RAPPORT DE STAGE DE BACTERIOLOGIE ET

DE PARASITOLOGIE

Effectu au Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie

E.S.S.Agro.

Du 03 Aot 2014 au 31 Octobre 2014

Prsent par : RAZAFINDRABE Tsiriniaina Jean Luco

Doctorant lA2E E.S.S.Agro.

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REMERCIEMENTS

Nous tenons remercier :

- Le Programme des Nations Unies pour le Developpement (PNUD), lOrganisme des

Nations Unies pour lEducation, la Science et la Culture (UNESCO) et du Comit
Scientifique (CS) ;
- LUniversit dAntananarivo travers toute lquipe G/DHD dirige par Monsieur le
Vice Prsident de la Formation et de la Recherche ;
- Tout le personnel du Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSAgro.

Nous adressons, particulirement, nos vifs remerciements et toutes nos chaleureuses

gratitudes Monsieur le Professeur RAKOTOZANDRINDRAINY Raphal, Chef de
Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSAgro. et aussi notre encadreur.

Cest avec un grand plaisir que nous rservons ces lignes en signe de gratitude et de
reconnaissance tous ceux qui ont contribu de prs ou de loin pour la ralisation de ce stage.
 SOMMAIRE
Pages
REMERCIEMENTS ................................................................................................................... i

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1

CONTEXTE ................................................................................................................................ 1

HISTORIQUE ET ACTIVITES DU SITE DACCUEIL....................................................... 2

METHODOLOGIE .................................................................................................................... 3

I.COLLECTE DE FECES DE BOVIN .............................................................................................. 3

I.1. Nature et condition de prlvement ..................................................................................... 3

I.2. Lieu et modalit de prlvement .......................................................................................... 3

I.3. Etiquetage............................................................................................................................... 3

I.4. Acheminement et transport .................................................................................................. 3

I.5. Rception au laboratoire....................................................................................................... 3

II. EXAMEN BACTERIOLOGIQUE DES SELLES (COPROCULTURE)............................ 3

II.1. Examen macroscopique des prelevements ...................................................................... 3

II.2. Culture : ensemencement et isolement ............................................................................ 4

II.2.1. Milieu de culture ............................................................................................................ 4

II.2.2. Technique de culture et isolement................................................................................ 5

II.3. Identification ...................................................................................................................... 5

II.3.1. Aspect des colonies ........................................................................................................ 5

II.3.2. Examen microscopique direct ...................................................................................... 5

II.3.3. Tests metaboliques (glucidiques, protiques, lipidiques) ........................................... 7

II.3.4. Autres tests didentification .......................................................................................... 7

II.4. Antibiogramme .................................................................................................................. 8

II.4.1. Technique et ralisation sur glose Mueller Hinton ................................................... 8

II.4.2. Lecture et interprtation............................................................................................... 8

III. EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES .................................................................. 9

III.1. Technique de sdimentation ............................................................................................. 9

III.2. Diffrents types duf dhelminthes des bovins observs .............................................. 9

RESULTATS ............................................................................................................................ 10

CONCLUSION ET PERSPECTIVES.................................................................................... 11

ANNEXES ................................................................................................................................. 12

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 15

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INTRODUCTION

Dans le cadre de la prparation du doctorat en sant animale au sein de lEcole

doctorale A2E ESSAgro de lUniversit dAntananarivo, le Programme des Nations Unies
pour le Developpement (PNUD), lOrganisme des Ntions Unies pour lEducation, la Science
et la Culture (UNESCO) en coopration avec l Universit dAntananarivo travers la
Gouvernance et Dveloppement Humain Durable (G/DHD) nous a offert un stage acadmique
3 mois au sein du Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSA-Universit
dAntananarivo.

Notre thme concerne la diarrh bovine : causes microbienne et parasitaire dans

les rgions dAmoroni Mania et Vakinankaratra . Cest pourquoi lobjectif de notre
stage focalis sur le savoir-faire des analyses bactriologiques et parasitologiques relatifs la
connaissance des causes de la diarrhe bovine.

