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PRACTICA N 8
Cuantificacin de nitrgeno total y determinacin del contenido de protena
cruda
I. Introduccin: El nitrgeno es el elemento qumico que permite diferenciar
las protenas de otros compuestos, particularmente de grasas y
carbohidratos. Sin embargo, la fraccin de protena del sistema biolgico no
es la nica fuente de nitrgeno ya que puede derivarse tambin de ppticos,
aminocidos libres y compuestos nitrogenados de naturaleza no proteica
(generalmente presentes en menor proporcin). Por ello al determinar el
contenido de nitrgeno en un sistema biolgico se califica de nitrgeno total y
al utilizar este dato para calcular el porcentaje de protena del sistema se
califica de cruda. La determinacin del nitrgeno sigue siendo el mtodo
analtico ms til para cuantificar la fraccin de protenas sin interferencias de
carbohidratos y lpidos.
En el desempeo profesional si lo deseable es conocer el porcentaje de
protena, se determina el contenido de nitrgeno total en la muestra a objeto
del estudio, luego se precipita la fraccin de protenas y se cuantifica el
nitrgeno no proteico del sobrenadante. La diferencia con el contenido de
nitrgeno total permite establecer el contenido de nitrgeno proteico.
Para calcular el contenido de protena cruda en funcin al contenido de
nitrgeno total, se recurre al factor de conversin, definido en funcin del tipo
de alimento. El factor representa el contenido de nitrgeno por 100 g de
protenas en ese sistema. El factor 6,25 es el ms comnmente usado.
La protena cruda es una de las determinaciones que integra la
COMPOSICIN PROXIMAL o ANLISIS PROXIMO de los alimentos. La
fraccin de protena cruda de los sistemas alimenticios, es importante desde
el punto de vista nutricional, de las propiedades organolpticas de los
alimentos. En los alimentos de origen animal, influyen significativamente en

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su textura. En la harina de trigo y en el pan constituye el mejor ndice de la
calidad panadera.
Para cuantificar el nitrgeno total en los alimentos y en la materia orgnica
en general se requiere la conversin completa del nitrgeno en su forma
nativa a nitrgeno gaseoso o a una sal inorgnica de amonio (estado
totalmente reducido del nitrgeno). La siguiente etapa del anlisis es la
determinacin precisa y exacta de alguna de las conversiones antes
sealadas. Se han descrito y desarrollado tres (3) mtodos, cada uno de
ellos lleva el nombre de su creador: Dumas, Kjeldahl y Ter Meulen.
En esta experiencia aplicaremos el mtodo descrito y desarrollado por
Kjeldahl.
II. Preparacin de la muestra:
Consultar en AOAC (1990) el muestreo para el anlisis, el almacenamiento,
preservacin y contenido de humedad para la preparacin de muestras
especificas (materiales biolgicos lquidos pueden ser secadas al aire y
alcanzaran su contenido de humedad constante). Resulta ms conveniente
que anlisis de nitrgeno total se realice en muestras equilibradas al aire
corregidas subsecuentemente a base seca. Esta muestra se manipula
fcilmente, en contraste a las anhidras que son higroscpicas.

III. Mtodo de Kjeldahl


A. Fundamento:
El mtodo de Kjeldahl se basa en la hidrlisis cida de la materia orgnica
de la muestra por calentamiento con cido sulfrico concentrado y sulfato
de potasio en presencia de un catalizador sulfato de cobre. El nitrgeno
se reduce en la sal sulfato de amonio, de la cual se libera con hidrxido
de sodio en la forma de amonaco y se destila. El destilado se valora con
una solucin patrn de cido clorhdrico o sulfrico.

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B. 3 Reactivos:
1. Silicona u otro antiespumante de accin similar.
2. Sulfato de potasio (K2SO4)
3. Catalizador adecuado (CuSO4)
4. cido sulfrico concentrado (H2SO4)
5. Hidrxido de sodio al 50 % (NaOH)
6. cido sulfrico o cido clorhdrico al 0,1 N (HCl)
7. Rojo de metilo al 0,1 % en alcohol de 95 % (cuando se recoge el
destilado en H2SO4 0,1 N)
8. Hidrxido de sodio 0,1 N (cuando se recoge el destilado en H2SO4
0,1N)
9. Mezcla indicadora rojo de metilo 0,1 % - azul de metileno 0,05 %, en
alcohol de 95 %; o rejo de metilo 0,1 % - verde de bromocresol 0,075
%, en alcohol de 95%.
10. cido brico al 4% (H3BO3)
C. Materiales:
1. Equipo de MacroKjedahl para digestin y destilacin.
2. Balones de Kjeldahl.
3. Papel tornasol rosado.
4. Equipo de MicroKjedahl para digestin y destilacin.
5. Balones de MicroKjeldahl.
6. Equipo Kjeldahl automatizado

D. Procedimiento:
1. Digestin:
1. Pesar 0,7 2,2 g de muestra sobre un trozo de papel de filtro sin
cenizas e introducir papel y muestra en el baln de digestin Kjendahl
(evitar que quede muestra adherida al cuello del baln).

