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Sede Quetzaltenango
Facultad de Ciencias de la Salud
Supervisora:
Licda Andrea Daz Cano
Estudiante:
Byron Estuardo Fuentes
Carnet:
14006340
MANUAL DE BACTERIOLOGIA
Curso:
Practica Supervisada
Manual de Baceriologa
Tincin de Gram
Introduccion
La tincin de Gram permite diferencias a las clulas bacterianas como gram positivas si
resisten la decoloracin con alcohol acetona o gram negativas si no la resisten. La capacidad de
resistir esta decoloracin se encuentra en el grosor de la pared celular. Esta pared celular tiene
como principal componente el pptidoglucano, y su funcin es dar forma a la bacteria, conferir
rigidez y tamao a la clula y permite que la clula bacteriana soporte altas presiones
osmticas. Las bacterias gram positivas poseen una pared celular gruesa conformada por varias
capas interconectadas de pptidoglucano que corresponden hasta un 90% de la pared celular.
Por el contrario las bacterias gram negativas nicamente poseen una fina capa de
pptidoglucano que constituye el 20% de la pared celular. (Cisternas, 2007) (Koneman, Allen,
Janda, Schreckenberger, & Winn, 2004).
El colorante principal en esta tincin el cristal violeta, el cual es un colorante bsico. Este
colorante ingresa en todas las clulas bacterianas y crea un complejo insoluble con el mordiente
que es el colorante de lugol. Posteriormente se trata a las bacterias con el decolorante alcohol-
acetona el cual disuelve o desorganiza la pared celular de las bacterias gram negativas, que causa
la liberacin del complejo cristal violeta-lugol de la clula bacteriana. Por el contrario en las
clulas gram positivas el decolorante permite la deshidratacin de la pared celular cerrando los
poros y reteniendo el complejo cristal violeta-lugol. Por ltimo se utiliza como colorante
secundario la safranina, la cual colorea todas las clulas que hayan perdido el complejo cristal
violeta-lugol (Cisternas, 2007).
PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Coloque una gota de solucin salina pequea en un portaobjeto rotulado y con su
asa estril tome una colonia pequea del medio slido con Staphylococcus sp.
Emulsifique la colonia en la gota de solucin salina. Esterilice su asa.
4. Permita que se seque el frote y fjelo pasando la parte posterior del portaobjetos
sobre la parte alta de la llama del mechero. Repita esto de 4 a 5 veces.
5. Repita los pasos 3 y 4 con el medio con Escherichia coli.
6. Cuando ya tenga los dos frotes proceda a teir siguiendo los pasos que se detallan
en el siguiente cuadro.
Tabla 1 Pasos para la tincin de Gram
Introduccion
Mycobacterium sp. son microorganismo cido resistente, esto significa que pueden resistir
una decoloracin con alcohol cido luego de ser teidas con carbol fucsina debido a la
presencia de cidos miclicos en su pared celular. El complejo Mycobacterium tuberculosis
comprende las especies de M. tuberculosis, M. microti, M. africanum y M. bovis, y se considera
el agente etiolgico ms frecuente de tuberculosis (Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger,
& Winn, 2004).
Es importante recordar que las muestras de esputo son altamente infecciosas, por eso se
debe de tomar todas las consideraciones necesarias para evitar la inhalacin de aerosoles.
Asimismo es necesario realizar desinfecciones del rea de trabajo con hipoclorito de sodio al
1% seguido de una limpieza con alcohol al 70%. El personal que manipule las muestras de
esputo debe utilizar lentes, mascarilla N95 y guantes como medidas de proteccin (LNS, 2008).
M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Mascarilla N95
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Alcohol 70%
Metanol 95%
Hipoclorito de sodio al 1%
Aplicadores de madera
Portaobjetos nuevos desgrasados (sumergirlas en alcohol al 95% y pasarlas por la
llama del mechero antes de usarlas)
Papel peridico
Carbol fucsina
Alcohol cido 3%
Azul de metileno
Muestra de esputo
PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables y su mascarilla. Desinfecte
su rea de trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Colocar papel peridico humedecido en hipoclorito de sodio al 1% sobre el rea de
la mesa de trabajo donde se van a procesar las muestras.
4. Identificar el portaobjetos donde se realizar el extendido.
5. Con un aplicador de madera con el extremo quebrado, seleccione una pequea
porcin de la parte ms densa y purulenta de la muestra.
6. Realice un extendido fino y uniforme circular u ovalado de no ms de 2 cm de
dimetro y djelo secar a temperatura ambiente.
7. Fijar el extendido pasando la lmina por la llama del mechero.
8. Cubrir el extendido fijado a la llama con carbol fucsina y calentar suavemente por
debajo de la lmina con el mechero de alcohol o un hisopo de alambre con torunda
de algodn humedecida con metanol al 95% hasta que se observe la produccin de
vapores blanquecinos a partir del colorante.