CONTEXTE

A Madagascar, lelevage bovin occupe une place trs importante dans le cadre du
dveloppement en intervenant dans plusieurs domaines conomiques, sociologiques et
culturels (1). Comme toute spculation, il rencontre des problmes de maladies telles que la
diarrhe banale, le mtorisme, les helminthoses (2). La diarrhe entraine des pertes
conomiques pour les leveurs alors que sa cause exacte reste encore mconnue.
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HISTORIQUE ET ACTIVITES DU SITE DACCUEIL

Le Laboratoire de Microbiologie et de Parasitologie ESSA-Universit

dAntananarivo a t fond en 1990 grce au sutien financier de la Suisse sous la direction du
Docteur TYBERAENC (vtrinaire). En 1996, la coopration franaise a contribu pour
lappui technique et financier. En 2007, lUnion Europenne a assur la rhabilitation du
laboratoire. Le Professeur RAKOTOZA NDRINDRAINY Raphal a dirig le laboratoire
depuis mai 1993.

Les activits de ce laboratoire se focalisent sur les examens parasitologiques et

bactriologiques pour les stages et les travaux pratiques des tudiants ainsi que les travaux de
recherches pour les mmoires de fin dtude et les thses de doctorat.

Le personnel est compos du Chef de Laboratoire, de 2 Docteurs vtrinaires

Doctorants et de 2 Techniciens de laboratoire et dun Assistant Administratif.
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METHODOLOGIE

I. COLLECTE DE FECES DE BOVIN

I.1. Nature et condition de prlvement

Les prlvements sont des matires fcales fraichement mises provenant des bovins
prsentant de signes de diarrhe.

I.2. Lieu et modalit de prlvement

Les prlvements ont t pris dans les tueries dAmpasika et chez quelques leveurs
situs dans les Fokontany Andraisoro et Ambatomaro. Pour le receuil du prlvement, la
fouille rectale a t pratique.

I.3. Etiquetage

Bien emball dans un sachet, ces matires fcales sont tiquetes pour viter toute
confusion.

I.4. Acheminement et transport

Les prlvements ont t transports jusquau laboratoire danalyse de lESSAgro.

dans une glacire munie daccumulateurs de froid pour bloquer la multiplication bactrienne
et lvolution des ufs de parasites (Annexe 1).

I.5. Rception au laboratoire

Arrivs au laboratoire, ces prlvements sont mis dans un rfrigrateur (conservation

maximale 8 heures 4C) jusquau moment du dbut de lanalyse.

II. EXAMEN BACTERIOLOGIQUE DES SELLES (COPROCULTURE)

L'examen bactriologique des selles se fait par coproculture, en ensemenant ces

dernires sur des milieux de culture appropris. Le but est de rechercher des bactries rputes
pathognes.

II.1. Examen macroscopique des prelevements

Chaque prlvement est observ pour noter son aspect et sa consistance : la prsence
de mucus, sa couleur noirtres, son odeur (nausabonde).
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II.2. Culture : ensemencement et isolement

II.2.1. Milieu de culture

II.2.1.1. Types

Plusieurs types de milieu de culture sont utiliss :

o Glose au sang et glose au chocolat : glose ordinaire favorable la

croissance et multiplication bactrienne et mme ceux qui ont besoin dun
facteur de croissance.
o Bouillon selenite
o Glose Salmonella-Shigella
o Glose Mac Conkey : cest un milieu slectif pour les bacilles Gram ngatifs
o Glose Mueller-Hinton : milieu adapt pour lantibiogramme
o Autres milieux : bouillon au slnite, Salmonella Shigella agar.
II.2.1.2. Procdure de prparation

Pour la glose au sang et la glose au chocolat, on a utilis le Columbia blood agar

base CM0331 qui se prsente sous forme de poudre dissoudre raison de 39g/l deau
distille et striliser pendant 15mn 121C lautoclave. Ce milieu est refroidit jusqu 50C
la bain-mari pour la glose au sang (70C pour la glose au chocolat) puis ajouter 5% de
sang de mouton et repartition dans des botes de Ptri (20ml par bote) et conserver dans un
refrigerateur aprs solidification.

