AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTEINAS A PARTIR DE MATERIALES

BIOLOGICOS

OBJETIVO: Aislar y semipurificar protenas a partir de diversos materiales biolgicos

FUNDAMENTO: En bioqumica es comn aislar y purificar protenas para diferentes fines, especialmente
para estudiar su estructura y de ser posible su funcin. Para ello se emplean diferentes mtodos basados en la
diferencia de solubilidad en determinadas condiciones (pH prximo o alejado de su punto isoelctrico,
tamao molecular, fuerza inica del medio, etc.), de modo que, por regla general, se favorece la eliminacin
de materiales que puedan interferir, precipitando a continuacin la protena deseada y dejando los restantes
componentes de la muestra biolgica en el sobrenadante, para su eliminacin.
Los mtodos de separacin son diversos. As, la casena, la principal protena de la leche se precipita
simplemente por variacin del pH, hasta llegar al punto isoelctrico donde es insoluble en agua. La casena
es, en realidad una mezcla heterognea de fosfoprotenas que se encuentra en una proporcin del 3.5 % en la
leche y constituye un alimento muy completo pues posee todos los aminocidos esenciales para un
crecimiento y desarrollo normales.
La ovoalbmina el principal componente de la clara de huevo (64 %), se obtiene tras precipitar las
ovoglobulinas con sulfato amnico y ajuste del pH al punto isoelctrico donde su solubilidad es menor y
precipita.
La miosina, una globulina tpica, forma parte del sistema de protenas contrctiles de las miofibrillas del
msculo estriado. Como globulina se solubiliza en una solucin salina de fuerza inica baja y precipita al
disminuir notoriamente la fuerza inica. El mismo efecto se utiliza para extraer una globulina de un tejido
vegetal.
La ureasa (cdigo 3.5.1.5) fue la primera enzima cristalina obtenida en forma pura por Sumner, en 1926, a
partir de la soya, siguiendo el mismo procedimiento que seguiremos aqu, o sea mediante precipitacin con
acetona, a partir del extracto de semillas de soya.
La hemoglobina es una protena perteneciente al grupo de las hemoprotenas, formada por un grupo
prosttico hemo y una parte proteica o apoprotena, globina. Presente en la sangre donde es fundamental en
el transporte de oxgeno a los tejidos, por la presencia del tomo de hierro (Fe++). Para su obtencin deben
separarse los eritrocitos que la contienen del plasma sanguneo mediante centrifugacin. Se adiciona tolueno
para separar los lpidos, de la hemoglobina.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Centrfuga y tubos falcon de 50ml balanza
Vidrio de reloj grande bao Mara
Probeta de 50 ml agitador magntico
Termmetro tijeras
Gasa o algodn Media de nylon
guantes de ciruga pH-metro
Embudo de vidrio vaso de precipitados de 500 mL
Vaso de precipitados de 100 mL Mortero
Vaso de precipitados de 250 mL agitador de vidrio
Erlenmeyer de 125 mL erlenmeyer de 500 mL
papel de filtro trompa de vaco
Hielo embudo de separacin de 500 ml
100 mL de leche 2 huevos
cido actico al 25 % Acetona
ter etlico tolueno
Etanol al 95 % Etanol al 70 %.Conservarlo en nevera
NaOH 0.lN solucin saturada de sulfato de amonio (760 g/1)
NaCl 0.95 % EDTA 1%
PROCEDIMIENTO:
Aislamiento y purificacin de casena:
Mida 50 mL de leche descremada en un vaso de precipitados de 250mL y agitar suavemente en agitador
magntico sobre la parilla. Adicionar lentamente, con una pipeta Pasteur, la solucin de cido actico al
25%, gota a gota, hasta que se observe la precipitacin floculada de la casena, hasta ajustar el pH a 4.8. En
el punto isoelctrico se formar un precipitado voluminoso. En ese momento se detiene la agitacin y se deja
reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Mezclar la suspensin por unos cuantos minutos y distribuirla en tubos de centrfuga, procurando recuperar
todo el contenido. Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar a 5000 rpm durante diez minutos. Desechar
el sobrenadante. El precipitado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 20 mL de agua y agitar con
una varilla de vidrio, hasta obtener una suspensin homognea. Este lavado es para eliminar el cido.
Colocar la suspensin en un solo tubo de centrfuga y efectuar otra centrifugacin a 3000 rpm durante diez
minutos. Desechar el sobrenadante y repetir los lavados con agua dos veces ms. Al eliminar el agua del
ltimo lavado adicionar 10 mL de etanol de 95% al precipitado y homogeneizar con un agitador de vidrio.
Volver a centrifugar para eliminar el etanol. Finalmente, lavar con mezcla de etanol-ter etlico 1:1 de la
misma forma que se hizo con el alcohol. Resuspenda en 10 mL de ter el precipitado y colocarlo en un vidrio
de reloj grande o a otro recipiente previamente pesado. Deje secar al aire y pese el conjunto. Por diferencia
de pesadas determine la cantidad de casena obtenida. Guarde el polvo blanco obtenido para la prctica de
"Caracterizacin de protenas".

