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26/7/2010 The Leptospira Outer Membrane Prote…

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J Am Soc Nephrol 13:2037-2045, 2002 Este artigo


© 2002 Sociedade Americana de Nefrologia
Resumo
Texto completo (PDF)
A Leptospira proteína de membrana A vise-me quando este artigo for citado

externa LipL32 induz a expressão A vise-me se uma correção é lançada


Citação Mapa
gênica Tubulointerstitial Nefrite Serviços
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Yang Wei-Chih*, Wu-Szu Mai*, Ming-Pan Jeng , Download para o gerente da citação
Hsieh Wang-Ju , Alain Vandewalle e Huang-Ching Chiu*

* Departamento de Nefrologia, Chang Gung Memorial Hospital, em Citando os artigos

Taipei, Taiwan, República Popular da China; Pós-Graduação do Citando os artigos via HighWire
Instituto de Medicina Veterinária da Universidade Nacional de Taiwan, Citando os artigos via Google Scholar
Taipei, Taiwan, República Popular da China, e Instituto Nacional de Google Scholar
Saúde e Pesquisa Médica (INSERM), Unidade 478, da Faculdade de
Medicina Xavier Bichat, em Paris, França. A rtigos por Yang, C.-W.
A rtigos por Huang, C.-C.
Endereço para correspondência Dr. Chih-Wei Yang, Chang Gung Busca por Conteúdo relacionado
Memorial Hospital, Departamento de Nefrologia, 199, Tun-Hwa North
Road, Taipei 105, Taiwan. Telefone: 88633285386 Fax;: 88633282173; E- PubMed
mail: cwyang@ms1.hinet.net PubMed Citação
A rtigos por Yang, C.-W.
A rtigos por Huang, C.-C.

Resumo
Topo
RESUMO. A nefrite é uma Tubulointerstitial principal manifestação renal causada Resumo
Introdução
pela leptospira patogênicas que se acumulam principalmente nos túbulos proximais,
Materiais e Métodos
induzindo lesão tubular e tubulointerstitial nefrite. Para elucidar o papel da membrana Resultados
externa de leptospira proteínas na nefrite tubulointersticial, proteínas da membrana Discussão
Referências
externa da patogenicidade shermani Leptospira e não patogênicas de Leptospira
patoc extraído por Triton X-114 foram administradas a cultura mouse células dos túbulos proximais. Um
dependente de aumento da dose de monócitos chemoattractant protein-1 (MCP-1), RANTES, nitrito, e
fator de necrose tumoral (TNF- ) No sobrenadante da cultura foi observado após 48 h de incubação

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shermani Leptospira exterior proteínas da membrana com o mouse células dos túbulos proximais. RT-PCR
competitiva experimentos mostraram que shermani Leptospira proteínas da membrana externa (0,2 mg / ml)
aumentou a expressão de MCP-1, nítrico sintase (iNOS), RANTES, e TNF- mRNA de 3,0, 9,4, 2,5 e 2,5
vezes, respectivamente, quando comparado com o tratado células. proteínas da membrana externa extrair
avirulent Leptospira patoc não induziu efeitos significativos. A patogenicidade exterior extrair as proteínas da
membrana contém um componente principal de 32-kD lipoproteína (LipL32), que está ausente no leptospira
nonpathogenic membrana externa. Um anticorpo levantadas contra LipL32 impediu o efeito estimulante de
Leptospira shermani membrana externa extrato de proteínas MCP-1 e iNOS expressão de mRNA em
culturas de células do túbulo proximal, enquanto LipL32 recombinante significantemente estimulou a
expressão de MCP-1 e iNOS mRNAs e aumentada ligação nuclear da energia nuclear fator de B (NF- B)
e AP-1 transcrição fatores em células do túbulo proximal. Um anticorpo levantadas contra LipL32 também
embotado os efeitos induzidos pela LipL32 recombinante. Este estudo demonstra que LipL32 é um
componente importante de leptospira patogênica proteínas da membrana externa envolvidas na patogênese
da nefrite tubulointersticial.

Introdução
Topo
A leptospirose é uma zoonose difundida e reemergentes e tem -se um ser humano e Resumo
Introdução
veterinário importante problema de saúde global (1). A infecção é transmitida via
Materiais e Métodos
directa ou indirecta contato com a leptospira, o invasor espiroquetas altamente Resultados
patogênicos, através de animais infectados ou contaminados ambiente (1). Clínica Discussão
Referências
As manifestações variam de leve a formas severas de infecção, este que culminou
com falência de múltiplos órgãos e mortalidade (Weil Síndrome). Entre os vários órgãos afectados, o mais
comumente envolvido é o rim. Leptospira patogênica nos animais infectados host divulgar hematogenously
para os rins. A leptospira mais colonizar e se multiplicar em células do túbulo proximal, derramando na urina
e de transmissão a novos hospedeiros. A invasão direta do organismo para o rim através do efeito de
leptospira endotoxina e resposta imunológica pode induzir tubulointerstitial nefrite (1,2).

antígenos são encontrados em diversos locais do rim, incluindo células do túbulo proximal e macrófagos, e
em forma de grandes aglomerados extra no interstício (3). Eles estão associados com edema intersticial
acentuada, infiltrados de linfócitos, monócitos, células plasmáticas e neutrófilos levando a nefrite
tubulointersticial (4). A glicolipoproteína leptospirose, um componente de endotoxina leptospiral paralelos
que tubulointerstitial mudanças nephritic, foi encontrado para ser expresso em infectados túbulos renais e
lúmen vascular do interstício (5). A associação de leptospira com limite de proteína de membrana de gotas
nos túbulos proximal pode, portanto, ser importante na indução da nefrite tubulointersticial e do estado de
portador crônico em leptospirose do rato, onde nefrite intersticial difusa e fibrose pode ser iniciada (6).

as proteínas da membrana externa de leptospira é provável que sejam relevantes para as interações
patógeno-hospedeiro. Leptospira endotoxinas contendo proteínas de membrana externa de leptospira e
lipopolissacarídeo estão localizados na membrana externa e parecem ser os principais antígenos que
conferem imunidade a leptospira e podem causar disfunção renal (7). Nós temos demonstrado previamente
que leptospira patogênica proteínas da membrana externa ativa o fator nuclear- B (NF- B) e expressão do
gene a jusante mouse medular espesso ascendente células dos membros (8). A leptospirose componentes da

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proteína da membrana externa , portanto, pode provocar uma perturbação da função tubular e inflamação. A
identificação de um componente de proteínas da membrana externa deverá representar um passo importante
na compreensão da patogênese da nefrite túbulo invasiva causada por espiroquetas patógenos (9).

