Transferência de Oxigênio 6

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
ENG07053 - TRABALHO DE DIPLOMAO EM ENGENHARIA QUMICA
E st u d o d a t ra n sfe r n c i a d e
ox i g n i o e m c u l t i v o d e
Bacillus megaterium
Autor: Giulia Carli Lorenzini

Orientadora: Profa. Msc. Dbora Jung Luvizetto Faccin
Co-orientadora: Profa. Dra. Rosane Rech
Porto Alegre, julho de 2012

ii Estudo da transferncia de oxignio em cultivo de Bacillus megaterium
Sumrio
Sumrio ....................................................................................................................... ii
Agradecimentos .......................................................................................................... iii
Resumo ........................................................................................................................iv
Lista de Figuras ............................................................................................................. v
Lista de Tabelas ............................................................................................................vi
Lista de Smbolos ......................................................................................................... vii
Subndices ................................................................................................................. viii
Sobrendices.............................................................................................................. viii
Lista de Abreviaturas e Siglas ........................................................................................ix
1 Introduo .............................................................................................................. 1
1.1 Objetivos .......................................................................................................... 2
1.2 Estrutura .......................................................................................................... 2
2 Reviso Bibliogrfica ............................................................................................... 3
2.1 Breve introduo aos processos biotecnolgicos.............................................. 3
2.2 Polihidroxialcanoatos: biopolmeros................................................................. 3
2.3 Bacillus megaterium ......................................................................................... 5
2.4 Transferncia de massa em biorreatores: transferncia de oxignio ................ 7
2.5 Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) .............................10
2.5.1 Mtodos de determinao do kLa ...........................................................11
2.5.2 Fatores que afetam o kLa em biorreatores ..............................................14
2.5.3 Caminhos metablicos preferenciais em funo do kLa e da OTR ............18
3 Materiais e Mtodos ............................................................................................. 20
3.1 Cultivo de Bacillus megaterium ....................................................................... 20
3.1.1 Ativao celular e inculo .......................................................................20
3.1.2 Meio de cultura ...................................................................................... 21
3.1.3 Biorreator ...............................................................................................22
3.1.4 Esterilizao ............................................................................................23
3.2 Anlises ...........................................................................................................23
3.2.1 Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio.............................23
3.2.2 Concentrao de biomassa .....................................................................26
3.2.3 Anlise estatstica ...................................................................................26
4 Resultados e discusso.......................................................................................... 27
4.1 Crescimento celular e consumo de oxignio ....................................................27
4.2 Balano de massa para o oxignio: perfil de pO2 e OUR ...................................28
4.3 Influncia da biomassa no kLa .........................................................................31
5 Concluses e Trabalhos Futuros ............................................................................ 34
6 Referncias ........................................................................................................... 35
APNDICE A................................................................................................................ 39
APNDICE B ................................................................................................................ 41
ANEXO A .................................................................................................................... 45
DEQUI / UFRGS Giulia Carli Lorenzini iii
Agradecimentos
Por haver sido indescritvel, agradeo sem mais palavras o apoio das minhas
orientadoras Dbora Faccin e Rosane Rech.
Do mesmo modo, agradeo aos meus pais, Roberto e Gisele Lorenzini, e minha
famlia, embora no entre no mrito neste momento agradecer-lhes por tudo que
merecem.
Ao Prof. Marco Antnio Zchia Ayub, do ICTA/UFRGS, pela disponibilizao do

laboratrio, equipamentos e materiais necessrios realizao deste trabalho.
Ao Alan Budaszewski, pelo carinho e pacincia.
Aos amigos engenheiros (ou futuros engenheiros) Joo Pedro Chagas Zanetti, Carlo
Morandi, Alice DAlmeida, Gabriela Stoll, Vanessa Patzer e Mariana Saraiva pelos
momentos de angstia e descontrao e Amanda Manke, pela amizade de hoje e
sempre.
equipe do setor de Processo da Unitec, pelo incentivo, conhecimento transmitido e

compreenso.
Aos meus orientadores como bolsista de iniciao cientfica Ndya Silveira e Maria
Lionzo (Instituto de Qumica/UFRGS) e Oscar Lopez (Departamento de Engenharia
Qumica/UFRGS) e ao CNPq pelas oportunidades de crescimento acadmico.
Ao Programa Santander/UAM, pelo perodo de intercmbio acadmico.
E, finalmente, UFRGS e aos seus professores e funcionrios, que, ao longo deste

perodo, possibilitaram a mim todo esse processo evolutivo.
iv Estudo da transferncia de oxignio em cultivo de Bacillus megaterium
Resumo
O oxignio um gs pouco solvel em gua, o que torna sua transferncia em um
cultivo aerbio um fator crtico a ser considerado. O coeficiente volumtrico de
transferncia de massa (kLa) fundamental na avaliao da eficincia da transferncia de
oxignio e , por esse motivo, um dos critrios mais importantes no dimensionamento e
escalonamento de um biorreator aerbio. Esse parmetro afetado por diversos fatores,
como as condies operacionais e as propriedades do meio de cultivo. No presente
trabalho, procurou-se identificar se a biomassa e a concentrao desta afetam
significativamente os valores de kLa em um cultivo de Bacillus megaterium. Para isso,
realizou-se um cultivo batelada com a bactria B. megaterium em um biorreator do tipo
tanque agitado de 5 L durante 12 h. Mantiveram-se constantes as condies de
temperatura, taxa de aerao, velocidade de agitao e pH do meio. Os valores de kLa
foram determinados periodicamente atravs do mtodo dinmico. Atravs desse mtodo
obtiveram-se tambm os valores de taxa de respirao (OUR Oxygen Uptake Rate)
durante o cultivo. A biomassa foi determinada pelo mtodo gravimtrico, nos mesmos
intervalos de obteno do kLa. Atravs da anlise da curva de crescimento celular,
observou-se que o micro-organismo foi inoculado em sua fase exponencial de
crescimento, comeando a sofrer desacelerao metablica a partir de 6 h e atingido a
fase estacionria em 9 h de cultivo. No se verificou fase lag, nem morte celular durante
o cultivo de 12 h. A taxa especfica de respirao (qO2) apresentou comportamento tpico,
com maior atividade metablica (maiores valores de qO2) durante a fase exponencial e
decrescendo juntamente com a desacelerao do crescimento celular. Identificou-se um
comportamento anormal na curva de oxignio dissolvido e de respirao celular (OUR),
em 7 h e 8 h. A utilizao do mtodo dinmico para obteno do kLa levou o sistema a
atingir concentraes de oxignio muito baixas nos perodos de maior respirao,
provavelmente inferiores concentrao crtica para B. megaterium. Esse fato ocasionou
uma alterao da rota metablica das clulas at o restabelecimento do comportamento
normal na concentrao de oxignio dissolvido (pO2). Os valores de qO2 reduziram
atipicamente para esta etapa do cultivo, enquanto os de oxignio dissolvido elevaram-se,
indicando uma desacelerao inesperada do metabolismo. Esse resultado demonstrou a
limitao da aplicao desse mtodo de determinao do kLa para o cultivo estudado. O
kLa no foi significativamente influenciado pela presena de biomassa, conforme
confirmado por anlise de varincia. Esse resultado permite a utilizao de valores de kLa
que atendam aos interesses do cultivo determina-os previamente para o biorreator sem
clulas. Desse modo, elimina-se a problemtica da medio e do controle desse
parmetro durante o cultivo de B. megaterium. A constatao do presente estudo
permite ainda a desconsiderao do fator biomassa em correlaes para predio do kLa
nesses cultivos.
DEQUI / UFRGS Giulia Carli Lorenzini v
Lista de Figuras
Figura 1: Estrutura genrica de polihidroxialcanoatos. ...................................................... 4
Figura 2: Metabolismo central de carbono simplificado para B. megaterium. ................... 5
Figura 3: Rota metablica para a produo de PHB por B. megaterium. ........................... 6
Figura 4: Etapas e resistncias associadas na transferncia de oxignio da bolha de gs
clula. ....................................................................................................................... 8
Figura 5: Evoluo tpica da taxa de consumo de oxignio (OUR), taxa especfica de
consumo de oxignio (qO2) e concentrao de oxignio dissolvido (OD) durante um
cultivo aerbio. ......................................................................................................... 9
Figura 6: Crescimento microbiano em cultivo em batelada. .............................................10
Figura 7: Relao entre OTR, kLa e parmetros hidrodinmicos em biorreatores a diversos
nveis. ......................................................................................................................11
Figura 8: Principais mtodos para determinao do kLa. .................................................. 11
Figura 9: Determinao do qO2 e kLa a partir do mtodo dinmico. ..................................13
Figura 10: Variao da taxa especfica de respirao, qO2 , com a concentrao de
oxignio, C. ..............................................................................................................14
Figura 11: Fator de aumento biolgico: valores experimentais e estimados em culturas de:
a) Xantomonas campestris; b) Rhodoccocus erythropolis; c) Candida bombicola em
medio de crescimento; d) Candida bombicola em meio de produo. ......................17
Figura 12: Estudo do kLa e qO2 durante cultivo de clulas vegetais. ...................................18
Figura 13: Escalonamento para a inoculao do biorreator de 4 L. ...................................21
Figura 14: Biorreator com unidade de controle automtico ( direita) e sistema de
aquisio de dados ( esquerda) utilizado nos experimentos. ..................................22
Figura 15: Determinao experimental do kLa utilizando o mtodo dinmico...................25
Figura 16: Curva de crescimento celular de B. megaterium para o cultivo em biorreator (A)
e a duplicata (B).......................................................................................................27
Figura 17: Curva da taxa especfica de consumo de oxignio durante cultivo de B.
megaterium. ............................................................................................................28
Figura 18: Perfil da concentrao de oxignio dissolvido .................................................. 29
Figura 19: Perfil da taxa de respirao celular durante cultivo de B. megaterium. ............30
Figura 20: Variao do kLa durante cultivo de Bacillus megaterium..................................31
Figura 21: Concentrao oxignio dissolvido durante aplicao do mtodo dinmico. .....42
Figura 22: Determinao da OUR a partir da seo descendente da curva do mtodo
dinmico. .................................................................................................................43
Figura 23: Determinao do kLa a partir do trecho ascendente da curva do mtodo
dinmico. .................................................................................................................44
vi Estudo da transferncia de oxignio em cultivo de Bacillus megaterium
Lista de Tabelas
Tabela 1: Composio do meio de cultivo empregado para B. megaterium. .....................21
Tabela 2: Valores controlados para as variveis de cultivo. ..............................................23
Tabela 3: Menores medidas registradas na concentrao de oxignio dissolvido para os
experimentos A e B. .................................................................................................30
Tabela 4: Fator de aumento biolgico (E) em um cultivo de B. megaterium......................32
Tabela 5: Resumo da anlise estatstica de varincia ANOVA fator nico. ........................32
Tabela 6: Resultados da anlise estatstica de varincia ANOVA fator nico. ...................32
Tabela 7: Biomassa determinada atravs de peso seco celular durante cultivo de Bacillus
megaterium. ............................................................................................................39
Tabela 8: Taxa de respirao celular obtida pelo mtodo dinmico ao longo do cultivo de
B. megaterium. ........................................................................................................39
Tabela 9: Taxa especfica de respirao obtidas pelo mtodo dinmico ao longo do cultivo
de B. megaterium. ...................................................................................................40
Tabela 10: kLa determinado pelo mtodo dinmico durante cultivo de B. megaterium. ...40
Tabela 11: Aplicao do mtodo dinmico para determinao do kLa em 5 h de cultivo...41
DEQUI / UFRGS Giulia Carli Lorenzini vii
Lista de Smbolos
kLa Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio em meio sem clulas (s-1)
KL a Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio na presena de clulas (s-1)
kL Coeficiente de transferncia de massa (m s-1)
a rea interfacial especfica (m-1)
qO2 Taxa especfica de consumo de oxignio (s-1)
OTR Taxa de transferncia de oxignio (g L-1 s-1)
OUR Taxa de consumo de oxignio (g L-1 s-1)
t Tempo (s)
C Concentrao de oxignio dissolvido no seio do lquido (g L-1)
pO2 Concentrao de oxignio dissolvido no seio do lquido em relao saturao (%)
X Biomassa (g L-1)
Xi Biomassa no inculo (g L-1)
X0 Biomassa inicial no biorreator (g L-1)
M Massa dos frascos com biomassa (g)
m Massa dos frascos vazios (g)
F Vazo molar (mol s-1)
N Velocidade do impelidor (rpm)
Q Vazo de ar (m s-1)
vs Velocidade superficial de gs ( = 4Q / (Dt) ) (m s-1)
V Volume de lquido no biorreator (L)
Vi Volume do cultivo pelo impelidor (m)
Va Volume de amostra coletado (L)
Tenso superficial (N m-1)
Viscosidade dinmica (Pa s)
Pg Consumo de potncia gasosa (W)
Pgi Consumo de potncia gasosa pelo impelidor (W)

viii Estudo da transferncia de oxignio em cultivo de Bacillus megaterium
Di Dimetro do impelidor (m)
Dt Dimetro do tanque (m)
Sh Nmero de Sherwood modificado ( = kLaDi / DO2 ) (adimensional)
Rem Nmero de Reynolds modificado (adimensional)
Sc Nmero de Schmidt ( = ap / (DO2) ) (adimensional)
Fr Nmero de Froude ( = DiN / g ) (adimensional)
D Difusividade mssica (m2 s-1)
Subndices
O2 Oxignio
i Momento da interrupo da agitao/aerao do biorreator
0 Momento da retomada da agitao/aerao no biorreator
ap Aparente
Sobrendices
in Relativo entrada
out Relativo sada
* saturao no seio do lquido em equilbrio com o seio da fase gasosa

