Revista EIA

ISSN: 1794-1237
revista@eia.edu.co
Escuela de Ingeniera de Antioquia
Colombia

Figueroa, Omar Alfredo; Zapata, Jos dgar; Gutirrez, Gail Albeiro

MODELAMIENTO DE LA CINTICA DE HIDRLISIS ENZIMTICA DE PROTENAS DEL PLASMA
BOVINO
Revista EIA, nm. 17, julio, 2012, pp. 71-84
Escuela de Ingeniera de Antioquia
Envigado, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=149224285006

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Revista EIA, ISSN 1794-1237 Nmero 17, p. 71-84. Julio 2012
Escuela de Ingeniera de Antioquia, Medelln (Colombia)

MODELAMIENTO DE LA CINTICA DE HIDRLISIS

ENZIMTICA DE PROTENAS DEL PLASMA BOVINO

Omar Alfredo Figueroa*

Jos dgar Zapata**
Gail Albeiro Gutirrez***

RESUMEN

Se utiliz un modelo cintico para estudiar la velocidad de reaccin en la hidrlisis de protenas de plasma
de bovino con alcalasa 2,4 L en un reactor batch. Se estudi la influencia de variables como la concentracin
inicial de sustrato y enzima sobre el grado de hidrlisis y se determinaron los parmetros cinticos de la ecuacin
de velocidad, analizando su relacin con las variables de trabajo. Se ajust un modelo cintico de orden cero y
desactivacin enzimtica por sustrato, de segundo orden, as como la relacin directa entre la fraccin enzima-
-sustrato y la tasa de formacin de productos de hidrlisis.
PALABRAS CLAVE: hidrolizados proteicos; hidrlisis enzimtica; cintica enzimtica; modelos bioqumicos.

* Ingeniero Agroindustrial, Universidad Popular del Cesar; Magster (c) en Ciencias Farmacuticas: Alimentos, Facultad
de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia. omfimo22@gmail.com

** Ingeniero Qumico, Universidad de Antioquia; Doctor en Biotecnologa, Universidad de Granada, Espaa. Docente
de Planta, Departamento de Alimentos, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia. Medelln,
Colombia. jedgar_4@yahoo.es

*** Ingeniero Mecnico, Universidad Industrial de Santander; Doctor en Ingeniera, Universidad Pontificia Bolivariana,
Sede Medelln. Docente, Universidad Popular del Cesar. Valledupar, Colombia. gailgutierrez@unicesar.edu.co

Artculo recibido 14-XII-2011. Aprobado 2-V-2012

Discusin abierta hasta diciembre de 2012
 Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...

MODELING OF THE KINETICS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS

OF BOVINE PLASMA PROTEINS

ABSTRACT

A kinetic model was used to study the reaction rate of hydrolysis of bovine plasma proteins and alcalase 2.4 L,
in a batch reactor. The influence of variables, such as the concentration of initial enzyme substrate and the degree
of hydrolysis was studied, and kinetic parameters of the rate equation were determined by analyzing its relationship
with the work variables. A zero-order kinetic model and enzyme deactivation by substrate was found, as well as the
direct relationship between the fraction of enzyme-substrate and the rate of formation of hydrolysis products.
KEY WORDS: protein hydrolysates; enzymatic hydrolysis; enzymatic kinetics; biochemical models.

MODELAo DA CINTICA DE HIDRLISE ENZIMTICA DE PROTENAS

DO PLASMA BOVINO

RESUMO

Utilizou-se um modelo cintico para estudar a velocidade de reao na hidrlise de protenas de plasma
de bovino com alcalasa 2,4 L em um reator batch. Estudou-se a influncia de variveis como a concentrao
inicial de substrato e enzima sobre o grau de hidrlise e determinaram-se os parmetros cinticos da equao de
velocidade, analisando sua relao com as variveis de trabalho. Ajustou-se um modelo cintico de ordem zero
e desativao enzimtica por substrato, de segunda ordem, bem como a relao direta entre a frao enzima-
substrato e a taxa de formao de produtos de hidrlise.
PALAVRAS-CDIGO: hidrolisados proteicos; hidrlise enzimtica; cintica enzimtica; modelos bioqumicos.