Até à data, apenas a poucos leptospiral proteínas da membrana externa têm sido caracterizados em detalhe,
incluindo uma porina, OmpL1 (10), e várias lipoproteínas, como a LipL36 (11), LipL41 (10), e LipL32 (12).
Zuerner et al. (13) mostraram que a extracção da membrana externa com os detergentes não-iônico Triton
X-100 ou Triton X-114 permissão para solubilizar o kD LipL32 lipoproteína-32 representando o mais
proeminente antígeno identificado por uma infecção derivada soros suínos no Triton-114 detergente fase X
(14).

Análise imunoistoquímica de Leptospira kirschneriinfectados rins hamster demonstraram reatividade LipL32


intensa em células dos túbulos proximais e interstício (9). LipL32 é também um imunógeno proeminente
durante leptospirose humana em que a reatividade anti-LipL32 demonstrou maior sensibilidade e
especificidade na fase aguda e de convalescença da leptospirose soros humanos (15). A seqüência ea
expressão da LipL32 é altamente conservada entre leptospira patogênicas, que é ausente no exterior da
membrana da leptospira avirulent nonpathogenic (12). No entanto, o papel do túbulo proximal, em resposta a
leptospirose e no início da nefrite tubulointersticial por LipL32 é que ainda não compreendidas. Neste estudo,
as proteínas da membrana externa extrato de um leptospira patogênicas comuns em Taiwan, shermani
Leptospira foram incubadas com rato cultivadas células do túbulo proximal (16), ter mantido as principais
características das células parental a partir do qual eles foram derivados (17) para estudar a ativação da
transcrição e expressão do gene fator a jusante em relação ao tubulointerstitial nefrite. Os principais
resultados deste estudo sugerem fortemente que LipL32 é o principal patógeno Leptospira shermani
exterior proteína de membrana responsável pela célula tubular proximal pró resposta, o que pode levar in
vivo de nefrite tubulointersticial.

Materiais e Métodos
Topo
Proteínas da membrana externa Preparando Extrato de Leptospira por Triton Resumo
X-114 Introdução
Materiais e Métodos
Um comumente encontradas leptospira sorovar patogênico Leptospira shermani e Resultados
nonpathogenic biflexa Leptospira sorovar patoc foram obtidos a partir ATCC Discussão
(Gaithersburg, MD) e cultivadas em 10% EMJH meio de enriquecimento Referências

leptospirose (Difco, Detroit, MI). Leptospira células foram cultivadas por 5-7 d a
28 ° C, até atingir uma densidade celular de 108/ ml e foram enumeradas pelo campo escuro, microscopia,
como descrito (18). As proteínas da membrana externa da Leptospira shermani foram extraídas com 1%
Triton X-114 por uma modificação do método descrito anteriormente (13,14). Em breve, as células
cultivadas leptospira foram lavados em tampão fosfato salina (PBS) e 5 mM MgCl2 e, em seguida, extraído
com a presença de 1% Triton X-114 (Sigma, St. Louis, MO), 10 mM Tris (pH 8) , e um ácido
etilenodiamino mM (EDTA) a 4 ° C. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 17.000 X g por
10 min. O Triton X-114 na concentração do sobrenadante foi aumentada para 2%. separação de fase foi
realizada pelo aquecimento do sobrenadante a 37 ° C e submetê-la a centrifugação por 10 min a 2000 x g.
O detergente e fase aquosa foram separadas e precipitação com acetona. A concentração de proteínas foi
determinada pelo método de Bradford (Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Mais de 90%
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da membrana externa proteínas podem ser extraídas no-114 detergente Triton X fase. Para efeito de
comparação, a 0,04% de sódio dodecil sulfato (SDS) extrato método para Leptospira shermani proteínas
da membrana externa também foi usado como descrito anteriormente (8).

Cultivadas células dos túbulos proximais


As células-PR PKSV utilizados neste estudo foram provenientes de microdissectados túbulos proximais do
rim de um L-PK/Tag1 camundongo transgênico, como descrito anteriormente (16). As células foram
cultivadas em DMEM 01:01 HAM-F12 (vol / vol), 30 nM selenato de sódio, 5 mg / ml de transferrina, 2
mM de glutamina, 5 mg ml / insulina, dexametasona 50 nM, triiodotironina 5 nM, 10 ng / ml fator de
crescimento epidérmico, 20 mM de D-glicose, 2% soro fetal bovino inativado de calor (FCS), e 20 mM D-
glicose a 37 ° C em 5% CO2% -95 atmosfera (16). As células foram semeadas em cada 35 mm ou 60 mm
de placas de Petri revestidas com colágeno. A média de todas as amostras foi mudado a cada 2 m. Os
experimentos foram realizados na fase exponencial de crescimento confluente de células ou entre os 40 e 55
passagens. Células foram transferidas para um serum-free média 24 h antes do experimento. proteínas da
membrana externa LipL32 recombinante ou extrato de leptospira foi adicionado ao meio de cultura de
células por 48 h. Em experimentos de bloqueio, 50 ul do anti-soro para shermani Leptospira membrana
externa ou para extrair proteínas LipL32 foi pré-incubado com a membrana externa ou extrato de proteínas
LipL32 recombinante a 37 ° C por 30 min , então adicionado à cultura de células contendo 2 ml de meio.
Total RNA foi extraído de RT-PCR, e sobrenadante foi coletado para nitrito e medição de proteína. proteína
nuclear foi extraído por eletroforese ensaio mudança de mobilidade. Todas as medidas foram feitas pelo
menos em triplicado.