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2. Aadir de 15 18 g de sulfato de potasio; 0,5 g de sulfato cprico
anhidro y 25 ml de cido sulfrico concentrado.
3. Aadir unas perlitas de vidrio (solo en el caso del MacroKjeldahl y una
cantidad adecuada de antiespumante).
1. Colocar el baln en el aparato de digestin y calentar la mezcla
de digestin a temperatura baja hasta que cese la formacin de
espuma. Aumentar progresivamente la temperatura de la hornilla
(no permita que escape cido del baln por exceso de calor; ni
calentar por encima del nivel del lquido, cuando se usa mechero,
puesto que se pueden producir prdidas de nitrgeno por
volatilizacin de las sales de amonio)
2. Continuar calentando hasta que la mezcla se haga transparente y
/ o incolora y luego continu calentando, durante 30 minutos o
ms. ( Si el volumen de cido disminuye durante la digestin debe
aadirse ms para evitar sobrecalentamiento del baln).
2. Destilacin:
1. Enfriar el baln y aadir cuidadosamente 250 ml de agua y
mezclar bien.
PRECAUCIN: RECORDAR QUE AL AGREGAR AGUA AL
CIDO SULFRICO SE DESARROLLA UNA REACCIN
FUERTEMENTE EXOTRMICA, POR LO QUE HAY QUE SER
EXTREMADAMENTE CUIDADOSO.

2. Colocar una tira de papel indicador (tornasol rosado)


3. Mantener el baln en posicin inclinada y aadir 50 75 ml de
una solucin de NaOH al 50 % dejndola correr por las paredes,
de manera que se formen dos capas de lquido.
4. Conectar inmediatamente al condensador (cuya hornilla debe
estar encendida con antelacin) por medio del bulbo de Kjeldahl y
luego agitar para mezclar. El papel indicador debe mostrar que el

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contenido del baln esta alcalino.
5. Una vez que se ha mezclado la solucin de lcali, colocar
inmediatamente sobre la hornilla ya caliente.
6. Calentar hasta ebullicin y destilar unos 150 200 ml (con lo cual
se asegura que ha pasado todo el amoniaco formado)
7. Enjuagar el extremo del tubo de salida del destilado con agua
destilada, dentro del erlenmeyer que contiene el destilado.
Para recoger el destilado se puede usar uno de los siguientes
mtodos:
- Mtodo 1: El extremo de salida del condensador (antes de
comenzar la destilacin) debe estar sumergido en 50 ml de
solucin de cido sulfrico 0,1 N, contenida en un erlenmeyer de
500 ml a la cual se le han agregado 5-7 gotas de solucin
indicadora de rojo de metilo.
- Mtodo 2: El extremo de la salida del condensador (antes de
comenzar la destilacin) debe estar sumergido en 50 ml de
solucin de cido brico contenida en un elenmeyer de 500 ml con
2-3 gotas de la solucin indicadora rojo de metilo azul de
metileno (o rojo de metilo verde de bromocresol).
3. Titulacin:
- Mtodo 1 : Titular el exceso de cido sulfrico con solucin de
hidrxido de sodio 0,1 N.
- Mtodo 2 : Titular con solucin de cido sulfrico o cido
clorhdrico hasta obtener un color gris con la mezcla indicadora
rojo de metilo verde bromocresol o un color azul con la mezcla
rojo de metilo azul de metileno.
NOTA: Si se desean titular alcuotas del destilado, transferir
cuantitativamente el destilado a un matraz aforado de 200 0 250 ml,

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aforar el volumen con agua y titular alcuotas de 50 ml. En este
caso, tome en cuenta el factor de dilucin al realizarlos clculos.
4. Clculos:
Reporte los resultados como:
a. Porcentaje de nitrgeno total.
b. Porcentaje de protena cruda porcentaje de nitrgeno total x
factor de protena (*)
(*) Consulte los factores para los diferentes alimentos.
NOTA: En el mtodo 2, el volumen gastado para titular el amoniaco
viene dado por el resultado directo de la titulacin. En el mtodo 1,
ese valor se obtiene por diferencia de volmenes si las normalidades
del cido y del lcali son iguales; de lo contrario, es necesario
trabajar basndose en miliequivalentes.

Equipo de MacroKjeldahl: Unidad inferior, digestor integrado por seis


hornillas y unidad de extraccin de vapores. Unidad superior,
destilador.
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Unidad de digestin de MicroKjeldahl Unidad de destilacin de MicroKjeldahl

Diseado para determinar micro cantidades de protena o nitrgeno o en el


desempeo de una o dos macro determinaciones por da para lo cual se diluye la
muestra y se toman alcuotas de la misma. Acepta un mximo de 4 ml de muestra
digerida y da resultados reproducibles tan bajos como 1 mg N / L. Cada destilacin
toma solo cinco minutos.

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