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7. PCR - Uma tcnica de mil e uma utilidades

Esta aula bastante longa. Por isso optamos por construir internamente links para seus diversos temas, tabelados abaixo. Basta
clicar sobre o tema de interesse.

Sinopse da aula
Primeiros passos - Introduo ao PCR
RAPD - uma PCR com um primer s...e amplicando qualquer DNA!
PCR na investigao de Paternidade
PCR na investigao de crimes
PCR no diagnstico de enfermidades genticas
PCR em tempo real - o sistema Taqman
Um pouco de histria
Artigos importantes sobre PCR
Link para a aula de PCR da disciplina Tcnicas Moleculares na Biologia

7.1 Primeiros passos

Ainda na dcada de 60 muitos pesquisadores procuraram obter a sntese de DNA in vitro. evidente que obter DNA em tubo de
ensaio o primeiro passo para um universo de experimentos em gentica molecular. O primeiro a conseguir caminhar neste sentido
foi Arthur Kornberg, de quem j falamos na aula sobre replicao do DNA. Era natural, j que Kornberg era um profundo conhecedor
das DNA polimerases. A sntese de um DNA viral in vitro foi recebida com entusiasmo por todos, inclusive a imprensa leiga, que
qualicou o feito como a criao da vida em laboratrio. Esta metfora tem sido usada pela imprensa com insistncia em vrias
ocasies, sempre que se trata de manipular o DNA de um ser vivo, e em geral provoca mal estar entre os pesquisadores, o que foi o
caso de Arthur Kornberg.

Em 1983, Kary Mullis, ento pesquisador empregado na Cetus Corporation, EUA, imaginou uma forma de fazer com que a DNA
polimerase iniciasse e terminasse seu trabalho em trechos pr-determinados do DNA. Com o sistema seria possvel amplicar
milhes de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de DNA. A idia foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira
vez em 1985, numa conferncia. Depois disso a tcnica, conhecida como PCR, ganhou quase instantaneamente uma aceitao
mundial e em menos de uma dcada tornou-se o procedimento bsico de todo laboratrio de gentica molecular no mundo.

Mas, anal, o que a PCR?

A sigla signica "polymerase chain reaction", que em portugus seria reao em cadeia da polimerase. Ento, a base da tcnica a
ao in vitro da DNA polimerase. Para compreendermos como funciona a tcnica, que na verdade bem simples, precisamos
recordar que, para iniciar a sntese de uma ta nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde
e de precursores de sntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs (desoxinucleotdeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP).

A idia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA contendo o trecho que queria amplicar, os dNTPs,
a DNA pol e dois primers de DNA feitos em laboratrio, um hibridizando numa ta e "apontando" para o outro, que hibridizava com a
outra ta e "apontava" para o primeiro. A distncia entre os stios de pareamento dos dois primers no podia ser muito grande, e
foram escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reao era inicialmente aquecida
a 94 oC, para que todas as tas de DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos
primers, em geral para 50 oC. Por m, a temperatura era reduzida ainda mais, at 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli
pudesse trabalhar e estender duas tas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequncia alvo escolhida.
Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e
outro na cpia recm sintetizada, gerando, por sua vez, ao m do novo ciclo, 4 cpias do alvo. claro que a repetio do processo
geraria um nmero de cpias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2.

Na verdade, a coisa no foi to fcil assim: a DNA pol era termoinstvel (como a maioria das protenas dos seres vivos) e se
inativava irreversivelmente a 94 oC. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extenso. Alm disso, a baixa
temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de pareamentos esprios (sem sentido, errneos) no
sistema, gerando ao nal produtos de PCR inesperados.

A soluo foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituda por uma DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o
Thermus aquaticus. A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, nalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta
extraordinariamente til na gentica molecular. Que propriedades tm a Taq polimerase que a fazem to til? Ela termoestvel e
sua temperatura tima de funcionamento 72 oC. Com isto trs problemas caram automaticamente resolvidos:

a) no havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.

b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridizao, que podia ser mantida acima de 50 oC, evitando hibridizaes esprias.
c) o DNA molde no se renaturava por completo, permitindo uma rpida desnaturao ao se iniciar um novo ciclo.

Adicionalmente, a manuteno do tubo fechado evitava contaminao do material do laboratrio e dos estoques de reagentes com
os amplicons, nome genrico dado aos produtos de amplicao da PCR. claro que um amplicon gerado com um par de primers
qualquer serve perfeitamente de molde para uma nova reao de PCR com os mesmos primers. A contaminao de reagentes e
pipetas com amplicons continua sendo um problema para todos que trabalham com PCR.

