APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN

REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH

POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK
DETEKSI MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis
(MDR-TB)

Skripsi

IDA AYU RATIH DWI NUGRAHA PUTRI

1208505001

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
 APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN
REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK
DETEKSI MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis
(MDR-TB)

Skripsi

IDA AYU RATIH DWI NUGRAHA PUTRI

1208505001

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016

i
 Lembar Pengesahan

APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN

REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM (PCR-RFLP) UNTUK DETEKSI
MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis
(MDR-TB)

Tugas Akhir II
Tugas Akhir II (Skripsi) ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S. Farm) di Jurusan Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana
Oleh

IDA AYU RATIH DWI NUGRAHA PUTRI

1208505001
Menyetujui:

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si.
NIP. 197102101997022001 NIP. 197102191997021001
Mengesahkan:
Ketua Jurusan Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt.

KATA
NIP. PENGANTAR
196804201994021001

ii
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa karena
berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir II (Skripsi) yang
berjudul APLIKASI METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP)
UNTUK DETEKSI MUTASI PROMOTER inhA PADA PASIEN
MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) tepat
pada waktunya. Tugas Akhir II ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana.
Penulisan Tugas Akhir II ini tentunya tidak terlepas dari dukungan dan
bantuan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh
karena itu penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada:
1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si., selaku Dekan Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt, selaku Ketua Jurusan
Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Udayana.
3. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I
yang banyak mengarahkan serta memberi semangat dan dukungan yang tak
henti demi kelancaran penyusunan Tugas Akhir II ini.
4. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang banyak
mengarahkan serta memberi semangat dan dukungan demi kelancaran
penyusunan Tugas Akhir II ini.
5. Seluruh teknisi di Laboratorium Biologi Molekular FK, khususnya Mbok
Nanik, Kak Echi, dan Bu Komang yang telah banyak memberi bantuan dan
dukungan.
6. Seluruh dosen pengajar beserta pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah

iii
 banyak memberikan ilmu serta dukungan sejak awal penulis mengenyam
pendidikan di Jurusan Farmasi.
7. Kedua orang tua penulis, Ida Bagus Ngurah Sucarma dan I Gusti Ayu Ketut
Rasminiati yang tak henti memberi doa. Kedua saudari penulis, Mbk Ewik
dan Gek Agung yang selalu memberikan dukungan dan semangat kepada
penulis sehingga Tugas Akhir II ini dapat diselesaikan.
8. Sahabat tersayang penulis, Eni, Claudia, Sonia yang selalu memberikan
motivasi, dukungan, menjadi teman berbagi suka dan duka sejak awal
perkuliahan, serta Nia, Desak, Risma, Wiwik, Diah yang juga selalu
memberikan motivasi dan dukungan.
9. TB Team Linda, Widya, Dek Tri, Ebi yang selalu memberikan motivasi
selama penyusunan skripsi serta Rai yang menjadi teman diskusi sejak awal
penyusunan skripsi dan berbagi suka duka selama penelitian berlangsung..
10. Seluruh mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana,
khususnya teman-teman Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama sejak
awal.
11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa penulisan Tugas Akhir II (Skripsi) ini masih sangat
jauh dari kesempurnaan. Penulis berharap kritik dan saran yang bersifat
membangun dari berbagai pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan
datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan
ilmu pengetahuan.
Denpasar, Juni 2016

Penulis

iv
 DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................... i

LEMBAR PENGESAHAN ..................................................................... ii

KATA PENGANTAR ............................................................................. iii

DAFTAR ISI ........................................................................................... v

DAFTAR SINGKATAN ......................................................................... viii

DAFTAR ISTILAH ................................................................................. x

DAFTAR TABEL ................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xv

ABSTRAK .............................................................................................. xvi

ABSTRACT ............................................................................................ xvii

BAB I PENDAHULUAN..................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................... 5

1.3 Tujuan Penelitian ................................................................. 5

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................... 5

1.4.1 Manfaat Keilmuan ...................................................... 5

1.4.2 Manfaat Praktis ........................................................... 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................ 7

2.1 Mycobacterium tuberculosis ................................................ 7

v
 2.2 Multidrug Resistant Tuberculosis ........................................ 8

