Guia de Practicas Control Microbioogico de Medicamentos Farmac 2016 I 33 0

3B-2
GUA DE PRCTICAS
Unidad acadmica: EAP DE FARMACIA Y BIOQUMICA
CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS MEDICAMENTOS
Autores: Mg. Ana Mara Chvez Fernndez

Dr. Q.F. Vctor H. Guerra del guila
Mg. Q.F. Maril Jaramillo Briceo
F-CV3-3B-2 Rev. Abril 2016

INTRODUCCIN
La Microbiologa es una ciencia que estudia a los organismos microscpicos denominados
microorganismos los cuales se definen como aquellos seres vivos unicelulares o pluricelulares
carentes de organizacin tisular y que no pueden ser visualizados al ojo humano necesitando
para ello el microscopio.
Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesita el conocimiento de tcnicas nicas
denominadas tcnicas microbiolgicas. Estas tcnicas han permitido el conocimiento de las
diferentes estructuras y composicin bacteriana pudiendo comprenderse como muchas bacterias
se relacionan con el hombre ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el
mismo. As mismo, el conocimiento, manejo y utilizacin de los principales equipos,
instrumentos y materiales utilizados en el laboratorio de microbiologa es indispensable para la
ejecucin y desarrollo de estas tcnicas microbiolgicas que permitirn al alumno, futuro
profesional de la salud aplicar estos conocimientos en el control microbiolgico de los
medicamentos, por lo cual se aplicaran y desarrollaran en una primera etapa de las practicas.
La posibilidad de acceder a medicamentos seguros, eficaces y de calidad es un derecho esencial de

la poblacin que siempre debe ser garantizado. El aseguramiento de la calidad implica un conjunto
de metodologas y procedimientos que exceden el control del producto terminado, e involucran
todos los aspectos que intervienen en el proceso de elaboracin.
Entre estos aspectos puede mencionarse la forma y el modo en que se recibe la materia prima en el
establecimiento elaborador, los procesos de produccin del medicamento, las caractersticas de los
espacios donde se llevan adelante esos procesos, los modos en que se depositan y tratan los
productos una vez terminados, y el funcionamiento del laboratorio de control de calidad de la
planta, entre otros. Estos controles se fundamentan en orientaciones tcnicas que se basan en el
conocimiento exacto de la informacin contenida en las principales obras de referencia en general y
las consideraciones microbiolgicas que aplican a la industria farmacutica en particular, en la
preparacin y el control de los medios de cultivo, las cepas de prueba, los equipos, los indicadores
biolgicos para esterilizacin y los desinfectantes empleados en la industria farmacutica, en el
aprendizaje de la metodologa del anlisis microbiolgico del agua y la aplicacin de los criterios e
interpretacin de resultados en la industria farmacutica y de la evaluacin microbiolgica de
cuartos limpios y ambientes controlados.
Adems de ello deben conocerse las pruebas previas a la evaluacin microbiolgica de un producto
farmacutico no estril y estril, las pruebas de aptitud de los mtodos as como entender y
aplicar los criterios de validacin de los mtodos de anlisis microbiolgico.
F-CV3-3B-1 1 Rev. Abril 2016

Bioseguridad en el laboratorio
Desde hace tiempo la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en particular, la
seguridad biolgica son importantes cuestiones de inters internacional. En 1983, la OMS public la primera
edicin del Manual de bioseguridad en el laboratorio; en la que se alentaba a los pases a aceptar y
aplicar conceptos bsicos en materia de seguridad biolgica, as como elaborar cdigos nacionales de
prcticas para la manipulacin sin riesgo de microorganismos patgenos en los laboratorios que se
encuentran dentro de sus fronteras nacionales.
La tercera edicin del Manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) proporciona la

informacin ms actualizada para abordar los aspectos de la seguridad y la proteccin biolgica que se
plantean en el nuevo milenio. Asimismo, subraya la importancia de la responsabilidad personal. Adems,
hace reflexionar sobre los recientes acontecimientos mundiales que hacen evidente los peligros para la
salud pblica derivados de la liberacin o el uso indebido de agentes y toxinas microbianos.
Como profesionales de estas disciplinas, es importante conocer los principios bsicos de seguridad en el
trabajo con microorganismos, considerando los peligros relativos que implican su manejo. De acuerdo con
el potencial que tienen los microorganismos para infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado
en grupos de riesgo, que se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Clasificacin de microorganismos infecciosos por grupos de riesgo.
Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar

(riesgo individual y poblacional escaso o nulo) enfermedades en el ser humano o los animales.
Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades

humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
Grupo de riesgo 2
de entraar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la
(riesgo individual moderado, riesgo
poblacin, animales o el medio ambiente. La exposicin en el
poblacional bajo)
laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero existen
medidas preventivas y teraputicas ecaces y el riesgo de
propagacin es limitado.
Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades
Grupo de riesgo 3
humanas o animales graves, pero que de ordinario no se
(riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)
propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas
y teraputicas ecaces.
Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades graves

Grupo de riesgo 4 en el ser humano o los animales y que se transmiten con
(riesgo individual y poblacional elevado) facilidad de un individuo a otro, directa o indirectamente. Por
lo regular no existen medidas preventivas y teraputicas
ecaces
La OMS y los National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos, han propuesto las bases para la
jerarquizacin de los laboratorios en funcin del grupo de riesgo al que pertenecen los microorganismos que
manejan, indicando las condiciones de acceso, tipo de personal, equipo especial y diseo especfico de las
instalaciones.
En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad fsica de las personas involucradas; por
ello, no podr realizarse ninguna prctica o actividad experimental si el ejecutante no cuenta con los
elementos de proteccin indispensables para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas
aplicables, para lo cual se debern cumplir siempre las siguientes reglas.
1. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable vestir ropa
sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de algodn, zapatos cerrados, con suelas
gruesas y sin tacones o plataformas, as como traer el pelo recogido.
F-CV3-3B-1 3 REV. ABRIL 2016
2. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o los ojos con
las manos.
3. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabn y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salgan
por breves periodos.
4. Al manipular sustancias qumicas corrosivas o peligrosas se utilizarn guantes, lentes protectores y/o
mascarillas. No se deber pipetear oralmente ningn tipo de solucin o cultivo microbiano. Siempre se
utilizarn propipetas adecuadas para este fin.
5. No se admitirn visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atencin y pongan en riesgo la
seguridad en el trabajo.
6. Evitar la acumulacin de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades de manera
ordenada y en silencio para evitar accidentes.
7. Localizar extintores, botiqun y salidas de emergencia.
Sobre los procedimientos
1. Antes y despus de cada sesin prctica, los alumnos limpiarn las mesas de trabajo con el desinfectante que
se le proporcionar.
2. Cuando se utilice el mechero, este ser colocado en un lugar alejado del microscopio y otros equipos.
3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de conservar la calma,
inmediatamente informar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su
dispersin. b. Agregar abundante solucin desinfectante sobre las
toallas.
c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la
eliminacin de materiales contaminados.
4. Al concluir cada sesin prctica, el estudiante se asegurar de que los materiales de desecho u objetos
contaminados sean colocados en recipientes especficos para ello, as como en lugares apropiados. Debern
esterilizarse tal y como indique el profesor.
Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio
1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar la ayuda
del profesor, del ayudante o del tcnico del laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.
2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado para apagarlo,
desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia.
3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas,
autoclave, potenci- metros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
4. Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estn bien cerradas. Dejar limpias y secas
las mesas de trabajo.

I- PRACTICA N 1. Introduccion al laboratorio de microbiologa.
Reconocimiento y manejo de los principales equipos e instrumentos, preparacin de material de
vidrio, material auxiliar y su forma de esterilizacin.
1.1 Marco terico
En el laboratorio de Microbiologa es necesario utilizar material limpio, sin trazas de detergente
y estriles para el aislamiento y posterior identificacin de los grmenes que se est investigando,
se entiende por:
Limpieza al proceso fsico utilizado en los objetos en uso del laboratorio para eliminar materia
orgnica y residuos, mediante el lavado con agua con o sin detergente.
Desinfeccin es un proceso por el cual se elimina la mayor parte de microorganismos indeseables y en
el que se utilizan principalmente agentes qumicos sobre superficies.
Esterilizacin que viene a ser la destruccin de toda forma de vida, sta puede ser por
vapor saturado (autoclave) o por calor seco ( horno ).
Mtodos de esterilizacin
hmedo vapor a presin (autoclave)
aire caliente (horno)
calor
seco flameado
incineracin
discos de membranas o filtros absolutos
filtracin
Mtodos fsicos flujo laminar
rayos ultravioleta
no ionizantes
rayos infrarrojos
radiaciones rayos X
ionizantes rayos (cobalto-60)
radiacin electrnica de alta energa
gases xido de etileno
Metodos Qumicos formaldehdo
lquidos
-propiolactona
1.2 Competencias
Identifica y utiliza equipos y materiales en el Laboratorio de microbiologa
Conoce y hace uso de los conceptos de desinfeccin y esterilizacin.
Prepara el material de vidrio y metal para su esterilizacin.
1. 3 Materiales y equipos
Equipos e instrumentos tales como: Autoclave, horno, incubadora, bao Mara,
refrigeradora, equipo para luz ultravioleta , equipo de esterilizacin por filtracin, cmara
de flujo laminar, centrifuga y microscopio compuesto,
Portaobjetos y cubreobjetos
Papel para lente
Torundas de algodn
Gasa
Asa de Kolle
Cultivo bacteriano
Papel kraft
Tubos de prueba
Placas Petri
Balones, vaso de precipitados, pipetas y matraces
F-CV3-3B-1 5 de vidrio REV. ABRIL 2016
1. 4 Procedimiento
1. Examina cada uno de los siguientes equipos e instrumentos del laboratorio: autoclave, horno,
incubadora, cmara de flujo laminar, bao mara, equipo de esterilizacin por filtracin,
centrifuga y microscopio e identifica sus componentes, su aplicacin y utilizacin en el
laboratorio.
2. Preparacin de material de vidrio y material auxiliar
Confecciona tapones de algodn para el material de vidrio proporcionado, estos deben ser
consistentes y de un tamao apropiado que permita su manipulacin.
Empaqueta este material con papel kraft, en igual forma tambin se procede
con todo el material auxiliar que se use en el laboratorio para someterlo a un proceso
de esterilizacin y luego conservar su esterilidad un tiempo adecuado
Las placas Petri y los tubos de prueba (previamente taponados) se envuelven formando
paquetes de tres y seis unidades respectivamente. Debe tenerse especial cuidado en que
el papel utilizado se encuentre ntegro y sin orificios. Para las torundas e hisopos se
procede de igual forma.
En el caso de las pipetas, se cortan bandas largas (tiras) de papel kraft y se las envuelve
en forma diagonal y empezando por la punta, colocando un refuerzo de papel en esta
seccin, de esta forma la pipeta quedar ntegramente cubierta por el papel. Al final de la
envoltura se dejar una porcin en la que se escribir en nmeros la capacidad de volumen
de la pipeta.
Llevar a esterilizar el material preparado al horno a 180oC por dos horas.
5 Resultados
Registrar detalladamente cada una de las observaciones hechas y realizar los esquemas y dibujos
necesarios: Equipo de laboratorio (indicando sus componentes). Procede de igual forma con el
material de laboratorio empleado
6 Cuestionario.
1 .-Con qu propsito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

2. Por qu se emplean diferentes formas de esterilizacin?. Ejemplos
3.-A qu se debe la diferencia de tiempo en los procesos de esterilizacin por calor hmedo y
seco
Bibliografia
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack; Brock Biologia de los Microorganismos. 10a Ed.
2000
Jawetz E., Melnick y Adelberg. Microbiologa mdica. 25ed. Mxico, DF: Editorial Mc Graw Hill
Interamericana Editores, S.A. de C.V., 2011.