Os eventos ligados s trs temperaturas que mencionamos, 94 oC, 50 oC e 72 oC, esto esquematizados na gura abaixo. Observe
que, a 94 oC, os primers e as tas simples de DNA alvo esto misturados, mas no podem parear. Quando a temperatura reduzida
os primers rapidamente alcanam seus stios de complementariedade, pois so molculas pequenas e, portanto, muito mveis, e
porque esto em concentrao muito mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde tende a renaturar, mas logo a temperatura
novamente elevada para 72 oC, que permite a extenso das novas tas a partir dos primers, sem desparear os primers outra vez. Por
m, a temperatura volta a 94 oC, que desnatura todas as tas, inclusive as recm sintetizadas, recomeando o processo.

Figura 7.1 Eventos relacionados s trs temperaturas bsicas da PCR: Desnaturao a 94 oC, pareamento dos primers a 50 oC e extenso de novas
tas a 72 oC, supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estvel.

O processo descrito acima gera dois tipos de tas simples: uma de comprimento varivel, obtida a partir de um primer que tenha
hibridizado com a ta de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um vrus ou
plasmdeo), e outra, de comprimento determinado, que obtida sempre que um DNA previamente copiado empregado como
molde em sua sntese.

Esta situao est claramente representada na gura abaixo, que mostra os trs primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a ta
estendida a partir de um primer hibridizado com o DNA molde original no tem comprimento xo, porque o molde muito longo.
Seu comprimento nal vai ser determinado pelo instante em que o primer hibridizar com o stio de complementariedade e pela
tempo de extenso total, temperatura de 72 oC. As duas primeiras tas estendidas esto indicadas com a letra e sua direita. J
as tas que so produzidas a partir de primers que hibridizaram em tas previamente copiadas tm fatalmente ser comprimento
denido, j que inicia, no primer e terminam ao m do DNA molde, que exatamente a e extremidade 5do primer j incorporado na
ta molde. As tas de comprimento denido aumentam de nmero exponencialmente, formando aos poucos um imenso nmero d
ta duplas de comprimento denido, enquanto as tas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo, por alvo). Uma inspeo
da gura a seguir esclarecer o leitor sobre esta questo.

Figura 7.2 Produo de novas tas a partir de um DNA alvo pela PCR. Aps hibridizao dos primers a 56 oC, as tas novas so sintetizadas a 72 oC,
dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplicados (contornados em amarelo). Os
fragmentos amplicados acumulam exponencialmente na reao.

A visualizao dos produtos de uma reao de PCR costuma ser feita atravs do uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de
poliacrilamida, que corre verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por correr um gel horizontal
de agarose e visualizar as bandas por transiluminao UV, "corando" previamente o DNA com brometo de etdio (esta substncia se
intercala entre as tas de DNA e nestas condies absorve o UV e uoresce com cor alaranjada). O produto de PCR ser sempre um
DNA ta dupla e o que distingue um do outro, no gel, ser apenas o comprimento relativo. Esta situao est representada no
esquema da gura seguinte.
Figura 7.3 Visualizao de trs reaes de PCR. Em a e b dois produtos so gerados, a partir de dois pares de primers diferentes. Os dois produtos
tm comprimentos de 400 e 360 pb. A migrao das bandas na eletroforese de cima para baixo. O fragmento menor migra mais rpido e produz a
banda em vermelho. O maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. A coluna c um controle negativo, essencial em
qualquer reao de PCR. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA - DNA ladder - de 100 pb). Na
transiluminao ou na colorao por prata, evidentemente, todas as bandas tm a mesma cor.

Quando fazemos um PCR, a prtica aconselha a deixar o tubo com os reagentes por 5 a 10 minutos a 94 oC antes de iniciar o ciclo.
Em geral 1 minuto a cda temperatura suciente para as etapas do ciclo, que repetido de 35 a 40 vezes. Por m, ao terminar a
ltima extenso muitas vezes os protocolos experimentais sugerem a manuteno da temperatura de 72 oC por mais 5 a 10
minutos. A opo de esperar 10 minutos antes de comear o ciclo, mantendo o tubo aquecido, garante que todo o DNA alvo esteja
desnaturado antes de se iniciar o ciclo. Por outro lado, o perodo nal a 72 oC garante que todas as tas tero o mesmo
comprimento pois pode acontecer que, durante o ciclo, algumas tas copiadas no tenham atingido o m do molde. A gura a
seguir sintetiza o ciclo da PCR.

Figura 7.4. Ciclo padro de uma PCR. Antes de iniciar o ciclo o tubo com os reagentes mantido a 94 oC para garantir a desnaturao inicial de todo
DNA alvo. Da mesma forma, ao terminar o ciclo, a manuteno do tubo a 72 oC garante que todos as tas tenham exatamente o mesmo nmero de
bases.

Quando PCRs so realizadas, gerando produtos de diferentes comprimentos, e estes produtos so analisados por transiluminao
UV em gel de agarose, o resultado que se obtm pode ser semelhante ao mostrado abaixo. O menor dos produtos migra mais rpido
e gera a banda mais em baixo no gel. Em geral o gel de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa
pode ser necessrio usar um gel de poliacrilamida.