DEQUI / UFRGS Giulia Carli Lorenzini ix
Lista de Abreviaturas e Siglas

Acetil-CoA Acetil-coenzima-A
F Valor F do teste F da anlise de varincia
Fcrt Valor de F crtico do teste F da anlise de varincia
gl Graus de liberdade
OD Oxignio dissolvido
OECD Organization for Economic Co-operation and Development
(Organizao para a Cooperao Econmica e Desenvolvimento)
OTR Oxygen Transfer Rate (Taxa de transferncia de oxignio)
OUR Oxygen Uptake Rate (Taxa de consumo de oxignio)
P Valor P (P-value) da anlise de varincia
PHA Polihidroxialcanoato
PHB Poli(3-hidroxibutirato) ou poli(-hidroxibutirato)
SCP Single Cell Protein (protena microbiana)

DEQUI / UFRGS Giulia Carli Lorenzini 1
1 Introduo
A utilizao da biotecnologia para a produo de bens e servios remonta s origens
da civilizao. Porm, esse ramo da cincia vem se destacando cada vez mais pela grande
variedade e potencial para a descoberta de novas aplicaes e por ser uma fonte de
desenvolvimento sustentvel.
Entre os processos biotecnolgicos de interesse, encontram-se os realizados com

micro-organismos aerbios. Nesses, de fundamental importncia o entendimento e o
controle do mecanismo da transferncia de oxignio, a fim de otimizar as condies de
determinado cultivo.
Um desses processos consiste na produo de poli(3-hidroxibutirato), ou PHB, por

bactrias Bacillus megaterium. Esse polister um biopolmero biodegradvel e
biocompatvel produzido a partir de fontes renovveis. Ele possui caractersticas
promissoras para a substituio, puro ou com insero de outros monmeros, de
polmeros oriundos do petrleo. A sntese desse material, no entanto, ocorre sob
condies bastante especficas de aerao, sendo tanto o excesso quanto a ausncia de
oxignio fatores limitantes.
B. megaterium uma bactria estritamente aerbia que aceita uma variedade de

carboidratos como fonte de carbono, cresce em uma faixa relativamente ampla de
temperaturas e possui crescimento acelerado. Tais condies a tornam de grande
interesse na produo de PHB. Esse micro-organismo utiliza a rota aerbia do ciclo dos
cidos tricarboxlicos, ou ciclo de Krebs, para seu crescimento celular e gerao de
energia. J para a produo de PHB, utiliza uma rota alternativa que tem como ponto
comum com o ciclo de Krebs a utilizao da acetil-coenzima-A (acetil-CoA). Sob condies
de limitao de oxignio, a atividade do ciclo de Krebs diminui e maior quantidade de
acetil-CoA pode ser utilizada na sntese de PHB.
Em um cultivo aerbio como o de B. megaterium, um fator crtico a ser avaliado o

suprimento de oxignio ao cultivo, devido sua baixa solubilidade na gua. O coeficiente
volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) um dos principais parmetros que
quantificam a eficincia da transferncia de oxignio em um biorreator. Por esta razo o
kLa um dos, seno o principal, parmetro de escalonamento, dimensionamento e
operao de biorreatores aerbios.
O kLa afetado por diversos fatores, entre eles, as condies operacionais e as

propriedades do meio de cultivo. Geralmente, no estudo de um cultivo celular aerbio,
opta-se por empregar um valor de kLa constante durante o tempo, mantendo-se as
condies operacionais inalteradas, e igual para o biorreator sem e com clulas. H,
porm, estudos na literatura provando que no apenas as condies operacionais e as
caractersticas do meio de cultivo influenciam o valor do kLa, mas tambm a presena e a
concentrao de biomassa.
Entre os efeitos da biomassa no kLa estudados na literatura, encontram-se a alterao

de propriedades do meio, a presena fsica das clulas como partculas slidas e a
influncia da respirao celular. Atravs dos trabalhos disponveis, percebeu-se que
muitos desses efeitos apontam para direes opostas, podendo ocorrer um aumento ou
2 Estudo da transferncia de oxignio em cultivo de Bacillus megaterium
um decrscimo do kLa com a biomassa. Ainda, detectou-se a carncia de estudos que

avaliem experimentalmente o comportamento do kLa com a concentrao celular.
Por esse motivo, e tendo-se em mente o interesse por B. megaterium devido a suas
caractersticas e produtos, alm da importncia da transferncia de oxignio para a
otimizao da produo de PHB, decidiu-se pelo estudo do kLa durante um cultivo dessas
clulas.
1.1 Objetivos
Com o objetivo principal de estudar a transferncia de oxignio, avaliando a influncia
da presena e da concentrao de biomassa no kLa, durante um cultivo de B. megaterium,
adotou-se como objetivos especficos:
Realizar um cultivo batelada de B. megaterium em biorreator de bancada tipo

tanque agitado;
Determinar a curva de crescimento celular durante o cultivo de B. megaterium por

anlises da concentrao de biomassa atravs de medidas gravimtricas (medidas
de peso seco);
Avaliar a variao de oxignio dissolvido durante um cultivo de B. megaterium;
Obter a taxa de respirao (OUR) e a taxa especfica de respirao (qO2) durante

um cultivo de B. megaterium;
Determinar os valores de kLa periodicamente atravs de mtodo dinmico,

testando a aplicabilidade desta tcnica;
Relacionar os valores de kLa com a presena e a quantidade de biomassa e com a

taxa de respirao especfica das clulas.
1.2 Estrutura
Este trabalho est dividido em seis captulos, dois apndices e um anexo. No Captulo
1, introduziu-se o tema da pesquisa, incluindo as motivaes e objetivos do estudo. O
Captulo 2 contempla uma anlise da literatura com breves revises sobre: biotecnologia,
polihidroxialcanoatos, mais especificamente PHB e sua produo pelo micro-organismo
de interesse, B. megaterium, transferncia de oxignio em cultivos e o kLa, alm das
variveis que afetam e podem ser afetadas por esse parmetro em um bioprocesso. O
Captulo 3 rene a descrio dos experimentos realizados e materiais utilizados. Tambm
nesse so detalhadas as determinaes e anlises efetuadas. No Captulo 4, so
apresentados os resultados obtidos juntamente com sua interpretao e discusso.
Finalmente, o Captulo 5 rene as concluses observadas e proposies para trabalhos
futuros.
2 Reviso Bibliogrfica
2.1 Breve introduo aos processos biotecnolgicos
Biotecnologia, em uma definio genrica da Organizao para a Cooperao e o
Desenvolvimento Econmico (OECD, 2005), consiste na aplicao da cincia e tecnologia
a organismos vivos, bem como partes, produtos e modelos, para alterar materiais vivos e
no vivos, visando produo de conhecimentos, bens e servios.
A aplicao industrial da Biotecnologia envolve fundamentalmente conhecimentos de

Biologia, Qumica e Engenharia. A transferncia para larga escala dos processos
biotecnolgicos e a sua otimizao so atributos da Engenharia Bioqumica atravs da
aplicao dos conhecimentos da Engenharia Qumica (SCHMIDELL et al., 2001).
As origens da biotecnologia datam de cerca de 10.000 anos atrs, com o incio de

plantios e criaes animais. H cerca de 6.000 anos j se conheciam produtos alimentcios
obtidos a partir de processos microbiolgicos. Mais recentemente, contudo, a partir da
dcada de 1960, uma nova biotecnologia tomou forma. Esta evoluo engloba o uso de
processos celulares e biomoleculares para solucionar problemas e gerar produtos de
interesse (LITTLEHALES e MASSEY, 2007).
Atualmente, importantes aplicaes biotecnolgicas so empregadas nos setores

agropecurio, alimentcio, sanitrio, ambiental e industrial (BORZANI et al., 2001). Entre
alguns produtos desse ltimo, esto os biocombustveis, antibiticos, alimentos e bebidas
fermentados, plantas modificadas geneticamente, plsticos biodegradveis, etc. (WAITES
et al., 2001; LITTLEHALES e MASSEY, 2007).
Neste contexto, os processos industriais biotecnolgicos que envolvem o cultivo de

clulas microbianas aerbias ou aerbias facultativas possuem grande destaque. Entre
eles, encontram-se (HOCKING, 2005):
Produo de single cell protein (SCP) ou protena microbiana, isto , sntese de

biomassa de leveduras a partir de hidrocarbonetos;
Oxidao seletiva de hidrocarbonetos especficos empregados como substrato;
Produo de aminocidos, vitaminas, antibiticos e cidos orgnicos.
Os cultivos aerbios em larga escala ocorrem geralmente em biorreatores do tipo

tanque agitado (CSTR), em meio lquido, envolvendo um sistema trifsico slido-lquido-
gasoso. Nesses, o fator limitante decisivo o fornecimento de ar ao meio, devido baixa
solubilidade do oxignio em gua (HOCKING, 2005). Desta forma, esses processos
demandam o dimensionamento do sistema para a adequada transferncia de oxignio da
fase gasosa para a lquida, onde ser consumido pelas clulas.
2.2 Polihidroxialcanoatos: biopolmeros

Um grupo de produtos de destaque biotecnolgico so os biopolmeros (DANIELL e
GUDA, 1997), entre os quais se encontram os polihidroxialcanoatos (PHAs) (BYROM,
1987; WAITES et al., 2001).
Polihidroxialcanoatos so uma famlia de polisteres produzidos e armazenados por

diversas bactrias, tanto aerbias quanto anaerbias, como reserva de carbono e energia
(ANDERSON e DAWES, 1990; VERLINDEN et al., 2007). Esses biopolmeros podem ser
processados como polmeros petroqumicos, porm apresentando uma srie de
vantagens. Alm de serem biodegradveis e biocompatveis, os PHAs provm do
metabolismo microbiolgico, uma fonte renovvel.
O primeiro PHA identificado foi o poli(3-hidroxibutirato), ou PHB, em um trabalho de

Lemoigne datado de 1926. Esse composto foi encontrado como uma reserva de carbono
em bactrias Bacillus megaterium. Desde ento, foram identificados mais de cem cidos
hidroalcanicos como monmeros precursores de polisteres bacterianos, os quais
possuem a estrutura genrica apresentada na Figura 1 (BRAUNEGG et al., 1998; YU,
2007).
Figura 1: Estrutura genrica de polihidroxialcanoatos.