2.3 Isoniazid .............................................................................. 10

2.4 Gen resisten Isoniazid (inhA) ............................................... 12

2.5 Mutasi Gen .......................................................................... 13

2.5.1 Insersi ......................................................................... 14

2.5.2 Delesi ......................................................................... 14

2.5.3 Substitusi .................................................................... 15

2.6 DNA Metagenomik ............................................................. 15

2.7 Enzim restriksi .................................................................... 17

2.7.1 Enzim Restriksi Endonuklease Tipe II ........................ 19

2.7.2 Interaksi Enzim Restriksi Endonuklease Tipe II dengan

DNA ........................................................................... 21

2.7.3 Penempelan pada DNA dan Lokasi Situs Target ......... 22

2.8 PCR ................................................................................... 23

2.8.1 Tahapan Siklus PCR ................................................... 24

2.8.2 Komponen dalam melakukan proses PCR ................... 25

2.9 RFLP ................................................................................... 27

2.10 Elektroforesis .................................................................... 28

BAB III METODE PENELITIAN .......................................................... 31

3.1 Rancangan Penelitian .......................................................... 31

3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................... 31

3.3 Bahan Penelitian .................................................................. 31

3.4 Alat Penelitian ..................................................................... 32

vi
 3.5 Prosedur Penelitian .............................................................. 32

3.5.1 Pemilihan Enzim Restriksi .......................................... 32

3.5.2 Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv ........................... 33

3.5.3 Amplifikasi DNA dengan PCR ................................... 34

3.5.4 Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis................. 34

3.5.5 Digesti dengan menggunakan enzim restriksi .............. 35

3.5.6 Deteksi Hasil Digesti Enzim Restriksi dengan

elektroforesis .............................................................. 35

3.5.7 Interpretasi Hasil ......................................................... 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.................................................. 37

4.1 Pemilihan Enzim Restriksi .................................................. 37

4.2 Isolasi DNA Mycobacterium tuberculosis H37Rv................ 41

4.3 Optimasi dan Amplifikasi Daerah Promoter inhA ................ 44

4.4 Optimasi Formulasi dan Waktu Digesti Daerah Promoter

inhA dengan Enzim Restriksi SacII ...................................... 49

4.5 Digesti Daerah Promoter inhA ............................................. 54

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................. 58

5.1 Kesimpulan ......................................................................... 58

5.2 Saran ................................................................................... 58

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 59

LAMPIRAN ............................................................................................ 67

vii
 DAFTAR SINGKATAN

A : Adenin
ACP : acyl carrier protein
BSC : biological safety cabinet
bp : base pairs
C : Sitosin
DNA : Deoxyribonucleic acid
dATP : deoksiadenosin trifosfat
dCTP : deoksisitidin trifosfat
dGTP : deoksiguanosin trifosfat
dTTP : deoksitimidin trifosfat
dNTPs : Deoxynucleotide triphosphates
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
ETH : etionamid
FAS-I : Fatty Acid Synthetase tipe I
FAS-II : Fatty Acid Synthetase tipe II
G : Guanin
HIV : Human Immunodeficiency Virus
INH : isoniazid (isonicotinic acid hydrazide)
r
INH : isoniazid resistant
LAM : Lipoarabinomannan
LM : Lipomannan
ManLAM : Mannose Lipoarabinomannan
MDR : Multi-drug resistant
MTb : Mycobacterium tuberculosis
OAT : Obat Anti Tuberkulosis
ORF : Open Reading Frame
pb : pasang basa
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP : Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism

viii
PILAM : Phosphoinositol Lipoarabinomannan
PIM : Phosphatidylnositol mannosides
T : Timin
TB : tuberkulosis
TBE : Tris-Boric Acid-EDTA
WHO : World Health Organization

ix
 DAFTAR ISTILAH

Amplifikasi DNA : perbanyakan DNA

Amplikon : produk PCR
Asam amino : unit monomer penyusun protein yang dihubungkan
melalui ikatan peptida
Building block : unit monomer penyusun komponen
Comb : alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk
kolom (well) pada gel agarosa
Chamber : wadah untuk meletakkan gel agarosa
DNA polimerase : enzim yang diperlukan sebagai katalis dalam proses
polimerisasi DNA
DNA templat : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen
atau gen yang akan digandakan
Frameshift mutation : mutasi titik yang menunjukkan terjadinya penghapusan
atau penyisipan nukleotida (bukan kelipatan tiga)
Gen : urutan DNA yang menyandi suatu protein
GenBank : database utama dalam biologi molekuler yang dikelola
oleh NCBI
Genom : keseluruhan materi genetik (DNA/RNA) pada makhluk
hidup
Hairpins : struktur primer yang terbentuk oleh DNA tunggal
dimana terdapat suatu bagian tertentu dari DNA tersebut
terhibridisasi pada bagian komplemen di dalam untai
DNA yang sama, membentuk struktur menyerupai
hairpin
H37Rv : galur standar yang dijadikan wild type
In vitro : percobaan dilakukan dalam tabung yang menyerupai
sistem in vivo agar dapat memberikan hasil yang sama
dengan proses in vivo
In silico : dilakukan pada komputer