II.- PRACTICA N 2.- Preparacin de medios de cultivo y su forma de esterilizacin.
Tcnicas de siembra y estudio del desarrollo bacteriano.
2.1 Marco terico
Es importante aislar y observar el crecimiento de un microorganismo para su identificacin, por

lo que se utilizan materiales alimenticios artificiales preparados en el laboratorio llamados
medios de cultivo y su desarrollo es el cultivo.
Sus requerimientos varan considerablemente algunos slo requieren sustancias simples
(bacterias no exigentes ) y otros requieren de sustancias complejas ( bacterias exigentes )
Medios de Cultivo
Son sustancias o compuestos nutritivos estriles que permiten el crecimiento y
multiplicacin de los microorganismos en el laboratorio, este medio debe cumplir una
serie de condiciones como son temperatura, grado de humedad, y presin de oxgeno
adecuados, adems de nutrientes y factores de crecimiento y estar exento de todo
microorganismo contaminante con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas y
proceder a su identificacin mediante estudios complementarios.
Clasificacin de los medios de cultivo: Segn su composicin;

-Medios empricos.- Extrados de alimentos naturales
-Medios semi-sintticos.- Son medios de cultivo empricos enriquecidos de ciertos compuestos
qumicos
-Medios sintticos.- Medios qumicamente definidos
Segn su estado fsico: Medios lquidos, medios semislidos (con 0,3 a 0,5% de agar), medios
slidos (con 1 a 2% de agar).
Segn su aplicacin:
- Medios comunes o simples: permiten el desarrollo de la mayora de bacterias, sobre todo las no
exigentes.
- Medios especiales: Medios de enriquecimiento, medios enriquecidos, medios de conservacin y
transporte medios selectivos y medios diferenciales.
Preparacin de medios de cultivo:

Es preciso ejercer un cuidado meticuloso en su preparacin los que debern ser
esterilizados inmediatamente. una vez preparados
- Los tubos de ensayo que contienen los medios se tapan con tapones de algodn o tapas
metlicas o plsticas con el fin de evitar la penetracin de microorganismos extraos, luego se
esterilizan Las placas Petri se esterilizan por separado y luego los medios se vierten
aspticamente en ellas.
. Tcnicas de siembra:
En microbiologa las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por
esta razn se utilizan diversas tcnicas para separar un microorganismo de otro y obtener as un
cultivo puro que permita identificar al microorganismo aislado. Las tcnicas microbiolgicas se
basan en el aislamiento de microorganismos a partir de una muestra, por lo que es indispensable
tener en cuenta las mximas condiciones de asepsia, desde la toma de muestra hasta la siembra,
la cual debe efectuarse lo ms rpido posible.
Trminos
importantes:
Siembra
Inculo
Cultivo puro
Cepa
Se denomina tcnica de siembra al procedimiento mediante el cual se pone en contacto a los
microorganismos con un medio de cultivo y despus de un perodo de incubacin se produce el
desarrollo de colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra , entre los cuales estn los
siguientes:
- Siembra por dispersin y agotamiento
- Siembra por puntura
- Siembra por estra
- Siembra por inoculacin
- Siembra por incorporacin, en placa vertida, en masa o en todo el medio
- Siembra por diseminacin o en superficie o con cayado
Desarrollo bacteriano
Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basndose en el aspecto que
tienen sobre o dentro de los distintos medios de cultivo , es as que la observacin de las
caractersticas de crecimiento de las colonias de microorganismos en medio slido (agar) y lquido
(caldo), puede ser de gran utilidad.
Estudio bacteriano en medio lquido:
- Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rpido.
- Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones como:
presencia o ausencia de: turbidez, sedimento y pelcula.
- Produccin de gas: formacin de burbujas.
Estudio bacteriano en medio semislido:
- Movilidad
- Cambios metablicos
Estudio bacteriano en medio slido:
- Caractersticas morfolgicas de las colonias en cuanto a: elevacin, forma, borde,
superficie, tamao, consistencia y color de pigmentacin.
2.2Competencias
- Reconoce los principales medios de cultivo y su aplicacin.
- Prepara y esteriliza diversos medios de cultivo.
- Aplica diversas tcnicas de siembra para su cultivo y aislamiento hasta la obtencin de
cultivos puros
- Describe e interpreta sus observaciones usando la terminologa tcnica apropiada.
-
Preparacion de medios de cultivo y esterilizacion
2.3 Materiales y equipos
- Balanza, esptulas, algodn y papel kraft
- Probetas de 500 ml, frascos y/o beakers de 500 ml.
- Agua destilada.
- Trpodes con rejilla metlica
- Tubos estriles y placas Petri estriles ,baguetas, beakers
- Medios de cultivo deshidratados:
- Solido: Agar: Tripticase de Soya (TSA), Agar MacConkey para placas petri
- Agar SIM (Azufre Indol Motilidad) y TSA para tubos
- Liquido: Caldo: Tripticase de Soya (TSB) y/o Caldo peptonado.
2.4 Procedimiento
- Disolver en agua destilada los medios comerciales proporcionados, segn la indicacin del
envase, a los que contengan agar ser necesario someterlos a ebullicion para su completa
disolucin.
- Enfriar este preparado hasta aproximadamente 50C.
- Mide el pH del medio, con la cinta indicadora.
- Si es necesario, ajusta el pH empleando NaOH 1N o HCL 1N.
- Envasa, rotula, sealando el tipo de medio8y la fecha de preparacin.REV. ABRIL 2016
F-CV3-3B-1
- Esteriliza por autoclave a 15 lb de presin es decir a 121 C por 15 minutos.
- Controla la esterilidad del medio, por incubacin del mismo a 37C por 24 horas.
2. 5 Resultados
Mencione los criterios y consideraciones importantes a tener en cuenta para la preparacin de

medios de cultivo
2.6 Cuestionario:
1. Que importancia tiene el uso de los medios slidos?

2. Como controlara si el medio de cultivo preparado esta listo para realizar una siembra?
Tcnicas de Siembra y estudio del desarrollo en Medios de cultivo:

1. Medios de cultivo:
- Placas petri con agar TSA y Agar MacConkey
- Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado
- Tubos con caldo TSB
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas
aeruginosa
2. Desarrollo bacteriano:
- Utilizar los medios de cultivo preparados en la prctica anterior y proceder a
realizar los sembrados en los distintos medios segn tcnicas
Procedimiento:
1. Tcnicas de Siembra en Medios Lquidos, Semislidos y Slidos:
Siguiendo la metodologa descrita segn los esquemas anexos, proceder tal como sigue:
- Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de
microorganismos, y sembrar por el mtodo de dispersin y agotamiento en las placas de
TSA y MacConkey
- Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inculo del cultivo de bacterias y
sembrar en agar SIM, por el mtodo de puntura.
- Con el asa en aro, toma el inculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con agar
en pico de flauta o plano inclinado, por el mtodo de estra .
- Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar por el
mtodo de inoculacin en el tubo con caldo TSB.
2. Desarrollo bacteriano:
- Efectuar la lectura, observacin e interpretacin de los resultados para cada uno de los
medios y cepas empleadas.
3 Resultados:
Reportar y describir l a composicin y el fundamento de las diferentes clases de medios de

cultivo utilizados en la practica.
Observar y describir el crecimiento microbiano en cada medio de cultivo y la morfologa de las
colonias.
Bibliografia
2000
III.- PRACTICA 3: CULTIVO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAM (+) DE
IMPORTANCIA MEDICA E INDUSTRIAL: COCOS Y BACILOS GRAM (+).
3. 1 Marco terico
1. Estudio de los estafilococos

La patogenicidad de una especie de Estafilococo, se determina por produccin de
hemolisina,fermentacin del manitol y produccin de las enzimas coagulasa y
desoxiribonucleasa.
2. Estudio de los estreptococos

Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hemates, as
tenemos los estreptococos alfa, beta y gama hemolticos, segn sea la lisis parcial, total o
nula. Existen varias pruebas especficas para el estudio de estos microorganismos como son:
- Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta
hemoltico del Grupo A, de los Beta hemolticos del Grupo No A.
- Prueba de CAMP, que se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico
Grupo A, del estreptococo beta hemoltico grupo B.
- Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el perxido de
hidrgeno.
- Prueba de Optochin, para evidenciar la sensibilidad del S. pneumoniae al Optochin
y la resistencia del S. viridans
3. 2
Competencias
- Cultiva, aisla e identifica especies representativas del gnero Staphylococcus y
Streptococcus.
3. 3 Material y mtodos
Placas con agar sangre
Placas con agar manitol salado
- Placas con agar DNA
- Cultivo de: Staphylococcus aureus y S. epidermidis; Streptococcus viridans, S.
pyogenes, S. pneumoniae y S. agalactiae
- Set de colorantes Gram
- Reactivo de coagulasa
- Solucin HCl 1N
- Solucin de perxido de hidrgeno al 3%
- Discos de Bacitracina
- Discos de Optochin
3 . 4 Procedimiento
1.Estudio de los
estafilococos
Coloracin y morfologa
- Efecta frotices en lminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Despus de fijarlas al calor, realiza coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.
- Toma una placa de agar sangre y lo divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estafilococos: S.
aureus y S. epidermidis.
- Incuba a 37C por 24
horas.
Segundo da
- Observa el crecimiento en agar sangre.
-
Crecimiento en agar manitol salado

Primer da
- Toma una placa de agar manitol salado y divdelo en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con las mismas cepas del ejercicio anterior.
- Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Observa el crecimiento en agar manitol salado y describe la morfologa de las colonias.
- Observa el viraje del color del indicador rojo de fenol, debido a la acidez
Prueba de la coagulasa
Primer da
- Toma dos tubos que contienen 0.5 mL de plasma de conejo (reactivo de coagulasa).
- Inocula cada uno de ellos con 0.1 mL de cada una de las dos cepas de estafilococos.
- Incuba a 37C.
- Observa cada hora la aparicin de cogulos, por espacio de 4 horas.
- De ser negativo el resultado, se deja incubando y se hace una lectura final a las 24 horas.
- Si aparece un cogulo, la bacteria posee la enzima coagulasa.
-
Accin de la DNAsa
Primer da
- Toma una placa de agar DNA y la divide en dos sectores.
- Inocula en una mitad con el cultivo de S. aureus y la otra mitad con S. epidermidis.
- En ambos casos, la siembra la realiza con un solo trazo lineal perpendicular a la lnea
divisoria.
- Incuba a 37C por 24 horas
Segundo da
- Agrega a la superficie del agar 1 ml de HCl 1N y espera unos minutos.
- El HCl 1N precipita el DNA contenido en el medio de cultivo, enturbindolo.
- Observa la presencia de la enzima DNAsa, por la aparicin de un halo transparente
alrededor de la siembra, que indica la ausencia de DNA.
-
Prueba de la catalasa
- Toma una asada de cada cultivo de S. aureus y S. epidermidis y lo coloca sobre un
portaobjetos limpio.
- Aade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
- Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.
2. Estudio de los estreptococos

- Efecta frotis en laminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Despus de fijarlas al calor, realice coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersin y anota las caractersticas morfolgicas.
- Toma una placa de agar sangre y la divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S.
viridans (alfa hemoltico) y S. pyogenes (beta hemoltico).
Segundo da
- Observa las diferencias de hemlisis en agar sangre.
Prueba de la bacitracina
Se usa para la diferenciacin de un estreptococo Beta hemoltico del Grupo A, de los Beta
hemolticos del Grupo No A. Primer da
- Toma una placa de agar sangre y divde en dos sectores.

- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos:
S.agalactiae y S.pyogenes y coloca cuidadosamente y en forma estril con ayuda de una
pinza, un disco de Bacitracina en cada mitad. Incuba a 37C por 24 horas.
Segundo da
- Observa el halo de inhibicin, indicando la susceptibilidad a la Bacitracina del S. pyogenes.
-
Prueba de CAMP
Se usa para la diferenciacin de un estreptococo beta hemoltico Grupo A, del
estreptococo beta hemoltico grupo B.
Primer da
- Inocula con trazo lineal en una placa de agar sangre, una colonia de S. aureus.
- Luego perpendicular al trazo anterior, inocula las cepas de estreptococos: S.
agalactiae y S. pyogenes en cada mitad de la placa sin tocar la cepa de estafilococo.
Segundo da
- Observa los resultados obtenidos.
- El estreptococo beta hemoltico Grupo B (S.agalactiae), produce una sustancia (factor
CAMP), que agranda la zona de hemlisis producida por el estafilococo, factor que no
posee el estreptococo beta hemoltico Grupo A (S. pyogenes).
-
- Toma una asada del cultivo de Streptococcus pyogenes y coloca sobre un portaobjetos
limpio.
- Aada 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
Prueba de Optochin
Primer da
- Toma una placa de agar sangre y la divde en dos mitades.
- Inocula una mitad de la placa con S. viridans y la otra mitad con S. Pneumoniae
y coloca cuidadosamente y en forma estril con ayuda de una pinza, un disco de Optochin
en cada mitad.
8. 5 Resultados
Observar, interpretar y reportar los resultados para cada una de las pruebas.
8.6 Cuestionario
Qu factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparacin con otras
especies de estafilococos?
1. Qu enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?
2. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalistis, hacerse un
examen de secrecin farngea a fin de descartar la presencia de Streptococcus pyogenes
Bibliografia
2000

GENERO Bacillus
El genero Bacillus, agrupa microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, Gram

positivos, caracterizados por su capacidad de producir endoesporas y que pueden sobrevivir en el
ambiente por mucho tiempo y son de importancia medica e industrial.
2 Competencias
- Cultiva, aisla e identifica especies representativas del gnero Bacillus.
3 Materiales y equipos
- Cultivo de:Bacillus subtilis
- Tubos con gelatina
- Placas con agar sangre
- Tubos con caldo tioglicolato
- Tubos con TSA
- Perxido de hidrgeno
- Set de coloracin de esporas
- Set de coloracin Gram
4 Procedimiento
1. Grupo Bacillus
- Prepara frotices del cultivo de Bacillus subtilis y colorea por la tincin de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersin.
- Observa los bacilos dispuestos en cadenas largas con los extremos rectos. Las esporas se
localizan generalmente en la parte subterminal del bacilo y aparecen como reas no
teidas.
Inoculacin en agar sangre

Primer da
- Siembra la cepa de B.subtilis en agar sangre por el mtodo de dispersin agotamiento.
Segundo da
- En el agar sangre, observa la beta hemlisis producida por B.subtilis.
-
Inoculacin en TSA
Primer da
- Siembra la cepa de B.subtilis en TSA por el mtodo de dispersin agotamiento.
Segundo da
- Observa las caractersticas de la colonia, gris blanquecina, grande, extendida, de bordes
irregulares.
-
Hidrlisis de la gelatina
Primer da
- Siembra por el mtodo de puntura en el tubo con gelatina.
Segundo da
- Enfria el tubo y observa la hidrlisis de la gelatina.
-
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Aade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
-
Movilidad
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjeto limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del B.subtilis
utilizando el objetivo de 40x.
5 Resultados
Esquematizar, reportar e interpretar los resultados obtenidos en cuanto a su morfologa
microscpica y las caractersticas de cada uno de los microorganismos trabajados en la practica.
Cuestionario
. Porque se dicen grmenes anaerobios obligatorios

. Cual es la importancia medica e industrial de los generos Bacillus y Closridium.
Bibliografia
2000
PRACTICA 4.- Lectura, interpretacion y discusin de los

resultados. Identificacin de una muestra problema.
Redaccion y presentacin de Informe de la practica.

V.- PRACTICA 5: CULTIVO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAM (-) DE
IMPORTANCIA MEDICA E INDUSTRIAL: BACILOS GRAM ( - ) FERMENTADORES Y NO FERMENTADORES.
5 .1 Marco terico
1. Bacilos Gram negativos Fermentadores. Grupo Enterobacterias
Las diferentes especies de enterobacterias se identifican por su actividad metablica en
diferentes medios de cultivo que contienen carbohidratos, protenas, aminocidos, etc. Estos
microorganismos no producen citocromo oxidasa, lo que las diferencia de las Pseudomonas,
Alcalgenes, Aeromonas y Vibrios.
2. Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas
Algunas especies son patgenas oportunistas para el hombre, siendo la mas importante
Pseudomonas aeruginosa por ser la especie mas frecuentemente asociada con enfermedad
humana. P.aeruginosa desarrolla fcilmente en los medios de cultivo, la mayora de las especies
son identificadas en base a su olor caracterstico, morfologa colonial, pigmentos y otros.
3. Oxidasa Positivos. Grupo Vibrios
En el gnero Vibrio se describen dos grupos: un grupo comprende a Vibrio cholerae, causante del
clera y los Vibrio no aglutinantes que pueden producir diarreas no epidmicas. Otro grupo, lo
conforman las especies halofilicas, que tienen afinidad por el cloruro de sodio. Entre estos, V.
parahaemoliticus, que puede producir enfermedades similares al clera pero sin ser tan severas.
5. 2 Competencias
- Cultiva, aisla e identidica bacterias Gram ( - ) fermentadoras y no fermentadoras de
importancia medica e industrial.
5. 3 Materiales y mtodos
Bacilos Gram negativos Fermentadores. Grupo Enterobacterias
- Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB, TSI, Citrato de Simmons
- Tubos con agar: Urea, SIM
- Tubos con caldo: VP RM, peptonado,
lactosado
- Campanas de
Durham
- Cultivo de: E.coli, Salmonella tiphy, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Proteus vulgaris
- Set de colorantes
Gram
- Reactivos de: Kovacs, Rojo de Metilo, Voges Proskauer: (alfa naftol al 5% y KOH creatina
al 40%), oxidasa
- Lminas porta y cubreobjetos
Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

- Tubos con: TSA y TSI
- Tubos con TSB
- Cultivo de Pseudomonas
aeruginosa
- Set de coloracin
Gram
- Reactivo de
oxidasa.
Oxidasa positivos. Grupo Vibrio

- Cultivo de Vibrio cholerae
- Cultivo de Vibrio parahaemolyticus
- Placas con agar TCBS
- Tubos con agar TSI
- Reactivo de oxidasa
- Set de coloracin Gram
- Desoxicolato de sodio
5. 4 Procedimiento
1. Bacilos Gram negativos Fermentadores. Grupo Enterobacterias
- En su mesa encontrar una cepa representativa de los siguientes grupos: Proteae,
Escherichiae, Salmonellae, Shigellae, y Klebsiellae; con la cual trabajar durante toda la
prctica.
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tincin de Gram.
-
Movilidad
- Toma una asada de la cepa del cultivo proporcionado y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del
microorganismo utilizando el objetivo de 40x.
-
Inoculacin en agar Mc Conkey
Primer da
- Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento la placa con agar
Mc Conkey.
Segundo da
- La degradacin de la lactosa a cidos se manifiesta por el viraje de color a rojo del indicador
de pH rojo neutro; siendo estas colonias, lactosa positivas.
- Las colonias que son lactosa negativas son incoloras
-
Inoculacin en agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
Primer da
- Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento en la placa con agar
EMB.
- Incuba a 37C por 24 horas. Segundo da
- En el medio EMB observa colonias negruzcas con brillo metlico verdoso, cuando
metabolizan la lactosa o sacarosa y translcidas o de color mbar si son lactosa negativas.
-
Inoculacin en agar SS (Salmonella Shigella)
Primer da
- Siembra la cepa proporcionada por el mtodo de dispersin agotamiento en la placa con agar SS.
- Incubar a 37C por 24 horas.
Segundo da
- En el medio SS, la deteccin de coliformes se comprueba cuando hay degradacin a cido
mediante el indicador de pH rojo neutro y observar colonias negras, si las bacterias
producen sulfuro de hidrgeno.

Diferenciacin metablica del grupo de Enterobacterias
Primer da
- Con la cepa asignada, procede a inocular por los mtodos de siembra adecuados, los
siguientes medios:
- Caldos: Lactosado, peptonado y MR VP
- Agar: Urea, TSI, SIM, Citrato
Segundo da
El alumno anotar los resultados de este ejercicio y efectuar la identificacin de
la cepa proporcionada. Comparar los resultados con la tabla proporcionada: Ver tabla: 10-1.
a) Caldo Lactosado: despus del perodo de incubacin, observe el resultado obtenido
(cambio de coloracin, presencia de gas) y compare con los resultados de los dems alumnos
de la clase.
b) Agar Urea: la prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o
en todo el tubo y es negativa, si el medio permanece del color original. Observe el
resultado obtenido y compare con los resultados de los dems alumnos de la clase.
c) Agar TSI: es indispensable que la lectura en el plazo establecido y observe:
- Produccin de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo).
- Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo).
- No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado).
- Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
d) Agar SIM (Azufre Indol Movilidad):
- Detecta la produccin de hidrgeno sulfurado por medio de la observacin de un
precipitado negro en el medio.
- Realiza la prueba de produccin de indol como en (e)
- Observa la movilidad del microorganismo, y realiza un examen macroscpico del medio
por una zona de desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin.
e) Caldo peptonado: despus del perodo de incubacin:
- Agrega en zona 4 gotas del reactivo de Kovacs, en cada tubo que presenta desarrollo
bacteriano, luego agitar suavemente.
- La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona
superior del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo y es negativa si
no hay cambio alguno.
f) Caldo MR VP (reaccin de Rojo de Metilo):
- Agrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta
entre pH 4.4 (ROJO) y 6.0 (AMARILLO).
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable y negativa si da una coloracin
amarillo naranja.
g) Caldo MR VP (reaccin de Voges Proskauer): agregar a cada tubo:
- 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH creatina.
- Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto y deja en reposo durante 15
minutos.
- La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o
en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos (presencia de acetil-metil-carbinol) y
negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.
h) Agar Citrato:
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar
en 24 a 48 horas y negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
Nota: para la lectura se recomienda hacer uso de las tablas de identificacin
bioqumica que describen las reacciones de diagnstico clave para identificar los gneros de
las bacterias entricas
.
Reaccin de la Citocromo
Oxidasa
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento del tubo con la cepa proporcionada,
y transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.