Fonte: adaptado de Valappil et al. (2007)
Poli(3-hidroxialcanoatos) ou poli(-hidroxialcanoatos), em especial PHB, so os PHAs

mais comuns, e possuem X=1. PHB puro composto por monmeros com um grupo
metila como cadeia lateral (BRAUNEGG et al., 1998). Estudos sobre diferentes aplicaes
do PHB, inclusive comerciais, em substituio aos plsticos provenientes do petrleo
foram apresentados por Holmes (1985), Byrom (1987), Anderson e Dawes (1990), Waites
et al. (2001), Volova et al. (2003), Bucci et al. (2005), entre outros.
Em seu estudo, Reyes et al. (1997) isolaram e identificaram bactrias para a produo
de PHB em amostras de solo das Filipinas. Os grnulos de polmero observados
apareceram como incluses com colorao marrom para preto dentro de clulas rosa
avermelhadas. As clulas foram mantidas em estado de privao, o que se mostrou
eficiente para manter a capacidade de sntese do biopolmero. Entre as clulas isoladas,
B. megaterium mostrou-se promissora para a produo de PHB.
Semelhantemente, Yilmaz et al. (2005) realizaram estudo comparativo da produo

de PHB por bactrias do gnero Bacillus, a maioria isolada de amostras de solo da
Turquia, entre as quais B. megaterium. Esta espcie apresentou rendimento de PHB entre
5,6 % e 12,4 % de seu peso seco celular. O maior rendimento (41,7 %) obteve-se para B.
subtillis.
Entre as vantagens representadas pelo cultivo de B. megaterium, esto seu rpido

crescimento, a aceitao de diversas fontes de carboidratos, a utilizao destas fontes de
carbono mesmo em condies no otimizadas e a relativamente ampla faixa de
temperaturas timas em que crescem (30 C a 40 C) (REYES et al., 1997). Ainda, Reyes et
al. (1997) constataram maior rendimento em PHB em um menor perodo de sntese que
para bactrias Alcaligenes eutrophus.
2.3 Bacillus megaterium

Bacillus megaterium uma bactria gram-positiva (WAITES et al., 2001). Esta espcie
estritamente aerbia e formadora de esporos (REYES et al., 1997), estruturas
resistentes a condies adversas que representam uma vantagem para a sobrevivncia e
disseminao do micro-organismo. Espcies de Bacillus produzem endsporos cilndricos
ou ovais (WAITES et al., 2001).
O metabolismo central de carbono de B. megaterium consiste da gliclise, via das

pentoses-fosfato e ciclo dos cidos tricarboxlicos (ou ciclo do cido ctrico ou, ainda, ciclo
de Krebs). A Figura 2 representa estas rotas metablicas simplificadamente.
Figura 2: Metabolismo central de carbono simplificado para B. megaterium.

Fonte: adaptado de Frch et al. (2007)
Nesse metabolismo, a acetil-coenzima-A (acetil-CoA) pode tanto ser oxidada atravs

do ciclo dos cidos tricarboxlicos, quanto ser utilizada como substrato para a produo
de PHAs, dependendo das condies de cultivo (ANDERSON e DAWES, 1990). Conforme a
Figura 3, durante o crescimento celular normal, a enzima 3-cetotiolase ser inibida pela
coenzima-A livre vinda do ciclo de Krebs. Porm, quando a entrada da acetil-CoA no ciclo
de Krebs restringida por alguma limitao de nutrientes, excetuando-se limitao de
carbono, o excesso desta direcionado para a biossntese de PHB. A rota metablica para
produo de PHB no envolve oxignio molecular (O2), podendo ocorrer na limitao
desse (VERLINDEN et al., 2007).
Devido ao PHB ser praticamente insolvel em gua, pode ser acumulado em grandes
quantidades como grnulos dentro das clulas. Com base nesse fato, Macrae e Wilkinson
(1958) discutiram a possibilidade de que o PHB tenha o papel de reserva de carbono e
fonte energtica.
Figura 3: Rota metablica para a produo de PHB por B. megaterium.

Fonte: Verlinden et al. (2007)
Os mesmos autores compararam diversas fontes de carbono na produo de PHB por

B. megaterium e B. cereus, obtendo maior rendimento em polmero para a glicose. A
adio de acetato de sdio aumentou significativamente a produo de PHB, j a adio
de fontes de nitrognio e magnsio resultaram em pequena inibio da produo. A
sntese mxima de PHB deu-se em pH aproximadamente 7,5.
Ainda nesse mesmo estudo, foi demonstrado que a produo de PHB por B.
megaterium e B. cereus inibida por altas concentraes de oxignio e que a sntese em
B. megaterium tambm no ocorre em condies anaerbicas. Verificou-se que a
produo de PHB foi maior com ar que com oxignio puro. Ao testar misturas de oxignio
e nitrognio de composies variveis, os autores encontraram uma concentrao tima
para a sntese do biopolmero a 5 % (v/v) de oxignio.
Estudos mais detalhados da regulao da sntese de PHB tendo glicose como fonte de
carbono foram realizados para Azobacter beijerinckii. Esta espcie acumula o polmero
apenas sob limitao de oxignio, quando a razo NADH/NAD aumenta (ANDERSON e
DAWES, 1990).
Os estudos de Slepecky e Law (1961) demonstraram que para cepas de B. megaterium

formadoras de esporos o metabolismo de sntese e utilizao de PHB foi atingido na fase
estacionria, com formao de poucos esporos (menos de 1 %). Em condies adversas
sntese, a quantidade e polmero formado foi significativamente menor e o pico de
produo ocorreu durante a fase exponencial de crescimento. A esporulao superou 90
% nestas condies. No caso em que as clulas esto fortalecidas com polmero, ou as
condies para seu rpido consumo no so favorveis, ocorre uma lenta utilizao do
PHB como fonte de carbono e reserva energtica, sem tendncia a esporular. Caso
contrrio, com escassez de polmero ou condies para seu rpido consumo, ocorre o
consumo da fonte de nutriente endgena no processo de esporulao, o qual demanda
energia. Glicose e acetato foram favorveis para produo de polmero.
Semelhantemente, Vazquez et al. (2003) observaram que o acmulo de PHB em B.

megaterium aumentava a partir da metade da fase de crescimento exponencial at a fase
estacionria. Os autores concluram que o acmulo de polmero e a expresso da enzima
fosfotransbutirilase possivelmente esto includos no sistema de regulao global
caracterstico do estado transiente da bactria, anterior esporulao. O PHB, como
fonte de energia e reserva de carbono, permitiria que os micro-organismos
permanecessem durante mais tempo no estado vegetativo, sob a forma de esporos.
Muitos dos estudos citados demonstraram a importncia da regulao do processo de

transferncia de oxignio nos cultivos de B. megaterium, a fim de maximizar a obteno
do produto de interesse. Portanto, fundamental entender e controlar o mecanismo de
transporte de oxignio nesses cultivos.
2.4 Transferncia de massa em biorreatores: transferncia de oxignio

A transferncia de oxignio da fase gasosa para o meio de cultivo lquido e dentro
desse at ser consumido pelas clulas uma etapa crtica e limitante dos processos
biotecnolgicos aerbios. Isto se deve baixa solubilidade do oxignio em gua: a
concentrao de saturao do gs dissolvido, a 35 C, ao se borbulhar ar a 1 atm, de
apenas 7 mg L-1 (SCHMIDELL et al., 2001). O estudo da transferncia de oxignio ,
portanto, fundamental para a correta seleo, projeto e escalonamento de biorreatores.
O processo de transferncia de oxignio da fase gasosa em que se encontra ao micro-

organismo respirante pode ser entendido como uma srie resistncias de diferentes
magnitudes associadas a cada etapa do transporte de massa, conforme representado na
Figura 4. Comumente, admite-se que a principal destas resistncias encontra-se na
pelcula lquida estagnada ao redor da bolha de ar (GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009).
A concentrao de oxignio dissolvido na fase lquida adequadamente agitada (C)

dada pelo balano material nesta:
dC
= OTR - OUR (1)
dt
onde C a concentrao de oxignio dissolvido em g L-1; t o tempo em s; OTR (Oxygen

Transfer Rate) a taxa de transferncia de oxignio em g L-1 s-1 e OUR (Oxygen Uptake
Rate) a taxa de consumo de oxignio pelas clulas em g L-1 s-1.
Figura 4: Etapas e resistncias associadas na transferncia de oxignio da bolha de gs

clula.
Fonte: adaptato de Schmidell et al. (2001) e Garcia-Ochoa e Gomez (2009)
A OTR, como discutido, governada pela resistncia transferncia de massa na

pelcula lquida estagnada ao redor da bolha de gs. Desse modo, sua equao pode ser
simplificada para:
OTR = kL a (C* - C)
(2)
onde C* a concentrao de saturao do oxignio no seio do lquido em equilbrio com

o seio da fase gasosa, para uma determinada temperatura, em g L-1; C a concentrao
de oxignio dissolvido no seio do lquido em g L-1; kL o coeficiente de massa local em s-1
e a rea da interface gs-lquido por unidade de volume do lquido em m-1.
A obteno dos parmetros kL e rea interfacial a individualmente bastante

complexa. Portanto, costuma-se englobar ambos em um nico parmetro, kLa,
determinado mais facilmente. O produto kLa denominado coeficiente volumtrico de
transferncia de oxignio. Segundo a Equao (2), a fora motriz da OTR o gradiente de

concentrao entre a interface gs-lquido e o seio do lquido, sendo kLa a constante de
proporcionalidade. Quando o kLa obtido em um sistema com clulas respirantes,
costuma-se empregar a notao KLa.
J a OUR dada pelo produto entre a taxa especfica de consumo de oxignio (qO2) e a
concentrao de clulas (X):
OUR = qO2 X (3)
A OUR pode ser medida, fornecendo importantes informaes sobre a atividade

metablica das clulas. O qO2 especfico para cada micro-organismo e usualmente
considerado constante durante o crescimento celular, apesar de que os resultados
experimentais no concordem com esta prerrogativa (GARCIA-OCHOA et al., 2010). Uma
curva tpico da OUR, qO2 e concentrao de oxignio dissolvido (OD) so apresentados na
Figura 5.
Figura 5: Evoluo tpica da taxa de consumo de oxignio (OUR), taxa especfica de

consumo de oxignio (qO2) e concentrao de oxignio dissolvido (OD) durante um cultivo
aerbio.
Fonte: adaptado de Garcia-Ochoa et al. (2010)
Quando os micro-organismos encontram-se na fase exponencial de crescimento, a

atividade metablica maior, portanto os valores de qO2 e OUR aumentam, enquanto o
OD diminui. Uma curva tpica de crescimento celular (log (X) versus tempo) que
demonstra a evoluo da biomassa (X) em um cultivo e as fases do metabolismo
microbiano representada na Figura 6.
Figura 6: Crescimento microbiano em cultivo em batelada.

Fonte: adaptado de Waites et al. (2001)
2.5 Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (k L a)

O conhecimento do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) em
biorreatores aerbios essencial para estabelecer a eficincia da aerao e quantificar o
efeito das variveis operacionais no fornecimento de oxignio dissolvido (GARCIA-OCHOA
e GOMEZ, 2009). A utilizao do kLa como critrio de escalonamento de biorreatores ,
desse modo, de grande importncia nos processos aerbios.
O kLa afetado por diversos fatores, entre os quais:
Caractersticas geomtricas e operacionais do biorreator (GALACTION et al., 2003);
Composio do meio (JAMNONGWONG et al., 2010), incluindo propriedades

como a viscosidade e a adio de substncias (antiespumantes, surfactantes, etc.)
(GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009);
Temperatura (GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009);
Tipo, concentrao e morfologia dos micro-organismos presentes (GALACTION et

al., 2003).
O fluxograma da Figura 7 relaciona esquematicamente diversos fatores que afetam o

kLa e a OTR a diferentes nveis em um bioprocesso.
Figura 7: Relao entre OTR, kLa e parmetros hidrodinmicos em biorreatores a diversos

nveis.
Fonte: adaptado de Garcia-Ochoa (2009)
2.5.1 Mtodos de determinao do kLa

De acordo com o mtodo empregado para obteno do kLa, podem ser obtidos
valores distintos (POULIOT et al., 2000; GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009). Entre os
mtodos, existem os que so aplicveis a biorreatores sem consumo biolgico de
oxignio (sem clulas respirantes) e os realizados durante um bioprocesso. Os mtodos
podem ainda ser subdivididos em qumicos e fsicos. Alguns dos principais mtodos foram
reunidos por Garcia-Ochoa e Gomez (2009) e so apresentados esquematicamente na
Figura 8.
Figura 8: Principais mtodos para determinao do kLa.

