Mtodo de Feulgen y Rossenberg (1921)

Identificacin de DNA

El fundamento de este mtodo se basa en la identificacin altamente especfica de cidos

nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehdos de la pentosa (azcar). Para
esto se realizan 2 pasos fundamentales:

1) Hidrlisis cida:
Se utiliza para romper los puentes de hidrogeno que unen a la doble hlice, mediante la
desnaturalizacin de la cadena. Para esto se utiliza cido clorhdrico (HCl), que es el componente
reactivo mas critico del mtodo, controlando la concentracin del cido, temperatura y tiempo,
que depende del tipo de tejido (compactacin de cromatina) y fijador empleado.
Durante la hidrlisis cida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde
del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la
posicin 2' de la ribosa, por lo que, este material no reaccin posteriormente con el reactivo de
Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases
pricas (A y G) de los residuos de deoxiribosa (depurinizacin) formando cido apurnico y
generando grupos aldehdo (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base
nitrogenada.

Fenomenos moleculares de la exposicion del DNA a la Hidrlisis Acida

Este es un paso crtico por lo que hay que tener en cuenta las variables de tiempo de exposicin a
la hidrlisis acida, pH ([ H+]) al que se lleve a cabo la reaccin, temperatura, el fijador utilizado en
el tejido y el grado de compactacin de la cromatina que depende de la naturaleza del tejido.
2) Tincin con Reactivo de Schiff:
Los grupos aldehdos liberados por la hidrlisis de Feulgen son teidos con reactivo de Schiff.
Cualquier grupo aldehdo libre endgeno y preexistente producido por el fijador (ej.
glutaraldehdo), tejido elstico inmaduro o algunos lpidos son removidos tratando el tejido con
boro hidrato de sodio antes de ser teido.

Los resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teido color fucsia y fondo incoloro, en
el caso de que de que se utilice una coloracin de contraste como el Fast Green FCF el fondo sera
verde.

Curva de Feulguen de Intensidad de Coloracin en un rango de tiempo al tratamiento con

Hidrlisis Acida de las muestras

Para realizar una extraccin qumica de los cidos nucleicos se aplica un tratamiento para remover,
RNA pero no DNA, con una solucin de cido perclrico (HCIO4) al 10% a 4C por toda la noche. La
selectividad de este proceso, de extraccin qumica, se basa en la catlisis por cidos de la
hidrlisis de las uniones entre pentosas y bases, y entre pentosas y cido fosforito. En el caso del
RNA las uniones fosfato-ester son mas lbiles a la hidrlisis que en el DNA, por lo que, se extraen
mas fcilmente y de forma selectiva, mientras simultneamente remueve bases pricas y
pirimidicas del DNA permitiendo ser teidos sus cidos nucleicos posteriormente con reactivo de
Schiff.

Solamente el mtodo de Feulgen puede considerarse estequiomtrico en donde es posible

observar una intensidad de coloracin proporcional a la concentracin de DNA, por lo que es
posible determinar cuantitativamente el DNA presente en el ncleo de las clulas, lo que se aplica
en patologa a la cuantificacin de clulas que contienen cantidades anormales de DNA en tumores
malignos. La hidrlisis cida rompe los puentes de hidrgeno separando las hebras de DNA
produciendo una depurinizacin, por lo tanto, para obtener un mayor nmero de grupos aldehdo
reactivos, identificables con reactivo de Schiff, es necesario realizar una hidrlisis que libere mayor
cantidad de bases pricas.
Ejemplo de Curva de hidrlisis para Feulgen obtenida experimentalmente

Anlisis de la curva de hidrlisis:

*Tiempo 0 min.: la muestra de tejido se encuentra con una intensidad de coloracin
prcticamente nula ya que el DNA no posee una cantidad grupos aldehdos expuestos suficiente
como para reaccionar con reactivo de Schiff, y producir color, porque no fue sometido a un
tratamiento de hidrlisis cida que produzca depurinizacin con una regeneracin de grupos
aldehdos.
*Tiempo 0 a 60 (ascenso): durante los primeros 60 en que el tejido a sido expuesto a la hidrlisis
cida se han ido rompiendo los puentes de hidrogeno, que unen la doble hlice, progresivamente
liberando bases pricas generando grupos aldehdos (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se
encontraba la base nitrogenada. A medida que aumenta el tiempo de hidrlisis se produce, por la
depurinizacin, una mayor cantidad de grupos aldehdos expuestos que por reaccin con el
reactivo de Schiff, generan una coloracin que se va haciendo mas intensa a medida que el tiempo
de exposicin al cido es mayor.
*Tiempo 60 a 90 (meseta): durante estos 30 de hidrlisis cida se han liberado todas las bases
pricas y pirimidicas del tejido sin producir una despolimerizacin del DNA, por lo que, se observa
la mxima intensidad de coloracin, con tonalidad fucsia, de los cidos nucleicos.
*Tiempo 90 a 120 (descenso): durante estos 30, en los que se trabajo, se pudo observar que el
tiempo al que a sido expuesto el tejido al cido clorhdrico a sido excesivo, por lo que, la hidrlisis
cida rompe las uniones tipo ester de la pentosa con los fosfatos en los C3 y C5 de forma
progresiva hasta producir una despolimerizacin del DNA.

Bibliografa: Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third
Edition, 1999.