9. Mantener la emisin de vapores durante 5 minutos. Evitar que el colorante hierva.
10. Lavar con agua el colorante y quitar el exceso de agua de la lmina.
11. Cubrir el extendido con alcohol cido al 3% durante 1 minuto.
12. Lavar con agua y quitar el exceso de agua de la lmina.
13. Cubrir el extendido con azul de metileno durante 30 segundos.
14. Lavar con agua y quitar el exceso de agua de lmina. Permitir que el extendido se
seque y observar al microscopio en objetivo de 100x.
15. Realizar la observacin de campos y la identificacin de BAAR, los cuales se vern
de color rojo a rosado, alargados y pueden presentar ramificaciones o formas
filamentosas.
16. La observacin del extendido debe realizarse de forma sistemtica y estandarizada,
observando de izquierda a derecha del extendido los campos microscpicamente
tiles (se observa la presencia de clulas bronquiales o leucocitos teidas de azul)
17. Realizar el reporte segn los siguiente parmetros
Nmero de bacilos
Nmero de campos observados
Promedio de bacilos /campo
Resultados
Nmero de bacilos
Nmero de campos observados
Promedio de bacilos /campo
Resultados
Aislamiento bacteriano en medio
slidos
Introduccion
Un medio de cultivo es una sustancia con un conjunto de nutrientes que permiten el
crecimiento de microorganismos. El medio a seleccionar depender de la naturaleza de la
investigacin que se desee realizar, as como del microorganismo que se busca. Las tcnicas de
inoculacin de bacterias permiten la obtencin de microorganismo en cultivos puros, lo cual
facilita su identificacin (Brooks, Carroll, Morse, Mietzner, & Butel, 2013).
M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa de nicromo en argolla
Cultivo en medio slido y en medio lquido de Staphylococcus sp.
Cultivo en medio slido y en medio lquido de Escherichia coli
Agar sangre de carnero al 5%
Agar McConkey
Alcohol 70%
Incubadora
Frasco para cultivo en microaeroflia
PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Esterilice el asa, espere a que enfre y seleccione una colonia del medio slido con
Staphylococcus sp. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar sangre de
carnero al 5% mediante la tcnica de estras paralelas.
4. Esterilice el asa, espere a que enfre y tome un inculo del medio lquido con
Staphylococcus sp. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar sangre de
carnero al 5% mediante la tcnica de estras continuas.
5. Esterilice el asa, espere a que enfre y seleccione una colonia del medio slido con
Escherichia coli. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar McConkey
mediante la tcnica de estras paralelas.
6. Esterilice el asa, espere a que enfre y tome un inculo del medio lquido con
Escherichia coli. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar McConkey
mediante la tcnica de estras continuas.
7. Incube las cajas a 35C durante 24 horas, las cajas de agar sangre del carnero al 5%
en microaeroflia y las de agar McConkey en aire ambiental.
Pruebas de identificacin
Staphylococcus
Catalasa, Coagulasa y Manitol Sal
Introduccion
El gnero Staphylococcus est conformado por bacterias esfricas organizadas en racimos
irregulares que a la tincin de Gram se tien con cristal violeta, no son mviles y pueden crecer
en ambientes aerbicos o microaeroflicos. Estas bacterias crecen en un gran nmero de
medios de cultivo, fermentan carbohidratos y pueden producir pigmentos que van desde
blanco hasta amarillo (Brooks, Carroll, Morse, Mietzner, & Butel, 2013).
Las bacterias de este gnero pueden pertenecer a la microbiota normal de piel y mucosas,
pero actan como patgenos potenciales causando desde infecciones en heridas hasta shock
sptico. Este gnero cuenta con hasta 40 especies siendo las ms frecuentes: Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus (Brooks, Carroll, Morse,
Mietzner, & Butel, 2013).
Para el cultivo de este gnero es necesario una incubacin a 37C, pero la formacin de
pigmento se da a temperaturas entre los 20-25 C. Las colonias en medios slidos son redondas,
lisas, convexas y brillantes. Pueden presentar hemlisis beta cuando crecer en medios con
sangre. Para la identificacin se utilizan tres pruebas: catalasa, coagulasa y manitol sal (Brooks,
Carroll, Morse, Mietzner, & Butel, 2013).
Catalasa
Principio: La catalasa es una enzima que descompone el perxido de
hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno. La mayora de las bacterias aerbicas
y anaerobias facultativas poseen esta enzima. El perxido de hidrgeno se
forma como uno de los productos finales de oxidacin del metabolismo
aerobio de los carbohidratos. Si este se acumula, resulta letal para las
bacterias.
Coagulasa
Principio: La coagulasa es una enzima que tiene actividad similar a
la protrombina capaz de convertir el fibringeno en fibrina, dando como
resultado la formacin de un cogulo visible. Esta enzima ayuda a la
bacteria a formar una barrera alrededor del sitio de infeccin limitando el
sitio de infeccin.
Esta enzima puede presentar de dos formas, libre y unida. La coagulasa
unidad es tambin conocida como factor de agrumacin, la cual se
encuentra unida a la pared celular bacteriana y permite la formacin de
bandas de fibrina que hace que se agrupen en grumos visibles. La
coagulasa libre es secretada al medio exterior y permite la formacin de
un cogulo de fibrina.