Apesar de terem sido os primeiros mtodos a se tornarem amplamente aceitos, os

mtodos qumicos para a determinao do kLa possuem a desvantagem de alterar a
fluidodinmica do sistema devido adio de compostos qumicos. Entre os mtodos
fsicos, os mais comumente empregados para obteno do kLa durante um bioprocesso
em que ocorre consumo de oxignio so:
a) Anlise da fase gasosa (balano da de gs):
Nesta tcnica, utilizam-se analisadores de oxignio para medir a concentrao desse

gs na entrada e na sada do processo, juntamente com um eletrodo que realiza a medida
do valor de oxignio dissolvido no lquido. Atravs do balano de massa para o oxignio,
obtm-se a equao que permite determinar o valor do kLa:
- F
Fin out
(4)
V(C - C)
kL a = *
e F so as vazes molares de oxignio medidas na entrada e na sada do

Onde Fin out
biorreator, respectivamente, e V o volume do biorreator.
Esse mtodo requer uma boa agitao para a sua aplicao. Ainda, se a OUR for muito
baixa, a variao da concentrao de oxignio entre as correntes gasosas de entrada e de
sada do bioprocesso ser muito pequena, devendo ser empregados analisadores mais
sensveis. Para biorreatores muito grandes e, consequentemente, com elevada fora
motriz (C* - C) para a transferncia de oxignio, pode-se aproximar esta fora pela mdia
logartmica entre os valores de concentrao de oxignio na entrada e na sada da
corrente gasosa.
b) Mtodo dinmico
O mtodo dinmico um mtodo simples, relativamente acurado e amplamente

empregado para a determinao do kLa durante um cultivo (GARCIA-OCHOA e GOMEZ,
2009) em razo da sua praticidade e reprodutibilidade.
Esta tcnica, proposta por Bandyopadhyay e Humphrey (1967), consiste na

interrupo da aerao e agitao no momento do cultivo em que se deseja determinar o
kLa. Esta interrupo temporria e deve durar poucos minutos para no afetar o
processo (GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009). A concentrao de oxignio dissolvido,
monitorada por um eletrodo imerso no biorreator, diminuir com uma taxa igual ao seu
consumo devido respirao celular. Esta queda linear e permite a obteno da OUR a
partir do seu coeficiente angular em um grfico de concentrao de oxignio dissolvido
versus tempo, conforme a Figura 9.
Ao religar a agitao e a aerao, a concentrao de oxignio volta a subir. A

determinao do kLa realizada empregando-se a equao obtida a partir do balano
material para o trecho ascendente de concentrao de oxignio dissolvido:
ln
= kL a( t - t 0 )
Ci - C
Ci - C0 (5)
onde Ci, C0 e C so, respectivamente, as concentraes de oxignio dissolvido antes da

interrupo da agitao/aerao, no momento em que retomada a agitao/aerao
(tempo t0) e em um tempo t durante a etapa de absoro de oxignio pelo meio,
conforme a Figura 9.
Figura 9: Determinao do qO2 e kLa a partir do mtodo dinmico.

Fonte: adaptado de Schmidell et al. (2001)
Esse mtodo assume que a taxa de utilizao de oxignio pelas clulas no afetada
pela ausncia de borbulhamento de ar e de agitao, nem pela menor concentrao de
oxignio dissolvido no meio.
Uma variao desse mtodo consiste na desoxigenao do meio pelo borbulhamento

de um gs, como nitrognio. Esta tcnica conhecida como mtodo dinmico gassing-out
(RIET, 1979) e aplicado para determinar o kLa quando no h consumo biolgico de
oxignio.
O procedimento utilizado para o mtodo dinmico pode ser empregado diversas

vezes durante um cultivo, porm possui limitaes a serem consideradas:
Decantao celular: com a interrupo total tanto da aerao quanto da agitao,

as clulas tendem a decantar no biorreator. Desse modo, o consumo de oxignio
torna-se maior no fundo do sistema e no corretamente medido pelo eletrodo,
localizado prximo ao meio do reator. Para contornar esse problema, Pouliot et al.
(2000) introduziram uma pequena modificao na tcnica. Os autores mantiveram
uma agitao reduzida (30 rpm) apenas para manter as clulas em suspenso ao
interromper a aerao.
Tempo de resposta dinmica do eletrodo: a resposta dinmica do eletrodo deve

ser considerada para a correta determinao do kLa, caso o tempo caracterstico
do eletrodo de oxignio seja da ordem de magnitude do tempo caracterstico do
processo de transferncia de oxignio (1/kLa) (POULIOT et al., 2000; GARCIA-
OCHOA e GOMEZ, 2009).
Concentrao crtica de oxignio: Para que no haja limitao de oxignio no

cultivo, deve ser mantida uma concentrao superior concentrao crtica para
cada micro-organismo. A concentrao crtica definida como o valor acima do
qual a velocidade especfica de respirao (qO2) constante e mxima, conforme
ilustra a Figura 10 (DORAN, 1995; SCHMIDELL et al., 2001).
Figura 10: Variao da taxa especfica de respirao, qO2 , com a concentrao de

oxignio, C.
Fonte: retirado de Schmidell et al. (2001)
Badino Jnior et al. (2001) observaram que esse mtodo somente til quando a
concentrao de oxignio dissolvido significativamente maior do que o valor crtico.
Para valores inferiores, mtodos alternativos, como o mtodo de balano de gs, seriam
mais apropriados para a determinao do kLa.
Por sua vez, Gomez et al. (2006a) aplicaram um mtodo dinmico modificado,
introduzindo uma etapa anterior de passagem de oxignio puro, devido s baixas
concentraes desse gs atingidas em um cultivo de Pseudomonas putida.
2.5.2 Fatores que afetam o kLa em biorreatores

O kLa pode ser afetado tanto por variveis operacionais e propriedades do meio de
cultivo quanto pela presena de biomassa, de diferentes maneiras.
a) Efeito de variveis operacionais, parmetros geomtricos e propriedades fsicas do

meio de cultivo no kLa
Atualmente, a literatura apresenta uma grande quantidade de estudos a respeito dos

efeitos de variveis operacionais de biorreatores do tipo tanque agitado no kLa, entre
elas, velocidade de agitao e taxa de aerao (AHMAD et al., 1994; GARCA-OCHOA e
GMEZ, 1998; SCHMIDELL et al., 2001; DEMIRTAS et al., 2003; GOMEZ et al., 2006a;
GOMEZ et al., 2006b).
Demirtas et al. (2003) observaram que, em um cultivo da bactria Thermus

thermophilus, o kLa afetado principalmente pela velocidade de agitao, aumentando
juntamente com esta. Da mesma forma, ocorreu aumento do kLa com maiores taxas de
aerao, porm menos significativamente. Consequentemente, tambm a OTR eleva-se
com o aumento desses parmetros.
Ahmad e colaboradores (1994) obtiveram concluses semelhantes em uma

fermentao com Candida utilis. Os autores observaram a elevao da OTR com a
agitao e a aerao at valores-limite. Concluiu-se nesse estudo que maiores
velocidades de agitao causam a quebra das bolhas de ar, aumentando a rea de
transferncia de massa, e criam condies turbulentas que favorecem a mistura. O tempo
de residncia das bolhas no reator tambm sofre um acrscimo. Em velocidades muito
elevadas de agitao, porm, ocorre danificao celular, diminuio da taxa de respirao
e, consequentemente, a fora motriz para a transferncia de oxignio. J maiores taxas
de aerao provocam o aumento da rea interfacial especfica (a).
Alm da agitao e da aerao, propriedades do meio de cultivo, como a viscosidade

aparente, tambm afetam a OTR. No caso da viscosidade, seu aumento est relacionado
a uma maior resistncia transferncia de oxignio, verificando-se queda do kLa em
cultivos de maior viscosidade (BADINO JNIOR et al., 2001).
Garca-Ochoa e Gmez (1998) estudaram a influncia de diversos parmetros no kLa

em soluo de goma xantana, obtendo uma correlao em que o aumento da agitao,
velocidade superficial de gs e diminuio da viscosidade efetiva do lquido levam ao
aumento do kLa. Os autores sugeriram que a diminuio na efetividade da transferncia
de oxignio em funo do aumento da viscosidade pode ser causada pela queda do grau
de turbulncia. Esta queda causaria o aumento do tamanho de equilbrio dinmico das
bolhas de gs, diminuindo o kLa.
Correlaes para o kLa em funo de variveis operacionais (velocidade de agitao,

taxa de aerao e consumo de potncia gasosa), parmetros geomtricos (volume do
cultivo, dimetro do impelidor) e propriedades fsicas dos cultivos (viscosidade aparente e
tenso superficial) foram reunidas e ajustadas a dados experimentais por Badino Jnior et
al. (2001). Estas correlaes esto presentes no Anexo I deste trabalho.
b) Efeito da biomassa no kLa
Encontra-se ainda escasso material na literatura que investigue experimentalmente o

efeito da presena e concentrao de clulas aerbias no kLa. Sabe-se que as clulas
podem afetar a transferncia de oxignio em um cultivo basicamente de trs formas
distintas: alterando propriedades do meio; pela simples presena como partculas slidas
de quantidade varivel durante um cultivo e atravs do consumo de oxignio dissolvido
no meio (JU e SUNDARARAJAN, 1994). Os estudos disponveis revelam que esses fatores
podem afetar o kLa de diferentes formas, tornando de difcil previso a influncia da
biomassa nesse parmetro.
b.1) Modificaes metablicas do meio
Tanto a morfologia e o crescimento da biomassa durante o cultivo quanto os produtos

por ela sintetizados podem alterar propriedades do meio e, consequentemente, o kLa.
Badino Jnior et al. (2001) demonstraram que durante um cultivo de Aspergillus

awamori, ocorreu aumento da viscosidade aparente e, com isso, reduo dos valores de
kLa. Tambm foi observado um modesto comportamento ascendente da tenso
superficial relativa para o mesmo perodo, provavelmente devido ao consumo de
nutrientes dissolvidos do meio de cultura original.
Por outro lado, h estudos que identificaram a diminuio das bolhas de ar durante o
cultivo e, desse modo, o aumento da rea interfacial gs-lquido especfica e do kLa (JU e
SUNDARARAJAN, 1994). Ho e colaboradores (1995) sugeriram que a liberao de
substncias semelhantes a surfactantes pela cultura celular, como protenas, poderia ter
reduzido a tenso superficial interfacial e causado um aumento dos valores de kLa.
b.2) Presena fsica das clulas como partculas slidas
A presena de biomassa simplesmente em sua condio de partculas pode ter efeitos

contrrios no kLa. Deve-se ressaltar que o nmero de clulas varia durante as fases de um
cultivo, alterando a magnitude desta influncia.
Ju e Sundararajan (1994) estudaram a influncia de clulas de levedura

(Saccharomyces cerevisiae) inativas na transferncia de oxignio a diferentes
concentraes celulares, velocidades de agitao e taxas de aerao. Os valores de kLa,
determinados pelo mtodo dinmico, foram at 30 % inferiores na presena de clulas
em comparao com o respectivo meio filtrado. Esse efeito foi explicado como um
bloqueio fsico da interface gs-lquido pelas clulas, que possuem menor permeabilidade
ao oxignio que o meio lquido. O efeito bloqueador aumentou com a concentrao de
clulas. Tambm ocorreu aumento do bloqueio com maiores velocidades de agitao e
com menores taxas de aerao, pois quanto menores as bolhas geradas, maior era a
captura celular em sua interface. Galaction et al. (2004) confirmaram estas observaes.
J Andrews e Fonta (1984a) reportaram o chamado snowball effect (efeito bola de

neve, em ingls) em cultivos de Escherichia coli conduzidos na fase estacionria. Esse
estudo mostrou que a grande concentrao de materiais surfactantes existentes no
cultivo na fase estacionria e adsorvidos s bolhas de gs no era suficiente para
imobilizar a interface gs-lquido. Teoricamente, esta imobilizao deveria ocorrer devido
ao contrabalanceamento entre as foras exercidas pelo lquido e a presso superficial dos
surfactantes. Porm, no trajeto percorrido pela bolha, clulas chocam-se contra ela,
adsorvendo-se e movimentando sua interface. O movimento interfacial acarreta um
aumento na eficincia de captura celular e mais clulas so adsorvidas, gerando o efeito
bola de neve, at a interface tornar-se completamente mvel. As clulas acumulam-se
prximo ao ponto de estagnao inferior, portanto, assim como o efeito bloqueador da
biomassa, o aumento qumico produzido pelo aumento da taxa de respirao na interface
gs-lquido possui pouca influncia na taxa de transferncia total de oxignio. Esse efeito
hidrodinmico igualmente importante para clulas mortas ou partculas inertes e
provoca o aumento no coeficiente de transferncia de massa (ANDREWS e FONTA,
1984b).
b.3) Respirao celular e o fator biolgico de aumento (E)
A presena de clulas pode afetar o kLa e a OTR devido respirao dos micro-
organismos (OUR) acumulados na interface gs-lquido. Para quantificar o aumento do kLa
com a respirao celular, definiu-se um fator de aumento biolgico (E), como a razo
entre o fluxo de absoro de oxignio na presena de uma terceira fase dispersa (clulas,
neste caso), KLa, e o fluxo de absoro sem esta, kLa, sob as mesmas condies
hidrodinmicas e mesma fora motriz para a transferncia de massa (GARCIA-OCHOA e
GOMEZ, 2009):
KL a (6)
E=
kL a
Em geral, apesar da influncia da biomassa no kLa, assume-se E = 1.
Gomez et al. (2006a) obtiveram estimativas do fator E durante um cultivo de