- Considerara la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo
intensa en la tira, en un mximo de 5 segundos
2. Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por la tincin de Gram.
-
Inoculacin en TSA
Primer da
- Siembra la cepa de Pseudomonas aeruginosa en TSA por el mtodo de dispersin
agotamiento.
Segundo da Observa las caractersticas de la colonia y presencia de pigmentacin
- .
Inoculacin en agar TSI
Primer da
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estra la superficie del pico de
flauta.
- Rotula e incuba a 37C por 24
horas. Segundo da
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias
.
Reaccin de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias
Cultivo a 42C
Primer da
- Siembra la cepa de P. aeruginosa en los tubos de TSB por la tcnica de inoculacin.
Segundo da
- Observa la presencia o no de crecimientomicrobiano a 42 C, en los tubos
3. Oxidasa Positivo Grupo Vibrio
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tincin de Gram.
-
Inoculacin en agar TCBS (Tiosulfato Citrato Sales biliares Sacarosa)
Primer da
- Divide la placa de TCBS por la mitad y sembrar en cada mitad las cepas de Vibrio por el
mtodo de dispersin agotamiento.
Segundo da
- Las colonias de Vibrio cholerae que desarrollan en TCBS son circulares, con el borde
ligeramente opaco, con un halo claro alrededor y son amarillas por que metabolizan la
sacarosa.
- Las colonias de Vibrio parahaemolyticus que desarrollan en TCBS son circulares,
pegajosas, con halo claro alrededor, y son de color verde porque no degradan la sacarosa
Inoculacin en agar TSI

Primer da
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estra la superficie del pico de
flauta.
- Rotula e incuba a 37C por 24
horas.

Segundo da
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias.
Reaccin de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias.
Prueba del filamento o String Test
- Deposita una gota de la solucin de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lamina
portaobjeto.
- Emulsiona en ella una colonia de V.cholerae o V. Parahaemolyticus con el asa de siembra.
- Detecta la presencia de filamento al levantar el asa
5 Resultados
Observar e interpretar los resultados obtenidos, identificando en cada caso la especie problema.
6 Cuestionario
Describa el fundamento de las pruebas realizadas
7 Fuentes de informacion
Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Dowell Jr., V. R.; Janda, W. M.; Sommers, H. M.; Winn Jr, W. C.:
Color, Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. J. B. Lippincott Company. Third Edition.
Philadelphia, 1997.
2000
PRACTICA 6.- Lectura, interpretacion y discusin de los

resultados. Identificacin de una muestra problema.
Redaccion y presentacin de Informe de la practica.

VII. PRCTICA N 7.- TOMA DE MUESTRA Y ANLISIS MICROBIOLGICO DEL
AGUA CRITERIOS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS EN LA INDUSTRIA
FARMACUTICA. USP 38; CAP 1231.
Marco terico
El agua se usa ampliamente como materia prima, ingrediente y disolvente en el procesamiento,
formulacin y fabricacin de productos farmacuticos, ingredientes farmacuticos activos
(API), productos intermedios, artculos farmacopeicos y reactivos analticos.
Para asegurar el cumplimiento de determinadas normas de calidad microbiologica y qumica
mnimas, el agua usada en la produccin de frmacos o la que usa como fuente de alimentacin
para la preparacin de distintos tipos de aguas purificadas debe cumplir los requisitos de las
reglamentaciones bsicas relativas al agua potable (USP 38, CAP 1231).
3.2 Competencias
- Reconoce la importancia y adquiere destreza en la realizacin de controles microbiolgicos
del agua.
- Aplica y experimenta la metodologa existente para el anlisis de agua en la industria
farmacutica.
- Distingue los requerimientos de los tipos de agua en la industria farmacutica.
3.3 Materiales y equipos
- Materiales
o 4 Frascos estriles x 500 mL con 0,5 mL de Tiosulfato de Sodio al 3%
o 4 Frascos x 500 mL con 300 mL de agua destilada estril
o 4 Mecheros Bunsen
o 4 Mecheros de alcohol
o 8 Pipetas bacteriolgicas de vidrio estriles x 10 mL con algodn
o 4 Equipos de filtracin estriles (embudo y porta membrana) dos para agua potable y
otro dos para agua purificada
o 4 Bombas de vaco
o 4 Kitasatos estriles x 1 L
o 30 Membranas filtrantes de 0,45 m de dimetro con cuadrculas, estriles
o 8 Pinzas estriles
o 10 Placas petri con agar recuento de placa (plate count) o agar de recuento de placa
de mtodos estndar o TGYA.
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Recuento de Placa (Plate Count) o Agar de Recuento de
Placa de Mtodos Estndar o TGYA licuado
o 12 Pipetas estriles x 1 mL x 2 mL
o 24 Placas Petri estriles
o 4 Placas con Agar Mac Conckey.
o 4 Placas con Agar Cetrimide.
- Medios de Cultivo
o Agar de Recuento de Placa (plate count) o Agar de Recuento de Placa de Mtodos
Estndar (TGYA): 4,125 g para 150 mL para 6 placas con medio solidificado.
o Agar de Recuento de Placa (plate count) o Agar de Recuento de Placa de Mtodos
Estndar (TGYA) 2,35 g por cada 100 mL de medio licuado.
o Agar Mac Conckey, 8 g para 160 mL de medio.
o Agar Cetrimide, 7,2 g para 160 mL de medio.
3.4 Procedimiento
- Toma de muestra:
o Desinfectar el grifo o punto de salida del agua, flameando con un mechero de alcohol.

o Dejar correr 1 o 2 minutos el agua y proceder a la toma de muestra de 300 mL a 500
mL.
o Si se trata de aguas de cisterna o pozos, se sumergir el frasco sin tapa, permitiendo
el ingreso del agua.
o Utilizar un frasco estril de boca ancha con tapa rosca para la toma de muestra; si se
trata de agua potable el frasco deber contener 1 mL de tiosulfato de sodio por cada
litro de agua muestreada (inactivando el cloro presente en el agua potable).
o La muestra debe tomarse con sumo cuidado evitando rozaduras y lo mas estril como
sea posible, en el caso de agua potable o de cisterna.
o Procesar la muestra dentro de las dos primeras horas despus de haber sido
recolectada y si no fuera posible se deber mantener la muestra en refrigeracin (2C
a 8C durante mximo 12 horas).
o Cerrar hermticamente el frasco y etiquetar.
- Recuento
o Rotular el material a utilizar.
o Volumen de muestra:
Vertido en Placa: 1,0 mL
Este mtodo se aplica para agua potable.
Filtracin por Membrana: 100 mL y 10 mL
Este mtodo se aplica para agua destilada y agua potable; en el caso de agua
destilada se filtran volmenes de 100 mL para cada medio a emplear (APC, MC, AC)
y en el caso de agua potable se filtran 10 mL tambin para cada medio (APC, MC,
AC).
o Medio de cultivo: Agar Recuento de Placa de Mtodo Estndar o TGYA o Agar Plate
Count
o Condiciones de Incubacin: 30C a 35C.
o Tiempo de incubacin: 48 a 72 horas.
Mtodo de Filtracin por Membrana
Mtodo de Vertido en Placa
Fig. 3.1. Sistema de filtracin:

Filtracin por Membrana
Fig. 3.2. Siembra por
vertido en placa
3.5 Resultados
Registrar e interpretar los
resultados obtenidos.
3.6 Cuestionario
- Defina:
o Niveles de alerta
o Niveles de accin.
- Sustente el seguimiento microbiolgico que aplica a los diferentes tipos de agua.
3.7 Fuentes de informacin

- Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica 32 Rev.Formulario Nacional 27 Ed. (USP
32- NF 27).
- World Health Organization. WHO Technical Report Series, No. 929, Thirty-ninth report.
2005. Annex 3. WHO Good Manufacturing Practices: water for pharmaceutical use.

VIII. PRCTICA N 8.- TOMA DE MUESTRA Y ANLISIS MICROBIOLGICO DE
AMBIENTES Y SUPERFICIES CRITERIOS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS EN
LA INDUSTRIA FARMACUTICA. USP 38; CAP 1116.
4.1 Marco terico
Dado que los microorganismos se desarrollan en una amplia variedad de ambientes naturales,
es importante controlar su presencia, ms an cuando en la industria farmacutica se llevan a
cabo procesamientos aspticos de frmacos a granel, formas farmacuticas y en ciertos casos,
dispositivos mdicos, adems de la necesidad de la necesidad del establecimiento y control de
la calidad microbiolgica de ambientes controlados (USP 38; CAP 1116).
4.2 Competencias
- Reconoce la importancia y adquiere destreza en la realizacin de controles
microbiolgicos de los ambientes en la industria farmacutica.
- Aplica y experimenta la metodologa para la toma de muestra de ambientes y
superficies.
- Observa las especificaciones y requerimientos de los cuartos limpios y ambientes
controlados en la industria farmacutica.
4.3 Materiales y Equipos
- Materiales:
o 4 Lminas de papel manteca estriles de dimensin A4, que en la parte central
presenten un recuadro recortado de 10 x 10 cm
o 4 Tubos de 30 x 20 mm conteniendo 10 hisopos estriles cada uno
o 12 Tubos estriles de 18 x 150 mm
o 20 Pipetas estriles x 1 2 mL
o 1 Vortex
o 40 Placas Petri estriles descartables
o 4 Probetas estriles x 100 mL
o 4 Frascos de 100 mL de Agar Digerido de Casena y Soja.
o 4 Frascos de 100 mL Agar Sabouraud Glucosado.
o 4 Tubos con 5 mL de Cloruro de Sodio al 0,9 %.
o 12 Placas Rodac con Agar Digerido de Casena y Soja*.
o 16 Placas Petri con Agar Digerido de Casena y Soja*.
- Medios de Cultivo y Reactivos:
o Agar Digerido de Casena y Soja: 4 g por cada 100 mL de medio.
o Agar Sabouraud Glucosado: 6,5 g por cada 100 mL de medio.
o Cloruro de Sodio: 0,45 g de Cloruro de Sodio en 50 mL de agua destilada
4.4 Procedimiento
- Microorganismos Viables Transportados por el Aire:
o Placas de Sedimentacin.
- Microorganismos Viables en Superficies:
o Placas de contacto Rodac (Replicate Organism Direct Agar Contact).
o Hisopado.
Fig. 4.1. Hisopos Fig. 4.2. Solucin de enjuague