Staphylococcus aureus es la nica especie de este gnero que posee esta
enzima.
Manitol Sal
Principio: El medio manitol sal es un medio selectivo y diferencial. Las
bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y
fermentan el manitol, producen cidos que modifican el pH del medio y
hacen virar el indicador de pH de color rojo a amarillo.
M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa de nicromo en argolla
Cultivo bacteriano de 18-24 horas de incubacin en agar sangre de carnero al 5%
Alcohol 70%
Perxido de hidrgeno al 3%
Plasma con EDTA
Agar manitol sal en placa o en tubo
PROCEDIMIENTO
CATALASA
COAGULASA UNIDA
COAGULASA LIBRE
Pruebas de
identificacin de
Enterobacterias
Oxidasa, Tsi, Lia, Mio, Citrato,
Urea
Introduccion
Los miembros de esta familia son bacilos de tamao intermedio (0.3 a 1 x 1 a 6 m) gram
negativo que pueden ser inmviles o mviles con flagelos pertricos y no forman esporas.
Todos los miembros pueden crecer rpidamente de forma aerobia o anaerobia en varios
medios nutritivos (agar sangre de carnero al 5%) o selectivos (agar McConkey). Tienen
requerimientos nutricionales sencillos, fermentan la glucosa y citocromo oxidasa negativos
(Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009).
CITOCROMO OXIDASA
Principio: Esta prueba permite detectar la presencia de la enzima
citocromo oxidasa. Esta enzima se encuentra presente en la cadena de
respiracin aerobia y se encuentra en bacterias aerobias, microaeroflias y
anaerobios facultativos. Se utiliza el colorante tetrametilo de p-
fenilendiamina el cual es incoloro en estado reducido y al estar en
contacto con la enzima citocromo oxidasa se torna de color prpura
intenso.
Agar TSI
Agar LIA
Principio: Permite detectar la descarboxilacin y desaminacin de
la lisina, la formacin de gas y la produccin cido sulfhdrico (H2S).
Agar MIO
Agar Citrato
PROCEDIMIENTO
CITOCROMO OXIDASA
LECTURA DE RESULTADOS
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Revise los medios TSI, LIA, citrato y urea y anote los resultados segn lo descrito
anteriormente.
4. Para el medio MIO, anote los resultados de las pruebas de movilidad y ornitina.
Adicione de 3-4 gotas del reactivo de Kovacs al medio anote el resultado.
5. Compare los resultados obtenidos con la tabla de identificacin de enterobacterias
que se
encuentra en el anexo de este manual.
6. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con alcohol al 70%,
descartar los guantes y lavarse las manos.
7. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
Urocultivo
Introduccion
Las vas urinarias se encuentran divididas en dos partes, la superior que comprende los riones,
pelvis renal y urteres, y la inferior que comprende la vejiga urinaria y uretra. Las infecciones de
las vas urinarias suelen ser ascendentes, es decir que se originan en la vejiga y ascienden por los
urteres hasta los riones. Estas infecciones tambin pueden ser el resultado de la distribucin
por va hematgena de bacterias dentro del glomrulo y corteza renal, situacin frecuente en
pacientes con septicemia (Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger, & Winn, 2004).
Figura 1.1 Procedimiento para inoculacin de cultivo de orina. Primero se realiza una estra
en el centro del medio de cultivo con el asa calibrada, luego se procede a distribuir la muestra
en todo el medio mediante estras paralelas.
M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa plstica descartable con argolla calibrada a 0.001mL
Asa de nicromo en argolla
Agar sangre de carnero al 5%
Agar McConkey
Agar Cromo
Alcohol 70%
Muestra de orina en frasco estril
PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Rotule las cajas de agar sangre de carnero al 5% y agar McConkey con el nombre
del paciente y la fecha de procesamiento.
4. Homogenice la muestra mediante movimientos circulares, dejando el frasco sobre
la mesa. Destape la muestra y sumerja el asa estril en el centro del frasco son
tocar las paredes ni el fondo.
5. Realice una estra en el centro del agar sangre de carnero al 5%.
6. Repita el paso 4 y realice una estra en el centro del agar McConkey.
7. Distribuya la muestra en toda la caja de ambos medios de cultivo con su asa de
nicromo en argolla previamente esterilizada.
8. Incube ambos medios a 37C durante 24 horas, la caja de agar sangre de carnero al
5% en microaeroflia y la de agar McConkey en aire ambiental.
9. Si no obtiene crecimiento a las 24 horas, contine la incubacin por otras 24 horas.
De no obtener crecimiento se reporta como NEGATIVO A LAS 48 HORAS DE
INCUBACIN.
10. Si a las 24 horas se obtiene crecimiento, realizar un conteo de las colonias
obtenidas, si estas superan las 100,000 UFC/mL, realizar la identificacin y prueba
de sensibilidad antimicrobiana.
11. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con alcohol al 70%, descartar
los guantes y lavarse las manos.