1. INTRODUCCIN Los hidrolizados de protenas se han utiliza-

La sangre bovina es un subproducto de la
industria crnica con un importante valor biolgico,
representado en su contenido de protenas, lo que
la convierte en una buena fuente de aminocidos,
cuyo uso como ingrediente, en especial la fraccin
plasmtica, se ha extendido en alimentacin humana
y animal, en aplicaciones como la formulacin de
embutidos, pudines, panes, galletas, etc. (Rodas et
al., 1998). No obstante, la mayor parte de la sangre
producida en el sacrificio de animales se vierte a las
fuentes de agua, contribuyendo al dao del medio
ambiente (Hyun y Park, 2002).
do en muchos procesos alimentarios, gracias a sus
propiedades funcionales, como mayor capacidad de
agitacin, dispersin y elevada solubilidad (Ramos et
al., 2006; Dvila et al., 2007; Bentez, Ibarz y Pagan,
2008). Desde el punto de vista de la nutricin, las
protenas y pptidos procedentes de alimentos se
estn empleando con el fin de mejorar funciones
biolgicas (Mller et al., 2008; Bernardini et al.,
2010), pues los pptidos obtenidos por hidrlisis
son capaces de ejercer efectos biolgicos especfi-
cos (Martnez y Martnez, 2006). Tal es el caso de
hidrolizados de plasma a los que se les ha reportado
actividad inhibidora de la enzima convertidora de la

