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Micotoxicologia
Sumrio
Neste captulo visa-se fazer uma introduo ao estado actual de conhecimento na rea da micotoxicologia, e
introduzir conceitos e definies que so usados no decorrer da dissertao.
1. O que so micotoxinas
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Tabela 1.1. Avaliao comparativa do risco (agudo e crnico) de diversos contaminantes alimentares (adaptado
de Kuiper-Goodman, 1998)
Agudo Crnico
Elevado
Microbiolgicos Micotoxinas
Ficotoxinas Contaminantes antropognicos
Algumas fitotoxinas Algumas fitotoxinas
Micotoxinas Dietas desiquilibradas
Contaminantes antropognicos Ficotoxinas
Aditivos alimentares Microbiolgicos
Resduos de pesticidas Aditivos alimentares
Resduos de pesticidas
Baixo
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
o Inverno, a Aleukia Txica Alimentar (ATA). Os gros colhidos na primavera eram txicos,
ao contrrio dos colhidos no Outono. Mas a histria conturbada de guerras da Rssia nem
sempre permitiu a existncia de mo-de-obra para a colheita dos campos, o que se veio a
verificar mais uma vez na segunda guerra mundial e nos anos que a seguiram. Entre 1942-
1947, verificaram-se violentos surtos de ATA, levando morte milhares de pessoas.
No Japo, uma doena afligia os consumidores de arroz contaminado com fungos,
conhecida desde o sculo XIX: o beri-beri cardaco. Sakaki conduziu estudos pioneiros em
1891 e estabeleceu a etiologia da doena. Ao administrar arroz com bolor a coelhos, verificou
que este tinha efeitos neurotxicos. O problema continuou a ser investigado nos anos
seguintes, e culminou na descoberta da presena de fungos txicos no arroz, Penicillium
citreonigrum. O metabolito txico responsvel pela doena foi isolado em 1947 por Hirata
(Subramanian, 1983).
Poucos esforos foram feitos antes dos anos 60 do sculo XX para reunir a informao
dispersa sobre os registos de envenenamento em animais e humanos por fungos. Em 1933,
Steyn faz uma introduo ao tema da implicao dos fungos na sade humana e animal,
atravs de experincias dos efeitos da ingesto de alimentos contaminados com bolores em
animais. Em 1954, o russo Sarkisov faz uma reviso sobre as micotoxicoses na USSR,
descrevendo as toxicoses e os fungos causadores, entre as quais faz vrias referncias ATA
(Ainsworth & Austwick, 1959). Mas o termo micotoxicose, donde deriva o termo micotoxina,
foi popularizado por Forgacs e Carll (1955), sendo sinnimo de doena causada por toxinas
produzidas por fungos.
A associao da doena com o alimento contaminado era feita atravs da administrao de
doses orais conhecidas do alimento suspeito a animais, bem como testes dermatolgicos
usando extractos. Adicionalmente, era necessrio isolar e identificar os bolores presentes no
alimento e testar individualmente cada espcie por administrao oral e testes dermatolgicos
usando extractos do miclio em cultura pura e no substracto em que o fungo foi detectado. Os
investigadores verificaram que existiam estirpes toxignicas e estirpes atoxignicas. Mas
salvo raras excepes, as toxinas envolvidas no foram quimicamente identificadas.
Foi no incio dos anos 60, com a doena X dos pers, que se atrau a ateno para as
micotoxinas e as suas implicaes na sade humana e animal, impulsionando
verdadeiramente a micotoxicologia. A doena X dos pers vitimou milhares de pers na
Inglaterra, e foi assim designada pois a causa da morte dos animais era desconhecida.
Esforos de investigao mostraram que a morte se deveu ingesto de raes contaminadas
com um metabolito txico produzido por um fungo, Aspergillus flavus. O composto qumico
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4000
3500
Artigos cientficos publicados
3000
Patulina
2500
2000 Toxinas de
Fusarium
1500
Ocratoxinas
1000
500 Aflatoxinas
0
al
56
60
65
70
75
80
85
90
5
00 199
tu
19
19
19
19
19
19
19
19
ac
a
20
Figura 1.1. Nmero de artigos publicados entre 1956 at finais de 2004 em perodos de 4 anos sobre as
micotoxinas mais investigadas devolvidos pelo motor de busca Scirus1: aflatoxinas, ocratoxinas, patulina e
toxinas de Fusarium (deoxinivalenol, fumonisinas, zearalenona e toxina T-2)
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URL: http://www.scirus.com (acedido em 12/12/2004)
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causa etiolgica da Nefropatia Endmica dos Balcs (BEN), uma doena crnica renal de
longa latncia.
A OTA foi uma das primeiras micotoxinas a ser descoberta aps as aflatoxinas. Foi
isolada e identificada a partir duma cultura de Aspergillus ochraceus por van der Merwe
(1965). Os principais efeitos txicos observados foram danos no fgado e nos rins. Em 1973, a
presena de OTA e de outra micotoxina, a citrinina, foi associada com a nefropata suna
(Krogh et al. 1973). Estudos subsequentes parecem apoiar esta suposio, e ligam a OTA
etiologia da micotoxicose suna mais fortemente, quando se observa que possvel induzir a
doena experimentalmente por administrao de raes contaminadas com a micotoxina a
porcos e outros animais (Krogh, et al., 1974; 1976). Adicionalmente, a presena de OTA foi
detectada a ocorrer naturalmente em cereais e em rins de animais com nefropatia,
aparentemente confirmando a OTA como substncia causadora da doena (Krogh, 1977).