Fig. 4.3. Placas Rodac
- Control de ambientes
o Seleccionar el rea del laboratorio para realizar el control ambiental.
o Colocar placas petri con Agar Digerido de Casena de Soya (por duplicado cada
punto a monitorear) por espacio de 20 minutos como mnimo.
o Realizar el mismo procedimiento pero esta vez exponiendo placas petri con agar
Sabouraud Glucosado.
o Luego de la exposicin, proceder a incubar:
o Las placas de Agar Digerido de Casena de Soya a 30C a 35 oC, por dos das
o Las placas de Agar Sabouraud Glucosado a 20 C a 25 oC, por cinco das.
o Realizar las observaciones diarias de las placas para evidenciar el crecimiento
microbiano y reportar los resultados obtenidos.
o Realizar las observaciones al microscopio y reportar los resultados obtenidos:
o Para las bacterias realizar primero la coloracin Gram.
o Para los hongos preparar lminas con hidrxido de potasio (KOH).
- Control de superficies
Seleccionar el mtodo adecuado para los objetos asignados.
o Placas RODAC:
Aplicar la placa sobre la superficie a evaluar.
o Hisopado:
a. Embeber el hisopo en solucin salina e hisopar segn el tipo de superficie a
evaluar.
- Usando la plantilla con la superficie delimitada haciendo uso de las lminas
con el rea de 10 x 10 cm. , hacindolo primero en forma horizontal, luego
vertical, en diagonal de derecha a izquierda y despus de izquierda a derecha.
- Hisopado directo.
b. Terminada la operacin introducir el hisopo en un tubo que contiene 5 mL de
solucin salina, rotular y agitar en un vortex por 1 minuto.
c. Tomar 1 mL y trasladarlo a una placa estril para adicionarle 15 mL de agar
digerido de casena y soja.
d. Incubar de 30 a 35C por 48 a 72 horas.
e. Reportar las observaciones y anotar los resultados obtenidos.
f. Realizar las observaciones al microscopio y reportar los resultados obtenidos:
i. Para las bacterias realizar primero la coloracin Gram.
ii. Para los hongos preparar lminas con hidrxido de potasio (KOH).
4.5 Resultados
Registrar e interpretar los resultados obtenidos
4.6 Cuestionario
- En qu se basan las diferentes normativas que clasifican los ambientes controlados?
- Qu clase de ambientes requieren un constante monitoreo ambiental ?
Bibliografia
1.Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica USP Edicin 38 Formulario Nacional 33 Ed.
2.Farmacopea Britnica 2016 (British Pharmacopoeia, 2016), 2016.
3.Farmacopea Europea Edicin (European Pharmacopoeia, 8 Ed.), 2016.
Pginas Web
1.- http://www.usp.org/es/usp-nf
2.- https://www.edqm.eu/en/european-pharmacopoeia-8th-edition-1563.html
3.- https://www.pharmacopoeia.com/what-is-the-bp
4.- http://www.who.int/es/
6.- http://www.fip.org/

IX.- PRCTICA N 9.- PRUEBAS DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO Y APTITUD DEL
MTODO PREVIO AL ANLISIS DE UN PRODUCTO FARMACUTICO NO ESTRIL:
LISTA DE CHEQUEO Y EJECUCIN. USP 38; CAP 61; 62.
5.1 Marco terico

El examen microbiolgico de productos farmacuticos no estriles incluye en primera instancia
las pruebas de recuento cuantitativo de bacterias mesfilas y hongos que pueden desarrollarse
en condiciones aerbicas.
Si los productos a examinar poseen actividad antimicrobiana, sta deber eliminarse o
neutralizarse para lo cual los inactivadores debern ser de probada eficacia adems de ser
inocuos para los probables microorganismos contaminantes.
Previo al anlisis debern realizarse la prueba de promocin de crecimiento y la prueba de
aptitud del mtodo de recuento, sta ltima ser definida segn la naturaleza del producto y
el lmite de microorganismos requerido (USP 38: <61>, <62>).
5.2 Competencias
- Reconoce la necesidad de ejecutar procedimientos previos a las pruebas
microbiolgicas de recuento en productos no estriles.
- Aplica y experimenta la metodologa para las pruebas de promocin de crecimiento y
de aptitud de los mtodos de recuento microbiano.
5.3 Material y Equipos
- Materiales
o 35 Tubos con 10 mL de Buffer pH 7,2 (volumen total 350 mL).
o 15 Tubos con 10 mL de Buffer pH 7,2 (volumen total 350 mL) ms Polisorbato al
0,05%
o 88 Placas Petri estriles
o 5 Pipetas de 0,1 1,0 mL
o Gradillas
o 15 Esptulas de Drigalsky estriles
o 24 Pipetas de 2,0 mL
o 12 Placas con Agar Manitol Salado
o 12 Placas con Agar Cetrimide
o 12 Placas con Agar Sabouraud
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Digerido de Casena y Soja
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Manitol Salado
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Cetrimide
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Sabouraud
o 8 Tubos com 9 mL de Caldo Agar Digerido de Casena y Soja
o 4 Tubos com 9 mL de Caldo Sabouraud
- Medios de Cultivo y Reactivos:
o Fosfato monobsico de potasio
o Agar Manitol Salado
o Agar Cetrimide
o Agar Sabouraud
o Agar Digerido de Casena y Soja
o Agar Cetrimide
o Agar Sabouraud Glucosado
o Caldo Digerido de Casena y Soja
o Caldo Sabouraud
- Cepas de estudio:

o 4 Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo
menos 5 a 7 das.
o 4 Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo
menos 24 horas antes de la prctica.
o 4 Cultivos puros de Pseudomonas aeruginosa en Agar Casoy (agar inclinado), de por
lo menos 24 horas antes de la prctica.
5.4 Procedimiento
Para la prueba de promocin del crecimiento de los medios se emplearn los mtodos de:
Vertido en placa, Extensin en superficie e Inoculacin Directa utilizando:
a. Agar Digerido de Casena y Soja.
b. Agar Saboureaud Dextrosa.
c. Agar Cetrimide.
d. Agar manitol salado.
e. Caldo Digerido de Casena y Soja.
- Promocin del Crecimiento de los Medios (Medio ms inculo)
o Inocular los medios con no ms de 100 ufc de los siguientes microorganismos.
- Staphylococcus aureus (ATCC 6538) o ambiental, Pseudomonas aeruginosa (ATCC
9027) o ambiental, para los medios medios (a) y (b).
o Inocular los medios con no ms de 100 ufc de los siguientes microorganismos.
- Aspergillus niger (ATCC 16404) o ambiental, para el medio (d).
o Incubar de 30C a 35C por tres das para el caso de las bacterias y de 20C a 25C
por 5 das para el caso de hongos.
o Reportar los resultados obtenidos teniendo en consideracin que el resultado no
debe diferir en un factor mayor que 2 a partir del valor calculado en medios slidos.
- Mtodo de Vertido en Placa (vase figura 3.2.):
o Agregar 1 mL de la suspensin (inculo de 100 ufc) y 15 a 20 mL de los medios
slidos adecuado segn sea el caso, manteniendo la temperatura de a no ms de
45C.
o Incubar segn se indic anteriormente.
o Realizar el recuento y reportar la media aritmtica del nmero de ufc obtenido en
cada medio.
o Contrastarlo con el nmero de ufc del inculo original.
- - Mtodo de Extensin en Superficie:
o Esparcir un volumen de 0,1 mL de suspensin (inculo de 100 ufc) en las placas que
contienen los medios segn sea el caso.
o Incubar segn se indic anteriormente.
o Realizar el recuento y reportar la media aritmtica del nmero de ufc obtenido en
cada medio
o Contrastarlo con el nmero de ufc del inculo original.
Fig. 5.1. Siembra en Superficie

- Inoculacin Directa:
o Agregar un inculo de suspensin bacteriana correspondiente equivalente a 100 ufc,
al caldo especfico.
Tabla 5.2. Preparacin de las Cepas para las Pruebas de de Promocin de Crecimiento y
Aptitud del Mtodo de Recuento e Presencia del Producto
Aptitud del Mtodo de Recuento en
Promocin de Crecimiento
Microorganismos Preparacin de Presencia del Producto
Cepas
RTMA RTCHL RTMA RTCHL
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS (NMP)
100 ufc
S. aureus 30 35C 100 ufc
30 35C 30 25C
18 24 h
3d 3d
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS (NMP)
30 35C 100 ufc
P. aeruginosa 30 35C
100 ufc
18 24 h 30 25C
3d
3d
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS (NMP)
100 ufc
B. subtilis 30 35C
30 35C
100 ufc
18 24 h 30 25C
3d
3d
ADCS A. SAB ADCS SAB
A. SAB o C.SAB
100 ufc 100 ufc 100 ufc 100 ufc
C. albicans 20 25C
30 35C 20 25C 20 25C 20 25C
23d
5d 5d 5d 5d
ADCS A. SAB ADCS SAB
A. SAB o PDA
100 ufc 100 ufc 100 ufc 100 ufc
A. niger 20 25C
30 35C 20 25C 20 25C 20 25C
57d
5d 5d 5d 5d
5.5
Resultados
Emisin de reporte final.
5.6 Cuestionario
- Cul es la finalidad para la aplicacin de los diferentes mtodos de recuperacin de
microorganismos ?
- De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecucin de las pruebas de
promocin de crecimiento a qu microorganismos se restringira esta prueba
preliminar?
Bibliografia
Pginas Web

X. PRCTICA N 10.- ANLISIS MICROBIOLGICO DE FORMAS FARMACEUTICAS
NO ESTERILES: SLIDAS Y LIQUIDAS. VALIDACIN DEL MTODO. USP 38 CAP
61; CAP 62.
Marco terico
El anlisis microbiolgico de estas formas farmacuticas incluye pruebas que permiten calcular el
nmero de microorganismos aerbicos viables y el nmero de hongos filamentosos y levaduras
presentes, as como determinar la ausencia de especies microbianas patgenas consideradas
como indicadores de contaminacin (USP 38: CAP 61; CAP 62).
6.2 Competencias
- Reconoce la importancia de comprobar la aptitud de los mtodos de anlisis: recuento y

pruebas de microorganismos especficos.
- Aplica y experimenta la metodologa para las pruebas de microorganismos especficos de
una forma farmacutica slida oral y liquida.