Pour la glose Mac Conkey (Mac Conkey agar CM0115), 51,5 gsont dissous dans un
litre deau distille et porter bullition jusqu bullition complte. Striliser 15mn 121C
lautoclave, laisser refroidir puis repartir dans des botes de Ptri (20ml par bote) puis
conserver dans un rfrigrateur aprs solidification.

La mme opration est respecte pour la glose Mueller-Hinton (Mueller-Hinton

agar CM0337) avec dissolution de 38gdans un litre deau distille (Annexe 2).

Pour Slnite broth base CM0395, la prparation se fait comme suit : dissoudre 4g de
biselenite de sodium dans 1l deau distille et ajouter 19g de milieu de base, chauffer jusqu
dissolution complte puis bien melanger et repartir en tubes sur une hauteur de 5cm, steriliser
au bain-marie bouillant pendant 10mn, ne pas autoclaver.
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Pour S.S.Agar CM0099 : dissoudre 63g de poudre dans un litre deau distille puis
porter lbullition en agitant frquemment et maintenir un leger frnissement jusqu
dissolution complte puis refroidir jusqu 50C, mlanger et rpartir.

II.2.2. Technique de culture et isolement

La culture permet dobtenir des colonies bactriennes. Elle se fait en strie laide
dune anse en platine sur le milieu de culture et renverser la bote (milieu en haut) et incuber
37C pendant 18 24 heures.

L'isolement est une technique qui permet de sparer les diffrentes bactries d'un
chantillon. L'isolement permet d'observer les colonies.

Si les colonies sont isoles, on peut procder lidentification.

II.3. Identification

II.3.1. Aspect des colonies

Cet examen apprcie :

La couleur de la colonie qui peut tre jaune, blanche, blanchtre, grise ou

gris blanc.
La forme de la colonie : arrondie ou irrgulire
La taille de la colonie : petite , moyenne (1mm de diamtre) ou grande
Laspect de la colonie : lisse ou rugueuse (Annexe 3)
Le pouvoir hmolytique : se voit sur glose au sang avec diffrents
types :
o -hmolytique
o -hmolytique
II.3.2. Examen microscopique direct

II.3.2.1. Examen direct a ltat frais

a. Matriels
Lame et lamelle
Microscope optique
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b. Principe

Que ce soit leprlvement (calque dorgane, pus, plaie) ou prise dun chantillon de
la colonie dans le milieu ensemenc, il faut respecter les tapes suivantes :

Prendre une lame bien strile

Y dposer quelques gouttes deau distille
Prendre un chantillon de la colonie du milieu ensemenc par
un oese et mlanger avec les gouttes deau.
Recouvrir dune lamelle et lecture au microscope avec
objectif X 40.

Rsultat : cet examen direct permet dobserver :

La forme de la bactrie (cocci, bacille, coccobacille)

La mobilit de la bactrie :
Mobile pour le cas dun bacille ciliature pritriche
comme Salmonella et Escherichia coli ;
Immobile pour les cocci comme les Staphylocoques et
Streptocoques (mouvement brownien) (Annexe 4).

II.3.2.2. Examen direct apres coloration de Gram

a. Matriels et colorants
o Lame bien propre
o Feu
o Anse de platine avec boucle
o Violet de Gentiane
o Lugol
o Ethanol
o Safranine
o Microscope
b. Principe
o Utiliser une lame propre
o Prlever les colonies
o Etaler et fixer la chaleur
o Colorer au Violet de Gentiane pendant 1mn
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o Rejeter le colorant
o Verser le lugol pour fixer le colorant pendant 1 mn
o Rejeter le lugol et verser lalcool pour dcolorer la
prparation
o Rejeter lalcool et rincer avec leau
o Verser lencre de fuschine pendant 30 secondes et rejeter
de nouveau
o Rincer avec leau et scher la lame
o Verser de lhuile de Cdre
o Lecture au microscope avec objectif X100
c. Rsultats

o Bactrie Gram positif : prparation de couleur violet au

microscope ;
o Bactrie Gram ngatif : prparation de couleur rose
(Annexe 5).