A micotoxina foi implicada numa nefropatia humana de etiologia desconhecida, cujos
sintomas e leses renais observados eram semelhantes nefropatia suna, a BEN (Elling &
Krogh, 1977). A associao da micotoxina doena foi feita devido semelhana da
patologia e ao facto de se terem encontrado nveis de OTA mais elevados nos alimentos de
habitantes na rea onde a doena era endmica comparativamente aos locais onde a doena
era ausente (Pavlovic et al., 1979). Rastreios ao sangue de pessoas de reas afectadas e no
afectadas pareciam indicar que a OTA era mais frequentemente detectada e regra geral, em
nveis mais elevados, no sangue de pacientes afectados (Petkova-Bocharova et al., 1988). Mas
os resultados eram contraditrios entre investigadores, e a ligao entre as toxinas fngicas e a
BEN puramente circunstancial e inconclusiva. Mais de 20 anos depois da suposio de que a
OTA poderia estar envolvida na etiologia da BEN, a etiologia da doena continuava
desconhecida (Bozic et al., 1995; Tatu et al., 1998). A doena foi associada a tumores nos rins
e uretra, verificando-se que o problema da BEN era no s renal, mas tambm oncolgico.
Apesar de parecer evidente que a doena era causada por factores ambientais, outras possveis
causas para a doena foram investigadas, em particular a presena de hidrocarbonetos
aromticos policclicos na gua, bem como outros compostos txicos derivados de minas de
carvo, como as lenhites do Plioceno (Orem et al., 1999). Esta ltima hiptese parecia muito
promissora, visto que se conseguiu estabelecer uma forte ligao entre a distribuio
geogrfica da BEN e a presena de compostos aromticos txicos na gua de poos. No
entanto, a controvrsia ainda parece estar longe de terminar. Poucos anos depois, foi
publicado um estudo em que se tambm se detectou uma associao entre a incidncia de
OTA em cereais e a distribuio geogrfica da BEN (Puntaric et al., 2001). Para uma reviso
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Comunicao de risco
Comparao
Interaco
Estabelecimento de prioridades
Educao
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
factores, como processamento dos alimentos tanto pela indstria como em casa. A exposio
varia com a idade, com as crianas, regra geral, mais expostas a certos alimentos como o leite.
Estudos da exposio podem ser conduzidos avaliando os nveis de micotoxinas presentes no
sangue ou outros fluidos da populao.
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Moy (1998) reviu os esforos internacionais para avaliar e reduzir os riscos humanos por
consumo de micotoxinas. Em 1963, a FAO e WHO estabeleceram a Comisso Codex
Alimentarius, um organismo intergovernamental cujo propsito proteger a sade dos
consumidores e assegurar boas prticas no mercado alimentar. O Codex composto
actualmente por mais de 150 pases membros, e tem desenvolvido directivas e outras
recomendaes cujo propsito facilitar o comrcio internacional de alimentos. Com o
estabelecimento da Organizao Mundial de Comrcio (OMC) em 1995, os textos adoptados
pelo Codex so vistos como representativos do consenso internacional quanto aos requisitos
de sade e segurana dos alimentos. Os textos adoptados pelo Codex permanecem voluntrios
at serem aceites ou usados pelos pases, mas os acordos implementados pela OMC
providenciam uma forma para a adopo colectiva de normas, directivas e recomendaes do
Codex por todos os pases membros da OMC.
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Tabela 1.2. Alimentos destinados alimentao humana em que foram detectadas micotoxinas e seus efeitos
txicos (adaptado de CAST, 2003)
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Tabela 1.2. Alimentos destinados alimentao humana em que foram detectadas micotoxinas e seus efeitos
txicos (adaptado de CAST, 2003) (continuao)
Tabela 1.2. Reviso dos alimentos onde foi detectada a presena de OTA desde 2000 at ao momento da escrita
da dissertao
Produto alimentar Referncia
Alcauz Majerus et al., 2000
Azeite Miraglia & Brera, 2002; Papachristou & Markaki,
2004
Cacau, Chocolate Miraglia & Brera, 2002; Bonvehi, 2004; Tafuri et
al., 2004
Caf vd Stegen et al., 1997; Leoni et al., 2000; Romani et
al., 2000; Otteneder & Majerus, 2001; Varga et al.,
2001; Fazekas et al., 2002; Lombaert et al., 2002;
Miraglia & Brera, 2002; Pardo et al., 2004
Cereais e seus derivados Campbell et al., 2000; Varga et al., 2001; Beretta et
al., 2002; Czerwiecki et al., 2002; Fazekas et al.,
2002; Jorgensen & Jacobsen, 2002; Miraglia &
Brera, 2002; Palermo et al., 2002; Blesa et al.,
2004a; Aragus et al., no prelo; Molini et al., no
prelo
Cerveja Visconti et al., 2000; Soleas et al., 2001; Miraglia &
Brera, 2002; Odhav & Naicker, 2002; Tangni et al.,
2002; Aragus et al. (no prelo);
Derivados de carne (fiambre, fumados) Chiavaro et al., 2002; Miraglia & Brera, 2002
Especiarias Vrabcheva, 2000; Miraglia & Brera, 2002
Figos e frutos secos Miraglia & Brera, 2002; MacDonald et al., 2003
Milho Machinski et al., 2001; Puntaric et al., 2001
Outros Miraglia & Brera, 2002
Tecidos porcinos Dragacci et al., 1999; Jorgensen & Petersen, 2002;
Miraglia & Brera, 2002
Uvas e produtos derivados V. captulo 2, Tabelas 2.2 e 2.3
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
estabelecidas doses mximas, e a sua exposio deve ser reduzida ao mnimo possvel (OMS,
1998).