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72
angiotensina (ACE), actividad antigenotxica (re-
duccin de daos en el ADN) (Hyun y Park, 2002) y
actividad antioxidante (Liu et al., 2010). Por otro lado,
han sido aislados pptidos de hemoglobina bovina
con propiedades antimicrobianas (Daoud, Dubois-
Delval y Bors-Dodita, 2005; Nedjar et al., 2006).
Debido al uso potencial del plasma y otras
protenas de la sangre, existe hoy da gran inters
por modelar el comportamiento de sistemas que
involucran reacciones de hidrlisis enzimtica, con el
fin de dimensionar equipos industriales, pronosticar
comportamientos dinmicos, controlar tiempos de
proceso y otras variables cinticas (Arantes, 2008).
Es importante resaltar que la optimizacin de estos
procesos depende del comportamiento cintico,
que puede llegar a ser muy complejo para sistemas
con sustratos proteicos, ms aun cuando se tienen
varias protenas en el mismo sistema reaccionante
(Guadix et al., 2000). En este sentido, un modelo muy
simple es insuficiente para representar un proceso, y
uno muy complejo se hace poco prctico (Mrquez
y Vzquez, 1999). Unos modelos cinticos para sis-
temas batch que explican la velocidad de hidrlisis
de casenas (Camacho et al., 1993), lactoalbminas
(Gonzlez-Tello et al., 1994), hemoglobina bovina
(Mrquez y Vzquez, 1999) y sustratos de origen
vegetal (Mrquez y Fernndez, 1993) se han proba-
do con xito, generando informacin bsica para la
optimizacin de procesos.
Considerando que las reacciones enzimticas
de protenas tienen cierto grado de complejidad, se
han venido estudiando modelos cinticos de agru-
pamiento que contemplan la distribucin de pesos
moleculares de los productos de reaccin (Shi, He
y Qi, 2005), as como sistemas discontinuos de sepa-
racin empleando membranas, a fin de reducir los
inconvenientes con las inhibiciones enzimticas por
producto (Cheison, Wang y Xu, 2006; Prieto, Guadix
y Guadix, 2008; Trusek-Holownia, 2008).
En el presente trabajo se aborda el modelado
de la hidrlisis de protenas de plasma bovino, cuya
exploracin, desde la perspectiva de los modelos
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de hidrlisis, ha sido poco documentada. Se realiz
un estudio cintico de la hidrlisis enzimtica de
protenas de dicho sustrato, por medio del anlisis
de las curvas de hidrlisis bajo diferentes condi-
ciones de trabajo, y se encontr que es posible
ajustar el comportamiento descrito a un modelo
matemtico basado en una cintica de reaccin de
orden cero, desactivacin enzimtica de segundo
orden e inhibicin irreversible inicial de una frac-
cin de la enzima, pudindose determinar de esta
forma los parmetros cinticos del mecanismo de
reaccin propuesto. Este estudio permiti obtener
informacin til para predecir y manipular el com-
portamiento de las variables del proceso, lo que
podra servir para dirigir la hidrlisis enzimtica
hacia la obtencin de fracciones peptdicas de
inters biolgico.
2. MATERIALES Y MTODOS
2.1 Materiales
Los reactivos usados en el estudio fueron de
grado analtico y los mtodos empleados fueron
estandarizados a priori. El plasma fue suministrado
por la empresa Yeruv S. A., en la ciudad de Espe-
ranza, provincia de Santa Fe, Repblica Argentina.
La presentacin del producto fue lquida, con un
contenido proteico de 6,5 %. A este se le realizaron
controles microbiolgicos de mohos y levaduras,
coliformes totales y mesfilos, en el momento de la
recepcin. Para la hidrlisis de protenas, se utiliz
alcalasa 2,4 L grado alimenticio (actividad especfica
de 2,45 0,07 AU/g), cuya actividad se verific con
el mtodo de Takami, Akiba y Horikoshi (1989) mo-
dificado; es una enzima proteoltica producida por
fermentacin sumergida de una cepa seleccionada
de Bacillus licheniformis. El componente principal
de la enzima, subtilisina A (subtilisina Carlsberg), es
una endoproteasa. Las condiciones ptimas para
alcalasa 2,4 L son temperaturas entre 55 C y 70 C,
dependiendo del tipo de sustrato, y valores de pH
entre 6,5 y 8,5.
73
 Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...
2.2 Sistema de reaccin
Se us un reactor de vidrio con camisa de
circulacin de agua para regulacin de la tempe-
ratura y capacidad volumtrica de 1 L. El control
de pH y el registro de temperatura se hicieron con
un electrodo combinado de vidrio LL con diafrag-
ma esmerilado fijo (temperatura entre 0-80 C),
conectado a un titulador automtico (Titrando 842)
marca Metrohm, operado por computador (software
tiamo 1.2.1). El sistema de reaccin se mantuvo en
agitacin constante usando un agitador magntico
801 (Metrohm), con variacin de velocidad. La
temperatura en el sistema fue de 55 C, el pH de 8
y la agitacin de 200 rpm.
2.3 Mtodos analticos
2.3.1 Anlisis del contenido proteico
La concentracin de protenas del plasma
recibido fue determinada por el mtodo de Bradford
(1976). La curva patrn se construy empleando al-
bmina bovina, referencia A7030 de Sigma-Aldrich.
Las mediciones espectrofotomtricas se hicieron
en un espectrofotmetro UV-1700 PharmaSpec de
Shimadzu. La absorbancia a temperatura ambiente
se midi a 595 nm (Trusek-Holownia, 2008).
2.3.2 Seguimiento de la reaccin
de hidrlisis
Unos estudios previos de hidrlisis con alcalasa
2,4 L y hemoglobina bovina revelan que concen-
traciones iniciales de sustratos del orden de 1-10
En la hidrlisis de un enlace amido a pH alcalino, se siguen las siguientes etapas (Guadix, 2002):
El grupo carboxilo terminal se disocia por completo:
74
g/L de protena presentan buen comportamiento
respecto a la velocidad de formacin de pptidos
(Mrquez y Vzquez, 1999). El contenido de protenas
del plasma se vari entre concentraciones de 4, 6 y
8 g/L, y fue hidrolizado con concentraciones de en-
zima de 2, 2,5 y 3 % en peso. El pH y la temperatura
en el reactor se ajustaron con base en los valores
ptimos de trabajo recomendados por el proveedor
de la enzima (alcalasa 2,4 L), es decir, 8,0 y 55 C
respectivamente. Los ensayos de hidrlisis con ca-
da relacin enzima-sustrato fueron efectuados por
duplicado. Cada ensayo tuvo una duracin total de
una hora, tomando registros del grado de hidrlisis
(GH) cada 5 min.
La reaccin a pH alcalino se observ para la
determinacin del GH, expresado como la relacin
entre el nmero de enlaces peptdicos cedidos en
la hidrlisis (h) y el nmero de enlaces peptdicos
totales en la protena nativa por unidad de peso
(ht). Para este caso se emple un valor reportado
para protenas de la sangre de ht de 8,3 eqv/kg
(Adler-Nissen, 1986). El mtodo empleado para la
determinacin del grado de hidrlisis es el de valo-
racin del protn o mtodo del pH-estato. Consiste
en mantener constante el pH del medio de reaccin
con adicin de una solucin bsica (hidrxido de
sodio 0,1 N), pues a medida que la hidrlisis avanza
en medio alcalino, el grupo carboxilo terminal se
disocia por completo y los protones formados se
reparten de acuerdo con el equilibrio de proto-
nacin de los grupos -amino liberados. La base
agregada para mantener constante el pH neutraliza
nicamente los protones que son sustituidos por el
catin de la base (Guadix, 2002).
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 La base agregada neutraliza los protones: entre la velocidad de la reaccin, la concentracin
inicial de sustrato (S0) y de enzima (e0) con dos
parmetros de ajuste a y b (vase ecuacin 2), que
fueron determinados con la funcin lsqcurvefit del
Luego este consumo de base puede relacio- toolbox de MATLAB, la cual resuelve problemas de
narse con el GH segn la ecuacin 1 (Mrquez y ajuste de datos de curvas no lineales.
Vzquez, 1999).

