FERMENTACIN

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Conteo de clulas, balances de materia y rendimientos de una
fermentacin alcohlica y produccin de etanol a partir de materias
primas de segunda generacin.

Caicedo Garcia-M.Alejandra, Riveros Rojas-Jonathan, Pinza Pabon- Eveling Yurany,

Trujillo Moreno-Yuli Tatiana

Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales, Departamento de ingeniera Qumica, laboratorio de ingeniera qumica ll.
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RESUMEN

La fermentacin alcohlica comprende algunos tpicos desde los que se pueden abordar, en cuanto al tipo
de microorganismo a usar, la fuente de sustrato y la forma de produccin en el biorreactor. Se presenta a
continuacin el uso de la fermentacin como produccin de bioetanol, el tipo de sustrato a usar en tal
fermentacin; que para este caso hay un enfoque sobre las materias primas de segunda generacin, el
conteo de clulas del microorganismo a cargo de la bioconversin, y el tipo de rendimiento de acuerdo al
sustrato/biomasa, sustrato/producto, biomasa/producto.

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1. Introduccin microorganismos, por suministro de oxgeno,

Las bioconversiones son procesos en los cuales
los microorganismos convierten un grupo de
sustancias en un producto, utilizando para esto
desde un pequeo nmero hasta una complicada
secuencia de reacciones enzimticas. Tales
microorganismos poseen unas respectivas
etapas de crecimiento, regulada por su actividad
enzimtica; desarrollo, asimilacin, biosntesis y
asimilacin [1].
La fermentacin es una de estas llamadas
bioconversiones; es un proceso catablico
(rompimiento de compuestos complejos a
compuesto sencillos) oxidativo (intercambio de
electrones) de cuyo resultado obtenemos un
compuesto orgnico. El producto final vara
segn el sustrato [2].
Las fermentaciones se clasifican de acuerdo a
diferentes puntos de vista que son: por
medio en que se lleva a cabo la fermentacin
(slido, lquido,); de acuerdo a esto, la
fermentacin puede darse en la superficie del
sustrato o sumergido en este, y de acuerdo al
rgimen temporal en que opera el biorreactor; ya
sea, discontinuo, por lotes o continuo.
Una vez se tiene claro el tipo de fermentacin, es
necesario conocer el mtodo de seguimiento al
crecimiento microbiano, y por supuesto la
medicin del metabolito que se desea producir.
Para esto existen variedad de mtodos de conteo
de forma directa o indirecta que se muestran a
continuacin.
El objetivo en particular es la produccin de
etanol a partir de materias primas de segunda
generacin (componentes lignocelulosicos), con
el que se busca el aprovechamiento de residuos
agrcolas, residuos forestales, son fuentes
renovables y abundantes; su generacin no
compite con tierras de uso agrcola ni con la
seguridad alimentaria.
2. Conteo de clulas
Los recuentos celulares son una serie de
procedimientos que tienen por objeto
determinar el nmero de clulas que estn
comprendidos en una unidad de volumen
determinada.
El recuento celular es muy utilizado por ser un
mtodo sencillo y poco costoso, el cual permite
adems un mejor seguimiento del cultivo
mediante su inspeccin visual.
Existen diferentes mtodos empleados para el
conteo de clulas como:
2.1Mtodos de conteo directos al microscopio:
estos permiten efectuar el conteo de las clulas
totales vivas y muertas, la ventaja es que son
rpidos.
2.1.1 Conteo microscpico directo por el mtodo de
Breed: un volumen conocidos de la muestra
(generalmente 0.01 mL) se extiende sobre un
portaobjetos normal en una superficie conocida.
Se examinan en un microscopio, se cuentan las
clulas en diversos campos. Se obtiene el valor
medio de clulas por campo y se multiplica por el
nmero de campos comprendidos en la
preparacin. El resultado corresponde al nmero
de clulas en el volumen extendido (0,01 mL).
Multiplicando este valor por 100 (inverso del
inoculo colocado en el cuadrado) y 3000 (rea de
campo del microscopio, debe ser calculado para
cada uno) se obtiene el nmero total de
organismos por mL o por gramo de muestra.
travs de ella. Esto permite determinar con
= 3000 bastante exactitud
100
2.1.2 Conteo microscpico directo en cmara de
Petroff-Hauser y Neubauer: Es una placa de vidrio
con una cuadrcula en depresin en el centro
donde se deposita la muestra medida. Es posible
relacionar el nmero de clulas observadas en la
superficie de un cuadro, con el volumen de esa
rea. Considerando los volmenes en la
cuadrcula se puede calcular la concentracin de
microorganismos por ml, este mtodo requiere
de clulas individuales y presenta limitaciones
como el hecho de ser tedioso, no es prctico para
un gran nmero de muestras, adems no es muy
sensible pues se necesitan al menos de 106
Celulas/mL para que sean observadas al
microscopio y no se distinguen clulas vivas de
muertas.
Los pasos para el conteo son: 1. Contar las clulas
presentes en varios cuadrados grandes y sacar
un promedio. 2. Multiplicar el promedio por 25
(se obtiene n de clulas en un mm2), 3.
Multiplicar por 50 (se obtiene nmero de clulas
en un mm) y multiplicar por 1000 para
transformar a cm3.
( )
= 25 50 1000
Las ventajas y desventajas de este mtodo son:
Ventajas
Procedimiento rpido
Exigencia mnima con buena
experiencia de conteo
Permite observar diferencias
morfolgicas de los microorganismos
Desventajas
no se distinguen clulas vivas de
muertas
anlisis de poca cantidad de muestra
cansancio al operador
fcilmente se ocasionan errores
2.1.3 Conteo turbidimtrico: En una suspensin
microbiana la cantidad de clulas est
directamente relacionada con la turbiedad o
densidad ptica de la misma e inversamente
relacionada con la cantidad de la luz que pasa a
la cantidad de
microorganismos en la suspensin mediante la
determinacin de la turbiedad en un nefelmetro
o un espectrofotmetro. Los resultados se
comparan con una curva estndar construida con
una suspensin testigo de concentraciones
conocidas. La turbiedad que resulta en la
suspensin microbiana se aproxima a la
producida por un cierto nmero de clulas en la
suspensin. Esta tcnica es til solamente para
organismos unicelulares de pocos mm, como las
bacterias, lo que les permite mantenerse
suspendidos y homogneamente distribuidos.