Figura 7.5 Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (nmero total
de pares de bases) (colunas 2 a 5). Na coluna 1 esto os marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA ta dupla de comprimento conhecido,
obtidos por digesto por enzima de restrio de um DNA conhecido ou sintetizados por mquinas. A coluna 6 um controle negativo e a pequena
banda difusa no m do gel apenas a fronteira da eletroforese.

Nos dias de hoje uma PCR feita numa mquina chamada termociclador. simplesmente um bloco aquecido, controlado por um
sistema digital, que eleva e abaixa a temperatura do material nele inserido (tubos de ensaio pequenos, micro-placas de 96 poos,
etc), de acordo com a programao digitada pelo operador. Mais de duas dcadas foram necessrias para que estas mquinas
pudessem atingir um grau de preciso e conabilidade aceitveis, aliado a um preo razovel. Tambm os reagentes para PCR
reduziram de preo consideravelmente na ltima dcada, tornando o mtodo comercialmente atrativo. Uma reao de PCR pode,
agora, ser feita por US$ 1,00.
Alm do cuidado com a contaminao de amplicons, a PCR exige ateno em vrios outros detalhes. Um deles diz respeito ao
pareamento dos primers: a ltima base da extremidade 3 do primer tem que estar corretamente pareada com o DNA alvo, sem o
que no ocorrer amplicao. No restante do primer a necessidade de um pareamento exato no existe e, na extremidade 5
podemos at mesmo adicionar um segmento ta simples que no vai parear com o DNA alvo. Este ressalto (overhang) no
atrapalha em nada a reao e pode adicionar propriedades importantes ao nosso amplicon nal. Vejam um exemplo disso na
construo da biblioteca de cDNA na aula 6!

Outro ponto importante a questo dos erros na sequncia devido tautomeria de bases. A Taq polimerase no faz reviso (proof
reading) in vitro. Se, ao copiar pela primeira vez o DNA alvo, ela introduzir uma base errada numa das duas tas, 25% do produto nal
estar com sua sequncia diferente nesta base. As consequncias deste erro podem ser trgicas se estamos procurando fazer um
diagnstico gentico (veja item correspondente). Para evitar isto todos os testes so feitos em duplicata. A idia que a
probabilidade da Taq polimerase "errar" nas duas reaes sempre na primeira extenso muito reduzida e se um resultado
conitante surgir, ca claro que num dos tubos a Taq "errou". Se o "erro" for cometido depois do terceiro ciclo ele j se torna
praticamente imperceptvel, pois uma pequena porcentagem das tas ter erro e no ser possvel detect-lo facilmente.

Seria ideal que pudssemos disponibilizar em Downloads um relato de Mullis sobre o PCR a partir da sua apresentao na
Academia Nobel. Entretanto, no h na pgina da Academia Sueca que coordena o Nobel (http://www.nobel.se) as palestras de Kary
Mullis e Michael Smith. Uma apresentao on-line dos trabalhos dos dois laureados Nobel em Qumica, do ano de 1993 est
disponvel: Michael Smith (pelo aperfeioamento da tecnologia da mutao stio-dirigida) e Kary B. Mullis (pela inveno da PCR).
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/illpres/index.html

7.2. RAPD - uma PCR com um primer s...e amplicando qualquer DNA!

Uma limitao sria na PCR convencional a necessidade de se conhecer previamente a sequncia que se quer amplicar ou, pelo
menos, suas extremidades, para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se, contudo, baixarmos a temperatura
de hibridizao (pareamento) para menos de 45 oC, poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especicidade em
muitos stios do DNA. Em verdade, no precisamos sequer de dois primers, basta um.

Uma PCR feita com um s primer e empregando uma temperatura de hibridizao (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior
gera, muitas vezes, um nmero considervel de bandas em muitos diferentes DNAs, atravs do pareamento com baixa estringncia
do primer (em geral ele tambm, pequeno, com 10 a 15 bases, o que facilita os pareamentos). O curioso que, se repetirmos o
experimento nas mesmas condies experimentais, obteremos as mesmas bandas mais uma vez. As bandas, ento, no so uma
amplicao completamente aleatria de trechos de DNA, mas sim de trechos anqueados por sequncias que pareiam com o
primer com baixa estringncia, o que muito diferente. Apesar disso, a tcnica de PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de
fato rpida, mas o nome - randomly amplied polymorphic DNA - DNA polimrco amplicado aleatoriamente - d margem a certa
confuso. Se, por um lado, o pareamento no aleatrio completamente, por outro a existncia das sequncias com homologia de
fato aleatria, pois no sabemos de antemo se um DNA ter regies com complementariedade para o primer escolhido.

