). Tambin se
desarroll un clon parcial para el gusano de manzana Rhagoletis pommonella, seguido de 3? Y
5 \ beta RACE para desarrollar un clon de longitud completa (GenBank n de acceso
F0103584). Estos clones se usaron posteriormente como sondas en hibridacin Northernblot
para caracterizar la expresin de Hsp70 durante la diapausa. Para R. pommonella y R. suavis,
ambas entran en afacultative Pupal diapause (65), se realizaron comparaciones entre la
diapausacin de las pupilas a 4 C con aquellas en las que la diapausa se rompi con una
exposicin de 3 d a 25 C. L. dispar entra en una obligada pa- lapa, aunque, en este caso, como
una larva de primer estadio de pharate que todava se encuentra dentro del corion del huevo
(66, 67). Para L. dispar, la Se realiz una comparacin entre individuos diapausantes
4 C y aquellos en los que la diapausa se rompi por una exposicin de 3 d
A 25 C. En contraste, O. nubilalis exhibe un quinto (final) facultativo,
Diapausa larvaria, inducida por una longitud de da corta y baja temperatura
(68). M. sexta entra en una diapausa pupa facultativa, programada
Por longitud de da corta (69). Tanto para O. nubilalis como para M. sexta,
Se hicieron comparaciones entre la puta diapausing y su
Nondiapausing homlogos, todos los mantenidos a 20 C. Todas las manchas de Northern
Se realizaron por triplicado, con carga igual determinada por
Tincin con bromuro de etidio del ARN ribosmico.
DsRNA Sntesis e Inyeccin. Nuestro protocolo de sntesis de dsRNA fue
Adaptada de la de Kennerdell y Carthew (70), utilizando una
PCR modelo de mtodo de produccin. Primers especficos para Hsp23
Y Hsp70 de S. crassipalpis se construyeron con la adicin
De una secuencia T7 de 27 nucletidos a la secuencia 5 \ Final de cada cebador.
Los cebadores para Hsp23 se disearon para amplificar las bases 570
A travs de 1016 de la secuencia Hsp23 (GenBank n de acceso.
U96099), dando como resultado un fragmento de 446 pb que inclua el ORF
3? Del dominio \ alpha - cristalino conservado y la mayor parte de la \
UTR. Los cebadores para Hsp70 se disearon para amplificar las bases 797
A travs de 1225 de la secuencia parcial de Hsp70 (acceso GenBank
no. AF107338). Como control, tambin desarrollamos dsRNA para
Sarcotoxina, un gen implicado en la funcin inmune de S. crassipalpis
(71). Los cebadores para la sarcotoxina se disearon para amplificar bases
1-546 de la secuencia parcial (GenBank nm.
AY130768). La PCR basada en Supermix (Invitrogen) utiliz la
Clones respectivos en plsmidos pCR 2.1 (Invitrogen) como plantilla
Con 10 ciclos usando una temperatura de recocido de 40 C, seguido
Por 35 ciclos de hibridacin a 55 C. Despus de la amplificacin, el resultado
Producto se extrajo con fenol-cloroformo, se precipit con etanol,
Y reconstituido en tampn Tris. Seguidamente se realiz la sntesis de ARN
Utilizando T7 RNA polimerasa (Promega, Madison, WI)
Sobre 1 g de producto de PCR siguiendo el protocolo estndar. Despus
DNasa tratamiento para eliminar la plantilla, la reaccin fue de nuevo
Fenol-cloroformo extrado y precipitado con etanol antes
Almacenamiento a 70 C en etanol.
Nuestro protocolo de inyeccin de dsRNA fue adaptado de Nishikawa
Y Natori (72), utilizando larvas errantes de tercer estadio que
Ya purgaron sus tripas. DsRNA se disolvi en solucin salina de insectos
(NaCl 130 mM, KCl 5 mM y CaCl2 1 mM) a una concentracin
De 0,2 g / l, y se inyectaron 5 l en cada larva usando una
Aguja capilar de vidrio tirado. Las larvas fueron anestesiadas en fro
Hielo durante 30 minutos antes y despus de la inyeccin.
Exposicin a la temperatura. Para las exposiciones a altas y bajas temperaturas,
15 pupas fueron colocados en paredes delgadas, 13? 100 mm
Tubos de ensayo Pyrex con tapn de algodn que se colocaron en un
Modelo RM20 bao de glicerol fijado a la temperatura deseada.
Se evalu la supervivencia de las pupas nondiapausing a alta temperatura
Mediante el seguimiento de la eclosin de adultos con xito. Supervivencia de
Diapausing pupas a baja temperatura se evalu mediante el seguimiento
El estado de las pupas una semana despus; Pupas sanas permanecieron
Blanco, mientras que las pupas no saludables eran oscuras. Todos los tratamientos fueron
Se realizaron por triplicado, y los datos se analizaron por
ANOVA con replicacin, seguido por la prueba de Tukey del
Medios de mnimos cuadrados, con P? 0,05 considerado estadsticamente
significativo.
Diapause Incidencia y duracin. Quince das despus de la puparacin,
El oprculo fue retirado del pupario de las moscas criadas
En condiciones de induccin de diapausa (12:12 luz / oscuridad, 20 C), y la
Diapausa estado de las pupas se observ mediante la determinacin de si
Se haba iniciado el desarrollo de adultos (73). Para determinar la diapausa
Duracin, las pupas fueron posteriormente inspeccionadas a 10-d
Intervalos para observar el tiempo de terminacin de la diapausa, como se evidencia
Por la migracin de los discos antenales y la aparicin del rojo
Pigmentacin en los ojos. Todas las evaluaciones se realizaron por triplicado.
Agradecemos a Tracy Craig, Bryan Cairns, Jakub Godlweski y Katie
Yoders para la ayuda en estos experimentos y los profesores Richard E.
Lee, Jr., (Universidad de Miami, Oxford, OH) y Thomas H. MacRae
(Dalhousie University, Halifax, NS, Canad) por sus tiles comentarios sobre
El manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de
De la Iniciativa Nacional de Investigacin Agrcola 2005-03407),
Fundacin para la Ciencia, IOB-0416720, y los Institutos Nacionales
Salud Subvencin R01 AI058279.