(2)
1a)

3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
1b)
3.1 Modelo cintico
Donde B = volumen consumido de base
Los resultados obtenidos al estudiar el com-
(en litros), Mp = masa de la protena (en kg),
portamiento del GH con respecto al tiempo, a
NB = normalidad de la base (eqv/L).
diferentes concentraciones iniciales de enzima y de
En 1b, es el grado de disociacin de los gru- protena, se muestran en las figuras 1 y 2, en las cuales
pos -NH2 (grupos aminos liberados en la reaccin). se puede observar que al principio de la reaccin el
Para la estimacin del promedio del grado de GH aumenta con el tiempo y luego tiende a valores
disociacin de los grupos -NH2 liberados en la reac- constantes, que son directamente proporcionales a
cin, es necesario conocer el valor del pK medio y e0 e inversamente a S0.
establecer de esta forma la relacin entre el consumo Algunos autores (Gonzlez-Tello et al., 1994;
de base y el grado de hidrlisis. Mrquez y Vzquez, 1999) han indicado que en la
En la tabla 1, se muestran los valores del grado hidrlisis enzimtica de protenas, cuando se tienen
de disociacin de protenas en funcin del pH y la curvas de declinacin exponencial de la dGH/dt en
temperatura de reaccin (Adler-Nissen, 1986). funcin del tiempo, se puede ajustar un modelo de la
forma de la ecuacin 2 para el estudio cintico de la
Tabla 1. Valores de para distintas temperaturas reaccin, tal como se muestra en la figura 3, donde
y pH (Adler-Nissen, 1986) se pone en evidencia la disminucin exponencial de
la velocidad de la reaccin (d(GH)/dt ) con el GH.
T (C) pH
Por otro lado, el GH de la reaccin aumen-
50 7,5 0,71
ta cuando se trabaja a concentraciones iniciales
50 8,0 0,89 ms altas de enzima (vase figura 1), lo cual es
60 7,5 0,80 un comportamiento tpico en cintica enzimtica
60 8,0 0,93 de protenas (He, Qi y He, 2002), debido a que la
reaccin de hidrlisis est ligada a la formacin del
complejo enzima-sustrato, que a su vez depende de
2.4 Modelo matemtico la concentracin de la enzima activa.