x
Kodon : deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi
tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam
amino tertentu
Lokus : letak suatu gen pada suatu kromosom
Mutasi : terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang
lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat
menyebabkan perubahan sifat fenotip
Nukleotida : unit monomer pembentuk DNA
Nonsense mutation : mutasi akibat perubahan kodon sehingga kodon stop
terbentuk prematur
ORF : segmen dari urutan nukleotida yang diawali dengan start
kodon dan diakhiri dengan stop kodon dan memiliki
panjang yang cukup untuk mengkode protein
PCR : teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan
reaksi enzimatis
Primer : oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida
DNA templat
Polimerisasi : reaksi pembentukan polimer
Prodrug : senyawa yang tidak aktif dan bersifat labil, di dalam
tubuh akan mengalami perubahan melalui proses kimia
atau enzimatik menjadi senyawa induk aktif dan
kemudian berinteraksi dengan reseptor untuk
menghasilkan efek farmakologis
Promoter : suatu sekuen DNA spesifik yang berperan dalam
mengendalikan transkripsi gen struktural
Resistensi : kemampuan bakteri untuk bertahan terhadap adanya obat
yang dengan konsentrasi normal dapat membunuh atau
menghambat pertumbuhannya
Runs : pengulangan basa tunggal pada sekuen primer
Sekuen : urutan DNA

xi
Sekuensing : proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu
molekul DNA
Silent mutation : mutasi yang menunjukkan perubahan nukleotida dapat
mengakibatkan perubahan kodon tetapi tidak ada
perubahan fenotipik yang diamati pada individu
Transkripsi : proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai
templat
Tray : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa
Well : kolom-kolom tempat diletakkannya zat yang akan
dielektroforesis
Wild Type : organisme yang memunculkan karakter dalam populasi
aslinya

xii
 DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Rentang Pemisahan pada Gel Agarosa ...................................... 30

Tabel 4.1 Hasil enzim restriksi yang spesifik mengenal daerah promoter

InhA ......................................................................................... 38

Tabel 7.1 Formulasi Digesti I ................................................................... 76

Tabel 7.2 Formulasi Digesti II ................................................................. 76

Tabel 7.3 Formulasi Digesti III ................................................................ 76

xiii
 DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Isoniazid ............................................................................... 10

Gambar 2.2 Mutasi pada lokus inhA......................................................... 12

Gambar 2.3 Contoh insersi....................................................................... 14

Gambar 2.4 Contoh delesi ........................................................................ 14

Gambar 2.5 Contoh transisi dan transversi ............................................... 15

Gambar 2.6 Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi tipe I, II,

dan III ................................................................................. 18

Gambar 2.7 Ujung blunt dan ujung sticky............................................... 19

Gambar 2.8 Skema Ilustrasi Proses Pengikatan DNA dan Pemotongan

dengan Enzim Restriksi Endonuklease ................................ 22

Gambar 4.1 Hasil pemotongan enzim restriksi SacII menghasilkan ujung

asimetris (sticky end) ........................................................... 40

Gambar 4.2 Peta restriksi enzim restriksi SacII ....................................... 41

Gambar 4.3 Elektroforegram produk PCR hasil optimasi suhu isolat M.

tuberculosis H37Rv............................................................. 45

Gambar 4.4 Elektroforegram hasil amplifikasi fragmen region promoter

inhA M. tuberculosis pada suhu annealing 54oC .................. 47

Gambar 4.5 Elektroforegram hasil amplifikasi fragmen region promoter

inhA M. tuberculosis pada suhu annealing 54oC .................. 47

Gambar 4.6 Elektroforegram hasil optimasi digesti daerah promoter inhA 50

Gambar 4.7 Elektroforegram hasil digesti daerah promoter inhA ............ 55

xiv
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Prosedur penelitian............................................................... 67

Lampiran 2. Pemilihan Enzim Restriksi ................................................... 68

Lampiran 3. Tahapan Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv ...................... 69