- Materiales
o 24 Tubos x 9 mL de Buffer pH 7,2
o 12 Tubos con 9 mL de Caldo Mossel
o 12 Frascos de 250 mL, con 90 mL de Buffer pH 7,2
o 8 Frascos de 250 mL, con 100 mL de Buffer pH 7,2
o 4 Frascos con 200 mL de Agar Digerido de Casena y Soja
o 4 Frascos con 200 mL de Agar Sabouraud Dextrosa.
o 4 Frascos con 90 mL de Caldo Mossel.
o 16 Frascos con 90 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja
o 4 Frascos con 100 mL de Caldo Mac Conckey
o 4 Frascos con 100 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis.
o 12 Placas con Agar Manitol Salado
o 4 Placas con Agar Cetrimide
o 16 Placas con Agar Violeta Rojo Bilis.
o 32 Pipetas de 1 mL, 2mL
o 12 Pipetas de 10 mL.
o 1 Bao Mara a 22,5 C
o 20 Pipetas de 5 mL.
o 4 Asas de siembra
- Medios de Cultivo y Reactivos
o Buffer pH 7,2
o Caldo Mossel
o Agar Sabouraud Glucosado
o Caldo Mossel
o Caldo Mac Conckey
o Caldo Rappaport Vassiliadis.
o Agar Cetrimide
o Agar Violeta Rojo Bilis
- Cepas de estudio:

o Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, cultivo de 24 horas en Agar Digerido
de Casena y Soja en solucin amortiguada de fosfato monobsico de potasio de pH 7,2
que permitan obtener inculos de 100 ufc.
o Aspergillus niger, cultivo en solucin amortiguada de fosfato monobsico de potasio ms
0,05 % de polisorbato 80, de pH 7,2 de 5 das que permita obtener inculos de 100 ufc.
6.4. Procedimiento
6.4.1.Criterios a aplicar segn la solubilidad de las muestras:
Proceder a preparar las muestras a analizar para cada una de las siguientes pruebas segn los
criterios que se describen:
a. Productos solubles en agua: Dilucin 1 en 10 (o adicionales de ser necesario) del producto a
examinar (ajustando el pH de 6 a 8, de ser necesario), en:
- Solucin Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0
- Solucin Amortiguada de Fosfato de pH 7,2
- Caldo Digerido de Casena y Soja
b. Productos no grasos insolubles en agua: dem al anterior; puede aadirse un tensoactivo (1
g por L de polisorbato 80).
Fig. 6.1. Dilucin de

la muestra a evaluar
6.4.2. Pruebas de Verificacin de Propiedades de Promocin de Crecimiento e Inhibitorias de

los Medios
Analizar cada preparacin de medio verificando las propiedades promocin de crecimiento de
los medios en general, as como las propiedades inhibitorias especficas y las propiedades
indicadoras de los medios selectivos y diferenciales, segn sea el caso (vase tabla 6.1.a. y b.).
Tabla 6.1.a. Propiedades de Promocin de Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios
Prueba Medio Propiedad Cepa
Prom. de crecimiento E. Coli / P. aeruginosa
Bacterias Gram- Negativas C. Moss
Inhibitoria S. aureus
tolerantes a la Bilis
VRB Prom. Crecim + Indic. E. Coli / P. aeruginosa
Prom. De crecimiento E. coli
C.Mc
Escherichi coli Inhibitoria S. aureus
MC Prom. Crecim + Indic. E. coli
Tabla 6.1.b. Propiedades de Promocin de Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios

Prueba Medio Propiedad Cepa
Prom. de crecimiento S. typhimurium
CRV
Inhibitoria S. aureus
Salmonella
Prom. Crecim + Indic. S. typhimurium
XLD
Indicadora E. coli
Prom. de crecimiento P. aeruginosa
Pseudomona aeruginosa CT
Inhibitoria E. coli
Prom. Crecim + Indic. S. aureus
Staphylococcus aureus Mn
Inhibitoria E. coli
C.Ref Prom. de crecimiento Cl. sporogenes
Clostridios
A.Col Prom. de crecimiento Cl. sporogenes
C.Sab Prom. de crecimiento C. albicans
Candida albicans
SAB Prom. Crecim + Indic. C. albicans

6.5. Pruebas de Aptitud de los Mtodos de Recuento y de Microorganismos Especficos:
Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparacin de la muestra de 1 en 10, al
momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio indicado en una cantidad de
no ms de 100 ufc (medio ms producto a analizar y ms inculo).
Realizar la prueba segn se indica en el perodo ms corto de incubacin; cualquier actividad
antimicrobiana, requiere de la neutralizacin correspondiente.
A. Aptitud del Mtodo de Recuento
a. Inoculacin y dilucin: Agregar a las muestras de productos preparadas y a un control (sin
producto), un volumen de suspensin microbiana para obtener un inculo de 100 ufc.
b. Recuperacin de microorganismos en presencia de producto:
Filtracin por Membrana (vase figura 3.1.):
- Transferir una cantidad que represente 1 g del producto al filtro de membrana con un
volumen adecuado de diluyente.
- Transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Digerido de Casena y Soja
para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA).
- Transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Saboureaud Dextrosa para
determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL).
- Incubar.
- Realizar el recuento y reportar.
Recuento en Placa:
Trabajar por duplicado cada medio y usar el recuento medio del resultado.
- Mtodo de Vertido en Placa (vase figura 3.2.):
Agregar 1 mL de la muestra preparada y 15 a 20 mL de los medios slidos, Agar
Digerido de Casena y Soja, y,
Agar Saboureaud Dextrosa segn sea el caso, manteniendo la temperatura de
ambos medios a no ms de 45C.
Incubar segn se indica en 5.1.c.
Realizar el recuento y reportar la media aritmtica del nmero de ufc obtenido
en cada medio
Contrastarlo con el nmero de ufc del inculo original.
Mtodo de Extensin en Superficie:
- Agregar de 15 a 20 mL de los medios slidos, Agar Digerido de Casena y Soja, y,
Agar Sabouraud Dextrosa segn sea el caso, mantenidos a la temperatura de no ms
de 45C, a cada placa.
Dejar solidificar.
Esparcir un volumen de 0,1 mL de la muestra preparada.
Incubar.
Realizar el recuento y reportar la media aritmtica del nmero de ufc obtenido
en cada medio
Contrastarlo con el nmero de ufc del inculo original.
c. Neutralizacin/Eliminacin de la actividad Antimicrobiana:
- Comparar el nmero de microorganismos recuperados a partir de la muestra
preparada y diluida versus el nmero de microorganismos recuperados a partir de la
muestra control.
- Si se inhibe el crecimiento en un factor mayor a 2 modificar el procedimiento segn
se indica a continuacin:
i. Aumentando el volumen del diluyente o medio de cultivo.
ii. Incorporando agentes neutralizantes generales o especficos en el diluyente.
iii. Filtracin por membrana.
iv. Una combinacin de todos los anteriores.
B. Aptitud de los mtodos para las pruebas de microorganismos especficos.
a. Bacterias Gram Negativas Tolerantes a la bilis (vase Fig. 6.2.a).
Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de Casena y
Soja. Mezclar e incubar a 20 - 25C por 2 horas (suficiente para resucitar bacterias),
pero no ms de 5 horas.
- Prueba de Ausencia: usar un volumen correspondiente a 1 g del producto e inocular
Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias: incubar de 30 a 35C, durante

24-48 horas. Subcultivar en Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa; incubar de 30 a 35C
durante 18-24 horas. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
- Prueba Cuantitativa: inocular Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias
con preparaciones que contengan 0,1 0,01 g y 0,001 g mL de la muestra a evaluar;
incubar a 30 - 35C durante 18-24 horas. El producto cumple con la prueba si no se
desarrollan colonias; indicar la menor cantidad de producto que produce resultado
positivo y la mayor cantidad de producto que produce resultado negativo(vase Tabla
6.2.a.).
Tabla 6.2. Interpretacin de Resultados en la Prueba Cuantitativa de
Bacterias Gram Negativas Tolerantes a la Bilis
Cantidad probable de
Resultados para cada cantidad del producto bacterias
0,1 g mL 0,01 g mL 0,001 g mL (por g o mL del producto)
+ + + Ms de 103
+ + - Menos de 103 y ms de 102
+ - - Menos de 102 y ms de 10
- - - Menos de 10
CDCS (90mL)
10 g 10mL
20 25C
25h
10mL 0,1 g. o mL 0,1 g. o mL 0,1 g. o mL.
Caldo Mossel
(100mL)
Caldo Mossel (10mL)

30 35C
24 48 h
VRB VRB
30 35C 30 35C
24 48 h 24 48 h
Fig. 6.2.a. Bacterias Gram
Prueba de Ausencia Negativas Tolerantes a a la Prueba Cuantitativa
Bilis

b. Salmonella: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de
Casena y Soja; usar no menos de 10 g 10 mL para inocular Caldo Digerido de Casena y
Soja, mezclar e incubar de 30 a 35C durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL
de Caldo Digerido de Casena y Soja e incubar a de 30 a 35C durante 18-24 horas. Transferir
0,1 mL a 10 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella, e incubar
a 30 - 35 C, durante 18-24 horas. Subcultivar en una placa de Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30-35C por 18-48 horas (vase Fig. 6.2.b.).
El crecimiento de colonias color rojo (con o sin centro negro) indica posible presencia de
Salmonella, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificacin.
CDCS (90mL)
10g o 10mL
30 35C
18 24 h
0,1mL
Caldo Rappaport
Vassiliadis (10mL)
30 35C
18 24 h
XLD
30 35C
18 48 h
Fig. 6.2.b. Samonella sp.
c. Escherichia coli: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de
Casena y Soja; usar 1 g 1 mL para inocular Caldo Digerido de Casena y Soja, mezclar e
incubar de 30 a 35C durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de Caldo Mac
Conckey e incubar a 42 - 44 C, durante 24-48 horas. Subcultivar en una placa de Agar Mac
conckey a 30-35C por 18-72 horas.
El crecimiento de colonias indica posible presencia de E. coli, lo cual debe confirmarse con
pruebas de identificacin (vase Fig. 6.2.c-e.).
d. Pseudomonas aeruginosa: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo
Digerido de Casena y Soja; usar 1 g 1 mL para inocular Caldo Digerido de Casena y Soja,
mezclar e incubar de 30 a 35C durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de
Caldo Digerido de Casena y Soja e incubar a de 30 a 35C durante 18-24 horas. Subcultivar
en una placa de Agar Cetrimide. Incubar a una temperatura de 30-35C por 18-72 horas.

El crecimiento de colonias indica posible presencia de Ps. aeruginosa, lo cual debe
confirmarse con pruebas de identificacin (vase Fig. 6.2.c-e.).
Fig. 6.2.c-e. Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus; Clostridium sp.y Candida albicans
Dilucin 1/10
Diluyente (90mL)
10mL 10mL
10mL
CDCS 80C
(100mL) 10 min Caldo SAB
(100mL)
30 35C
18 - 24 h 30 35C
3-5d
C.T. Mn. Caldo Ref. Caldo Ref. SAB.