Se propuso un modelo matemtico basado en Se alcanzaron en este caso porcentajes de

el mecanismo de accin enzimtica (Gonzlez-Tello hidrlisis superiores al 12 % en una hora de reaccin,
et al., 1994), que establece una relacin exponencial con una relacin enzima-sustrato de 2 % (w/w),

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 Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...

Figura 1. Comportamiento del GH con el tiempo a pH = 8,0, T = 55 C, S0 = 8 g/L y e0 variable

S0

Figura 2. Comportamiento del GH con el tiempo a pH = 8,0, T = 55 C, e0 = 0,3885 AU/L y S0 variable

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76
 1,60

1,40 R = 0,9719
So= 4 g/L
1,20
R = 0,9997
So= 6 g/L
1,00
dGH/dt (min1 )

R = 0,9991
0,80 So= 8 g/L

0,60

0,40

0,20

0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
GH (%)

Figura 3. Disminucin de dGH/dt con el GH para el sistema plasma bovino-alcalasa 2,4 L

a diferentes S0 y e0 = 0,3885 AU/L, pH = 8,0, T = 55 C

mientras que los rendimientos inferiores se registran Esto se prueba de forma experimental, adicionando
con concentraciones menores de enzima (vase figu- enzima fresca a un hidrolizado despus de 30 minu-
ra 1). Unas investigaciones anteriores (Gonzlez-Tello tos de reaccin, al producirse un aumento notable
et al., 1994; Mrquez y Vzquez, 1999; Qi y He, 2006) en el grado de hidrlisis, lo que pone en evidencia
indican que la disminucin en la tasa de hidrlisis de el fenmeno de desactivacin indicado, como se
la reaccin responde, por lo general, a tres factores: observa en la figura 4.
(a) Disminucin en la concentracin de enlaces pep-
Se considera que la velocidad de hidrlisis a
tdicos susceptibles a la hidrlisis por las proteasas,
pH y temperatura constantes est dada por la ecua-
(b) posible inhibicin de las enzimas causada por el
cin 3 (Gonzlez-Tello et al., 1994):
sustrato de hidrlisis; (c) desnaturalizacin trmica
de la enzima (Gonzlez-Tello et al., 1994).
(3)
Analizando las figuras 1 y 2, para todos los
niveles de enzima y sustrato hidrolizados, se observa
Separando variables e integrando la ecuacin
la tendencia del grado de hidrlisis hacia valores
3, para el caso en que no hay desnaturalizacin
lmites distintos, por lo que es claro que el factor
enzimtica (Gonzlez-Tello et al., 1994):
controlante en la velocidad no es la disminucin
de enlaces peptdicos disponibles. Por otro lado, el
fenmeno de desactivacin enzimtica demostr ser (4)
influyente en la disminucin de la tasa de hidrlisis.

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 Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...

16
y = 8E-10x6 + 1E-07x5 - 4E-05x4 + 0,0026x3 - 0,0779x2 + 1,2205x
R = 0,9974
14

12

10
GH (%)

8
GH (%)

Grado de hidrlisis (%)

6

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Figura 4. Efecto de la adicin de enzima fresca (alcalasa 2,4 L) durante el proceso de hidrlisis de plasma
a pH = 8,0, T = 55 C, e0 = 0,3885 AU/L y S0 = 4 g/L.

De la misma manera, la expresin integrada registrados en los parmetros a y b, para distintas

para el caso en que se presente inactivacin enzim-
tica de segundo orden est dada por (5) (Gonzlez-
Tello et al., 1994):
(5)
Como puede verse en las ecuaciones 3 y 5,
existe una relacin directa entre el grado de hidr-
lisis y el producto e0*t, por lo que es posible decir
que, para el caso de los experimentos realizados, la
desactivacin es de segundo orden, lo cual puede
corroborarse con los resultados de la figura 5, donde
se muestra que los datos de GH a igual S0 y distintas
concentraciones de enzima inicial siguen la misma
lnea.
Por otra parte, una inactivacin enzimtica
por el sustrato en el rango de concentraciones
estimadas no se considera, puesto que los valores
concentraciones de e0 y S0, no concuerdan con el
comportamiento esperado en el caso de adicionar
al mecanismo este efecto inhibidor.
Estudios anteriores sugieren que un modelo
de la forma de la ecuacin 2 puede ser explicado
suponiendo una hidrlisis enzimtica de orden cero,
simultnea con una desnaturalizacin de la enzima
de segundo orden, como lo muestra el siguiente
mecanismo (Mrquez y Vzquez, 1999).
k1 K2
E + S ES E + P
k-1
k3
E + ES Ea +Ei +P
Donde E, S y P representan la concentracin
de enzima, sustrato y producto, respectivamente.