A gura abaixo mostra esquematicamente o resultado de um RAPD. Observe que as bandas coloridas podem ser amplicadas de
cromossomas diferentes ou do mesmo cromossoma, mas os primers que as anqueiam (e a todas as demais bandas) so sempre
os mesmos.

Fig. 7.6a Representao esquemtica do resultado de um RAPD empregando DNA extrado de indivduos de trs populaes distintas de insetos
(a,b,c), (d,e) e (f,g,h). Os indivduos i e j no tinham origem determinada e poderiam pertencer a qualquer um dos trs grupos. A semelhana do
padro de bandas com o primeiro grupo sugere a origem. Na parte de baixo da gura uma representao esquemtica dos stios de pareamento que
geram as bandas representadas em vermelho, azul e amarelo.

Idealmente um RAPD deve gerar um nmero de bandas superior a 4, e estas bandas devem ser polimrcas (isto , com diferentes
migraes) para indivduos diferentes, ao menos entr grupos distintos. Isto, contudo, nem sempre ocorre. Ainda assim, o RAPD
uma tcnica extremamente poderosa porque os marcadores so bastante polimrcos e porque se pode testar um grande nmero
de primers em cada situao. Alm disso a tcnica rpida e de baixo custo. A gura a seguir mostra o resultado de um
experimento real do Gentrop/ UFPE, no contexto do trabalho desenvolvido pelo nosso colega Valdir Balbino. DNA de diferentes
exemplares de Lutzomyia longipalpis, o vetor da leishmaniose visceral nas Amricas, foi empregado em reaes de RAPD. Os
exemplares provieram de uma mesma localidade. Pode-se observar o acentuado polimorsmo destes marcadores.
Fig7.6b RAPD obtido de exemplares de Lutzomyia longipalpis, inseto vetor da leishmaniose visceral. Todos os exemplares foram capturados no
municpio de Calumbi, PE, a a amplicao feita com o primer OPP-04 (cortesia Valdir de Queiroz Balbino). A primeira coluna esquerda a escada
de DNA de 100 pb. A terceira banda mais forte, de cima para baixo, corresponde a 600 pb.

O RAPD permite no apenas discriminar entre populaes diferentes de organismos, mas inferir sua correlao logentica. A
tcnica tem, contudo, suas limitaes, sendo a mais grave a diculdade em reproduzir exatamente os mesmos resultados de um
laboratrio para outro.

7.3. PCR na investigao de Paternidade

Uma das aplicaes mais conhecidas da PCR a investigao de paternidade. Tcnicas bioqumicas ou moleculares (voltadas ao
DNA) j existiam muito antes da descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnsticos baseados em PCR
que a investigao de paternidade alcanou o mercado com mais abrangncia, pela reduo dos custos do exame e
democratizao dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties).

Para se compreender como funciona a tcnica precisamos recordar um pouco a organizao do genoma humano ( e de muitos
outros organismos complexos). Apenas 3% do nosso genoma composto de genes. H, ao contrrio, uma enorme parte dele
composta de repeties mais ou menos longas, conforme o caso. No sabemos ainda porque isto ocorre, mas estas repeties
podem ser usadas vantajosamente como marcadores moleculares em muitos casos. Como no so genes, no esto sob uma
presso seletiva to grande e mostram muito mais variao do que as sequncias de genes propriamente ditas.

Dentre as regies repetidas a investigao de paternidade por PCR costuma empregar uma classe de repeties conhecidas como
STR - small tandem repeats ou pequenas repeties em tandem. So pequenas regies de DNA com um nmero varivel de
repeties de 3 ou 4 nucleotdeos cada, anqueadas por regies conservadas. Um esquema simplicado de um STR est mostrado
na gura abaixo. Como os seres humanos e os demais mamferos so diplides, cada regio de um cromossomo (exceto nos
machos o par XY) est presente no outro. Elas no precisam, contudo, ser exatamente iguais. Na representao da gura abaixo
chamamos alelos as duas rgies homlogas nos dois cromossomos, por analogia ao que fazemos com genes, embora os STRs no
sejam genes. Observe que as regies repetidas esto anqueadas por regies conservadas que se estendem esquerda (5) e
direita (3) das repeties. Para qualquer ser humano estas regies conservadas so as mesmas, mas cada um de ns pode ter um
nmero diferente de repeties em cada alelo. Quanto maior o conjunto de diferentes repeties maior ser a informao colhida
pela realizao da anlise da regio. Assim, se o nmero de repeties para o caso estudado (cada caso chamado sistema e em
geral empregam-se 8 a 16 sistemas, cada um lanando mo de um STR de um cromossoma diferente) varia, digamos, de 3 a 15,
haveria 12 possibilidades em cada alelo. Apenas como exerccio, se a probabilidade na natureza fosse a mesma para qualquer uma
das repeties (i.e., a frequncia allica fosse a mesma), a probabilidade de um indivduo qualquer ter o arranjo de 4 e 9 repeties
mostrado abaixo seria 1/12 x 1/12 = 1/ 144.