II.3.3. Tests metaboliques (glucidiques, protiques, lipidiques)

Mtabolisme glucidique : fermentation des sucres comme le glucose,

le lactose, le saccharose.
Mtabolisme protique : dsamination, dcarboxylation.
Mtabolisme lipidique : prsence de diffrente lipase.

Ces diffrents tests mtaboliques peuvent tre faits en plaquette comme la galerie
API.

II.3.4. Autres tests didentification

Test doxydase
Il existe plusieurs types de matriels pour vrifier le test de loxydase : disques,
solution. Le contact des bactries au disque entrane le changement de la couleur de ce dernier
en violet : oxydase positive. Si la bactrie a une oxydase ngative, il ny a pas de changement
de couleur.
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Test de Catalase
Les bactries rduisent leau oxygne (H 2 O 2 ) en eau avec dgagement dO 2 . On
met les colonies dans une goutte deau oxygne. Les bactries sont catalase positive sil y a
formation de bulles dair .Si non, les bactries sont catalase ngative.

Galerie API
Il existe de nombreux kit Api : API 20E pour les entrobactries, Api 20NE pour les
non entrobactries, API NH pour les cocci gram- tels Neisseria et Haemophilus, API Staph
pour les staphylocoques.

Ralisation :

- Prparer les souches : mettre des souches dans deau physiologique NaCl
0,9% de faon avoir la turbidit dun Mac Farland 0.5 ;
- Remplir les cupules ;
- Incuber 37C pendant 18 24 heures ;
- Faire la lecture (Annexe 6).

II.4. Antibiogramme

II.4.1. Technique et ralisation sur glose Mueller Hinton

o Prparer les souches : mettre des souches dans deau physiologique
NaCl 0,9% de faon avoir la turbidit dun Mac Farland 0.5 ;
o Ensemencer et taler sur milieu glose Mueller Hinton laide dun
couvillon ;
o Placer les disques dantibiotique ;
o Incuber pendant 24 heures 37C.
II.4.2. Lecture et interprtation

Lefficacit de lantibiotique est mesure par le diamtre de la surface vide autour du

disque correspondant lactivit de lantibiotique.

La mesure du diamtre de la zone dinhibition se fait avec une rgle et exprime en

mm. Linterprtation des rsultats suit la rfrence CLSI (Clinical Laboratory Standard
International).
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Penicilline (P 10): 6mm (R)

Ampicilline (AMP 20): 6mm (R)
Clindamicine (DA 2) : 6mm (R)
Imipneme (IPM 10) : 29mm (S)
Ciprofloxacine (CIP 5) : 30mm (S)
Tetracycline (TE 30) : 24mm (S)

R : rsistant S : sensible

Antibiogramme dEscherichia coli sur glose Mueller Hinton

III. EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES

III.1. Technique de sdimentation

Cinq grammes de matires fcales ont t pess et dposs dans un becher de 100 ml
contenant 50 ml deau, mlanger bien avant de la faire passer travers le passoir puis laisser
reposer durant une heure et rejeter le surnageant, 3 gouttes du sdiment sont examines au
microscope lobjectif X10.

Chaque examen doit tre vrifi 3 fois partir du mme chantillon avant dtre
class ngatif. Les fces ont t gards au froid pour viter lvolution de luf (Annexe 6).

III.2. Diffrents types duf dhelminthes des bovins observs

uf de strongle uf de Fasciola gigantica

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Diffrents types dufs sont observs :

- Toxocara vitulorum : arrrondi, taille moyenne, paroi paisse ;

- Strongles digestifs tels Oesophagostomum radiatum, Haemonchus contortus,
Trichostrongylus axei : ovalaire ou ellipsode, paroi mince, contenant des
blastomres ;
- Fasciola gigantica : ovalaire, operculeux lun des ples, grande taille,
contenu granuleux, jaune dor ;
- Trichuris globulosa : ovalaire, petite taille, deux ples pourvus de bouchon
polaire (3).