A IARC realizou numerosos estudos para estabelecer a carcinogenicidade de vrias
micotoxinas. Segundo a IARC, as micotoxinas so classificadas como carcinognicas para
humanos (grupo 1), possveis carcinognicas para humanos (grupo 2B), no classificveis
quando carcinogenicidade em humanos (grupo 3).
A nvel internacional, foi criado um programa de monitorizao de qumicos em
alimentos, para contribuir para o estabelecimento da exposio, designado de GEMS/Food.
Este programa, que engloba cerca de 70 pases, tem como objectivos informar os governos, a
Comisso Codex Alimentarius e outras instituies relevantes, bem como o pblico, quanto
aos nveis de contaminantes presentes nos alimentos, a sua contribuio para a exposio
humana total, e a sua significncia em termos de sade pblica e mercados. As micotoxinas
monitorizadas pelo GEMS/Food so aflatoxinas, OTA, DON, patulina e fumonisinas, em
diversos produtos alimentares (OMS, 2001). Periodicamente a base de dados da GEMS/food
avaliada, para estabelecer nveis e tendncias na contaminao dos alimentos.
Quando o risco est suficientemente bem caracterizado, podem ser consideradas vrias
opes de controlo. No entanto, como foi referido na seco 1.2, as decises de gesto de
risco devem incluir consideraes econmicas, sociais e polticas (factores de no-risco). Se o
contaminante for relevante no mercado internacional alimentar, as opes de gesto de risco
podem ser consideradas pelo Comit do Codex em Aditivos e Contaminantes Alimentares
(CCFAC) para elaborao no sistema do Codex. O CCFAC tenta desenvolver limites
mximos (MLs) de micotoxinas em certos alimentos. O sucesso desta iniciativa no caso da
aflatoxina foi limitado, visto que os pases adoptaram diferentes nveis nos alimentos. Na
ausncia de dados de confiana e consenso cientfico, h desacordos frequentes entre os
pases importadores e exportadores quanto ao estabelecimento de nveis regulatrios com base
na sua percepo de que nveis so conseguidos por boas prticas agrcolas e de fabrico. Por
isso, os governos nacionais estabeleceram nveis muito diferentes para as aflatoxinas. O
cumprimento destas polticas acarreta custos econmicos considerveis. A rejeio de
carregamentos alimentares resulta em custos econmicos significativos, particularmente para
os pases em desenvolvimento. Alm disso, os governos nacionais e organizaes
internacionais devotam recursos considerveis quanto aos mtodos de preveno, reduo ou
eliminao das micotoxinas dos alimentos.
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Cerca de 100 pases possuem legislao sobre uma ou mais micotoxinas em diversos
alimentos (FAO, 2004). A tomada de deciso sobre que micotoxinas regulamentar, em que
produtos e em que nveis complexa. Na maior parte dos pases, as regulamentaes sobre
micotoxinas no foram baseadas em estabelecimentos de risco slidos. O estabelecimento de
limites por parte dum pas influenciado por diversos factores, como os mtodos analticos
disponveis para o controlo legal, os dados sobre toxicologia e ocorrncia da micotoxina em
alimentos usados no estabelecimento de risco, bem como a existncia de legislao noutros
pases com que existam trocas comerciais. A falta duma abordagem unificada entre pases
resultou numa grande variedade de recomendaes e regulamentaes no que diz respeito s
micotoxinas. Vrios factores dificultam uma abordagem comum. Um destes factores diz
respeito a conflitos entre interesses nacionais e comerciais. Os interesses dos pases
produtores no coincidem necessariamente com os dos importadores e a presena de
micotoxinas em alimentos pode levar a barreiras comerciais a menos que todas as partes
concordem em definir nveis seguros de micotoxinas e respeitar os seus prprios interesses.
Em geral, os pases produtores tm limites mais elevados para as micotoxinas nos produtos
que os pases importadores. Outros factores impeditivos dizem respeito diferente
interpretao e anlise dos dados usados no estabelecimento de risco consoante os pases, bem
como diferenas nos padres alimentares (Moy, 1998).