Citotoxicidade
A viabilidade celular foi avaliada por um baseado de tetrazólio 3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5 difeniltertrazolim-
brometo (MTT), ensaio (19) para determinar a citotoxicidade inespecífica das proteínas da membrana
externa extrato de shermani Leptospira de células dos túbulos proximais. As células foram cultivadas e
cultivadas em 96 poços placas (Corning Co., Corning, NY) para 3 m. As células foram então expostos a
diferentes concentrações (0,1 a 1 mg / ml) de membrana externa proteínas do extrato por 48 h, e 40 µl de 5
mg / ml 3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5 - difeniltertrazolim brometo foi adicionado a cada poço. Depois de 2 horas
a 37 ° C, as células foram lisadas pela adição de 100 l de 20% (wt / vol), SDS e 50% (vol / vol) N, N-
dimetilformamida (pH 4,7) e incubadas overnight a 37 ° C. A absorvância em 570 nm foi medida para cada
bem, com uma leitora de microplacas Dynex. Os experimentos foram realizados em duplicata ea viabilidade
celular foi expressa como a porcentagem de células viáveis em comparação com o de células não tratadas.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)


Os níveis de peptídeo do sobrenadante de cultura mouse proximal células tubulares foram medidos após a
exposição a 0,1 a 1 mg / ml de proteínas da membrana externa da Leptospira shermani por 48 h, e no caso
de bloqueio de experiências. Mouse monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), RANTES, e fator de
necrose tumoral (TNF- ) Os níveis de peptídeo foram medidos por ELISA (Quantikine; R & D Systems,
Minneapolis, MN).

Nitrito ensaio de produção


Acúmulo de nitrito (NO2-), empregado como um índice de monóxido de produção de óxido no
sobrenadante da cultura foi determinada por um reagente de Griess, conforme descrito anteriormente (8).

RT-PCR competitiva
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RNA foi extraído de células do túbulo proximal confluente com o RNA-zol (Cinna / Biotecx Laboratories
International Inc., Friendwood, TX), conforme descrito referência (8. RNA (1 mg) foi reverso transcrito com
o vírus da gripe aviária mieloblastose reversa do transcriptase (RT AMV, Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemanha) a 42 ° C por 60 min. complementares de DNA foi amplificado por 30-42 ciclos em 100 µl
volume total contendo 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 10 mM dNTP, 1,5 para 3,0 mM MgCl2, 1
unidade de Taq polimerase e 10 picomoles de primers específicos. O protocolo de ciclagem térmica foi a
seguinte: 94 ° C por 1 min e 60 ° C por 1 min e 72 ° C por 3 min. Amplification produtos foram separados
em gel de agarose 4% com brometo de etídio e fotografados. Os conjuntos de primers utilizados para RT-
PCR foram conforme descrito anteriormente 20,21). O óxido nítrico sintase (iNOS) par de primer foi de 5
'GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG 3' sentido () e 5 'GGT CGA TCT CAT GAG CAA TGT AGG 3
"antisense (), gerando um produto de PCR bp-508. A MCP-1 par de primer foi de 5 'AGG TCC CTG ACT
TGC TCC TGG 3 'sentido () e 5' GTC ACT CCT GAA GTG ACA CTT G 3 "antisense (), gerando um
produto de PCR bp-424. A RANTES par de primers foi 5 'CCC TGC TGC TTT CCG TAC TCC CTC 3'
sentido () e 5 'TCG CGG GAG GAG CGG ATG ATG CCG 3 "antisense (), produzindo um produto de
PCR bp-133. O TNF- par de primers foi 5 'ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC CGC 3 'sentido () e
5' AAG CCA TAG ACC TGC CCG GAC TC 3 'antisense (), gerando um produto bp PCR-692. O -
Actina par de primer foi de 5 'AGG CAC CAA TCT GTG GGT 3' sentido () e 5 ' TGA TCA GGT AGT
CCG TCA GG 3 "antisense (), gerando um 460 bp- produto da PCR. Os produtos PCR foram analisados
inicialmente pela amplificação na fase exponencial. PCR foram realizados ensaios de competição de
quantificação mais precisa para os níveis de mRNA que apresentaram alterações em relação ao -Actina
mRNA por densidade óptica obtidos por digitalização densitômetro. Competitivo PCR foi realizada para
medir a MCP-1, iNOS, TNF- E -Actina como descrito anteriormente (8). O teste de modelo para todas
as reações de PCR foi uma alíquota de DNA coletado a partir de cultura de células. Para quantificar os
cDNAs de teste, várias quantidades de cDNA do mutante modelos foram adicionados para competir com o
teste de DNA em uma base equimolar, conforme descrito em (referências 21 e 22. Para MCP-1, iNOS,
TNF- E -Actina, DNA mutante deletado modelos foram desenvolvidos para criar 87 -, 39 -, 124 - e-
deleções 103 pb no meio das moléculas, resultando em cDNAs mutantes de 339, 469, 568 e 357 pb,
respectivamente. Após eletroforese em gel de agarose, bandas de amplificação corado pelo brometo de
etídio foram quantificados a partir do negativo por densitometria. Como anteriormente relatado 23,24), a
proporção de mutantes de banda densidade tipo selvagem foi calculado para cada pista e plotados em
função da quantidade de iniciais mutante modelo adicionado à reação. A quantidade de cDNA foi obtido a
partir da análise de regressão linear com ensaios em duplicado ou triplicado. Os valores médios para os
ensaios foram expressos em variação percentual para o controle. Convencional de PCR foi realizada para
medir RANTES mRNA devido à curta sequência, que impedia PCR competitiva executando mutante DNA.
Semiquantitation foi realizada por diluição seriada da entrada de cDNA para medir RANTES mRNA.

Eletroforese em gel e Immunoblotting por SDS-PAGE


amostras de leptospira por SDS-PAGE foram solubilizados em um final buffer amostra composta de 62,5
mM Tris cloridrato (pH 6,8), glicerol 10%, 5% 2-mercaptoetanol, SDS e 2%. As proteínas foram separadas
em SDS 12%, e corados com Coomassie brilhante azul ou foram transferidas para nitrocelulose (Schleicher
& Schull, Keene, NH) de immunoblotting. Para a detecção antigênica em immunoblots, a nitrocelulose foi
bloqueado com 5% desnatado leite em pó em 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T) e incubadas por 2 h com anti-
soro em PBS-T. O immunoblot foi inicialmente sondada com coelho anti-soro específico para leptospirose
membrana externa LipL32 de proteína (1:5000), seguido pelo de coelho anti-IgG conjugado com fosfatase
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alcalina para permitir a detecção colorimétrica.