Lampiran 4. Sekuen Nukleotida M.tuberculosis H37Rv Promoter inhA ... 70

Lampiran 5. Pembuatan Larutan .............................................................. 71

Lampiran 6. Hasil Enzim Restriksi dengan aplikasi Clone Manager Suite 6 73

Lampiran 7. Formulasi Digesti Enzim Restriksi SacII ............................. 76

Lampiran 8. Ethical Clearance ................................................................ 77

xv
 ABSTRAK

Mutasi pada promoter inhA tidak hanya mengakibatkan terjadinya resistensi

terhadap isoniazid (obat anti tuberkulosis lini pertama), tetapi juga bertanggung
jawab terhadap terjadinya resistensi silang pada etionamid (obat anti tuberkulosis
lini kedua). Mutasi yang pernah dilaporkan terjadi adalah pada nukleotida -15 dan
-24 dari promoter inhA. Deteksi mutasi secara molekuler dapat dilakukan dengan
cara Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism
(PCR-RFLP), yang menggunakan enzim restriksi spesifik untuk mengenal urutan
nukleotida tertentu. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui enzim restriksi
yang dapat secara spesifik mengenal mutasi pada -24 dari daerah promoter inhA
dan mendeteksi adanya mutasi tersebut dengan menggunakan teknik PCR-RFLP.
Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksploratif laboratoris, dengan
tahapan sebagai berikut: pemilihan enzim restriksi, isolasi DNA M. tuberculosis
H37Rv, amplifikasi daerah promoter inhA, deteksi produk PCR, optimasi dan
digesti dengan menggunakan enzim restriksi, deteksi hasil digesti, dan interpretasi
hasil.
Hasil analisis dengan menggunakan aplikasi Clone Manager Suite 6
memperlihatkan bahwa enzim restriksi SacII mampu mengenal secara spesifik
urutan nukleotida -24 dari promoter inhA. Hasil optimasi digesti menunjukkan
bahwa enzim SacII bekerja secara optimal pada suhu 37oC dengan waktu inkubasi
3 jam. Inaktivasi enzim dilakukan pada suhu 65 oC selama 20 menit. Hasil digesti
memperlihatkan bahwa enzim restriksi SacII memotong daerah promoter inhA
pada isolat P10, P11, P16, 86, dan 134 menghasilkan 2 pita, yang menunjukkan
bahwa tidak terjadi mutasi pada isolat-isolat tersebut.
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa enzim restriksi yang digunakan
untuk mendeteksi mutasi pada nukleotida -24 dari promoter inhA adalah enzim
restriksi SacII. Pada keseluruhan isolat yang diteliti, yaitu P10, P11, P16, 86, dan
134 tidak ditemukan adanya mutasi pada titik -24 dari promoter inhA.

Kata kunci: MDR-TB, promoter inhA, PCR-RFLP, enzim restriksi, SacII

xvi
 ABSTRACT

The mutation of inhA promoter is not only result in isoniazid resistance (first
line antituberculosis drugs), but also have responsible for cross resistance in
ethionamide (second line antituberculosis drug). The mutations that have been
reported was at -15 and -24 in promoter region of inhA. Molecular detection of
mutations could be done by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment
Length Polymorphism (PCR-RFLP), which uses specific restriction enzymes to
recognize specific nucleotide sequences. Changes in the nucleotide sequence due
to mutation, will be quickly recognized by this method. This study aims to
determine the restriction enzyme which can specifically recognize the mutation at
promoter region of inhAand detect the mutation using PCR-RFLP technique. This
research were conducted in several steps which are: selection of restriction
enzyme, DNA isolation of H37Rv Mycobacterium tuberculosis, amplification
promoter region of inhA, detection of PCR product, optimization and digestion
using restriction enzyme, detection of digestion product, and interpretation of
result.
The analysis result using Clone Manager Suite 6 showed that SacII
restriction enzyme could recognize specifically at -24 promoter region of inhA.
The result of digestion optimization showed that SacII restriction enzyme have
optimal work at 37oC for 3 hours incubation time, heat inactivation at 65oC for 20
minutes. Digestion result showed that SacII restriction enzyme cleave inhA
promoter region of P10, P11, P16, 86, and 134 isolates into 2 bands, that showed
there was no mutation in all isolates.
In conclusion, the enzyme that could detect the mutation at -24 in promoter
region of inhA is SacII. There were no mutation found at all isolates at -24
promoter region of inhA.

Key words: MDR-TB, inhA promoter, PCR-RFLP, restriction enzyme, SacII

xvii