Fig 7.7 Representao esquemtica de um STR e sua amplicao por PCR, atravs de primers dirigidos s regies anqueadoras conservadas. Os
dois produtos gerados tem comprimentos diferentes pois a parte interna da sequncia difere de um alelo para o outro.

Quando o sistema acima analisado em gel de agarose, duas bandas sero visveis se o indivduo for heterozigoto para aquele STR.
No caso de investigao de paternidade, o lho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da me. Isto que dizer que,
para um sistema qualquer, o lho ter um STR (e uma banda) materno e outro paterno. A gura abaixo retrata a situao onde um
casal avalia a paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem claramente uma banda de origem materna e a segunda banda
est na mesma altura da banda paterna. Portanto, o marido no pode ser excludo de ser o pai. No segundo caso, contudo, a criana
tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda paterna. Esta situao exclui o marido de ser pai do
segundo lho (Fo. 2).

Fig. 7.8 Representao esquemtica de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigao de paternidade. A primeira
coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o resultado da amplicao
de um sistema para o suposto pai, a me e dois lhos. A banda materna de cada lho est indicada e a banda paterna de um deles est contornada
com uma elipse. O teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo lho.

A incluso obrigatria da me em testes de paternidade evita que uma eventual troca de recm-nascido na maternidade possa
confundir os resultados. O mesmo processo descrito acima pode ser empregado em qualquer animal que tenha reproduo sexuada.
preciso apenas identicar os STRs candidatos e avaliar criteriosamente a distribuio dos alelos na populao em estudo. Para os
seres humanos os alelos esto distribudos igualmente em todas as populaes do globo, mas em bovinos, por exemplo, devido ao
cruzamento controlado pelo produtor, os STRs esto distribudos de forma muito diferente de uma raa para outra. Ainda assim, a
avaliao de pedigree em animais de raa um campo crescente de aplicao desta tecnologia.

Apenas como lembrete: os STRs no so os nicos alvos possveis para investigao de paternidade via DNA. Alm disso, a
investigao bioqumica e gentica de paternidade j era um mtodo bem estabelecido muito antes da inveno do PCR. Sugerimos
que o leitor mais interessado procure informaes na internet para complementar esta questo.

7.4. PCR na investigao de crimes

Outro campo frtil para o uso da PCR a criminalstica. A possibilidade de amplicar um pequeno trecho de DNA milhes de vezes
permite, em muitos casos, amplicar de uma pequena amostra biolgica (mancha de sangue, bulbo de cabelo, fragmentos de pele),
mesmo em um estado de conservao, suciente DNA para uma anlise de STRs como a descrita acima. Um caso clssico a
investigao da procedncia de uma mancha de sangue no casaco da vtima (ou resto de pele sob as unhas da vtima). Supondo,
para ns deste exemplo, que o material no contivesse restos de clulas da prpria vtima, o procedimento para anlise do caso
estaria em conformidade com o mostrado na gura abaixo.

Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com duas bandas (aparecer apenas uma se o indivduo for
"homozigoto" para aquele STR). Na amostra as duas bandas do suspeito 2 esto claramente visveis. O suspeito um tem apenas
uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O teste exclui dois indivduos, mas no prova, como na paternidade,
que o outro o "dono" da amostra. A incluso do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de no excluso (como no caso
de paternidade) para 99,99999999%. Isto quer dizer que no podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de
99,99999999%.

Fig. 7.9 Representao esquemtica de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigao criminal. Trs suspeitos esto
sendo investigados e uma amostra de sangue est disponvel. A primeira coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de
peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplicao de um sistema para os possveis criminosos. A coluna 5 mostra o
resultado do mesmo sistema para a amostra. O padro de duas bandas idntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.
Os casos de estupro, em geral, trazem uma complicao adicional: o material colhido na vtima (por exemplo, esperma do
criminoso) est misturado com o DNA da vtima (e com muito DNA contaminante no humano, da ora vaginal). Nestes casos o
DNA dos suspeitos sempre misturado com o DNA das vtimas antes da amplicao dos STRs. O resultado feito por
comparao do padro de 4 bandas das misturas de DNA, uma a uma, de suspeito + vtima, com o padro obtido da amostra
colhida da vtima no corpo de delito. A gura abaixo ilustra este caso.

Fig. 7.10 Representao esquemtica de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigao criminal. Trs suspeitos esto
sendo investigados num caso de estupor e uma amostra de sangue est disponvel. A primeira coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes
aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplicao de um sistema para os possveis criminosos, sempre
em mistura com o DNA da vtima.. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra colhida no corpo de delito que, supostamente
contendo DNA da vtima e do criminoso. A ltima coluna da direita a amplicao apenas do DNA da vtima. O padro de quatro bandas da
amostra idntico ao do suspeito 3 e exclui os demais.