Clonagem de LipL32 e LipL41


DNA recombinante Standard procedimentos foram realizados para clone LipL32, como descrito
anteriormente por Haake et al. (12). Leptospira shermani DNA genômico foi utilizado como um modelo,
ea PCR foi utilizada para amplificar a porção do gene que codifica a LipL32 maduro proteína, começando
com o resíduo após a primeira terminal amino- cisteína. O "oligonucleotídeo 5 contido na seqüência de
nucleotídeos codificando para os seis aminoácidos cisteína após o amino-terminal de LipL32 maduro,
incluindo um Xhoeu endonuclease de restrição site: 5'-TTA CCG CTC GAG GTG CTT TCG TGC GTG
GTC-3 '. A 3 ' oligonucleotide contida na seqüência de nucleotídeos que codificam para as cinco carboxi-
terminal de aminoácidos e do códon LipL32, incluindo um SmaI endonuclease de restrição site: 5'-AT TGT
CCC GGG TTA CTT AGT CGC GTC AGA-3 '. Os 782 pb amplificado LipL32 gene foi digerido com
XhoI e SmaI e ligados em pRSETc (Invitrogen, Groningen, Holanda) digerido com XhoI e PvuII. O
resultado construir, pRSETc-LipL32, foi transformado em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen,
Madison, WI) para a expressão. A expressão da proteína LipL32 fusão His6 foi atingido por
isopropil- Dthiogalactopyranoside (IPTG, Sigma) a indução. Após a solubilização em PBS e purificação por
afinidade cromatográfica com Ni2+, ácido nitrilotriacético agarose (Qiagen, Chatsworth, Califórnia), a fusão
da proteína LipL32-His6 foi armazenada em PBS. LipL41, uma outra proteína da membrana externa menor
inicialmente descrita por Haake et al. (25) e codificação de uma proteína 41-kD de leptospira patogênicas,
também foi clonado na expressão do vetor usando os mesmos métodos, como descrito acima para gerar
LipL41 recombinante. Em todos os casos, a concentração de proteína foi medida pelo método de Bradford
(Protein Assay, Bio-Rad Laboratories).

Antissoros
Anti-soro contra 1% Triton X-114 proteínas da membrana externa extrato de shermani Leptospira foi
preparado em coelhos Nova Zelândia branco pela imunização, como descrito anteriormente (26). membrana
externa proteínas (400 mg) foram misturadas com adjuvante completo de Freund e injetado por via
intradérmica, em vários locais ao longo das costas do coelho. Um reforço da mesma dose foi dada duas
semanas depois. Os animais foram sangrados duas semanas após a última inoculação. O título do anti-soro
foi determinado por uma aglutinação microscópica de teste, que revelou um título de 1:10.000.

Anti-soro para LipL32 foi preparado como descrito anteriormente (12). Resumidamente, coelhos Nova
Zelândia Branco foram imunizados com purificada LipL32 proteínas de fusão-His6 expressa por
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS transformada com o plasmídeo contendo pRSET gene LipL32 (12).
Em seguida, 150 mg de proteína foi misturada com Freund adjuvante completo e inoculadas em um novo
macho White Rabbit Zelândia. imunizações adicionais com cerca de 150 mg de proteína LipL32 fusão His6
Freund em adjuvante incompleto foram dadas aos 4 e 8 semanas após a imunização primária. O coelho foi
sangrado 10 semanas após a imunização primária.

Nuclear extração de proteínas


proteínas nucleares foram preparados de acordo com Satriano e Schlondroff (27), com pequenas
modificações (8). Após o meio foi removido, mouse células do túbulo proximal em 75 cm- 2 frascos foram
colhidas com tripsina e peletizadas após centrifugação. pelotas da pilha de células foram lavadas com PBS-
frio de gelo e ressuspenso com tampão A contendo Hepes 10 mM (pH 7,9), 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl,
3,5 mM ditiotreitol (DTT), H2O, e inibidor da protease ( Boehringer Mannhein, completa). As células foram
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incubadas no gelo por 10 min e centrifugados por 5 min a 650 x g. Os pellets foram ressuspendidos com o
mesmo tampão A contendo 0,5% Nonidet P-40, lisadas por vórtice, e permitiu a inchar no gelo por 20 min.
As frações nucleares foram peletizadas por 5 min a 6000 x g e ressuspenso com tampão B contendo 5 mM
Hepes (pH 7,9), 26 glyceral%, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,4 M NaCl, H2O , e
completa. Após incubação em gelo por 30 min, o nuclear frações foram centrifugadas por 10 min a 12.000 x
g. Os sobrenadantes contendo proteína nuclear foram divididos em alíquotas e estocado a -80 ° C para
posterior utilização. As concentrações de proteína foram determinados por um método de Bradford usando
o Rad proteína Bio-ensaio.

Mobility Shift Assay eletroforética (EMSA)


extratos nucleares de células inteiras são submetidas a testes para NF- B atividade de ligação que empregam
NF- B oligonucleotídeo consenso (5'-AGT TTT TGA GGG GAC AGG C-3 '; Promega, Madison, WI)
com digoxigenina kit EMSA (Roche, Sommerville, NJ). Um total de 10 microgramas de proteínas nucleares
foram incubadas com digoxigenina rotulados NF- B oligonucleotídeo em uma mistura de ligação (50 mM
Hepes [pH 7,9], 20% glicerol, 5 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, DTT 2,5 mM, 250 mM NaCl, 0,5 mg de poli
dI-DC [Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia ], e H2O) para um volume final de 15 µl. Pós-incubação de 20
minutos em temperatura ambiente, os complexos DNA-proteína foram resolvidos em gel de poliacrilamida
4% nativas em 0,5x Tris Borato-EDTA-buffer do sistema e executar em 200 V de 1,5 a 4 h em sala fria C °.
Géis foram transferidos para Whatmann papel, secos e expostos ao XR5 película (Eastman Kodak,
Rochester, NY) em suportes de filme de 4 a 16 horas a -80 ° C. controle de concorrência específicas de
unlabeled oligonucleotídeo em excesso de 100 vezes foi adicionado à ligação mistura de reação por 10
minutos antes do marcado NF- sonda B foi acrescentado.