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Armazenamento/
Transporte
Processamento
Consumo animal
Consumo
humano
Figura 1.3. Diagrama representativo das fases de produo de alimentos at consumo humano
Os fungos toxignicos podem estar presentes nas vrias etapas da produo dos alimentos
at que chegam nossa mesa: durante o cultivo, colheita, armazenamento, transporte e
processamento. No possvel descrever um nico conjunto de condies que favorecem o
crescimento e produo de micotoxinas por fungos, porque os fungos micotoxignicos
diferem nas suas caractersticas ecolgicas, bioqumicas e nichos ecolgicos (captulo 3).
Como tal, difcil generalizar sobre estratgias de controlo, dada a diversidade de fungos
produtores de micotoxinas em diversas culturas antes e depois da colheita. Mas a
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
compreenso dos factores relevantes para a produo de micotoxinas por um dado fungo
numa dada comodidade agrcola permitem a definio de estratgias para combater o
problema. Os factores envolvidos na produo de micotoxinas em campo, isto , pr-colheita,
so distintos dos envolvidos no perodo ps-colheita, e so apresentados nas seces
seguintes. Grande parte do conhecimento que se tem sobre o fenmeno da contaminao de
culturas e alimentos com micotoxinas advm dos cereais. As micotoxinas mais estudadas
nestas matrizes foram as aflatoxinas, e mais recentemente, as toxinas de Fusarium. Por isso, a
maior parte das referncias citadas dizem respeito contaminao destas culturas com as
micotoxinas referidas. Apesar de se separarem ecologicamente os fenmenos de
contaminao pr e ps colheita, a produo de micotoxinas em alimentos frequentemente
um processo aditivo, que se inicia no campo e aumenta durante a colheita, armazenamento ou
processamento.
2.1. Pr-colheita
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
Estirpes Factores
toxignicas ambientais
Cultura
susceptvel
Figura 1.4. As 3 componentes necessrias para haver produo de micotoxinas em alimentos: presena de
estirpes toxignicas, cultura susceptvel e factores ambientais favorveis infeco do fungo e produo da
micotoxina na cultura/alimento (M = micotoxinas)
Nem todas as estirpes duma dada espcie so capazes de produzir micotoxinas. No caso
da espcie produtora de aflatoxinas, A. flavus, as estirpes no toxignicas so mais frequentes
que as toxignicas. Em termos de gentica populacional, as estirpes no toxignicas, mais
abundantemente distribudas, podem ser vistas como o tipo selvagem (wild-type), e as
toxignicas, mais restritas na sua distribuio, o tipo mutante. Alguns cientistas acreditam que
a produo de micotoxinas traz alguma vantagem s estirpes produtoras, defendendo-se com a
afirmao de Ernst Mayr de que nature does not believe in extravagance (Bilgrami &
Sinha, 1992). Lillehoj defende que as intensivas prticas agrcolas so responsveis pela
criao de agroeconichos nicos que sob certas condies seleccionam fungos produtores de
micotoxinas por mecanismos desconhecidos. O investigador pensa que as micotoxinas
funcionam como sinais qumicos entre as espcies num nicho ecolgico e podem
desempenhar uma funo no estabelecimento das espcies num dado nicho (Lillehoj, 1992).
O inculo de fungos micotoxignicos pode advir do ar, solo, vegetao em decomposio,
plantas infectadas ou insectos, entre outros. Em condies favorveis, estes fungos competem
com outros organismos do solo e produzem inculos abundantes (Payne, 1998). Os nveis de
inculo variam consoante os anos e os locais.
A presena de estirpes micotoxignicas um dos pr-requisitos para que haja produo de
micotoxinas em comodidades agrcolas, mas no implica a sua produo. Para produzir
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
micotoxinas numa dada planta, o fungo toxignico tem de ser capaz de colonizar e infectar a
planta bem como produzir a micotoxina nos tecidos do hospedeiro.
Na viso de Payne (1998), por colonizao entende-se o crescimento de fungos na
superfcie da planta, enquanto que por infeco entende-se uma relao mais ntima com o
hospedeiro, em que o fungo invade os tecidos da planta e obtm nutrientes de clulas vivas.
No entanto, o conceito de colonizao usado ao longo desta dissertao num sentido mais
abrangente: por colonizao entende-se a presena de propgulos fngicos na superfcie da
planta.
A capacidade de infeco da cultura depende por sua vez da patogenicidade da estirpe,
susceptibilidade da cultura, e de factores ambientais. Existem fungos micotoxignicos (v.g.,
espcies de Fusarium) que so patognicos para plantas, mas em geral, os fungos
micotoxignicos no so patognios agressivos, mas sim essencialmente saprfitas ou
parasitas oportunistas (v.g., espcies de Aspergillus e Penicillium), capazes de infectar as
culturas atravs de danos e injrias fsicas. Existem nas plantas vias naturais de entrada que
apresentam pouca obstruo fsica, que podem ser exploradas por estes fungos (Smart et al.,
1990). Como estes fungos tm capacidades parasticas limitadas, vrias condies ambientais
tm de ocorrer para que se d a infeco e a sntese de micotoxinas.