Pseudomonas putida. Observou-se o aumento de E com a concentrao de biomassa,
indicando que, sob estas condies, o transporte de massa est acompanhado de uma
grande OUR.
A Figura 11 apresenta resultados semelhantes (GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009). Os

valores de E menores que 1 indicam que a transferncia de massa acompanhada por
uma lenta OUR e uma maior resistncia ao transporte. H uma srie de resistncias
envolvidas que foram consideradas no modelo para a estimativa de E em biorreatores,
conforme descrito pelos autores.
Figura 11: Fator de aumento biolgico: valores experimentais e estimados em culturas de:
a) Xantomonas campestris; b) Rhodoccocus erythropolis; c) Candida bombicola em medio
de crescimento; d) Candida bombicola em meio de produo.
Fonte: adaptado de Garcia-Ochoa et al. (2009)
Ho et al. (1995) determinaram periodicamente o kLa durante cultivos de clulas

vegetais de tabaco para diferentes velocidades de agitao e obtiveram resultados
similares. Observou-se que, no incio do cultivo, quando a concentrao celular ainda
estava relativamente diluda, os valores de kLa se aproximaram dos valores para o
biorreator sem clulas. Durante o princpio da fase exponencial de crescimento, porm,
esse valor cresceu entre 10 % e 20 %. Sugeriu-se que esse aumento tenha decorrido do
contato direto das clulas com as bolhas de ar, conforme Andrews e Fonta (1984b), ou da
reduo na tenso superficial interfacial entre as bolhas e o meio lquido, devido
liberao de substncias semelhantes a surfactantes (protenas, etc.) pelas clulas. Aps o

comeo da fase exponencial de crescimento, o kLa diminuiu com o aumento da densidade
celular at estabilizar na fase estacionria. Esses resultados aparecem na Figura 12,
juntamente com curva qO2, a qual apresentou o comportamento tpico descrito por
Garcia-Ochoa e colaboradores (2010).
Figura 12: Estudo do kLa e qO2 durante cultivo de clulas vegetais.

Fonte: adaptado de Ho et al. (1995)(HO et al., 1995)
Pouliot et al. (2000), por outro lado, observaram que valores de kLa obtidos durante um
cultivo de Saccharomyces cerevisiae e tratados atravs de tcnicas de reconciliao de
dados se mantiveram relativamente constantes.
2.5.3 Caminhos metablicos preferenciais em funo do kLa e da OTR

Dependendo da transferncia de oxignio em um biorreator, o metabolismo celular
pode ser deslocado para uma ou outra rota metablica preferencial, alterando, desta
forma, os produtos obtidos.
Schirmer-Michel et al. (2008) demonstraram a influncia das condies de aerao

como um fator chave na bioconverso de xilose para diferentes produtos (etanol, xilitol
ou biomassa). O fornecimento de oxignio e os valores de kLa foram modificados atravs
do emprego de diferentes taxas de aerao e de velocidades de agitao. Em condies
aerbias, as bactrias Candida guilliermondii priorizaram a produo de biomassa a partir
de hidrolisado de casca de soja; sob anaerobiose, obteve-se etanol com altos
rendimentos; e, sob limitao de oxignio (microaerao), grande parte da xilose foi
convertida a xilitol com glicerol como coproduto. No trabalho, ressaltou-se a importncia
do controle do fornecimento de oxignio para otimizar a obteno do produto desejado.
Gomez et al. (2006a) observaram a influncia das condies de transferncia de

oxignio no crescimento celular e na capacidade de biodessulfurizao de dibenzotiofeno
de Pseudomonas putida. A concentrao de oxignio dissolvido no cultivo o resultado
das duas taxas opostas, OUR e OTR, e foi variada atravs do emprego de diferentes
velocidades de agitao. Uma alta concentrao de oxignio dissolvido aumentou a taxa
de crescimento de biomassa, enquanto uma queda na capacidade de dessulfurizao foi
verificada.
Como j citado anteriormente, o trabalho de Macrae e Wilkinson (1958) permitiu

estabelecer os efeitos da concentrao de oxignio dissolvido no metabolismo de B.
megaterium. Enquanto altas concentraes inibiram a sntese de PHB, menores

concentraes favoreceram a produo do biopolmero. No entanto, a limitao de
oxignio pode resultar na esporulao das bactrias (WU et al., 2001), havendo o
consumo de PHB (SLEPECKY e LAW, 1961). No houve sntese de PHB em condies
anaerbias. Pandian et al. (2010) e Kulpreecha et al. (2009) tambm observaram a
induo do acmulo de PHB em limitao de oxignio.
Atravs desses estudos percebe-se a importncia do estudo do kLa como varivel

para o controle da transferncia de oxignio em um cultivo e, por conseguinte, para a
otimizao da obteno do produto de interesse.
3 Materiais e Mtodos
Os experimentos deste estudo foram realizados no Laboratrio de Biotecnologia do
Instituto de Cincia e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul (ICTA/UFRGS).
No presente trabalho, avaliou-se a influncia da presena de biomassa, mais

especificamente de bactrias Bacillus megaterium, e de sua fase de crescimento na
transferncia de oxignio atravs do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio
(kLa). Para isto, realizou-se um cultivo de 12 h em batelada em um biorreator tipo tanque
agitado. Foi realizada uma duplicata do cultivo. Denominou-se os dois cultivos de A e B,
respectivamente. Determinou-se periodicamente o valor do kLa, taxa de respirao
celular (OUR) e a concentrao de biomassa (X). Os testes foram realizados conforme
descrito abaixo.
3.1 Cultivo de Bacillus megaterium
3.1.1 Ativao celular e inculo

O micro-organismo empregado foi Bacillus megaterium DSMZ 32T fornecido pelo
Laboratrio de Bioprocessos da COPPE/UFRJ atravs do Prof. D.Sc Tito Lvio Moitinho
Alves.
As clulas foram mantidas congeladas a -18 C em microtubos Eppendorf contendo

soluo crioprotetora (20 % em volume de glicerol). O estoque foi renovado a cada 6
meses at a utilizao dos micro-organismos.
Para a reativao celular a fim do seu emprego como inculo no biorreator, realizou-
se o cultivo das clulas em frascos cnicos contendo meio mineral com as mesmas
concentraes de fonte de carbono e de nitrognio utilizadas no biorreator. Os frascos de
pr-inculo foram mantidos durante 18 h em estufa incubadora rotatria a 160 rpm e
temperatura de 30 C.
Para obteno do inculo, 2 % (v/v) do contedo do frasco cnico foi transferido para
outro frasco contendo mesmo meio de cultivo. Esse inculo foi mantido por
aproximadamente 5 h nas mesmas condies de agitao e temperatura anteriores, a fim
de atingir a fase de crescimento exponencial. Utilizou-se 2 % (v/v) desse inculo para o
cultivo em biorreator de maior escala. A Figura 13 apresenta o procedimento de
escalonamento realizado.
Os micro-organismos previamente reativados e em sua fase exponencial de

crescimento foram utilizados como inculo no biorreator, eliminando a necessidade da
fase de adaptao (fase lag) das clulas a esse. Para garantir esta etapa do crescimento,
realizaram-se medidas da concentrao celular por densidade ptica anteriormente
inoculao do biorreator.
Figura 13: Escalonamento para a inoculao do biorreator de 4 L.
Durante esses procedimentos, procurou-se manter condies estreis a fim de evitar

uma possvel contaminao do cultivo.
3.1.2 Meio de cultura

Utilizou-se como meio de cultivo o meio mineral proposto por Wang e Lee (1997)
acrescido de 1 mL de soluo de micronutrientes a cada litro. A fonte de carbono
empregada foi sacarose e a de nitrognio, sulfato de amnio. O pH inicial foi ajustado
para 7,0 atravs da correo com cido (H3PO4 2M) ou lcali (NaOH 2M). A fonte de
nitrognio s foi adicionada minutos antes da adio do inculo no biorreator. As
concentraes de todos os componentes do meio de cultivo encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1: Composio do meio de cultivo empregado para B. megaterium.
Meio mineral
MgSO4.7H2O 0,008 g L-1
Na2HPO4 3,6 g L-1
KH2PO4 1,5 g L-1
FeSO4.7H2O 0,05 g L-1
CaCl2.2H2O 0,01 g L-1
cido Ctrico 0,1 g L-1
Soluo de micronutrientes 1 mL L-1
Soluo de micronutrientes
H3BO3 300 mg L-1
CoCl2.6H2O 200 mg L-1
ZnSO4.7H2O 30 mg L-1
MnCl2.4H2O 30 mg L-1
(NH4)6Mo7O24.4H2O 30 mg L-1
NiSO4.7H2O 30 mg L-1
CuSO4.5H2O 10 mg L-1
Fonte de Carbono e Nitrognio
Sacarose (fonte de Carbono) 16 g L-1
Sulfato de Amnio (fonte de Nitrognio) 2 g L-1
3.1.3 Biorreator
Os cultivos foram realizados em batelada em biorreator experimental tipo tanque
agitado (CSTR) de 5 L de volume (4 L de volume til). Utilizou-se o equipamento
BIOSTAT B (B. Braun Biotech International Co.). O vaso feito de vidro conta com
prato de topo de ao inox com entradas para os eletrodos de medida e com camisa
para troca trmica. O ar fornecido por um compressor e injetado pelo fundo do
biorreator atravs do aerador localizado abaixo do impelidor.
O impelidor de ao inox do tipo turbina com dois conjuntos de 6 ps planas.