Statistical Analyses
Todas as medições foram realizadas pelo menos em experimentos triplicado, e os resultados foram expressos
como média ± SEM. Diferenças entre grupos foram analisadas por pareado t de teste ou ANOVA quando
apropriado. P <0,05 foi considerado significativo.

Resultados
Topo
Citotoxicidade Resumo
A viabilidade celular, utilizada como um índice de dano celular (19), foi analisado Introdução
Materiais e Métodos
por Leptospira shermanitratados (0,1 a 1 mg / ml Triton X-114 shermani Resultados
Leptospira proteínas da membrana externa extrato por 48 horas a 37 ° C) e Discussão
Referências
proximal do rato não tratado células tubulares. A porcentagem de células viáveis não
diferiu significativamente entre células tratadas e não tratadas (104 ± variando entre 7% e 111 ± 6%, n = 4
versus controle). confluente mouse nas células tubulares proximais permaneceram viáveis após 48 h de
incubação com Leptospira shermani extratos de membrana externa. Untreated mouse nas células tubulares
proximais foram incubados em soro ou sem meio de cultura enriquecido com soro ou por 24 h para avaliar a
viabilidade celular. Nestas condições, o soro não influenciaram o celular da viabilidade e do crescimento do
rato células dos túbulos proximais (dados não mostrados).

Efeitos da Leptospira patogênica shermani exterior Proteínas de Membrana Extrato de MCP-1,


RANTES, iNOS e TNF- Expressão

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A adição de Leptospira shermani proteínas da membrana externa (0,2 mg / ml para 48 h) para PKSV
mouse-PR células cultivadas aumentaram a expressão de MCP-1 (3,0 vezes; P <0,01), RANTES (2,5
vezes; P <0,05 ), iNOS (9,4 vezes; P <0,001), e TNF- (2,5 vezes; P <0,05) em comparação com o
mRNAs das células não tratadas (Figura 1). Consistente com estes resultados, a-h de incubação de 48 com
shermani Leptospira proteínas da membrana externa (0,1 a 1 mg / ml) causou uma dose aumento
dependente da MCP-1, RANTES, nitrito, e TNF- recuperados no sobrenadante de cultura mouse PKSV-
PR células do túbulo proximal (Figura 2).

Figura 1. Expressão dos monócitos chemoattractant protein-1


(MCP-1), RANTES, óxido nítrico sintase (iNOS), fator de
necrose tumoral (TNF- ) MRNAs analisados por transcriptase
reversa-PCR (RT-PCR) em túbulo proximal estimulada pela
leptospira proteínas da membrana externa extrato (0,2 mg / ml)
por 48 h. Como controle, -Actina foi utilizado como padrão
interno. A expressão de MCP-1, RANTES, iNOS e TNF-
mRNAs aumentou significativamente em comparação com
Ver versão maior (27K):
[Nesta janela] células não tratadas. Os valores médios para os ensaios foram
[] Em uma nova janela expressos em percentual de alteração de valores sem tratamento
[Como] de slides do PowerPoint (controle). M marcador; C, controle, LS, shermani Leptospira;
*P <0,05, **P <0,01; ***P <0,001.

Figura 2. sobrenadantes de cultura de células do túbulo


proximal estimuladas com diferentes quantidades de proteínas de
membrana externa de leptospira extraídos (0,1-1 mg / ml) por
Triton X-114 por 48 horas apresentaram um aumento dose-
dependente, medida pela de imunoadsorção enzimática (ELISA)
eo método de Griess. (A) MCP-1, (B) RANTES; (C), nitrito
(D), TNF- .

Ver versão maior (15K):


[Nesta janela]
[] Em uma nova janela
[Como] de slides do PowerPoint

Identificação de LipL32 como um importante componente da Leptospira patogênica shermani Outer


Membrane
As proteínas da membrana externa extracto de um sorovar nonpathogenic patoc Leptospira foi adicionado
ao mouse células do túbulo proximal de um estudo comparativo com patogenicidade shermani Leptospira.
proteínas da membrana externa extrato (0,2 mg / ml) foi aplicado para PKSV-PR células de camundongos
por 48 h. Posteriormente, MCP-1, iNOS e mRNA expressões actina foram analisados. Mudanças
significativas no níveis de MCP-1 e iNOS mRNAs foram encontrados em células incubadas com as proteínas
da membrana externa de patogenicidade Leptospira shermani mas não naqueles de Leptospira patoc.
jasn.asnjournals.org/cgi/content/…/2037 8/19
26/7/2010 The Leptospira Outer Membrane Prote…
Competitiva RT-PCR revelou que shermani Leptospira proteínas da membrana externa induzida de 3,0
vezes aumento da expressão de mRNA MCP-1 (P < 0,01) e um aumento de 9,4 vezes na expressão do
RNAm da iNOS (P < 0,001). Em contraste, nenhuma mudança significativa em qualquer um dos analisados
mRNA foi detectado quando células do túbulo proximal foram incubados com Leptospira patoc extrair
proteínas da membrana externa (Figura 3).