As aplicaes forenses (na justia) da PCR so ilimitadas, mas no h espao aqui para maior detalhamento.

7.5. PCR no diagnstico de enfermidades genticas e na identicao de portadores sos de alelos mutantes.

Doenas genticas podem, algumas vezes, ser difceis de diagnosticar. Adicionalmente, no aconselhamento gentico de casais
importante determinar inequivocamente se um indivduo portador de um alelo mutante (portador so). A identicao de
mutaes em genes pode ser feita tambm por PCR, em geral com a manipulao posterior do produto de amplicao. A seguir
exemplicamos duas destas aplicaes. Numa delas o nucleotdeo mutado faz parte de um stio de restrio (se voc lembrar que
so mais de 600 as enzimas de restrio, cada uma com seu prprio stio, no ser muito difcil encontrar uma que corte um stio
incluindo o nucleotdeo em estudo). Na outra um artifcio permite detectar qualquer nucleotdeo mutado, faa ele parte de um stio
de restrio ou no.

A gura abaixo ilustra o caso em que o stio de restrio para EcoRI, GAATTC, inclui um nucleotdeo que est frequentemente
mutado no caso da doena gentica em estudo. No alelo normal o stio de restrio est preservado e no alelo mutante ele foi
perdido, pela troca de um par AT por um GC. Se o contrrio tivesse acontecido, a tcnica tambm poderia ser aplicada da mesma
forma, apenas com a mudana equivalente na interpretao dos resultados. Quando o trecho de DNA em estudo amplicado por
dois primers anelando nas regies acima e abaixo da mutao (em princpio todo o restante do gene conservado), os produtos
gnicos tero o mesmo tamanho, sejam provenientes do alelo normal (wt - wild type)ou do mutante. Ento, ser preciso uma
interveno nos produtos para que uma distino entre eles possa aparecer. Isto feito pela ao da enzima de restrio escolhida
(no caso, a EcoRI). O produto de PCR produzido a partir do alelo normal pode ser clivado pela enzima de restrio, dando origem a
duas bandas. O produto originado da amplicao do alelo mutante no tem mais o stio para EcoRI e no pode ser clivado,
permanecendo do tamanho original. Assim, num indivduo heterozigoto (portador so de uma mutao recessiva) o sistema
produzir trs bandas: a maior, correspondente ao produto de PCR do alelo mutante, que no pde ser clivado pela EcoRI, e duas
menores, fruto da clivagem do produto de PCR do alelo normal.
Fig. 7.11 Princpio da identicao de mutaes pontuais atravs da eliminao/criao de stios de restrio e gerao de fragmentos de digesto
com polimorsmo de comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP). A gura representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca
estudada. A mutao elimina um stio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplicao dos dois alelos produz fragmentos de mesmo
comprimento. Entretanto, a digesto destes fragmentos com a enzima EcoRI gera um polimorsmo de comprimentos, com o alelo mutante
permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho distinto.

Na avaliao do resultado da PCR/RFLP discutida acima, o gel deve mostrar uma banda nica apenas para o indivduo afetado
(homozigoto mutante, com clnica da doena), j que os produtos de PCR dos dois alelos no podem ser clivados pois perderam o
stio de restrio para EcoRI. J o homozigoto normal ter seus os produtos de PCR de dois alelos clivados e no gel apenas duas
bandas estaro visveis. Apenas no caso j discutido (portador so, heterozigoto wt/m) sero visveis trs bandas. A gura abaixo
representa de forma esquemtica o resultado de uma anlise PCR/RFLP.

Fig. 7.12 Resultado da investigao da presena de mutao no stio EcoRI por PCR (PCR/RFLP). A gura representa o caso de um indivduo
heterozigoto para a marca estudada (coluna b), um indivduo afetado e um normal homozigoto. A mutao elimina um stio EcoRI existente no alelo
selvagem (wt). A amplicao dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto destes fragmentos com a enzima
gera um polimorsmo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de
tamanho distinto.