RESULTATS

Cette tude nous permet de savoir la cause de la diarrhe des bovins, dameliorer le
contrle de la prsence de la maladie et dorienter le programme de vermifugation et les soins
des animaux. Ce qui reduit le taux de mortalit des animaux et augmente ses productivits. Il
y aura donc un impact sur la vie des paysans et le developpement conomique du pays.

Parmi les bactries pathognes causant la diarrh bovine, on peut citer en premier
lieu Escherichia coli entrotoxinognes prsent dans le tube digestif, y produisent des toxines
et perturbent le bon fonctionnement des entrocytes (cellules de l'intestin). Il y a aussi les
bactries entro-invasives qui dgradent les entrocytes comme Salmonella, Shigella et
Campylobacter (4).

Pour les parasites, on peut citer en premier lieu Fasciola gigantica dans la famille
des trmatodes, les strongles digestifs et Toxocara vitulorum pour les nmatodes (5).

Les causes de la diarrhe bovine peuvent tre diverses comme le stress, la fatigue,
linsuffisance en alimentation, le changement climatique. A part ces causes possibles, la
diarrhe peut tre aussi dorigine virale, non seulement dorigine bactrienne ou parasitaire.

L'tude bactriologique des selles est un examen techniquement dlicat. Le

prlvement doit tre fait et conserv dans de bonnes conditions. Les milieux de cultures
doivent tre de bonne qualit, et de prparation rcente. Le non-respect des conditions
opratoires peut conduire des rsultats faussement ngatifs. Elle ncessite un laboratoire de
bactriologie bien quip, disposant de tout le matriel pour raliser des cultures et d'un
personnel entran.
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CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Ce stage nous a rapport beaucoup de connaissance concernant le monde du

laboratoire, sa structure, son fonctionnement et surtout son activit.

Le laboratoire est un pilier pour une meilleure prise en charge des maladies. Les
analyses effectues permettent la prise en charge thrapeutique. Il est trs important de bien
matriser les tapes des examens bactriologique et parasitologique partir dun prlvement.

Les objectifs sont atteints et nous esprons une continuit de laccord de coopration
cadre entre les divers acteurs pour mieux approfondir davantage sur les autres analyses de
laboratoire concernant la serologie (test ELISA) et la biologie moleculaire (PCR) et
limplication de la zootechnie pour ameliorer la production.
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ANNEXES

Annexe 1 : Prlvement et condition de transport

Bovin prsentant une diarrhe Glaciaire remplie de prlvements

Annexe 2 : Prparation de la glose

Glose au sang

Annexe 3 : Rsultat de la culture

Sur glose au sang : colonies rondes, lisses, de

taille moyenne, de couleur blanchtre et non
hmolytique

Colonies sur glose au sang

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Annexe 3 : Identification

Prparation pour examen direct

Annexe 4 : Identification

Lames pour coloration de Gram

Annexe 5 : Api 20 E

API 20E aprs 24 heures dincubation

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Annexe 6 : Technique de sdimentation

Prparation sdiment
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1- Claire G. La combinaison des analyses quantitatives et qualitatives pour une tude des
dynamiques de pauvret en milieu rural Malgaches. Thse pour Doctorat es Sciences
Economiques : Universit Montesquieu Bordeaux IV ; Droit Sciences sociales et
politique.2006 ; 368.
2- SEDES. Recensement et caractristiques du cheptel. 1988 ; 2 :148-176
3- Frederic B. Atlas de coproscopie. 2001.
4- Pilet C et al. Bactriologie mdicale et vtrinaire. Doin Editeurs, 2me dition. 1979 :
437p.
5- Rousset J.J., Copro-parasitologie pratique. Edition ESTEM.1993 :251p