Figuure 3. Efeitos da leptospira patogênicas e não patogênicas


proteínas da membrana externa na indução da MCP-1 e iNOS
expressão de mRNA em células do túbulo proximal. Como
controles, -Actina foi utilizado como padrão interno. Em
contraste com a Leptospira shermani e Leptospira patoc
proteínas da membrana externa extrato não induziu quaisquer
alterações significativas no MCP-1 e iNOS expressões. Os
Ver versão maior (30K):
[Nesta janela] valores médios para os ensaios foram expressos em percentual
[] Em uma nova janela de alteração de valores sem tratamento (controle). M marcador;
[Como] de slides do PowerPoint C, controle, LS, shermani Leptospira, LP, Leptospira patoc;
**P 0,01 <; ***P <0,001 versus testemunha.

proteínas da membrana externa extraído por Triton X-114 foram submetidos a SDS-PAGE. Proteína e
perfis antigênicos do patogênicos shermani Leptospira foram comparados com os do nonpathogenic patoc
Leptospira. azul manchado de géis Coomassie revelou diversas bandas de proteínas, uma de 32 kD e outra
de 41 kD, e várias bandas de proteínas, principalmente menores de maiores pesos moleculares na
patogenicidade shermani Leptospira , mas não em nonpathogenic Leptospira patoc extrato de proteínas de
membrana externa (Figura 4A) . Extração de shermani Leptospira proteínas da membrana externa por
Triton X-114 e SDS métodos foram comparados por análise de SDS-PAGE gel. Os resultados também
revelaram uma proteína-kD banda 32 e 41 kD proteína banda correspondente à LipL32 e LipL41,
respectivamente (Figura 4B). Para demonstrar que a banda principal proteína efetivamente correspondeu
com LipL32, a análise do immunoblot foi realizada em proteínas da membrana externa extrair shermani
Leptospria usando um anti-soro de coelho imunizado com purificada LipL32 recombinantes. O anti-soro
resultante LipL32 revelou uma banda de 32 kD único, o que indica que LipL32 é o principal componente da
Leptospira patogênica membrana externa (Figura 4C).

Figura 4. (A) SDS-PAGE de Triton X-114 tratados com


extrato de proteínas da membrana externa da patogenicidade
shermani Leptospira (pista 1) revelou 32 kD e uma proteína-
kD 41 faixas que não foram detectadas em nonpathogenic
Leptospira patoc extratos (pista 2). (B) SDS-PAGE de Triton
Ver versão maior (34K): X-114-tratados (pista 1) e SDS-tratados (pista 2), proteínas de
[Nesta janela] membrana externa extrair patogênicos shermani Leptospira
[] Em uma nova janela ambos revelaram a 32 kD e 41 kD bandas de proteínas. (C)
[Como] de slides do PowerPoint Immunoblot de shermani Leptospira proteínas da membrana
externa extraído por Triton X-114 (pista 1) e SDS (pista 2),
utilizando o anticorpo anti-LipL32 revelou que a banda de 32
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kD correspondeu a LipL32. Note-se que a extração por Triton
X-114 revelou uma maior quantidade de banda de proteína
LipL32 que a extração SDS.

Efeitos de um anticorpo feito contra LipL32 e LipL32 recombinante


Cultivadas células do túbulo proximal foram incubadas com Leptospira shermani proteínas da membrana
externa e soros levantadas contra LipL32 (anti-LipL32) e contra a fase de detergente Triton X-114 extrair
(anti-LS) para avaliar o papel LipL32 na indução da nefrite tubulointersticial. Pré-incubação de shermani
Leptospira proteínas da membrana externa com o anti-LipL32 anticorpo impediu o aumento da MCP-1 e
iNOS mRNAs. O anticorpo anti-LipL32 diminuiu a expressão de MCP-1 e iNOS mRNA de 92% (P
<0,01) e 48% (P <0,01), respectivamente. Por outro lado, o anticorpo anti-LS diminuiu a expressão de
MCP- 1 e iNOS mRNA em 79% (P <0,01) e 95% (P < 0,001), respectivamente. O anticorpo anti-LipL32
significativamente diminuiu 63% (P <0,05) e 82% (P <0,05) o montante de MCP-1 e peptídeo níveis de
nitrito, respectivamente, recuperado nos sobrenadantes de cultura das células incubadas com Leptospira
shermani membrana externa proteínas do extrato. Da mesma forma, o anti-LS anticorpos também diminuiu
52% (P <0,05) e 93% (P < 0,01) a quantidade de MCP-1 e peptídeo nitrito, respectivamente, recuperado
nos sobrenadantes das culturas, enquanto não significativo efeito inibitório foi observado quando o soro de
coelho preimmune (PIS) substituiu os anticorpos (Figura 5). Estes resultados forneceram linhas de fortes
indícios de que grande parte LipL32 transduz a indução da expressão gênica mediada por nefrite
tubulointersticial por leptospira proteínas da membrana externa. Cultivadas mouse proximal células tubulares
foram incubadas com LipL32 recombinante de 48 h para elucidar o papel da LipL32. mRNAs para MCP-1,
iNOS e -Actina foram medidos por RT-PCR competitiva e os resultados foram expressos em número de
vezes de controlos. Aumentando as concentrações da proteína recombinante (0.6, 1.2, 2.4, 6 e 12 ng / ml)
aumentou de forma dose-dependente da expressão de MCP-1 (4.0, 9.0, 11.3, 11.4, e de 11,8 vezes,
respectivamente) em comparação com as células não tratadas (P <0,001). iNOS expressão também aparece
7,4, 11,5, 15,0, 15,6 e 14,9 vezes aumenta para 0,6, 1,2, 2,4, 6 e 12 ng / ml, respectivamente, em
comparação com células não tratadas (P <0,001) (Figura 6A). Em contraste, a LipL41 recombinante não
induziu alterações nos níveis de MCP-1 e expressões iNOS quando comparado com doses equivalentes de
LipL32 recombinante (Figura 6B).

Figura 5. RT-PCR competitiva para MCP-1, iNOS e -Actina


mRNAs em células do túbulo proximal estimulada pela leptospira
proteínas da membrana externa: inibição por anti-LipL32 (anti-
LipL32) e anti-Triton X-114 fase detergente extrato (anti-LS)
soros. A incubação do soro anti-LipL32 de Leptospira shermani
proteínas da membrana externa extrato induziu uma diminuição
acentuada dos túbulos proximal MCP-1 e iNOS expressão
mRNAs. Adicionando-LS anti-soro anti também inibiu MCP-1 e
iNOS mRNAs expressão (A). MCP-1 peptídeo (B) e nitrito (C)
níveis medidos no sobrenadante da cultura mostrou um padrão
semelhante de estímulo de proteínas da membrana externa extrato
Ver versão maior (35K):
(LS), que foi quase completamente prevenida pela anti-LipL32 e
[Nesta janela]
soros anti-LS. Nenhum efeito de inibição foi observada quando o
[] Em uma nova janela
soro de coelho preimmune (PIS) foi utilizado para substituir anti-
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soros. Os resultados são a média ± EPM de experimentos em
triplicata. C, testemunha, LS, shermani Leptospira; *P <0,05,
**P 0,01 <; ***P <0,001 versus LS.