Em muitos casos de mutaes pontuais a tcnica de PCR/RFLP no pode ser aplicada, seja porque no h stio de restrio
conhecido para o entorno da mutao, seja porque mltiplas mutaes so possveis no gene de interesse, tornando a abordagem
acima impraticvel. Uma alternativa o mis-match PCR, ou PCR com pareamento errneo. O princpio desta tcnica, descrito pela
primeira vez por Cotton et al., em 1988, e tambm conhecido com CMC - chemical mismatch cleavage - baseia-se na clivagem de
DNA em locais com pareamento errneo pela piperidina, e est representada na gura abaixo. Um indivduo heterozigoto tem uma
mutao pontual numa regio qualquer do gene. Podemos amplicar esta regio com primers dirigidos a suas extremidades, como
zemos na PCR/RFLP. Em seguida aquecemos o produto do PCR e deixamos esfriar rapidamente para induzir a formao de
heteroduplexes (uma ta simples de um alelo e a complementar do outro) alm dos homoduplexes (as dus tas pareadas de volta,
de um mesmo alelo). Nas regio no pareadas ou com pareamento errneo com bases C e T liga-se o produto hidroxilamina ou o
tetrxido de smio, respectivamente. Uma vez ligados, estes produtos permitem a clivagem do DNA neste local pela piperidina.
Assim, 50% dos produtos de PCR sero cortados por este sistema em todo lugar onde houver uma mutao. Em geral os
fragmentos gerados pro este sistema so pequenos e devem ser visualizados em gel de poliacrilamida. A gura abaixo mostra
como funciona este sistema.
Fig. 7.13 Resultado da investigao da presena de mutao em uma base desconhecida pela tcnica de PCR-mismatch. A gura representa o caso
de um indivduo heterozigoto para a marca estudada: o alelo selvagem tem o par TA e o mutante o par GC. A amplicao por PCR do trecho onde a
mutao est usa primers que esto a alguma distncia direita e esquerda da provvel mutao. Quando o produto do PCR aquecido os dois
tipos de ta (TA e GC) se separam, dando origem a 4 tas simples. Quando a mistura rapidamente aquecida, as tas simples se reassociam ao
acaso de 4 formas distintas, pois a diferena de uma nica base no impede o pareamento das tas quase complementares. Aps o uso de um
sistema qumico adequado, os pares de base errneos so clivados e as tas com mis-match geram dois fragmentos no gel, ao contrrio das tas
com pareamento perfeito. O heretozigoto aparece, no gel, com trs bandas (veja gura abaixo).

O resultado do experimento descrito acima est esquematicamente representado na gura seguinte. O portador so, heterozigoto,
tem uma mutao na posio descrita na gura anterior. O primeiro afetado tem esta mutao nos dois alelos. J o segundo
afetado tem um alelo com a mutao da gura anterior e outro alelo com uma mutao mais a direita, como representado na barra
vertical ao lado do gel.

Fig. 7.14 Resultado da investigao da presena de mutao pela tcnica de mismatch PCR. A gura representa o caso de um indivduo
heterozigoto para a marca estudada (coluna b), dois indivduo afetados e um normal homozigoto. A amplicao dos dois alelos produz fragmentos
de mesmo comprimento. Entretanto, a clivagem destes fragmentos pela piperidina gera um polimorsmo de comprimentos, com o alelo mutante
permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho distinto. No caso do primeiro afetado (homozigoto)
no h mismatch interno porque os dois alelos so idnticos. Nocaso do afetado heterozigoto cada alelo diferente do outro em dois pontos
distintos, o que gera trs fragmentos pela piperidina, mais o produto no clivado do homoduplex.

No se deve esquecer, contudo, que a presena de um mismatch no signica diretamente uma mutao, pois h na natureza
diferenas individuais entre qualquer ser vivo. Estad diferenas, que no signicam doena mas diferenas simples entre indivduos
so chamadas SNPs. O teste nal para o reconhecimento de presena de uma mutao , de fato, o sequenciamento direto do
produto de PCR. Se houver diferena entre os alelos, no lugar correspondente eletroferograma haver duas bases possveis (p.ex. T
ou A). (veja aula sobre sequenciamento, a seguir). A consulta num banco de dados pblico de SNPs ser essencial, tambm (ver
aula de Introduo Bioinformtica, mais adiante).

7.6. PCR em tempo real - o sistema Taqman

Recentemente foi desenvolvido um sistema pela empresa Applied Biosystems (fundida com a Celera na atual Applera), para
detectar o produto do PCR medida em que esta vai sendo sintetizado na reao. O engenhoso sistema baseado no uso de uma
sonda, dirigida contra uma regio interna da sequncia que se deseja amplicar, e que tem dois uorocromos, um em cada
extremidade da sonda (um DNA ta simples). Na extremidade 5 h um uorocromo que s uoresce se estiver distante sicamente
do uorocromo na posio 3. Este segundo uorocromo funciona como capturador de energia (quencher) e no deixa com que a
energia luminosa usada para excitar a sonda chegue em quantidade suciente para excitar o primeiro uorocromo. Estes dois
uorocromos esto representados como R e Q (para quencher). Quando o primer hibridiza na regio 5, a sonda tambm o faz no
meio da sequncia. medida em que a Taq polimerase avana sintetizando a ta nova, ela vai degradando a sonda sua frente,
liberando o uorocromo R da sonda e permitindo que absorva energia e emita luz. A energia para a excitao dos uorocromos
provem de um feixe de laser que atravessa a amostra e o equipamento que faz isto chama-se PCR em tempo real (real time PCR) ou
Taqman. A gura abaixo esclarece este princpio.