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 k1 K2
E + S ES
k1 E + P K2
E k+-1S ES E + P
k-1
k3
E + ES Eka3 +Ei +P
E + ES de
Figura 5. Influencia Eala+Ei +P
concentracin inicial de enzima por el tiempo en el GH, pH = 8,0, T = 55 C, S0 = 8 g/L

ES es el complejo enzima sustrato. e = E + ES (8)

Ea y Ei indican la concentracin de enzima
activa e inactiva en la reaccin. Se sugiere la presencia de un inhibidor irre-
versible en el sustrato, que bien puede estar presente
Luego las ecuaciones cinticas para la forma- o formarse en la reaccin de hidrlisis. Puede estar
cin de producto y para la etapa de desactivacin asociado a inhibidores -AT presentes en la sangre
enzimtica son: humana y bovina (Beatty, Bieth y Travis, 1980) o
inhibidores similares a estos, como los encontrados
dGH dGH por Weber y Nielsen en matrices lcteas (Weber y
r = sr0= s0 dt= k= 2 |ES
2 |kES | | (6)(6) (6)
dt Nielsen, 1991).
de
=- dtk3=|Ek3|||ES
E|||ES| (7)(7)
de
- (7) Esta hiptesis sugiere que parte de la enzima
dt
inicial se liga al inhibidor, modificando la concen-
tracin de enzima inicial disponible de manera
Donde k2 es la constante cintica de velocidad
instantnea, en la forma que se muestra en (9)
de formacin de productos, k3 es la constante de
(Gonzlez-Tello et al., 1994):
desactivacin enzimtica.
Teniendo en cuenta que la enzima interviene E0act = e0 -S0 (9) (9)
como catalizador del sistema, la concentracin de
enzima en todo momento resulta de:
e = E + ES (8)
e = E + ES (8)
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79

K +K2
-1
 |E|= (12)
S0
K K
e=E0act exp 3 m GH (13)
K2
Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...
K3 Km
e=E0act exp GH (13)
K2
Donde B*S0 es la fraccin de sustrato ligada al Entonces
d(gh) una ecuacin de velocidad
K3para
Km el
inhibidor y E0act es la concentracin de enzima inicial r= s0 puede=k
sistema (e0 -S
expresarse 0 )EXP
como sigue: GH
dt 2 K2
E0act
real activa en el e0E-S
= sistema, e0 -S0(9)para la reaccin.
0act0=disponible (9) d(gh) K3 Km
Segn la aproximacin de Briggs-Haldane (Tzafriri y r= s0 =k (e0 -S0 )EXP GH (14)
(14)
dt 2 K2
Edelman, 2007), la constante de Michaelis-Menten
Km es: Es decir, llega a un modelo general de la
E0act = e0 -S0 (9) forma de la ecuacin 2, obtenindose para a y b las
(10) siguientes expresiones:
k02/S[(e
a =ak2=[(e 0 )-]
/S )-]
0 0 (15)
(15)
Km =
K +K2
K +K(10)
-1 a = k2 [(eo/S0 )-B] (15)
-1 2
Un balance de masa
m enKel
K1
K =
estado estacionario (10) k3 km
1 b= k k (16)
para el complejo ES indica que bk2 = 3 m
k2
(16) (16)