Devido ao conhecimento de que a configurao do impelidor afeta os valores de kLa
(GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009), procurou-se manter a mesma configurao dos
conjuntos de ps para os experimentos.
O biorreator est acoplado a uma unidade de controle. As variveis controladas

foram temperatura e velocidade do impelidor. A unidade ainda permite o controle de
pH e do percentual de oxignio dissolvido (pO2). possvel realizar sem controle
automatizado a injeo de antiespumante, caso necessrio, e regular a aerao
manualmente utilizando o rotmetro localizado na unidade de controle.
Um computador foi conectado ao conjunto para recepo e envio de sinais a fim

de realizar a aquisio de dados e o controle. Utilizou-se o software MATLAB
(MathWorks) como interface. O sistema completo aparece na Figura 14.
Figura 14: Biorreator com unidade de controle automtico ( direita) e sistema de

aquisio de dados ( esquerda) utilizado nos experimentos.
Os experimentos foram conduzidos com controle automtico de temperatura atravs

da circulao de gua de resfriamento pela camisa do reator e sem controle de pH.
Empregou-se uma velocidade de agitao de 600 rpm e aerao de 4 L min-1 (1 vvm) de
ar. A Tabela 2 resume os valores estipulados para estas variveis. Adicionou-se
antiespumante quando necessrio.
Tabela 2: Valores controlados para as variveis de cultivo.
Varivel Valor
Temperatura (C) 30
Velocidade de agitao (rpm) 600
Taxa de aerao (L min-1) 4
O eletrodo de pH foi previamente calibrado fora do reator. As medidas de percentual

de saturao de oxignio dissolvido foram realizadas por eletrodo polarogrfico
conectado ao biorreator. O eletrodo de oxignio dissolvido foi calibrado no meio de
cultivo para 100 % da saturao de oxignio e para 0 %, atravs da expulso do ar por
injeo de gs nitrognio, antes da adio do inculo.
3.1.4 Esterilizao
O biorreator, juntamente com os eletrodos, foi preenchido com gua destilada e
autoclavado fechado a 121 C durante 30 minutos. Posteriormente, substituiu-se a gua
destilada pelo meio de cultura a ser utilizado e se repetiu a autoclavagem por mais 20
minutos. A fonte de nitrognio s foi adicionada ao biorreator imediatamente antes do
comeo do cultivo, sendo, para isso, autoclavada separadamente.
3.2 Anlises
Na realizao deste estudo, procurou-se manter todas as condies operacionais
descritas sem alteraes, de modo que apenas a variao da quantidade de biomassa e
da respirao celular durante o cultivo afetassem os valores de kLa.
3.2.1 Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio

Para avaliar o comportamento do kLa durante o cultivo, o coeficiente volumtrico de
transferncia de oxignio foi medido atravs do mtodo dinmico proposto por
Bandyopadhyay e Humphrey (1967), com a modificao sugerida por Pouliot et al. (2000).
A tcnica consiste na interrupo do fornecimento de ar ao cultivo e na diminuio

quase total da agitao. Esta interrupo executada durante poucos minutos, a fim de
evitar influncias na evoluo do processo. Foi mantida uma velocidade de agitao de 50
rpm apenas para impedir que as clulas decantassem e fossem obtidas medidas
equivocadas de pO2 pelo eletrodo (POULIOT et al., 2000).
Ao interromper a agitao e a aerao, ocorre a queda da concentrao de oxignio

dissolvido devido respirao celular. Considera-se, para estas condies, que a
transferncia de oxignio (OTR) nula, e a concentrao de oxignio dada por:
= OUR = - qO2 X
dC (7)
dt
Integrando esta equao a partir de uma concentrao de oxignio Ci no momento em

que so interrompidas a agitao e a aerao (instante ti) a uma concentrao C em um
dado tempo t, temos:
C = Ci - qO2 X( t - ti ) (8)
A OUR pode ser obtida diretamente da inclinao da curva de concentrao de

oxignio dissolvido em funo do tempo. As taxas especficas de respirao celular (qO2)
foram calculadas em posse dos valores de OUR e dos dados de concentrao celular (X).
Ao religar a agitao e a aerao, a concentrao de oxignio volta a aumentar.

Considerando um cultivo em estado estacionrio, uma vez que a variao da
concentrao de oxignio dissolvida normalmente lenta durante o cultivo e utilizado
um perodo curto para aplicao do mtodo dinmico, espera-se que o pO2 retorne a
valores semelhantes aos de antes da aplicao do mtodo dinmico. Assim, obtemos do
balano de massa em estado estacionrio:
kL a C* - Ci = q X
(9)
que, reorganizada, torna-se:
Ci = C* -
qO2 X (10)
kL a
O balano de massa para o oxignio no trecho ascendente da curva do mtodo

dinmico ser dado por:
= kL a Ci C
dC (11)
dt
Integrando a equao acima do tempo em que se retoma a agitao/aerao t0 ao
tempo t, possvel determinar o kLa atravs da equao obtida do balano de massa para
o oxignio (SCHMIDELL et al., 2001):
Ci - C
ln
= kL a ( t -t0 )
Ci - C0
(12)
onde Ci, C0 e C so as concentraes de oxignio dissolvido logo antes da interrupo da

agitao/aerao, no tempo t0 ao retomar a aerao e em um tempo t durante a etapa de
absoro de oxignio, conforme a Figura 9.
O kLa obtido a partir da inclinao da reta de logaritmo natural da razo das

concentraes versus tempo para o trecho ascendente da curva do mtodo dinmico,
conforme a Equao (12) e a Figura 15.
Com fins ilustrativos, o Apndice B deste trabalho traz a determinao do kLa e do qO2
atravs do mtodo dinmico para um dos pontos do cultivo. Os demais pontos foram
determinados de maneira anloga.
Figura 15: Determinao experimental do kLa utilizando o mtodo dinmico.

Fonte: adaptado de Doran (1995)
Nesse mtodo, so, portanto, realizadas as seguintes consideraes:
A taxa de respirao celular no afetada pela interrupo da aerao/agitao,

nem pelas baixas concentraes de oxignio, desde que superiores concentrao
crtica;
Variao lenta da concentrao de oxignio dissolvido ao longo do cultivo,

permitindo assumir estado estacionrio durante intervalos de tempo limitados;
Aplicao do mtodo dinmico em um intervalo curto de tempo, sendo a

concentrao de OD antes da interrupo da agitao/aerao praticamente igual
no trmino da determinao;
Considera-se a concentrao Ci constante. Desse modo, admite-se que o valor de

qO2 no varia durante a determinao do kLa;
Inicialmente, efetuou-se a medida do kLa para o biorreator sem clulas. Nesse caso, em
que no ocorre consumo biolgico de oxignio, o gs foi expulso atravs da injeo de
nitrognio, segundo o mtodo dinmico gassing-out (RIET, 1979). Aps a adio do
inculo, realizou-se a determinao do qO2 e kLa a cada hora, a partir da segunda hora de
cultivo, quando a densidade celular j seria significativa.
Admitiu-se que o valor de kLa independe da posio no fermentador, uma vez que
foram empregadas altas taxas de agitao e o cultivo apresentava baixa viscosidade,
permitindo um bom grau de mistura.
A influncia de biomassa nos valores de kLa foi analisada tambm atravs da razo
entre os valores para o biorreator com clulas (KLa) e o valor obtido inicialmente para o
biorreator sem clulas (kLa). Esta razo conhecida como fator de aumento biolgico (E)
e dada pela Equao (6).
3.2.2 Concentrao de biomassa

A concentrao de clulas, ou biomassa (X), no biorreator foi determinada a cada
hora, a partir da segunda hora de cultivo, em duplicata. As determinaes foram
realizadas por medidas de peso seco celular (gravimetria) (DEMIRTAS et al., 2003;
BANDAIPHET e PRASERTSAN, 2006; SCHIRMER-MICHEL et al., 2008; KULPREECHA et al.,
2009). Para isso, tomaram-se alquotas do volume do biorreator em frascos para
centrfuga previamente pesados. As amostras foram centrifugadas durante 15 minutos a
3500 rpm, lavadas com gua destilada, e novamente centrifugadas nas mesmas
condies. A massa celular depositada foi deixada em estufa a vcuo a 75 C at atingir
peso constante. A biomassa foi obtida da seguinte maneira:
M - m
X = (13)
Va
onde M a massa do frasco com a massa seca celular; m a massa de cada frasco e Va
o volume coletado de meio em cada frasco centrifugado.
Para a determinao da biomassa imediatamente no incio do cultivo (0 h), utilizaram-

se os dados de concentrao celular do inculo, determinados pelo mesmo mtodo
gravimtrico. Como foi empregado um volume de 80 mL de inculo no biorreator para
totalizar aproximadamente 4 L de volume (2 % v/v), a biomassa no tempo 0 (X0) contida
no biorreator dada por:
X0 = 0,02Xi (14)
onde Xi a concentrao celular determinada para o inculo.
3.2.3 Anlise estatstica

Os dados experimentais foram submetidos anlise de varincia para permitir
concluir se os valores de kLa foram significativamente afetados durante o cultivo. Utilizou-
se a ferramenta de anlise de dados ANOVA: fator nico do MSExcel 2007 (Microsoft). O
mtodo encontra-se descrito por Montgomery e Runger (2003) e, resumidamente, por
Cvijovi et al. (2005).
4 Resultados e discusso
O Apndice A deste trabalho rene os resultados numricos obtidos para os valores
de biomassa (X), taxa de respirao celular (OUR), taxa especfica de respirao celular
(qO2) e coeficiente volumtrico de transferncia de massa (kLa) determinados ao longo
das 12 h de cultivo de Bacillus megaterium (A) e da sua duplicata (B).
4.1 Crescimento celular e consumo de oxignio

O crescimento celular durante o cultivo foi analisado atravs das curvas de biomassa
em funo do tempo de cultivo, mostradas na Figura 16. Para obter a curva tpica de
crescimento, plotaram-se os valores de biomassa em escala logartmica. Os grficos da
Figura 16 apresentam valores mdios de biomassa.
Observou-se a ausncia de fase lag de adaptao das clulas ao biorreator, conforme

esperado, j que o inculo, cultivado previamente no mesmo meio de cultivo, estava no
princpio da fase exponencial quando adicionado. A fase estacionria foi plenamente
atingida em aproximadamente 9 h de cultivo.
Ao longo das 12 h, percebeu-se a alterao no aspecto visual do cultivo, de

transparente para rosa leitoso. Tambm foi notado um odor caracterstico.
1
Biomassa (g L )
-1
0,1
0,01
0 2 4 6 8 10 12
Tempo de cultivo (h)
Figura 16: Curva de crescimento celular de B. megaterium para o cultivo em biorreator (A)
e a duplicata (B).
A curva da taxa de respirao especfica (qO2) durante o cultivo, obtida a partir dos
dados do trecho descendente da curva do mtodo dinmico e dos valores de biomassa
determinados por gravimetria, comportou-se conforme apresentado na Figura 17. Esses
resultados devem ser analisados conjuntamente com os de crescimento celular (Figura
16). Como j esperado, observou-se que o qO2 iniciou a partir de um valor mximo, uma
vez que as clulas j se encontravam na fase de maior respirao, a fase exponencial.
medida que a biomassa vai aumentando e as clulas comeam a se deparar com a
limitao de nutrientes, o cultivo vai se aproximando da fase estacionria, quando a
atividade metablica decai, com a consequente reduo no qO2. Esse comportamento
est de acordo com o observado na literatura por Garcia-Ochoa e Gomez (2009) e Ho et
al. (1995).
1,0
0,9
0,8
0,7
qO2 (g g s )
-1
0,6
-1
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
2 4 6 8 10 12
Figura 17: Curva da taxa especfica de consumo de oxignio durante cultivo de B.

megaterium.
Desse modo, a atividade metablica celular pode ser investigada atravs do

crescimento celular (Figura 16) e do qO2 (Figura 17) durante o cultivo. Pode-se perceber
analisando estas duas figuras que, em um tempo de cultivo de 6 h, j comea a ocorrer
uma leve desacelerao do crescimento celular. A partir de 7 h esta desacelerao se
torna clara e, em 9 h, o crescimento j se encontra em uma fase plenamente estacionria.
O cultivo no chegou a apresentar uma fase de morte celular.
4.2 Balano de massa para o oxignio: perfil de pO 2 e OUR