Figura 6. competitiva resultados RT-PCR de MCP-1, iNOS e -


Actina mRNAs em células do túbulo proximal estimuladas com
diferentes concentrações de LipL32 recombinante (A) ou LipL41
recombinante (B). Os resultados são a média ± SEM de três
experimentos separados. M marcador; C, testemunha; *P <0,05;
**P <0,01; ***P <0,001 versus controle de células não tratadas.

Ver versão maior (31K):


[Nesta janela]
[] Em uma nova janela
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Cultivadas células do túbulo proximal foram incubadas com a LipL32 recombinante (2,4 ng / ml) e do anti-
soro antiLipL32. recombinante LipL32 melhoraram significativamente o MCP-1 (11,3 vezes; P <0,001) e
iNOS (15 vezes; P <0,001) . Em contraste, uma pré-incubação com o soro anti-LipL32 impediu o aumento
da MCP-1 e iNOS em 81% (P <0,01) e 78% (P < 0,01), respectivamente. A proteína recombinante
LipL32 significativamente aumentou a quantidade de MCP-1 (2,4 vezes, P <0,05) e nitrito (2,2 vezes, P
<0,05) recuperados no sobrenadante da cultura. Em contraste com pré-incubação, da LipL32 recombinante
com o anti- antissoro LipL32 reduziu o aumento de MCP-1 e nitrito por 78% (P <0,05) e 95% (P <0,01),
respectivamente. Como controles, não foram detectados efeitos inibitórios quando as células foram
previamente incubada com a PIS (Figura 7). Em conjunto, esses resultados indicam que LipL32
significativamente induz um aumento na tubulointerstitial mediada gene-expressão nefrite túbulo proximal em
células.

Figura 7. competitiva resultados RT-PCR de MCP-1, iNOS e


-Actina mRNAs em túbulo proximal incubadas com LipL32
sozinho ou com LipL32 mais o anticorpo anti-LipL32.
Preincubating proteínas da membrana externa com o anticorpo
anti-LipL32 reduziu significativamente (P <0,01) o aumento do
MCP-1 e iNOS mRNAs (A). MCP-1 peptídeo (B) e nitrito (C)
níveis medidos no sobrenadante da cultura, apresentaram um
padrão similar de estimulação por LipL32 que foi quase
completamente prevenida por soros anti-LipL32. Nenhum efeito
de inibição foi observada quando o soro de coelho preimmune
(PIS) foi utilizado para substituir o anticorpo. Os resultados são a
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média ± SEM de três experimentos. M marcador; C, testemunha,
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LS, shermani Leptospira; anti-LipL32, LipL32 recombinante
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anti-soro; PIS, soro de coelho preimmune; *P <0,05, **P
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<0,01.

Efeitos da LipL32 em NF- B, DNA AP-1 de ligação nuclear


Significativa DNA nuclear túbulo proximal ligação da transcrição fator NF- B foi observada quando as
células foram incubadas por 15 a 120 min com LipL32 recombinante. A DNA nuclear similar ligação de AP-
1 fator de transcrição também foi observado nas mesmas condições de incubação (Figura 8). Esses
resultados eo fato de que um excesso de 100 vezes de frio NF- sonda B inibiu a NF- B DNA nuclear
obrigatório confirmar a especificidade da LipL32 recombinante da proteína.

Figura 8. (A) Indução do fator nuclear- B (NF- B) e AP-1


fatores nucleares por LipL32 recombinante. Ilustração da
indução tempo-dependente de NF- B e AP-1 em culturas de
células do túbulo proximal mouse incubadas com LipL32
recombinante (8 ng / ml). (B) NF- B estimulada por LipL32 não
Ver versão maior (31K):
foi detectada com um teste livre (pista 1), ou quando células do
[Nesta janela]
túbulo proximal foram incubadas com LipL32, acrescido de um
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excesso de 100 vezes de frio NF- Sonda B (faixa 3).
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Discussão
Topo
Os resultados deste estudo indicam que LipL32, uma proteína importante Resumo
componente da Leptospira shermani membrana externa, é certamente envolvido na Introdução
Materiais e Métodos
patogênese da leptospirose levando a tubulointerstitial nefrite. Patogênicas de Resultados
Leptospira membrana externa pode determinar a virulência e ser o principal alvo de Discussão
Referências
imunidade. Muitas das mais abundantes proteínas na membrana externa
espiroquetas são lipoproteínas, que podem levar a um possível mecanismo de patogênese. Anterior estudos
têm sugerido que a membrana externa de leptospira tem uma proteína relativamente complexo perfil
(13,14,28). A procura para os componentes de proteína de alta patogenicidade do leptospira exterior da
membrana representa uma abordagem importante na compreensão da patogênese da leptospirose doença
renal.

Os resultados do estudo oferecem linhas de evidências sobre o papel determinante da LipL32 no início da
inflamação resposta de células tubulares. A seqüência ea expressão da LipL32 são altamente conservadas
entre todas as espécies de Leptospira patogênica; portanto, as proteínas da membrana externa extraído
patogênica Leptospira shermani com LipL32 recombinante LipL32 ou tenham sido testados em cultura
mouse células dos túbulos proximais. As proteínas da membrana externa LipL32 contendo extrato induziu a
produção de quimiocinas MCP-1, RANTES, iNOS e TNF- em ambos os mRNA e os níveis de proteína
em ratos células dos túbulos proximais. LipL32 marcada estimulou a produção de MCP-1 e iNOS, e ambos
os soros para todo proteínas da membrana externa ou extrato LipL32 recombinante em grande parte
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impedida a resposta inflamatória de células dos túbulos proximais induzidas pelo exterior proteínas da
membrana extrato. Estes dois fatos sugerem fortemente que LipL32 é a componente da membrana externa
importante que pode dar início a in vivo leptospira relacionadas com nefrite tubulointersticial. O papel da
LipL32 na patogênese da leptospirose pode merecer uma investigação mais detalhada , porque LipL32
também tem sido mostrado para induzir TNF- indução no monocytic células humanas (29). Em contraste, a
membrana externa da proteína LipL41 na leptospira patogênica não induz a mudanças nos níveis de
expressão de genes relacionados à tubulointerstitial nefrite. Esse resultado indica que LipL41 não podem
estar envolvidos na lesão tubular e inflamação induzida pela patogenicidade leptospira.