Caldo MC (100mL) (100mL)
(100mL)
30 35C 30 35C Anaerobiosis

18 - 72 h 18 - 72 h 30 35C
42 44C 48 h 30 35C
24 - 48 h 24 48 h
Pseudomonas Staphylococcus
aeruginosa aureus A.Col. A.Col. Candida albicans
30 35C
18 - 72 h
Anaerobiosis
M.C. 30 35C
Escherichia coli 48 h
Clostridium sp.
e. Staphylococcus aureus: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo
Digerido de Casena y Soja; usar 1 g 1 mL para inocular Caldo Digerido de Casena y Soja,
mezclar e incubar de 30 a 35C durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de
Caldo Digerido de Casena y Soja e incubar a de 30 a 35C durante 18-24 horas. Subcultivar
en una placa de Agar Cetrimide. Incubar a una temperatura de 30-35C por 18-72 horas.
El crecimiento de colonias color amarillo, o blanco rodeado de amarillo indica posible
presencia de Staphylococcus aureus, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificacin
(vase Fig. 6.2.c-e.).
6.4.4. Prueba de Producto:
Proceder de la misma forma que en A. y B. pero sin inculo.
6.5 Resultados
6.6 Cuestionario
- Si se trata de realizar el examen microbiolgico de un antibitico, explique las operaciones
preliminares y fundamente su respuesta.
- De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecucin de todos las pruebas
preliminares Qu hara? Obviara alguna de ellas? Procedera a la ejecucin de todas
consecutivamente? Si es as En qu orden procedera ? Fundamente su respuesta.
Bibliografia
XI. PRCTICA N 11.- PRUEBAS DE APTITUD DEL MEDIO PREVIO AL ANLISIS DE

UN PRODUCTO FARMACUTICO ESTRIL. VALIDACION DEL METODO.
USP 38 CAP 71.

8.1 Marco terico
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseado para garantizar que una partida de un
producto es estril o ha sido esterilizada. Esta garanta se consigue principalmente mediante la
validacin del proceso de esterilizacin o de los procedimientos del procesamiento asptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artculos cuya esterilidad es requerida por la
Farmacopea. Sin embargo, un resultado satisfactorio nicamente indica que no se han encontrado
microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las condiciones de la prueba.
La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones aspticas, por lo que, para lograr tales
condiciones, el entorno de la prueba debe adaptarse a la manera en que sta se realice. Las
precauciones para evitar la contaminacin se deben tomar de modo tal que no se afecte a ningn
microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en la que se
efectan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del rea de
trabajo y la realizacin de controles apropiados. (vase USP 38: <71> Pruebas de Esterilidad).
8.2 Competencias
- Aplica y experimenta la metodologa de l c o n t r o l d e e s t e r i l i d a d de una forma

farmacutica esteril.
- Reconoce las diferencias en la metodologa para el anlisis microbiolgico de formas
farmacuticas esteriles.
o 12 Tubos con 10 mL de Buffer, pH 7,2
o Tubos con 10 mL de Buffer, pH 7,2, ms Polisorbato
o Frascos con 150 mL de Agar Digerido de Casena y Soja
o Frascos con 100 mL de Agar Sabouraud Dextrosa
o 21 Pipetas de 0,1 y 1 ,0 mL estriles
o Kitasatos estriles de 1 L
o Equipos de filtracin estriles
o Pinzas estriles
o Membranas filtrantes estriles
o Balanzas
o Jeringas de 20 mL descartables estriles
o 18 Frascos con 100 mL de peptona pH 7,1
o Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Lquido
o Frascos con 100 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja
o Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos 5
a 7 das.
o Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos
24 horas antes de la prctica.
Microorganismo Incubacin
Medio de Cultivo
Especie Cepa ATCC T Tiempo
S. aureus
Caldo Tioglicolato C. sporogenes 19404 3035C 3 das
P. aeruginosa
6538
Caldo Casoy B. subtillis 6633 3035C 3 das
9027
B. subtillis
10231
Caldo Casoy C. albicans 2025 C 5 das
16404
A. niger

7.4 Procedimiento
7.4.1. Pruebas de Verificacin de las Propiedades de Promocin de Crecimiento e Inhibitorias de
los Medios y Aptitud de las Pruebas de Recuento y de Microorganismos Especficos
Proceder para las siguientes pruebas segn se muestra en el texto correspondiente de la
practica N 6.
Proceder de la misma forma que en 1.4.1. pero sin inculo.
practica N 6.
7.5 Resultados
Emisin de reporte final e interpretacion de los resultados.

7.6 Cuestionario
- Describa los criterios a tener en cuenta en la prueba de promocin de crecimiento de
microorganismos aerobios, anaerobios y hongos.
Bibliografia
Pginas Web

XII.-PRCTICA N 12.- ANLISIS DE UN PRODUCTO FARMACUTICO ESTRIL
VALIDACIN DEL MTODO POR TRANSFERENCIA DIRECTA Y FILTRACION POR
MEMBRANA. USP 38 CAP 71.
Marco terico
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseado para garantizar que una partida de un
producto es estril o ha sido esterilizada. Esta garanta se consigue principalmente mediante la
validacin del proceso de esterilizacin o de los procedimientos del procesamiento asptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artculos cuya esterilidad es requerida por la
Farmacopea. Sin embargo, un resultado satisfactorio nicamente indica que no se han encontrado
microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las condiciones de la prueba.
La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones aspticas, por lo que, para lograr tales
condiciones, el entorno de la prueba debe adaptarse a la manera en que sta se realice. Las
precauciones para evitar la contaminacin se deben tomar de modo tal que no se afecte a ningn
microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en la que se
efectan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del rea de
trabajo y la realizacin de controles apropiados. (USP 38; CAP 71. Pruebas de Esterilidad).
Competencias
- Aplica y experimenta la metodologa del control de esterilidad de una forma farmacutica esteril.
-Reconoce las diferencias en la metodologa para el anlisis microbiolgico de formas farmacuticas
esteriles.

o 4 Kitasatos estriles de 1 L
o 4 Equipos de filtracin estriles
o 8 Pinzas estriles
o 6 Membranas filtrantes estriles
o 1 Bomba de vaco
o 8 Jeringas de 20 mL descartables estriles
o 12 Frascos con 100 mL de peptona pH 7,1
o 8 Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Lquido
Resultados
Emisin de reporte final e interpretacin de los resultados.
Cuestionario
- Describa la composicin de los medios de cultivo empleados en la prueba de esterilidad e

indique la funcin de cada ingrediente.

PROCEDIMIENTO
PRUEBA DE ESTERILIDAD:
Mtodo de Transferencia Directa
Limpiar la superficie de
las envolturas que
contienen las muestras
con alcohol al 70% y
abrirlas cuidadosamente
con tijeras estriles
Transferir las muestras a un
frasco que contenga
Con ayuda de 1000 mL de caldo thioglicolato y
pinzas estriles a otro frasco que contenga 1000
mL de caldo tripticase soya
Caldo tioglicolato,
Llevar a a 20 a 25C
incubar por 14
d as: Caldo tripticase
soya a 30 a 35C
Presencia de Ausencia de
crecimiento: el crecimiento: el
producto no cumple producto cumple
con los con los
requerimientos de la requerimientos de
pr ueba la prueba

ANLISIS DE UN PRODUCTOS FARMACUTICO ESTRIL Y VALIDACIN DEL MTODO
FILTRACIN POR MEMBRANA: SOLUCIN INYECTABLE
Material y Equipos
o 3 Balanzas
o 4 Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos
5 a 7 das.
o 4 Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos
24 horas antes de la prctica.
PROCEDIMIENTO
PRUEBA DE ESTERILIDAD:
Mtodo de Filtracin por Membrana
Limpiar la Transferir el contenido de las muestras a

superficie de las travs la unidad de filtracin estril (con
ampollas con la membrana filtrante de :47 mm y
alcohol al 70% poro: 0,45 .
Tomar el
contenido de las Enjuagar la membrana con
ampollas con una agua peptonada
jeringa estril
Una mitad a 100

mL de caldo
tripticase soya,
Desmontar el equipo incubar a 20 a 25C
aspticamente y con pinzas
estriles tomar la membrana Incubar por 14
cortarla y transferir: das a...
30 a 35C
La otra mitad a
100 mL de caldo
thioglicolato
Resultados.- Reporte e interpretacion de resultados

Cuestionario
- Que criterios y caractersticas deben tener los medios de cultivo para el control de
esterilidad de suspensiones acuosas de antibiticos.
Bibliografia

XIII.-PRCTICA N 13.- SEMINARIO DE INVESTIGACION: PRUEBA DE ENDOTOXINAS
BACTERIANAS
OPERACIONES PREPARATORIAS, CLCULOS PARA HALLAR EL MVD: LISTA DE
CHEQUEO DETERMINACIN DE LOS LMITES DE ENDOTOXINAS PARA ARTCULOS
NO FARMACOPEICOS
Marco terico
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas {PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de
bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Umulus polyphemus
o Tachypleus tridentatus).
Hay tres tcnicas para esta prueba: la tcnica de coagulacin (gel-clot), la cual est basada en la
formacin de gel; la tcnica turbidimtrica, basada en la produccin de turbidez despus de la
ruptura de uniones de un sustrato endgeno; y la tcnica cromognica que se basa en el desarrollo de
color despus de la ruptura de un complejo sinttico pptido-cromgeno. Efec tuar la prueba con
cualquiera de las tres tcnicas. En caso de duda o controversia, la decisin final se toma basndose
en la prueba de lmite de coagulacin, a menos que se indique algo diferente en la monografa del
producto en anlisis. La prueba se efecta de forma tal que se evite la contaminacin por
endotoxinas.
Consiste en verificar si el Reactivo de Lisado de Amebocitos (LAL) tiene la sensibilidad
etiquetada y/o se encuentra dentro de los rangos aceptables (0,5 lambda a 2 lambda).
Para esto, se enfrentan diferentes concentraciones de un Control Estndar de Endotoxinas con el
reactivo de LAL. Se reconstituye el Control de Endotoxinas (5 000 EU/vial) con 5 mL de agua
apirgena certificada, homogenizndola en un vortex por 30 minutos.
Usando micropipetas calibradas y tubos despirogenados, se hacen diluciones en forma asptica hasta
obtener concentraciones de endotoxina de: 2 , , 0,5 , 0,25 , las cuales son
equivalentes a:
Spike*: 0,6 UE/ mL
2 : 0,06 UE/ mL
: 0,03 UE/ mL
0,5 : 0,015 UE/ mL
0,25 : 0,0075 UE/ mL
Competencias
- Aplica y experimenta la metodologa para las pruebas de Endotoxinas bacterianas