A percentagem de oxignio dissolvido (pO2) e a taxa de respirao celular (OUR)
durante o cultivo foram representados na Figura 18 e Figura 19, respectivamente. As
quedas acentuadas na curva de pO2 correspondem s determinaes de kLa atravs do
mtodo dinmico para o biorreator com clulas.
Durante um cultivo aerbio, as curvas de crescimento celular, taxa de respirao e a

de concentrao de oxignio esto inter-relacionadas. Como j observado, com o
aumento do nmero de clulas durante a fase exponencial de crescimento, ocorre uma
queda na concentrao de oxignio dissolvido, devido alta demanda de oxignio (OUR)
provocada pelo maior consumo de substrato durante esta etapa. Posteriormente, as
clulas ingressam na fase estacionria devido limitao de nutrientes, entre os quais
oxignio, e esta demanda diminui, fazendo com que os nveis de OD sejam recuperados.
Segundo Garcia-Ochoa e Gomez (2009), esse o comportamento apresentado na maioria
dos cultivos de micro-organismos disponveis na literatura.
Avaliando a curva de pO2 obtida, observou-se a tendncia a seguir esse

comportamento tpico para os dois experimentos, ocorrendo, no entanto, um
comportamento anmalo em 7 h e 8 h de cultivo. A taxa de consumo de oxignio mais
elevada nesta etapa do cultivo, como confirmado pela Figura 19, devido ao produto entre
biomassa e qO2 estar elevado. Ao realizar a determinao do kLa, acredita-se que a
concentrao de oxignio dissolvido tenha cado alm da concentrao crtica para esta
linhagem de B. megaterium.
Durante a aplicao do mtodo nesses pontos, a taxa de decrscimo no pO2 foi

bastante acentuada e superior ao tempo de resposta do eletrodo. Mesmo aps a
retomada da aerao e agitao, os valores de pO2 continuaram caindo. Portanto, devido
a esta limitao de oxignio, acredita-se que as clulas tenham alterado seu
metabolismo. Aps o cultivo atingir baixas concentraes de OD, as clulas passaram a
consumir o gs a uma taxa mais lenta, aumentando repentinamente o valor de pO2
medido e contrariando a tendncia que vinha sendo seguida. Posteriormente, a partir de
9 h, o metabolismo restabeleceu o comportamento tpico.
Observa-se na Figura 19 que as taxas de respirao celular a 7 h e 8 h apresentaram

uma queda inesperada. Isto ocorreu devido s alteraes metablicas descritas acima. As
curvas de OD e de OUR apresentam comportamentos contrrios. Esse resultado deve-se
ao balano de massa para o oxignio, dado pela Equao (1), em que a queda na OD
causada pela respirao celular ao longo do cultivo.
A
100
80
pO2 (%)
60
40
20
B
100
80
pO2 (%)
60
40
20
0 2 4 6 8 10 12
Figura 18: Perfil da concentrao de oxignio dissolvido
Conforme Pouliot et al. (2000), se a atividade da reao bioqumica for alta o

suficiente para reduzir significativamente os nveis de OD no cultivo, a determinao com
o mtodo dinmico torna-se invivel, devendo utilizar-se determinaes baseadas no

balano de gs. Esta concluso refora a afirmao feita por Badino Jnior et al. (2001).
1,2
1,0
0,8
OUR (s )
-1
0,6
0,4
0,2
0,0
2 4 6 8 10 12
Figura 19: Perfil da taxa de respirao celular durante cultivo de B. megaterium.
As concentraes mnimas de OD atingidas em 7 h de cultivo, aps as quais a B.

megaterium apresentou comportamento anmalo, foram de 19,8 % para o cultivo (A) e
21,9 % para a duplicata (B). As concentraes mnimas que foram medidas pelos
eletrodos de OD em cada hora para os experimentos A e B esto listadas na Tabela 3. Em
vista dos resultados, acredita-se que a concentrao crtica de oxignio para B.
megaterium encontre-se redor dos 20 %.
Tabela 3: Menores medidas registradas na concentrao de oxignio dissolvido para

os experimentos A e B.
Tempo (h) pO2 mnimo A (%) pO2 mnimo B (%)

2 49,4 69,4
3 47,6 66,4
4 38,3 56,3
5 42,6 32,4
6 29,8 36,5
7 19,8 21,9
8 34,2 19,4
9 23,4 18,8
10 30,7 27,7
11 43,7 36,5
12 44,8 54,9
4.3 Influncia da biomassa no k L a

Inicialmente, o valor medido do kLa para o biorreator sem clulas foi, em mdia, de
0,045 s-1 0,003 s-1.
Para anlise da variao do kLa durante o cultivo, foram desconsiderados os pontos

tomados em 7 h e 8 h, devido ao desvio de metabolismo descrito. Alm disso, a obteno
de poucos pontos para a aplicao do mtodo dinmico, uma vez que a concentrao de
OD caia muito rapidamente e no se desejava aproximar-se do valor crtico, dificultou a
obteno de valores confiveis de kLa nesses casos. A alterao metablica dos micro-
organismos fez com que os nveis de OD no retornassem aos valores iniciais, ao se
desligar a aerao na determinao em 7 h. Opostamente, esses nveis subiram
significativamente, e a seo ascendente da curva de determinao do kLa pelo mtodo
dinmico no apresentou um comportamento linear durante todo o trecho, dificultando
ainda mais a obteno de um valor confivel.
A Figura 20 apresenta os resultados obtidos para o kLa. Pode-se verificar que o valor
manteve-se relativamente constante ao longo do cultivo e, consequentemente, com a
quantidade de biomassa. O kLa no foi influenciado pelo qO2, no ocorrendo, portanto, o
efeito significativo da respirao celular no kLa descrito por Garcia-Ochoa e Gomez (2009)
e observado tambm por Ho et al. (1995).
0,05
0,04
kLa (s )
0,03
-1
0,02
0,01
0,00
0 2 4 6 8 10 12
Figura 20: Variao do kLa durante cultivo de Bacillus megaterium.
A fim de verificar a influncia da biomassa no valor do kLa, foram obtidos os valores

do fator biolgico de aumento (E). Os dados apresentados na Tabela 4 confirmam que
esse fator pode ser considerado aproximadamente igual a 1 durante o cultivo.
Tabela 4: Fator de aumento biolgico (E) em um cultivo de B. megaterium.
Tempo (h) E mdio Desvio padro

2 1,06 0,44
3 0,91 0,26
4 0,91 0,09
5 0,93 0,09
6 0,84 0,14
9 0,99 0,03
10 0,96 0,09
11 1,05 0,19
12 1,04 0,07
Como j esperado, a anlise de varincia (Tabela 5 e Tabela 6) mostrou que as

variaes entre os valores de kLa no foram significativas para representar uma alterao
do kLa ao longo do cultivo, sendo esses desvios devido ao acaso e a erros. Como indicado
na Tabela 6, o fator F foi inferior ao F crtico e a probabilidade (valor-P) para esse valor de
F foi bastante superior a 0,05. Esses valores indicam que no h diferena significativa
entre os valores de kLa. Tambm foram desconsiderados os valores obtidos a 7 h e 8 h
nesta anlise.
Tabela 5: Resumo da anlise estatstica de varincia ANOVA fator nico.
Grupo Contagem Soma Mdia Varincia

0 2 0,09085 0,045425 9,03E-06
2 2 0,0954 0,0477 0,000278
3 2 0,0821 0,04105 8,32E-05
4 2 0,0825 0,04125 4,51E-05
5 2 0,0839 0,04195 1,81E-06
6 2 0,0763 0,03815 1,4E-05
9 2 0,0899 0,04495 3,12E-06
10 2 0,0866 0,0433 9,8E-07
11 2 0,0949 0,04745 3,12E-05
12 2 0,0945 0,04725 4,5E-08
Tabela 6: Resultados da anlise estatstica de varincia ANOVA fator nico.
Fonte da variao SQ gl MQ F valor-P F crtico

Tempo de cultivo 0,000188 9 2,09E-05 0,447424 0,879177 3,020383
Erro 0,000467 10 4,67E-05
Total 0,000655 19
Esses resultados esto de acordo com Pouliot et al. (2000). Conforme os autores, para
cultivos no viscosos, como o caso de Saccharomyces cerevisiae e de Bacillus
megaterium, o kLa permanece relativamente constante durante o curso da fermentao
se as demais condies experimentais forem mantidas constantes. Pequenas mudanas
no kLa podem ser notadas, uma vez que esse valor levemente afetado pela
concentrao celular, produo de metabolitos e adio de agente antiespumante.
Obtiveram-se desvios padro relativamente altos entre os valores obtidos nos dois
cultivos para alguns pontos. Isto ocorreu devido a algumas importantes fontes de erros
que devem ser consideradas, entre elas:
Tempo de resposta dinmica do eletrodo de oxignio dissolvido no

considerado;
Adio de maneira diferenciada de antiespumantes, segundo a necessidade.
Assim como surfactantes, estas substncias tendem a diminuir os valores de
kLa (GARCIA-OCHOA e GOMEZ, 2009);
Estabelecimento do valor de aerao manualmente, atravs de rotmetro, e
oscilaes da presso de ar fornecido pelo compressor. No entanto, como a
aerao no afeta o kLa de maneira to significativa (DEMIRTAS et al., 2003),
esse fator de erro pode ser considerado menor;
Peculiaridades dos cultivos e do metabolismo celular.
De fato, Pouliot et al. (2000) observaram que as variaes dos valores de kLa
estimados pelo mtodo dinmico em um cultivo de Saccharomyces cerevisiae
desconsiderando os erros de medida e a dinmica do eletrodo de oxignio dissolvido
eram significantemente maiores do que os valores obtidos por reconciliao matemtica
dos dados.
A constatao de que o kLa pode ser assumido constante com a biomassa um ponto
positivo nos estudos com Bacillus megaterium, pois elimina a necessidade de monitorar e
controlar o kLa durante um cultivo em que as demais condies sejam mantidas
constantes. Desse modo, possvel realizar o ajuste do kLa de acordo com as condies
experimentais (taxa de aerao, velocidade de agitao, etc.), mantendo seu valor
durante o experimento. Ainda, os problemas envolvidos na utilizao do mtodo
dinmico, pela baixa concentrao de oxignio dissolvido nos perodos de maior OUR,
no precisam ser contornados. Como as clulas podem ser afetadas pela utilizao desse
mtodo, principalmente se a determinao do kLa no for rpida, pode ser determinado o
valor de kLa para o biorreator sem clulas, acabando tambm com esse inconveniente no
processo. Por fim, a obteno de um valor de kLa relativamente constante elimina a
biomassa como parmetro a ser ajustado em uma correlao para predio do kLa.
5 Concluses e Trabalhos Futuros

Neste trabalho, realizou-se cultivo batelada de B. megaterium durante 12 h em um
biorreator de 5 L do tipo tanque agitado. Foram determinados periodicamente valores de
coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) e taxa especfica de respirao
(qO2) atravs de mtodo dinmico e de biomassa atravs de mtodo gravimtrico, com o
objetivo principal de verificar se existe influncia da presena e concentrao de
biomassa no valor do kLa durante o cultivo.
As clulas de B. megaterium apresentaram resultados tpicos para micro-organismos

aerbios quanto ao crescimento celular, taxa especfica de respirao e taxa de
consumo de oxignio durante o cultivo. A biomassa apresentou leve desacelerao no
crescimento exponencial em cerca de 6 h e atingiu a fase estacionria plenamente em 9
h. No se verificou fase lag nem morte celular em 12 h de cultivo. A taxa de respirao
especfica apresentou queda progressiva medida que o cultivo se aproximou da fase
estacionria, indicando diminuio da atividade metablica devido limitao de
nutrientes.
A utilizao do mtodo dinmico para um cultivo de B. megaterium limitada nos

perodos de maior respirao, devendo-se empregar um mtodo alternativo de
determinao do kLa. A aplicao desse mtodo provocou uma queda no valor de
oxignio dissolvido provavelmente inferior concentrao crtica para o micro-
organismo, prxima a 20 %. A curva tpica de OD foi afetada pela alterao metablica
consequente. A taxa de respirao apresentou reduo atpica nesses casos, indicando
desacelerao da atividade metablica.
O kLa no se mostrou dependente da biomassa em cultivos de B. megaterium. Esse

resultado constitui um ponto positivo nos estudos desse micro-organismo, uma vez que
permite o ajuste e determinao do kLa antes da adio do inculo ao biorreator e torna
desnecessrio seu controle durante o cultivo. Esse fato evita a problemtica envolvida na
sua determinao com clulas. Alm disso, elimina-se um parmetro a ser inserido em
correlaes para prever o kLa em um cultivo de B. megaterium.
Como proposio para trabalhos futuros, de acordo com algumas lacunas a serem
exploradas identificadas no presente trabalho, encontram-se:
Repetio dos cultivos, evitando aproximar o cultivo de concentraes muito

baixas de oxignio dissolvido no momento da determinao do kLa,
considerando, inclusive, a utilizao de modificaes no mtodo de
determinao;
Investigao do valor real de concentrao crtica de oxignio para Bacillus

megaterium e estudo mais detalhado da forma com que concentraes de
oxignio abaixo desse valor afetam seu metabolismo;
Anlise de como a produo de PHB pode ser afetada pela taxa especfica de
respirao celular (qO2).
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APNDICE A
Resultados experimentais tabelados

Resultados experimentais tabelados para o cultivo (A) e sua duplicata (B). Na Tabela
10 os dados de 7 h e 8 h foram excludos devido ao comportamento atpico observado e
ao desvio no mtodo dinmico.
Tabela 7: Biomassa determinada atravs de peso seco celular durante cultivo de Bacillus
megaterium.
Tempo (h) X A (g L-1) X B (g L-1) X mdio (g L-1) Desvio padro (g L-1)