Aps a infeco, o fungo produz a micotoxina cumulativamente, at que o substrato seja
esgotado, o fungo morto ou que se estabeleam condies permanentemente desfavorveis
para a sntese de micotoxinas. A micotoxina, se no for degradada entretanto, permanece no
alimento at s fases finais da produo.
A planta cultivada tem de ser compatvel com o fungo toxignico presente para haver
produo de micotoxinas, isto , como foi referido na seco anterior, tem de ser possvel a
infeco e a produo de micotoxinas pelo fungo nos tecidos da planta.
Ao longo do seu ciclo de vida, a planta apresenta susceptibilidade diferente a fungos.
Por isso, factores relacionados com a colheita so essenciais no estabelecimento da infeco.
Regra geral, quanto mais tarde for feita a colheita, mais tempo existe para haver formao de
micotoxinas no campo e mais susceptvel a cultura se torna. No momento da colheita,
infligem-se danos s culturas, podendo-se abrir vias de entrada para fungos micotoxignicos.
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
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2.2. Ps-colheita
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OTA durante o fabrico de pekmez disso exemplo. O pekmez uma bebida turca feita de
sumo de uva concentrado e fervido. Verificou-se que a concentrao de OTA no pekmez era 5
a 6 vezes maior que o detectado nas uvas (Arici et al., 2004).
possvel que a produo de micotoxinas se d durante o processamento dos alimentos.
Bailly e colaboradores (2002) verificaram que durante o fabrico de queijo h potencial para a
produo de micotoxinas. Mas a produo de micotoxinas durante o processamento alimentar
no referida habitualmente.
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Figura 1.5. Distribuio e teor de aflatoxina em gros de milho numa espiga (adaptado de Cotty et al., 1994).
Clulas brancas = no infectadas, aflatoxina no detectada; Clulas amarelas = infectadas, aflatoxina no
detectada; clulas cinzentas = concentaes de aflatoxina de 0,1 2,5 g/kg; clulas negras = mais de 2,5 g/kg
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Tabela 1.5. Principais espcies produtoras de OTA isoladas de alimentos onde foi detectada a presena da
micotoxina
J foi referido em seces anteriores que a produo de micotoxinas pelos fungos depende
de factores ambientais e da cultura em causa, particularmente do seu estado de
susceptibilidade. Em campo, o estado da cultura apontado por Pitt e Hocking (1997) como o
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
principal factor que governa a ecologia da biodeteriorao dos alimentos por fungos. O estudo
da produo de micotoxinas em tecidos vivos das plantas mais um ramo da patologia
vegetal que da microbiologia alimentar. No entanto, em tecidos moribundos, dormentes, ou
mortos, os factores que governam a biodeteriorao e a produo de micotoxinas so fsicos e
qumicos. Segundo os autores citados, h 8 factores principais: 1) actividade de gua; 2); pH;
3) temperatura; 4) tenso de O2 e CO2, 5) consistncia, 6) composio nutricional do
substrato; 7) solutos especficos; 8) conservantes.
A maioria dos fungos pouco afectada pelo pH numa larga gama de valores, tipicamente
entre 3 a 8. O pH um factor importante em termos competitivos a elevadas actividades de
gua, onde a biodeteriorao por bactrias provvel. Mas abaixo de pH 5, o crescimento de
bactrias menos provvel. A tenso de O2 e CO2 importante para os fungos visto que so
organismos aerbicos. A sensibilidade das espcies a estes parmetros tem particular
importncia durante o processamento de alguns alimentos, como queijos, e no embalamento
de alimentos. A consistncia do alimento importante quanto ao tipo de fungos filamentosos
mais provveis de causar estragos: duma forma geral, as leveduras causam mais estragos em
produtos lquidos, visto que o ambiente mais favorvel disperso de organismos
unicelulares, e os fungos filamentosos causam mais frequentemente estragos em substratos
slidos, onde tm acesso fcil ao oxignio. Quanto composio nutricional do substrato, a
sua importncia em termos de produo de micotoxinas j foi realado previamente neste
captulo. A presena de certos solutos pode ser importante para o crescimento de alguns
fungos, nomeadamente glucose, glicerol, cloreto de magnsio e cloreto de sdio, mas este
factor parece ter pouca importncia para as espcies anamrficas de Aspergillus e Penicillium.
No caso de resistncia a conservantes, em particular cidos fracos, verificou-se diferenas na
resistncia das espcies, mas obviamente que este aspecto s tem interesse quando se usam
conservantes alimentares. Indubitavelmente, dois dos aspectos considerados mais importantes
e estudados mais frequentemente quanto aos requisitos ecofisiolgicos para o crescimento de
fungos filamentosos e produo de micotoxinas so a actividade de gua e a temperatura.
Quanto actividade de gua, os fungos produtores de micotoxinas so divididos em
fungos de campo e fungos de armazenamento. Os fungos de campo s conseguem crescer
com actividades de gua elevadas (acima de 0,90 aw), e so relevantes antes da colheita, como
o caso dos Fusarium. Os fungos de armazenamento so fungos com capacidade de crescer
com baixas actividades de gua, e so relevantes em condies de armazenamento de
comodidades agrcolas secas, como cereais. nesta ltima categoria que se inserem
tipicamente Aspergillus e Penicillium, apesar dos fungos de armazenamento tambm estarem
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CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
presentes no campo, onde podem infectar as colheitas (v.g., Aspergillus flavus) e produzir a
micotoxina.