|E||S|
(11) (10)
|ES|= K = K-1+K|E||S|
2 (11)
Kmm K1 |ES |= (11) 3.2 Determinacin de los parmetros
Km
Sustituyendo la ecuacin 11 en la (8) y supo- cinticos
< S0: niendo que la concentracin
|E||S| de sustrato [S] = S0
|ES|= (11) Los datos obtenidos en los ensayos experimen-
Km << S0: y Km << S0: Km e Km
tales se ajustaron a un modelo general de la forma
|E|= (12)
S0 Km e de la ecuacin 2. El ajuste del modelo con los datos
|E|= (12)(12)
0 y Km << S0: S0 experimentales fue satisfactorio y los parmetros a
Km e y b estimados estn de acuerdo con el mecanismo
|E|=
De las ecuaciones (12)se obtiene
(6), (7) y (12) propuesto (tabla 2).
S0
por integracin una expresin para e, donde el lmite
K K Se aprecia que los valores de a aumentan con
0act exp K GH
e=Ede
inferior integracin3esmla enzima inicial(13)
realmente
activa E0act: 2 la relacin e0/S0, mientras que los valores del pa-
K3 Km
e=E0act exp GH (13)rmetro b permanecen en torno a un cierto valor,
K2
K3 Km
GH para el rango de concentracin de sustrato y enzima
e=E0act exp (13)
(13)
K2 evaluados, con un promedio de (0,255 0,038) min-1.
d(gh) K3 Km
r= s0 =k (e0 -S0 )EXP GH (14)
dt 2 K2
d(gh) K3 Km
r= s0d(gh) =k (e0 -S0 )EXPK3K GH (14)
r=Tabla
s0 2.dt =k (e
2 0 -S
Valores
m
GH
K2
)EXP a evaluado
del0parmetro (14)
y recalculado arec a distintas relaciones enzima-sustrato
dt 2 K2
con su correspondiente coeficiente R2

[e0]/[S0] (AU/g) a (min-1) R2 arecalculado (min-1) R2

a = k2 [(e0 /S0 )-] (15)
0,036 0,072 0,9999 0,066 0,9995
k3 km
b =a =a k=2 k[(e /S (16)
)-] (15) (15)
2 0[(e00 /S 0 )-]
0,049
0,380 0,9992 0,414 0,9962
k2
0,061 k3 km 0,413 0,9992 0,466 0,9957
b= k k (16)
0,065 b k2 3 m
=
k2 0,639
(16) 0,9997 0,654 0,9998

0,073 0,657 0,9966 0,698 0,9875

0,097 1,652 0,9998 1,578 0,9992

Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq

80
 Este comportamiento concuerda con reportes de lite- Donde k3km = kd, constante cintica de des-
ratura previos sobre hidrlisis enzimtica de protenas activacin.
de la sangre (Mrquez y Vzquez, 1999). Los valores
Los valores de los parmetros cinticos calcu-
de a fueron recalculados con la magnitud promedio
lados para el sistema alcalasa 2,4 L-plasma bovino
del parmetro b y analizados a la luz de la variacin
son: K2 (g/AU*min)= 22,940; (AU/g)= 0,035 con
de la relacin enzima-sustrato, tal como se muestra
R2=0,9329 y Kd (g/AU*min)= 5,848 con R2=0,9386.
en la tabla 2.
Con base en esto, el modelo cintico quedara
Cuando los valores de arec se grafican contra como se presenta en la ecuacin 18. e n n
e0/S0, es posible estimar la constante de formacin
de producto k2 y la constante B de la ecuacin 15 d(GH) -5, 848
r= s0 =22,,940(e0 -0,03
35S0 )exp GH (18))
(ver figura 6). dt 22, 940

(18)
De la misma manera, una representacin
grfica del producto de los parmetros ab contra
En la figura 8 se muestran los valores predi-
(e0/S0-B) en una lnea que pasa por el punto (0,0) per-
chos por el modelo propuesto en la ecuacin 18
mite la determinacin del producto de las constantes
(lnea continua en cada curva), as como los valo-
k3km (ver figura 7), que en el mecanismo propuesto
res experimentales (curvas con marcadores) para
equivale a la constante de desactivacin enzimti-
diferentes relaciones de e0/S0. El modelo muestra
ca de segundo orden de la reaccin (kd), como se
un error relativo promedio con respecto a los datos
muestra en la siguiente expresin:
experimentales del 7,30 %, lo cual indica un buen
de e2
ajuste del modelo propuesto, teniendo en cuenta
- =k3 km (17) (17) que es una reaccin multisustrato.
dt S0

Figura 6. Variacin de los diferentes valores de arec con e0 /S0 (AU/g).