Obtencin de ovoalbmina de clara de huevo:

Separe una clara de huevo en un vaso de precipitados y fltrela a travs de una malla de media de nylon y
recbalas en otro vaso de precipitados previamente tarado. Determine el peso de la clara de huevo.
Aada un volumen igual de solucin saturada de sulfato de amonio como gramos de clara de huevo haya
recogido. Esta adicin se debe realizar con lentitud, gota a gota, mientras se agita vigorosamente. Las
ovoglobulinas y la ovomucina (principal responsable de la viscosidad de la clara de huevo) precipitan
fcilmente y se pueden separar por centrifugacin a 5000 rpm, durante cinco minutos.

El sobrenadante se filtra a travs de una mota de algodn situada en el vrtice de un embudo y al filtrado se
le aade solucin saturada de sulfato de amonio, gota a gota, se notar una ligera turbidez que desaparecer
al agitar. Siga vertiendo sulfato de amonio y agite hasta que la turbidez ya no desaparezca. Dejar la mezcla a
temperatura ambiente durante media hora. En este punto se aade cido actico al 25 %, gota a gota y con
agitacin continua hasta que el pH de la solucin est prximo a 4.5 (comprobar con el pH metro) que es el
punto isoelctrico de la ovoalbmina, A este pH se produce la precipitacin de la protena. El precipitado se
separa por centrifugacin a 5000 rpm durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y redisuelva el
precipitado en unos 20 ml de agua destilada, agitando con una varilla de vidrio. Transfiera a otro recipiente
filtrando a travs de un embudo con una mota de algodn. Aada al filtrado lentamente, y con agitacin, 20
mL de acetona. El precipitado que se forma se separa por centrifugacin a 3000 rpm por 10 minutos.
Adicione al precipitado 20 mL de ter y deje secar al aire. Pese el polvo obtenido y gurdelo para la prctica
de "Caracterizacin de protenas".

Obtencin de hemoglobina:
Recoja 20 mL de sangre sobre un tubo heparinizado o en uno que contenga 2 ml de EDTA AL 1%, agite
bien y centrifugue a 3000 rpm durante 15 minutos. Descarte el plasma sobrenadante. Se resuspende el
precipitado de eritrocitos en un volumen aproximadamente igual de cloruro sdico al 0.95 % y centrifugue
de nuevo a 3000 rpm durante 10 minutos, para eliminar los restos de plasma. El residuo se resuspende en
agua destilada hasta un volumen total de 30 mL. Se agregan 5 mL de tolueno y se mantiene el conjunto a 37
C durante 15 minutos, con agitacin fuerte y constante. Se centrifuga de nuevo a 3000 rpm, durante 10
minutos, y se descartan el sobrenadante y la fase orgnica que contiene buena parte de los lpidos. Se
transfiere la disolucin de hemoglobina a un bao de hielo y se mide su volumen, se agita fuertemente
durante tres minutos y se le aade un volumen de etanol fro al 70 %, gota a gota, agitando el conjunto con
una varilla para que la precipitacin sea uniforme. Se centrifuga y el residuo se guarda para la prctica de
"Caracterizacin de protenas".

RESULTADOS:

Indique el peso de la protena aislada. Cul es el porcentaje de la protena aislada (en los casos en
que se obtuvo un polvo) con respecto a la muestra biolgica utilizada? Compare ese valor con el que
se encuentra en la literatura.

Cules son las caractersticas fsicas de la solucin o del polvo de protena obtenido?
Consulte sobre las caractersticas y funcin de la protena aislada.