Quimiocinas são uma família de citocinas quimiotáticas que induzem a migração de vários tipos de células,
especialmente as de lymphoid origem. Quimiocinas são upregulated durante várias formas de glomerular e
intersticial lesões (30,31). Entre essas entidades, CC quimiocinas são moléculas que provavelmente
mononuclear recrutar mais leucócitos para o rim. Como a maioria das formas de tubulointerstitial nefrite,
incluindo a leptospirose, a causa mononucleares para se infiltrar no túbulo e interstício (6), leptospira externa
da membrana extrato foram adicionados à cultura mouse túbulo proximal células para reproduzir o in vivo
condição. A expressão aumentada de CC quimiocinas MCP-1 e RANTES associado com o aumento da
produção de iNOS e TNF- indicar a propensão de leptospirose proteínas da membrana externa para
estimular a resposta inflamatória de células do túbulo proximal e, talvez, para recrutar células infiltrando em
caso de nefrite tubulointersticial. Estes resultados também sugerem que CC quimiocinas múltiplos podem
desempenhar um papel no recrutamento de leucócitos na leptospirose doença renal. adição de proteínas de
membrana externa patogênica Leptospira shermani upregulated quimiocinas em culturas de células do
túbulo proximal, enquanto acrescentando nonpathogenic Leptospira patoc proteínas de membrana externa
não induzir tais um upregulation. A leptospira patogênica da proteína de membrana externa pode, portanto,
concebível início tubulointerstitial nefrite através dos componentes contidos na membrana externa. Esta
descoberta é a primeira evidência que demonstra um papel de leptospira patogênica proteínas da membrana
externa na patogênese da nefrite tubulointersticial relacionadas com células do túbulo proximal.

túbulo proximal é uma das principais fontes de óxido nítrico produção sob as duas condições basal e
estimulado (32). Uma série de in vivo e in vitro estudos (32) revelaram significativa do papel do óxido
nítrico na fisiologia túbulo proximal e fisiopatologia. É geralmente aceite que o óxido nítrico inibe fluido dos
túbulos proximal e reabsorção de sódio. Neste estudo, as proteínas da membrana externa da Leptospira
shermani marcada estimulou a produção de óxido nítrico por células do túbulo proximal. A produção de
óxido nítrico pode ter um papel importante na regulação da oxigenação renal e prevenir a lesão hipóxico. Por
outro lado, o óxido nítrico apresenta potente pró efeitos nos estados estimulada. O óxido nítrico pode ainda
contribuir para o dano tecidual através da interação com a geração de superóxido e peroxinitrito (33). O
óxido nítrico também interage com outras regulamentar mecanismos. Enhanced produção de óxido nítrico
pode downregulate Na+-K+-ATPase, Na+/ H+ trocadores e permeabilidade paracelular de células do túbulo
proximal, o que pode contribuir para o seu efeito sobre o transporte tubular proximal (32). Aqui, leptospira
membrana externa marcadamente proteínas estimulam a produção de iNOS. Como demonstrado por
Younes-Ibrahim et al. (34), a adição de glycolipoproteins leptospira extraído de Leptospira interrogans
inibe a Na+-K+ATPase de actividade em células epiteliais renais. Portanto, não pode ser excluído que a
expressão aumentada da iNOS pode alterar a regulação do íon de transporte em células do túbulo proximal.

Leptospira patogênica proteínas da membrana externa também estimular o TNF- expressão em células do

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túbulo proximal, que é associado com um aumento na capacidade de ligação de DNA nuclear de NK- TNF
B. - é uma citocina pró-inflamatória que é produzido por monócitos / macrófagos (35) e residente células
renais (36). O TNF- gene contém uma NF- B seqüência obrigatório em seu promotor (37). TNF- se
estimula a NF- B ativação (38) e pode aumentar TNF- síntese através de novas NF- B ativação de uma
forma autócrina amplificação. Tem sido demonstrado que o peptidoglicano membrana externa de Leptospira
copenhageni induz a liberação de TNF- do sangue periférico de células mononucleares (39). semelhante
ocorre com a indução de TNF- quando leptospira proteínas da membrana externa é adicionada ao extrato
medular espesso ascendente membro células em cultura (8).

As células eucarióticas contêm uma infinidade de caminhos de ligação estímulos ambientais para a
regulamentação específica da expressão gênica. Dois resposta precoce complexos de transcrição, NF- B e
AP-1, parecem responder aos estímulos ambientais, induzindo a expressão de genes específicos a jusante. A
importância da NF- B ativação tem sido demonstrada em vários modelos de nefrite. Essa ativação
desempenha um papel central de inflamação, tanto na glomerulonefrite e nefrite tubulointersticial (38). Nós
temos demonstrado previamente que leptospira membrana externa proteínas induzir em cultura de células de
espessura membro ascendente significativo de DNA nuclear ligação do NF- B por Leptospira shermani
mas não o avirulent nonpathogenic patoc Leptospira. Os resultados deste estudo mostram a ativação de
LipL32 similar no DNA nuclear de ligação do NF- B em células do túbulo proximal.

Em conclusão, os resultados deste estudo fornecem fortes evidências de que entre shermani Leptospira
proteínas da membrana externa LipL32 representa a principal proteína patogênicos que podem induzir
proximal inflamação tubular por meio da NF- Associados gene B expressão. Estes resultados podem servir
como um passo importante na compreensão de como um microorganismo pode iniciar tubulointerstitial nefrite
relacionados aos seus componentes de membrana externa através de uma inflamatório via prejuízo.

Agradecimentos
Este estudo foi suportado por concessões do National Health Research Institute e pelo National Science
Council, Taiwan, República da China, e pelo INSERM, França. Os autores gostariam de agradecer Yi-
Ching Ko, Chung-Tseng Huang, e Hsiau-Mai Yu pela sua dedicada e excelente suporte técnico.

Referências
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Resumo
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