Lmite de confianza del 95 % y R2= 0,965

Escuela de Ingeniera de Antioquia

e n n 81

d(GH) -5, 848

= s0 =22,,940(e0 -0,03
35S0 )exp GH (18))
dt 22, 940
 Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...

Figura 7. Variacin de los diferentes valores de a*b con (e0 /S0)- (AU/g.
Lmite de confianza del 95 % y R2= 0,938

GRADO DE HIDRLISIS Vs TIEMPO (SISTEMA PLASMA-ALCALASA (W/V)

14
0,0607 AU/g

12 0,0647 AU/g

0,0971 AU/g
10

8
GH (%)

0
0 10 20 30 40 50 60
t (Minutos)

Figura 8. Comportamiento del GH en funcin del tiempo a diferentes e0 /S0 (La lnea continua representa los
valores predichos por el modelo y los marcadores representan los datos experimentales), pH=8,0, T=55 C

Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq

82
 La ecuacin 2 ha sido empleada para estudiar
la relacin entre el grado de hidrlisis y el tiempo de
reaccin de diversas fuentes proteicas como garban-
zo (Mrquez y Fernndez, 1993), sistema alcalasa-
-casena (Camacho et al., 1993) e hidrlisis trptica
de casena (He, Qi y He, 2002), albminas de suero
lcteo (Gonzlez-Tello et al., 1994), seroalbmina bo-
vina (Qi y He, 2006) y hemoglobina bovina (Mrquez
y Vzquez, 1999). Ello demuestra el amplio espectro
de aplicacin de este modelo, tanto desde el punto
de vista del sustrato, como de complejos enzimticos
y condiciones de operacin (Mrquez y Vzquez,
1999). Un enfoque ms reciente es la aplicacin de
redes neuronales artificiales para la estimacin de los
parmetros de la ecuacin 2 (Abakarov et al., 2010).
Estos resultados ponen de manifiesto la
importancia de la relacin e0/S0 sobre la cintica
de hidrlisis enzimtica de plasma de bovino y la
presentan como una variable clave para optimizar
las condiciones de operacin tendientes a orientar
los valores de GH hacia regiones de inters. Tal
informacin es importante cuando se quiere dirigir
la hidrlisis a la consecucin de pptidos en deter-
minados rangos de tamao, a la optimizacin de
condiciones de operacin en escala industrial y al
diseo de biorreactores.
4. CONCLUSIONES
En este trabajo se evalu y valid un modelo
matemtico que puede usarse para simular la re-
accin de hidrlisis enzimtica de plasma bovino
con alcalasa 2,4 L en un reactor batch. El modelo
sugiere un mecanismo de reaccin que representa
una cintica de orden cero con respecto al sustrato,
simultnea con una desactivacin enzimtica de
segundo orden e inhibicin irreversible de una parte
de la enzima presente en la reaccin.
Un anlisis de la reaccin de hidrlisis enzi-
mtica de protenas a la luz de la ecuacin 2 puede
llevarse a cabo para distintos tipos de sistemas
proteicos (bien de origen animal o vegetal). La
deduccin del mecanismo cintico basado en la
Escuela de Ingeniera de Antioquia
determinacin de los parmetros a y b del modelo
general y la relacin entre S0, e0, GH con el tiempo de
reaccin es informacin de gran valor en actividades
de optimizacin de parmetros, para una potencial
produccin industrial de pptidos, as como para el
diseo y funcionamiento de biorreactores.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Comit para el Desarrollo de
la Investigacin (CODI) de la Universidad de Antio-
quia y al Centro de Investigacin para el Desarrollo
Tecnolgico del Carbn (CIDTEC) de la Universidad
Popular del Cesar.
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