UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE MEDICINA

AGENTES BIOLGICOS

TINCIN GRAM

Autor:

Erick Fernndez

Docente:

Dra. Milagros Escalona

Curso:

Cuarto A

2017
TEMA:

Tincin Gram

INTRODUCCIN:

Es complicado observar bacterias al microscopio ptico sin un correcto mtodo de tincin, debido
a la falta de contraste que estas presentan y su tamao tan reducido, por ello para mejorar la
observacin bacteriana se utiliza tincin Gram, un proceso por el cual las molculas de un
colorante se absorben en la superficie celular de diversos microorganismos as nos permite
distinguir dando un contraste diferencial a las bacterias y basndose en su coloracin, se puede
clasificar en dos grupos: grampositivas y gramnegativas como hemos revisado previamente.

Esta tincin tiene gran importancia en el estudio bacteriolgico, ya que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias y surge varias interrogantes al
respecto, Con que sustancias se tie las bacterias? Cmo se realiza una correcta tincin para
poder observar las distintas colonias de bacterias al microscopio? Qu tan riesgoso es manipular
las diferentes bacterias?

OBJETIVOS:

Objetivo General:

Realizar tincin de Gram en un grupo de bacterias y poder diferenciarlas como Gram

positivas y Gram negativas

Objetivos Especficos:

Explicar el mecanismo funcional de la tincin Gram en bacterias.

Describir el procedimiento para realizar la tincin Gram en el laboratorio de microbiologa.

EVIDENCIA GUA Y MTODO TERICO:

Coloracin Gram
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, Gram-positivas y Gram-negativas de acuerdo a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y
forma al organismo, as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa
y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano, as como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la
clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de
peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,
lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.
La coloracin Gram consiste en una tcnica de tincin que utiliza 4 componentes: un colorante
bsico (cristal violeta), un mordiente (lugol), un decolorante (alcohol cetona) y un colorante de
contraste (safranina) estos son catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares
cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos, que estan
cargados negativamente y envuelven a los microorganismos. (Fernandez, 2014)
Pared Gram +
Capa densa y uniforme que contiene:

cidos teicoicos
Polisacridos
Protenas (pocas veces)
Peptidoglicano (80% del peso seco)
Pared Gram -
Capa interna delgada con capas externas de densidad menor, contiene:

Lipopolisacridos
Lipoprotenas
Protenas
Peptidoglicano (10% del peso seco)
El mecanismo de la tincin Gram es el siguiente:

GRAM + GRAM -

1) Violeta de genciana, por 30 Clulas color violeta Clulas color violeta

segundos
2) Lugol, por 30 segundos Se forma el complejo violeta- Se forma el complejo violeta-
lugol. Las clulas continan lugol. Las clulas continan
teidas de color violeta. teidas de color violeta.

3) Acetona por 15 segundos El complejo violeta-lugol no Eliminacin por extraccin de

sale de las Clulas, las que grasas de las paredes
conservan el color violeta. celulares. El complejo violeta-
lugol se separa de las Clulas,
las que pierden el Color y no
pueden observarse
 4) Safranina por 30 segundos Clulas no decoloradas; Clulas decoloradas; se tien
quedan teidas de color de color rojo rosceo.
violeta

MATERIALES SUTANCIAS

Placas porta y cubre objetos Violeta de Genciana

Asas microbiolgicas Acetona

Mecheros de bunsen Sarfanina

Bioseguridad Lugol

Microscopio Agua

Cultivos Disponibles

PROCEDIMIENTO:

1. Extensin:
En un portaobjetos esterilizado (con alcohol, papel de filtro y flameado) y con el asa de siembra
esterilizada a la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o en su caso,
de una colonia.
Con el asa se realiza un frotis bacteriolgico sobre los portaobjetos, con movimientos circulares y
uniformes, se esteriliza nuevamente el asa bacteriolgica para otras muestras a recolectar.
2. Fijacin
Se puede acelerar el secado, calentando ligeramente con un mechero Bunsen, pero sin acercar
directamente.
3. Coloracin:
Se somete la muestra a:

30 segundos en cristal violeta (colorante inicial), y se lava con agua corriente.

30 segundos en lugol (mordiente), y se lava con agua corriente.
15 segundos con acetona (decolorante), y se lava con agua corriente.
30 segundos en safranina (colorante de contraste) y se lava con agua corriente.
 4. Secado y observacin
Se seca suavemente a temperatura ambiente o cerca del mechero, una vez que la preparacin
est totalmente seca, se coloca el cubreobjetos y se pone una gota pequea de aceite de
inmersin y observar al microscopio con el objetivo de 100X. (Olivas, 2012)

CONCLUSIONES:

La tincin Gram clasifica a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivos por la
gruesa capa de peptidoglicanos y Gram negativos por la delgada membrana que poseen,
si se realiza un mal proceso de recoleccin de la muestra no se lograra diferenciar esta
clasificacin.

En caso de no haber esterilizado ninguno de los materiales a utilizar durante la recoleccin

de muestra, esta saldr contaminada, la identificacin va a ser muy difcil.

La tincin Gram se realiza preparando las placas con cultivos de bacterias, se aplica la
extensin, la fijacin de la muestra, la coloracin con azul de metileno, lugol, acetona y
safranina, si no se realiza correctamente estos procesos, en el orden y tiempo adecuado,
la muestra resultara daada.

RECOMENDACIONES:

Esterilizar el asa bacteriolgica y el portaobjetos previo a la obtencin de la muestra, sacar las

bacterias con mucho cuidado y hacer un frotis preferiblemente circular para que salga
correctamente la tincin.
No someter por mucho tiempo a las sustancias colorantes, estas pueden afectar sobretodo el
alcohol-acetona que puede eliminar todo el colorante y la muestra estara perdida.
Utilizar estrictamente el equipo de bioseguridad debido a los agentes infecciosos que estamos
manipulando.

BIBLIOGRAFA:

Fernandez, C. (04 de 2014). Gua de Laboratorio de Microbiologa. Obtenido de

http://www.puce.edu.ec/sitios/documentos_DGA//11_27_2703_2012-
02_MD0403_Todos_T_Todos.pdf
Olivas, E. (03 de 2012). Manual de Practicas de Microbiologa. Obtenido de Instituto de Ciencias
Biomedicas: http://bivir.uacj.mx/Reserva/Documentos/rva2011296.pdf
Parrilla, M. P. (2009). Microbiologa Clnica. Obtenido de Guias Practicas:
http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/practicas.pdf
ANEXOS:

1. Kit de Bioseguridad 2. Esterilizacin 3. Extraccin de bacterias

4. Fijacin 5. Coloracin 6. Lavado de la muestra

7. Secado de la
8. Observacin 9. Resultados
Muestra