Fig. 7.15 Princpio de funcionamento do Taqman, ou PCR em tempo real. Uma sonda ta simples com dois orocromos adicionada reao de
PCR. O uorocromo Q atua com atenuador da uorescncia de R, sendo protanto um quencher. Para isto preciso que esteja prximo a R. A TAq
polimerase separa os dois uorcromos medida em que degrada a sonda quando sintetiza a ta nova. O uorocromo R recm liberado da sonda
emite ento luz num comprimento de onda caracterstico, diferente de Q. A excitao dos uorocromos feita com laser que atravesse o tubo de
reao.

A medio da radiao feita pelo aparelho, que taa um grco com a absoro obtida aps cada ciclo de PCR. O ciclo em que o
patamar (limite) de negatividade ultrapassado est diretamente relacionado quantidade de DNA molde na mistura. Com isto, a
quanticao de DNA molde passou a ser no apenas possvel, mais rpida. O sistema ainda bastante dispendioso mas tender a
se tornar mais barato medida em que novos sistemas entrarem no mercado e um maior nmero de mquinas for disponvel.

Fig. 7.16 Grco obtido com o Taqman. A seta indica o ciclo em que a reao ultrapassa o limite da reao negativa. Quanto menor a quantidade de
DNA molde no tubo de reao maior o nmero de ciclos necessrios para ultrapassar o limite da negatividade. A reao de PCR no Taqman emprega
em geral apenas duas temperaturas (94 oC para desnaturao e 60 oC, para hibridizao e extenso) e o resultado da PCR pode ser dado em menos
de 30 minutos.

7. 7 Um pouco de histria

em construo

A reao em cadeia da polimerase foi desenvolvida a partir de uma idia de Kary B. Mullis.

K. Mullis nasceu em 1944 em Lenoir, Carolina do Norte, EUA. Obteve o grau de bacharel em qumica em 1966 no Instituto de
Tecnologia da gergia e o PhD em Bioqumica pela Universidade da Califrnia em Berkeley. Passou ento 7 anos como ps-doutor
em Cardiologia Pediatria e Qumica Farmacutica na Escola de Medicina da Universidade de Kansas (EUA). Em seguida reebu um
convite para trabalhar como tcncio na Cetur Corporation, em Emeryville, em 1978. Foi l que teve a idia da PCR.
Segundo ele, foi dirigindo seu carro de San Francisco para sua casa em La Jolla, California, que ele comeou a imaginar uma
maneira simples de determinar uma sequncia de nucleotdeos a partir de um trecho de DNA. Ele ento, como querem para si
outros cientistas, tece uma inspirao sbita: a soluo no era apenas para seu problema original, mas tinha um alcance muito
maior. Ele imaginou uma forma de fazer a DNA polimerase iniciar e terminar seu trabalho em pontos pr-determinados e,
consequentemente, pelo uso desta proipriedade, descobriu uma maneira de amplicar exponencialmente uma sequencia de DNA
num tubo de ensaio.

Mullis ento levou a idia para seus colegas da Cetus e juntos eles a colocaram para trabalhar de verdade. Ela foi apresentada pela
primeira vez ao pblico numa conferncia em 1985 e foi pronta e amplamente aceita pela comunidade cientca. A popularidade da
tcnica, assim como seu conceito, ganhou crescente popularidade ao longo dos anos seguintes.

Em 1989 a revista Science escolheu a molcula usada na PCR, a Taq polimerase, como a primeira "Molcula do Ano".

Em 1991 a PCR se tornou extremamente comum em laboratrios pelo mundo afora e referncias ao uso da tcnica j somavam
milhares nas revistas cientcas. Um ano depois a Cetus, depois de uma reorganizao corporativa, vendeu a patente da PCR para a
Hoffman - La Roche por US$ 300.000.000,00.

Devido ao alcance e popularidade da PCR Kary Mullis foi apontado e recebeu o prmio Nobel de Qumica em 1995. Esta indicao
foi duramente contestada por muitos que acreditavam que a PCR foi apenas um desenvolvimento de tcnica e que sua concepo
no era suciente para dar a Mullis o status de nobelista. Mullis argumentou a seu favor que a unio das tcnicas pr-existentes no
formato por ele criado fazia toda a diferena.

Para uma histria um pouco mais detalhada sobre o desenvolvimento da PCR veja o site
http://usitweb.shef.ac.uk/~mba97cmh/history/history.htm

7.8 Artigos importantes sobre PCR

Uma seleo dos mais importantes artigos sobre PCR, tanto durante o desenvolvimento da tcnica quanto para diversas aplicaes,
pode ser encontrada na pgina especca da Universidade de Berkeley:
http://sunsite.berkeley.edu/pcr/foundationalPCR.html#anchor1239949
Vale a pena conferir!

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