As espcies do gnero Aspergillus so na maioria saprfitas ou patognicos oportunistas
de plantas, capazes de crescer at baixas actividades de gua e com temperaturas elevadas,
dominando ambientes quentes e/ou secos. O teleomorfo Eurotium consegue crescer at 0,70
de aw (Figura 1.6). Adicionalmente, algumas espcies de Aspergillus so termfilas, capazes
de crescer at temperaturas mximas de 55 C (v.g., A. fumigatus). A distribuio de
Aspergillus nos solos mais abundante entre latitudes as 26 e 35 em ambos hemisfrios, e
menos abundantes entre 35 e 45 (Klich et al., 1992). So mais frequentes em climas
tropicais que em climas temperados e nos trpicos que dominam a micoflora dos alimentos
e que so responsveis pela produo de micotoxinas em diversas comodidades agrcolas,
como cereais, amendoins, cacau, caf. As espcies de Aspergillus regra geral crescem mais
rpido que os Penicillium, apesar de tardarem mais a esporular. Os seus esporos so
resistentes radiao solar e a agentes qumicos (Pitt & Hocking, 1997).
O gnero Penicillium dos 3 gneros indicados o mais diverso, em termos de nmero de
espcies e diversidade de habitats. So espcies pouco exigentes nutricionalmente, capazes de
crescer em qualquer ambiente com uma fonte de sais minerais e qualquer fonte de carbono
excepto as mais complexas, numa gama vasta de condies fsico-qumicas (v.g. aw,
temperatura, pH e potencial redox). A maioria das espcies descritas tem o seu habitat
primordial no solo e so consideradas saprfitas ubquos. Christensen e colaboradores (2000)
verificaram numa reviso a 74 rastreios de solo publicados que os Penicillium esto entre os
principais constituintes da micoflora, e que ao invs dos Aspergillus, so proeminentes numa
gama de amplitudes muito alargada (entre 3 e 71). No entanto, o gnero Penicillium tambm
compreende algumas espcies patognicas de frutos (v.g., P. digitatum, P. expansum, P.
italicum). Muitas espcies so psicrfilas, capazes de crescer a temperaturas abaixo de 0 C,
mas algumas espcies so capazes de crescer at 40 C (Pitt & Hocking, ob. cit.). Regra geral,
crescem num regime mais estreito de actividades de gua, apesar de existirem algumas
espcies xerfilas, como o caso notvel de P. brevicompactum, capaz de crescer abaixo de
0,80 aw. Os Penicillium dominam a micoflora micotoxignica dos climas temperados, onde
so responsveis pela produo de micotoxinas essencialmente em cereais e derivados de
carne.
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Figura 1.6. Fungos e actinomicetes proeminentes e suas capacidades de crescer a diversas actividades de gua e
temperaturas. T. crust. = Thermoascus crustaceus; Sam. = Saccharomonospora; Stm. = Streptomyces (adaptado
de Lacey et al., 1991 por Kozakiewicz, com permisso da autora)
Regra geral, verifica-se que os limites ecofisiolgicos duma espcie para produzir
micotoxinas so mais estreitos que para crescer num dado produto (Frisvad & Samson, 1991).
Prova desta afirmao so os estudos recentemente publicados quanto aos requisitos de aw e
temperatura para a produo de OTA por estirpes toxignicas de Aspergillus seco Nigri em
uvas (Esteban et al., 2004; Mitchell et al., 2004). Uma vez estabelecidos estes limites,
possvel construir modelos preditivos de risco de produo da micotoxina.
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deste filo exibem normalmente em cultura estruturas de reproduo sexuada. Os fungos cujo
estado de reproduo sexual no conhecido designam-se de fungos imperfeitos, ou
deuteromycetes. Aspergillus, Fusarium e Penicillium pertencem a este grupo.
Os deuteromycetes reproduzem-se assexualmente por estruturas de reproduo
especializadas designadas de conidia (sing. conidium), que so esporos mitticos que se
formam em estruturas de reproduo especializadas, designadas de conidiforos. Os
deuteromycetes no existem como grupo taxinmico, e no representam nenhum
agrupamento natural. Este agrupamento foi abandonado a favor de alternativas menos
artificiais, com base nos parceiros mais prximos que apresentam reproduo sexuada. O
reconhecimento dos deuteromycetes como um grupo artificial justifica abordagens
taxinmicas puramente pragmticas.
A taxinomia dos gneros deste grupo, em particular de Aspergillus, Fusarium e
Penicillium, complexa devido aos problemas apontados em seguida, apesar de se terem feito
grandes esforos para a sua resoluo.