- Reconoce las diferencias en la metodologa para el anlisis microbiolgico d e
endotoxinas bacterianas.
Material y Equipos
o 2 Bao Mara a 37C
o 4 Gradillas para 40 tubos de 10 mm x 100 mm
o 4 Gradillas para tubos de 18 x 150 mm
o 4 Cronmetros
o 4 Termmetros
o 4 Micropipetas de 100 uL (Eppendorf)
o 4 Agitadores Vortex
o 8 Paquetes de 50 tubos cada uno apirgenos de 10 x 75 mm
o 4 Cajas de tips apirgenos de 5 a 100 uL
o 1 Caja de tiras indicadoras de pH
o 50 Tubos de 18 x 150 mm despirogenizados con tapas de acero (180C x 3 horas) envueltas
en paquetes de 8 tubos con papel aluminio.
o 10 Pipetas de 10 mL despirogenizadas a 180C x 3 horas con papel aluminio.
o 20 Pipetas de 1 a 2 mL despirogenizadas a 180C x 3 horas con papel aluminio.

o 1 Frasco de control estndar de endotoxina
o 8 Frascos del reactivo Lisado de Amebocitos de Limulus
o 8 Frascos de agua LAL
11.4 Procedimiento
11.4.1. Pruebas de Verificacin de las Propiedades de Promocin de Crecimiento e Inhibitorias de
los Medios y Aptitud de las Pruebas de Recuento y de Microorganismos Especficos
practica N 6.
Proceder de la misma forma que en 1.4.1. pero sin inculo.
practica N 6.
11.5 Resultados

11.6 Cuestionario
- Describir el fundamento de cada una de las tcnicas de la Prueba de Endotoxinas
Bacterianas
Bibliografia
Pginas Web

PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS Y PRESENTACIN DE UNA MATRIZ QUE
INCLUYE TODAS LAS ACTIVIDADES INVOLUCRADAS. USP 39 CAP 85.
Marco terico
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de
bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Umulus polyphemus
o Tachypleus tridentatus). (USP 38 CAP 85).
Hay tres tcnicas para esta prueba: la tcnica de coagulacin (gel-clot), la cual est basada en la
formacin de gel; la tcnica turbidimtrica, basada en la produccin de turbidez despus de la
ruptura de uniones de un sustrato endgeno; y la tcnica cromognica que se basa en el desarrollo de
color despus de la ruptura de un complejo sinttico pptido-cromgeno. Efec tuar la prueba con
cualquiera de las tres tcnicas. En caso de duda o controversia, la decisin final se toma basndose
en la prueba de lmite de coagulacin, a menos que se indique algo diferente en la monografa del
producto en anlisis. La prueba se efecta de forma tal que se evite la contaminacin por
endotoxinas.
DETERMINACIN DE LA MXIMA DILUCIN VLIDA (MDV)
Consiste en verificar si el Reactivo de Lisado de Amebocitos (LAL) tiene la sensibilidad

etiquetada y/o se encuentra dentro de los rangos aceptables (0,5 lambda a 2 lambda).
Para esto, se enfrentan diferentes concentraciones de un Control Estndar de Endotoxinas con
el reactivo de LAL.
Se reconstituye el Control de Endotoxinas (5 000 EU/vial) con 5 mL de agua apirgena certificada,
homogenizndola en un vortex por 30 minutos.
Usando micropipetas calibradas y tubos despirogenados, se hacen diluciones en forma asptica hasta
obtener concentraciones de endotoxina de: 2 , , 0,5 , 0,25 , las cuales son
equivalentes a:
Spike*: 0,6 UE/ mL

2 : 0,06 UE/ mL
: 0,03 UE/ mL
0,5 : 0,015 UE/ mL
0,25 : 0,0075 UE/ mL
Competencias
- Aplica y experimenta la metodologa para las pruebas de Endotoxinas bacterianas

- Reconoce las diferencias en la metodologa para el anlisis microbiolgico de endotoxinas
bacterianas.
Material y Equipos
o 2 Bao Mara a 37C

o 4 Gradillas para 40 tubos de 10 mm x 100 mm
o 4 Gradillas para tubos de 18 x 150 mm
o 4 Cronmetros
o 4 Termmetros
o 4 Agitadores Vortex
o 8 Paquetes de 50 tubos cada uno apirgenos de 10 x 75 mm
o 4 Cajas de tips apirgenos de 5 a 100 uL
o 1 Caja de tiras indicadoras de pH
o 50 Tubos de 18 x 150 mm despirogenizados con tapas de acero (180C x 3 horas) envueltas
en paquetes de 8 tubos con papel aluminio.

o 20 Pipetas de 1 a 2 mL despirogenizadas a 180C x 3 horas con papel aluminio.
o 1 Frasco de control estndar de endotoxina
o 8 Frascos del reactivo Lisado de Amebocitos de Limulus
o 8 Frascos de agua LAL.
Procedimiento

Resultados
Emisin de reporte final e interpretacin.

Cuestionario
- Describa los criterios y caractersticas que se deben tener en cuenta para la preparacin de
las soluciones y la determinacin de mxima dilucin valida (MDV)
Bibliografia
Pginas Web

XV. PRCTICA N 15.- SEMINARIO DE INVESTIGACION:
PRUEBA DE POTENCIA ANTIBITICA PARA UN ANTIMICROBIANO: OPERACIONES
PRELIMINARES, PREPARACIN DE MATERIALES, ESTNDAR, INCULOS Y
EJECUCIN DEL ANLISIS. USP 38 CAP 81.
Marco terico
En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibiticos puede demostrarse por su
efecto inhibidor sobre los microorganismos. La reduccin en la actividad microbiana puede ser difcil
de demostrar por mtodos qumicos. Este captulo resume los procedimientos para antibiticos
reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valoracin microbiolgica es
el mtodo analtico estndar: USP 38 CAP 81.
Se utilizan dos tcnicas generales: la valoracin en cilindro-placa (o en placa) y la valoracin
turbidimtrica (o en tubo).
Valoracin en cilindro-placa: La valoracin en cilindro-placa se basa en la difusin del antibitico
desde un cilindro vertical a travs de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El
crecimiento del microorganismo especfico inoculado en el agar resulta inhibido en un rea circular o
zona en torno al cilindro que contiene la solucin del antibitico.
Valoracin turbidimtrica: La valoracin turbidimtrica se basa en la inhibicin del crecimiento de
un microorganismo en una solucin uniforme del antibitico en un medio fluido que favorezca el
crecimiento del microorganismo en ausencia del antibitico.

o 3 Frascos x 50 mL
o 3 Frascos x 100 mL
o 3 Frascos x 400 mL
o 3 Frascos x 1 L
o 2 Frasco Roux
o 30 Perlas de vidrio
o 60 Placas Petri
o 10 Pipetas x 1 mL
o 10 Pipetas x 2 mL
o 10 Pipetas x 5 mL
o 10 Pipetas x 10 mL
o 4 Sacabocado
o 4 Beaker x 10 mL
o 3 Alcohol al 70% x 200 mL
o 3 Gasa
Composicin
Condiciones de Incubacin
Sugerida del lnculo
Temperatu-
Nmero ra Tiem-
Cantidad
Antibitico Organismo de Prueba ATCC Mediob () po
Medio" (ml/100 ml) Amfotericina B Socchoromyces cerevisioe 9763 19
29-31 48 h 19 1,0
Bacitracina Micrococcus tuteus 10240 1 32-35 24 h
1 0,3

Bleomicina Mycobacterium smeqmatis 607 36 36-37,5 48 h
35 1,0
Carbenicilina< Pseudomonas oeruainoso 25619 1 36-37,5 24 h
10 0,5
Cloxacilina sioonvtococcus oureus 29737 1 32 35 24 h
1 0,1
Colistimetato 8ordetella broocniseoca 4617 1 32-35 24 h
10 0,1
Colistina 8ordetella broncniseouco 4617 1 32-35 24 h
10 0,1
Dihidroestreptomi-
Segn se re- cina Boc,llus subtil,s 6633 32 32 35
5 das 5 Quiera
Eritromicina Micrococcus luteus 9341 1 32-35 24 h
11 1,5
Gentamicina Stophylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h
11 0,03
Nafcilina Staphylococcus oureus 29737 1 32-35 24 h
1 0,3
Neomicina Stophylococcus eoidermidis 12228 1 32-35 24 h
11 0,4
Novobiocina Staphylococcus eoidermidis 12228 1 32-35 24 h
1 4,0
Nistatina soccnoromvce: cerevistoe 2601 19 29-31 48 h
19 1,0
Perornorrucina Staohvlococcus eoidermid,s 12228 1 32-35 24 h
11 2,0
Penicilina G Staohvlococcus oureus 29737 1 32-35 24 h
1 1,0
Polimixina B 8ordetella bronchlsepuca 4617 1 32-35 24 h
10 0,1
Sisomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h
11 0,03
S
egn se re- Vancomicina Bocillus subtilis 6633 32 32-35
5 das 8 quiera
American Type Culture Collection, 10801 University Soulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 ml de una dilucin 1 :25 de la suspensin madre/100 ml de Medio I O.
Procedimiento
POTENCIA ANTIBITICA: Mtodo
Cilindro-Placa de Cultivo

13.5 Resultados
Emisin de reporte final e interpretacin.
13.6 Cuestionario
- Describa los criterios a tener en cuenta para la Validacion del Metodo de Valoracion de
Antobioticos.
Bibliografia
Pginas Web

Guia de Practicas Control Microbioogico de Medicamentos Farmac 2016 I 33 0

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2.1 Marco terico

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Clasificacin de los medios de cultivo: Segn su composicin;

Preparacin de medios de cultivo:

Mencione los criterios y consideraciones importantes a tener en cuenta para la preparacin de

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Tcnicas de Siembra y estudio del desarrollo en Medios de cultivo:

Reportar y describir l a composicin y el fundamento de las diferentes clases de medios de

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2. Estudio de los estreptococos

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PRACTICA 4.- Lectura, interpretacion y discusin de los

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Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

Oxidasa positivos. Grupo Vibrio

F-CV3-3B-1 16 REV. ABRIL 2016

F-CV3-3B-1 17 REV. ABRIL 2016

2. Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

3. Oxidasa Positivo Grupo Vibrio

Inoculacin en agar TSI

F-CV3-3B-1 18 REV. ABRIL 2016

PRACTICA 6.- Lectura, interpretacion y discusin de los

F-CV3-3B-1 19 REV. ABRIL 2016

F-CV3-3B-1 20 REV. ABRIL 2016

Mtodo de Filtracin por Membrana

Mtodo de Vertido en Placa

Fig. 3.1. Sistema de filtracin:

3.7 Fuentes de informacin

F-CV3-3B-1 21 REV. ABRIL 2016

Fig. 4.1. Hisopos Fig. 4.2. Solucin de enjuague

F-CV3-3B-1 22 REV. ABRIL 2016

Registrar e interpretar los resultados obtenidos

F-CV3-3B-1 23 REV. ABRIL 2016

5.1 Marco terico

F-CV3-3B-1 24 REV. ABRIL 2016

Fig. 5.1. Siembra en Superficie

F-CV3-3B-1 25 REV. ABRIL 2016

F-CV3-3B-1 26 REV. ABRIL 2016

- Reconoce la importancia de comprobar la aptitud de los mtodos de anlisis: recuento y