0 0,017 0,017 0,017 0,000
2 0,090 0,110 0,100 0,014
3 0,180 0,180 0,180 0,000
4 0,340 0,320 0,330 0,014
5 0,700 0,550 0,625 0,106
6 1,460 1,170 1,315 0,205
7 2,870 2,430 2,650 0,311
8 3,850 3,510 3,680 0,240
9 4,280 4,490 4,385 0,148
10 4,370 4,490 4,430 0,085
11 4,440 4,330 4,385 0,078
12 4,410 4,290 4,350 0,085
Tabela 8: Taxa de respirao celular obtida pelo mtodo dinmico ao longo do cultivo de
B. megaterium.
Tempo (h) OUR A (g L-1 s-1) OUR B (g L-1 s-1) OUR mdio (g L-1 s-1) Desvio padro (g L-1 s-1)
2 0,085 0,057 0,071 0,020
3 0,157 0,116 0,136 0,028
4 0,287 0,204 0,245 0,059
5 0,608 0,340 0,474 0,189
6 0,990 0,674 0,832 0,224
7 0,779 0,680 0,730 0,070
8 0,649 0,785 0,717 0,097
9 0,914 1,004 0,959 0,064
10 0,510 0,659 0,584 0,105
11 0,360 0,349 0,355 0,007
12 0,251 0,133 0,192 0,083
Tabela 9: Taxa especfica de respirao obtidas pelo mtodo dinmico ao longo do cultivo
de B. megaterium.
Tempo (h) qO2 A (s-1) qO2 B (s-1) qO2 mdio (s-1) Desvio padro (s-1)
2 0,947 0,518 0,732 0,303
3 0,869 0,646 0,758 0,158
4 0,844 0,637 0,740 0,147
5 0,868 0,618 0,743 0,177
6 0,678 0,576 0,627 0,072
7 0,271 0,280 0,276 0,006
8 0,168 0,224 0,196 0,039
9 0,214 0,224 0,219 0,007
10 0,117 0,147 0,132 0,021
11 0,081 0,081 0,081 0,000
12 0,057 0,031 0,044 0,018
Tabela 10: kLa determinado pelo mtodo dinmico durante cultivo de B. megaterium.
Tempo (h) kLa A (s-1) kLa B (s-1) kLa mdio (s-1) kLa mdio (h-1) Desvio padro (s-1)
0 0,0476 0,0433 0,0454 163,53 0,0030
2 0,0359 0,0537 0,0448 161,28 0,0126
3 0,0346 0,0475 0,0411 147,78 0,0091
4 0,0460 0,0365 0,0413 148,50 0,0067
5 0,0410 0,0429 0,0420 151,02 0,0013
6 0,0355 0,0408 0,0382 137,34 0,0037
7 - - - - -
8 - - - - -
9 0,0462 0,0437 0,0450 161,82 0,0018
10 0,0426 0,0440 0,0433 155,88 0,0010
11 0,0435 0,0514 0,0475 170,82 0,0056
12 0,0471 0,0474 0,0473 170,10 0,0002
APNDICE B
Clculo ilustrativo do mtodo utilizado para a determinao do kLa e do

qO2.
Os clculos deste exemplo foram realizados para o ponto correspondente a 5 h de
cultivo do reator A. A Tabela 11 contm os valores medidos e calculados para esse ponto.
As determinaes para os demais perodos dos cultivos foram conduzidas da mesma
forma.
Tabela 11: Aplicao do mtodo dinmico para determinao do kLa em 5 h de cultivo.

Tempo (h) Tempo (s) N (rpm) pO2 (%) (t - t0) (t - ti)
5,022 18397 600,48 88,9 - - -

5,024 18407 599,64 89,0 - - -
5,027 18418 600,36 88,8 - - -
5,030 18428 600,84 89,1 - - -
5,033 18438 600,12 89,5 - - -
5,036 18448 (ti) 599,16 89,22 (Ci) - - 0
5,039 18458 60,84 89,6 - - 10,16
5,041 18468 56,16 86,4 - - 20,38
5,044 18479 55,56 84,2 - - 30,7
5,047 18489 55,2 80,0 - - 41,14
5,050 18499 55,08 75,0 - - 51,3
5,053 18510 55,08 68,8 - - 61,68
5,056 18520 55,08 62,5 - - 71,84
5,058 18530 55,08 55,4 - - 81,89
5,061 18540 590,64 46,8 - - 92,33
5,064 18551 (t0) 559,44 42,61 (C0) 1 0,00 102,44
5,067 18561 580,8 52,6 0,24 10,27 -
5,070 18571 591,48 64,0 0,61 20,59 -
5,073 18582 595,2 73,8 1,11 31,03 -
5,076 18592 598,56 79,7 1,59 41,14 -
5,078 18602 599,28 83,1 2,03 51,41 -
5,081 18612 599,04 84,9 2,37 61,73 -
5,084 18623 599,76 86,5 2,83 72,17 -
5,087 18633 600,36 87,5 3,28 82,33 -
5,090 18643 599,4 88,3 - - -
5,093 18653 600,12 87,9 - - -
5,096 18663 601,08 87,9 - - -
5,098 18674 600,84 88,2 - - -
5,101 18684 600,96 88,8 - - -
5,104 18694 600 88,2 - - -
A curva da concentrao de oxignio dissolvido, devido interrupo da

agitao/aerao e sua posterior retomada, seguiu o comportamento tpico para esse
mtodo, conforme a Figura 21.
90
80
70
pO2 (%)
60
50
40
5,02 5,04 5,06 5,08 5,10 5,12

Figura 21: Concentrao oxignio dissolvido durante aplicao do mtodo dinmico.
a) Determinao da OUR e qO2
A seo descendente da Figura 21 foi satisfatoriamente ajustada para uma reta na

Figura 22. Atravs da regresso linear dos pontos, o coeficiente angular obtido foi de
aproximadamente - 0,61 s-1. Segundo a Equao (8), esse valor equivale taxa de
respirao celular (OUR), ou seja, a multiplicao entre qO2 e biomassa (X). Com os dados
de biomassa para este ponto, pode ser calculado o qO2 separadamente.
90
Dados experimentais
Ajuste linear
80
70
pO2 (%)
60
y = -0,6076x + 104,91
R = 0,992
50
40
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
( t - ti ) (s)
Figura 22: Determinao da OUR a partir da seo descendente da curva do mtodo

dinmico.
b) Determinao do kLa
Os valores de concentrao de oxignio dissolvido obtidos no trecho ascendente da

Figura 21 foram aplicados para determinar os valores de

, conforme a Tabela 11. De acordo com Equao (5), um grfico desses

logaritmos em funo do tempo pode ser ajustado para uma reta. Realizou-se, desse
modo, a regresso linear da Figura 23. O coeficiente angular fornece diretamente o valor
de kLa nesse perodo do cultivo. O valor obtido foi de 0,041 s-1.
3,5 Dados experimentais

Ajuste linear
3,0
2,5
ln((Ci - C)/(C i- C0 ))
2,0
1,5 y = 0,041x - 0,1259

R = 0,9966
1,0
0,5
0,0
0 20 40 60 80
( t - t0 ) (s)
Figura 23: Determinao do kLa a partir do trecho ascendente da curva do mtodo

dinmico.
ANEXO A
Correlaes para o kLa

Diversas correlaes para o coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa)
foram reunidas da literatura por (BADINO JNIOR et al., 2001). Esses modelos
encontram-se abaixo.
kL a = 41,44
vs 0,39
Pg 0,47 (15)
V
kL a = 19,89
vs 0,43 ap-0,12
Pg 0,53 (16)
V
Sh = 1,45Rem

* 0,83 0,43 0,74

ap vs -0,02
NDi -0,25 (17)
Sc Fr
vs
0,53
kL a
= 1,45
Q -1 Pgi * -0,40 (18)
Sc-0,20 *
Vi Q
As equaes (15), (16), (17) e (18) possuem coeficiente de correlao de,

respectivamente, 0,90; 0,92; 0,94 e 0,96. Esses valores representam bons ajustes para os
modelos, permitindo seu uso para estimativa do kLa com boa preciso.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

Autor: Giulia Carli Lorenzini

Co-orientadora: Profa. Dra. Rosane Rech

Porto Alegre, julho de 2012

Ao Prof. Marco Antnio Zchia Ayub, do ICTA/UFRGS, pela disponibilizao do

Ao Alan Budaszewski, pelo carinho e pacincia.

equipe do setor de Processo da Unitec, pelo incentivo, conhecimento transmitido e

Ao Programa Santander/UAM, pelo perodo de intercmbio acadmico.

E, finalmente, UFRGS e aos seus professores e funcionrios, que, ao longo deste

KL a Coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio na presena de clulas (s-1)

kL Coeficiente de transferncia de massa (m s-1)

a rea interfacial especfica (m-1)

qO2 Taxa especfica de consumo de oxignio (s-1)

OTR Taxa de transferncia de oxignio (g L-1 s-1)

OUR Taxa de consumo de oxignio (g L-1 s-1)

C Concentrao de oxignio dissolvido no seio do lquido (g L-1)

pO2 Concentrao de oxignio dissolvido no seio do lquido em relao saturao (%)

Xi Biomassa no inculo (g L-1)

X0 Biomassa inicial no biorreator (g L-1)

M Massa dos frascos com biomassa (g)

m Massa dos frascos vazios (g)

F Vazo molar (mol s-1)

N Velocidade do impelidor (rpm)

vs Velocidade superficial de gs ( = 4Q / (Dt) ) (m s-1)

V Volume de lquido no biorreator (L)

Vi Volume do cultivo pelo impelidor (m)

Va Volume de amostra coletado (L)

Tenso superficial (N m-1)

Viscosidade dinmica (Pa s)

Pg Consumo de potncia gasosa (W)

Pgi Consumo de potncia gasosa pelo impelidor (W)

Di Dimetro do impelidor (m)

Dt Dimetro do tanque (m)

Sh Nmero de Sherwood modificado ( = kLaDi / DO2 ) (adimensional)

Rem Nmero de Reynolds modificado (adimensional)

Sc Nmero de Schmidt ( = ap / (DO2) ) (adimensional)

Fr Nmero de Froude ( = DiN / g ) (adimensional)

D Difusividade mssica (m2 s-1)

i Momento da interrupo da agitao/aerao do biorreator

0 Momento da retomada da agitao/aerao no biorreator

out Relativo sada

* saturao no seio do lquido em equilbrio com o seio da fase gasosa

Lista de Abreviaturas e Siglas

F Valor F do teste F da anlise de varincia

Fcrt Valor de F crtico do teste F da anlise de varincia

OECD Organization for Economic Co-operation and Development

(Organizao para a Cooperao Econmica e Desenvolvimento)

OTR Oxygen Transfer Rate (Taxa de transferncia de oxignio)

OUR Oxygen Uptake Rate (Taxa de consumo de oxignio)

P Valor P (P-value) da anlise de varincia

PHB Poli(3-hidroxibutirato) ou poli(-hidroxibutirato)

SCP Single Cell Protein (protena microbiana)

Entre os processos biotecnolgicos de interesse, encontram-se os realizados com

Um desses processos consiste na produo de poli(3-hidroxibutirato), ou PHB, por

B. megaterium uma bactria estritamente aerbia que aceita uma variedade de

Em um cultivo aerbio como o de B. megaterium, um fator crtico a ser avaliado o

O kLa afetado por diversos fatores, entre eles, as condies operacionais e as

Entre os efeitos da biomassa no kLa estudados na literatura, encontram-se a alterao

um decrscimo do kLa com a biomassa. Ainda, detectou-se a carncia de estudos que

Realizar um cultivo batelada de B. megaterium em biorreator de bancada tipo

Determinar a curva de crescimento celular durante o cultivo de B. megaterium por

Avaliar a variao de oxignio dissolvido durante um cultivo de B. megaterium;

Obter a taxa de respirao (OUR) e a taxa especfica de respirao (qO2) durante

Determinar os valores de kLa periodicamente atravs de mtodo dinmico,

e F so as vazes molares de oxignio medidas na entrada e na sada do