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simples e imutvel. O conceito de espcie deve, pois, reflectir as necessidades prticas, bem
como ser intelectualmente satisfatria. Novas abordagens taxinomia destes gneros
resolveram alguns dos problemas apontados. A variabilidade morfolgica das estirpes foi
reduzida com a concepo de meios de cultura e condies de incubao padronizados. No
caso dos Fusarium, recomenda-se inclusive que as culturas sejam feitas a partir de um esporo
(Nelson et al., 1983). Fizeram-se esforos para reduzir a subjectividade do taxinomista na
observao das caractersticas morfolgicas com programas de anlise de imagem (Dorge et
al., 2000) e atravs de ensaios interlaboratoriais entre peritos (Frisvad et al., 2000). A
influncia de parmetros fisiolgicos como a temperatura e a actividade de gua foi includa
por Pitt na classificao e identificao de Penicillium (Pitt, 1979). Para as espcies
produtoras de micotoxinas mais relevantes, foram desenvolvidos meios de cultura selectivos,
como o caso do meio agarizado para Aspergillus flavus e A. parasiticus (AFPA), destinado
identificao das principais espcies produtoras de aflatoxina (Samson, 1991). Enfatizou-se a
necessidade de se identificarem as estirpes quando isoladas dos alimentos, para reduzir as
alteraes em cultura. Desenvolveram-se e aplicaram-se novas ferramentas e mtodos da
quimiotaxonomia a estes grupos de fungos. Estudos de ADN, ARN, protenas e
particularmente metabolitos secundrios, permitiram compreender as relaes filogenticas
entre gneros, subgneros e espcies definidas morfologicamente e clarificar a taxinomia,
sendo uma ferramenta valiosa na criao de novos taxa. Os dados resultantes destas
ferramentas podem ser complexos, mas tcnicas estatsticas multivariadas facilitam a anlise
destes dados (Frisvad et al., 1998).
Para Aspergillus e Penicillium, foram publicados manuais de identificao claros e
concisos, que enfatizam as principais caractersticas de cada espcie e as suas afinidades com
outros taxa. As espcies descritas nos manuais de referncia de Aspergillus (Raper & Fennell,
1965) e Penicillium (Raper & Thom, 1949) consideradas vlidas foram tipificadas (espcies
de Aspergillus por Samson & Gams, 1985; espcies de Penicillium por Pitt, 1979), e a
tipificao subsequente de espcies novas foi levada mais a srio pelos taxinomistas. Os
problemas nomenclaturais de Aspergillus foram solucionados. Subramanian e Malloch e Cain
providenciaram nomes para os teleomorfos de Aspergillus (Pitt & Hocking, ob. cit.), e Gams
et al. (1985) desenvolveram uma classificao nova de Aspergillus baseada em subgneros e
seces que substituiu o termo incorrecto grupo, e foi elaborado um novo manual de
Aspergillus onde se incorporaram os avanos desde 1965 (Klich & Pitt, 1988).
A existncia de novas ferramentas e a necessidade de estabilidade na taxinomia destes
gneros levou criao de comisses de peritos em sistemtica de Aspergillus e Penicillium e
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Figura 1.7. Conidiforo de Aspergillus bisseriado (A. ochraceus) e terminologia das estruturas usadas na
classificao e identificao. O conidiforo constitudo pelo aspergillum (designao que se d parte superior
da estrutura, ou seja, o conjunto da vescula e das clulas reprodutivas especializadas que contm) e pelo estipe.
So visveis nas figuras as mtulas (clulas estreis), filides (clulas conidiognicas) e conidia (esporos
assexuais) (barra de escala = 10 m)
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Figura 1.8. Outras estruturas de Aspergillus. Em cima, esquerda: esclercios negros de A. alliaceus; em cima,
direita: clulas de Hulle de Emericella sp. (setas); em baixo, esquerda: cleistotcios de Eurotium vistos ao
estereomicroscpio (estruturas de cor amarela); em baixo, direita: preparao microscpica de Eurotium, em
que so visveis um conidiforo de Aspergillus, o cleistotcio, ascos e ascsporos soltos
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Figura 1.9. Conidiforos de Penicillium com penicilli do tipo mais simples (penicillus monoverticilado
vesiculado de P. glabrum, direita) e complexo (penicillus terverticilado de estipe liso de P. brevicompactum,
esquerda) (barra de escala = 10 m)
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direita. O penicillus diz-se biverticilado se tem apenas mtulas, e terverticilado se tem mtulas
e ramos. Quando existem ramulos, o penicillus designa-se quaterverticilado.
A classificao e identificao das espcies baseiam-se em caracteres microscpicos e
culturais. Nos caracteres microscpicos, alm do tipo de penicilli, so importantes a forma e
tamanho das filides, em particular das collulae, a forma, tamanho cor e ornamentao dos
condios, e a textura do estipe, ramos e mtulas (que pode ser lisa ou rugosa). Existem dois
tipos de filides: ampuliformes e acerosas. As ampuliformes so semelhantes a garrafas
(Figura 1.9) e as acerosas so semelhantes a agulhas de pinheiro, com lados paralelos que
convergem numa forma cnica para um orifcio estreito. As filides acerosas so
caractersticas do subgnero Biverticillium. As restantes espcies tm regra geral filides
ampuliformes. Nos caracteres culturais, so importantes o tamanho das colnias, a textura,
cor, presena de exudado, pigmento solvel, e presena, tamanho e cor de esclercios.
As espcies capazes de reproduo sexuada, envolvem a formao de cleistotcios ou
gimnotcios.
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A distino entre subgneros e seces nem sempre fcil, visto que ocasionalmente, uma
estirpe pode apresentar penicilli de tipos diversos, como mono e biverticilados, ou
biverticilados e terverticilados. Por isso, a classificao apresentada na tabela diz respeito aos
penicilli predominantes na seco.
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ser produzidos esporos em grande nmero, que causam aumentos na contagem de clulas
viveis, mas no na biomassa (Pitt & Hocking, 1997). A biomassa pode ser quantificada mais
exactamente com recurso a diversas tcnicas, como ergosterol (Saxena et al., 2001) e PCR em
tempo real (Filion et al., 2003).
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5.2.1. Amostragem
A amostra teste deve ser homogeneizada num moinho ou misturadora. Quanto menor o
tamanho das partculas, mais homogeneizada estar a amostra. No caso de alimentos slidos,
aps reduo do tamanho das partculas em moinhos, faz-se uma pasta semi-slida numa
misturadora, com gua ou outro solvente. Depois, retira-se uma sub amostra, onde se faz a
anlise da micotoxina.
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Limpeza. A limpeza da amostra feita aps a extraco, para remover do extracto lquido
impurezas antes do passo determinativo ou quantificativo. A limpeza consiste em isolar a
micotoxina do extracto, e pode servir para concentrar a micotoxina. Este passo no
requerido em todos os procedimentos analticos (v.g., ELISA), mas na maioria dos
procedimentos de rastreio e confirmatrios necessrio, para adquirir a selectividade e
sensibilidade desejada. Geralmente, a limpeza de extractos faz-se recorrendo a colunas de
extraco em fase slida (SPE). O enchimento das colunas SPE normalmente de slica
porosa, cuja superfcie foi modificada para permitir uma adsoro selectiva do analito ou das
impurezas. Quando se passa o extracto lquido, se o analito retido, as impurezas so
lexiviadas. Retira-se selectivamente o analito por modificao da soluo de lavagem. Se a
coluna retm as impurezas, o analito permanece no extracto lquido, e no necessrio um
segundo solvente.
As colunas de imunoafinidade (IAC) so uma forma de colunas SPE. Neste caso, esto
ligados anticorpos para o analito num material inerte. Os anticorpos so altamente especficos,
e as impurezas passam. O analito depois removido da coluna com um solvente que
desnatura o anticorpo. Existem colunas de imunoafinidade disponveis para aflatoxinas, OTA,
fumonisinas, zearelanona e DON. Por vezes, interaces no especficas entre componentes
da matriz e o material de enchimento podem afectar o processo de limpeza, mas em geral, as
IACs so muito eficientes a remover impurezas. Como so os anticorpos que determinam a
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Um resultado para ser dado como vlido tem de satisfazer os requisitos de qualidade que
lhe sejam exigidos (Comisso Tcnica RELACRE CTR03, 1996)
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comparada com outro mtodo validado ou com MRC. Recomenda-se ainda que os estudos de
validao sejam feitos em nveis prximos dos regulamentados pela UE.
A UE definiu critrios especficos de desempenho para os mtodos de anlise
destinados ao controlo oficial de micotoxinas. Regra geral, os mtodos devem ter uma taxa de
recuperao entre 70 a 110% e valores de RSDr e RSDR menor ou igual a 20 e 30%,
respectivamente (Directiva 98/53/CE da Comisso de 16 de Julho de 1998 que fixa os
mtodos de colheita de amostras e os mtodos de anlise para o controlo oficial dos teores de
certos contaminantes nos gneros alimentcios2; Directiva 2002/26/CE da Comisso, de 13 de
Maro de 2002, que fixa os mtodos de colheita de amostras e de anlise para o controlo
oficial do teor de ocratoxina A nos gneros alimentcios3; Directiva 2002/27/CE da Comisso,
de 13 de Maro de 2002, que altera a Directiva 98/53/CE, que fixa os mtodos de colheita de
amostras e os mtodos de anlise para o controlo oficial dos teores de certos contaminantes
nos gneros alimentcios4).
A validao de mtodos analticos para controlo oficial dos nveis de micotoxinas em
alimentos deve ser levada a cabo a um nvel nacional e internacional, de acordo com
protocolos internacionais harmonizados para estudos colaborativos da IUPAC/AOAC/ISO.
Os mtodos validados podem ser adoptados como mtodos oficiais internacionais ou como
normas europeias por organismos como a AOAC internacional ou CEN.
Qualquer mtodo validado e adoptado pela AOAC internacional, CEN ou ISO
reconhecido como um mtodo oficial para os propsitos de comrcio internacional.
2
Disponveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/1998/l_201/l_20119980717pt00930101.pdf
3
Disponveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/2002/l_075/l_07520020316pt00380043.pdf
4
Disponveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/2002/l_075/l_07520020316pt00440045.pdf
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