2.1.4 Contadores electrnicos: Se hace pasar un
volumen conocido de la muestra con
microorganismos a travs de un orificio de 5 a 10
mm de dimetro, mediante manipulacin con
unas micropipeta de mercurio. La resistencia
elctrica a travs del orificio est normalizada y
se altera cada vez que un microorganismo pasa a
travs de l. La modificacin de la resistencia se
amplifica y se registra electrnicamente.
2.2 Mtodo de conteo en medio de cultivo:
mediante cultivo de la muestra se detectan
nicamente las clulas vivas. En todos los casos
se parte de un volumen o peso de muestra
conocido. Conociendo la procedencia de la
muestra se puede esperar la obtencin de
cuentas bajas o altas o incluso ausencias de
organismos. Si se esperan pocos
microorganismos, las muestras se pueden
centrifugar o filtrar. Si se esperan cuentas altas,
se puede diluir la muestra en cantidades
conocidas del diluyente, utilizando solucin
salina, agua peptonada u otros.[1]
2.3 Mtodo de la gota o de Miles Misra: involucra
la preparacin de diluciones seriadas de una
suspensin bacteriana. Las placas son divididas
en sectores separados. Se inocula cada sector una
gota empleando una pipeta pasteur calibrada o
bien micropipetas inoculando 0.02mL
2.4 Siembra en tubos o recuento del nmero ms
probable: proporciona una estimacin estadstica
de la densidad microbiana presente con base a
que la probabilidad de obtener tubos con
crecimiento positivo disminuye conforme es
menor el volumen de muestra inoculado.
El nmero de clulas viables de las clulas es
determinado por los tubos que presentan
turbidez multiplicado por el factor de dilucin.
Tiene como ventaja contar microorganismos que
son difciles de contar en medio slido, y se usa
tambin para determinar el nmero de clulas de
un cultivo mixto que pueden crecer en un medio
liquido determinado [2].
3. Tcnicas biolgicas de recuento de
celulas viables
3.1Recuento en filtro de membrana: consiste en
pasar con ayuda del vaco la muestra de agua a
travs de una membrana de celulosa de 0.45
micrones. La limitacin con los volmenes
depende tambin de la presencia de turbiedad.
Cuando se trata de aguas contaminadas es
necesario diluir previamente las muestras. Para
efectuar la disolucin se debe tener en
consideracin que el nmero ideal de colonias en
el filtro de membrana esta entre 20 y 60. La
muestra se filtrara a travs del filtro de
membrana convenientemente colocado en el
soporte de filtracin. Ventajas: los resultados son
obtenidos ms rpidamente, principalmente
para bacterias del grupo coliformes, volmenes
mayores de muestra pueden ser examinadas, los
resultados son ms precisos que los esperados
por la tcnica de los tubos mltiples, los equipos
y materiales necesarios ocupan menor espacio
con relacin a la tcnica de los tubos mltiples.[2]
Las ventajas es que los resultados son obtenidos
rpidamente , principalmente para bacterias del
grupo coliformes, Volmenes mayores de
muestra pueden ser examinada, los resultados
son ms precisos que los esperados por la tcnica
de los tubos mltiples, y los equipos y materiales
necesarios ocupan menor espacio con relacin a
la tcnica de los tubos mltiples.
En limitaciones las muestras con bajo recuento
de coliformes y relativamente gran cantidad de
slidos en suspensin, el crecimiento bacteriano
se puede constituir a veces en una pelcula
continua sobre la superficie de la membrana,
imposibilitando el recuento[2].
3.2Contaje en placa: consiste en el plaqueo de una
muestra de volumen conocido del alimento que
se analiza. El resultado es funcin de una serie de
factores como son el mtodo de muestreo, el tipo
de microorganismo, el tipo de alimento y las
caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos
pueden hacerse tanto en masa como en
superficie, aunque hay que considerar que los
cultivos en masa son letales para la flora
psicotrofa. Cada bacteria viable formara una
colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa
normal o por medio de un plaqueado en espiral
que va depositando concentraciones
progresivamente ms diluidas de la muestra, este
mtodo es utilizado principalmente para la
cuantificacin de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos.
Deben contarse de 30 a 300 colonias, si hay ms =+ (2)
de 300 se dice que son INCONTABLES [2]. ()
= 1 1 2 2 + V (3)

+ +
= 65
3 En una fermentacin ocurre que:
Donde: o No hay entrada ni salida de sustancias
CA= Carga alta durante el proceso por lo que estas dos
CB= Carga baja variables sern cero y la ecuacin se
CM= Carga media reduce a:
= (4)
3.3Films secos (petrifilm): son pelculas Donde
deshidratadas de medios de cultivos generales o ()
= (5)
selectivos en las que se deposita 1 ml de la
muestra que rehidrata el medio. Tras la = (6)
incubacin se hace el recuento. [3] = (7)
()
= ( ) (8)
3.4 Conteo peso seco: esta tcnica consiste en la
separacin de solidos suspendidos en la solucin
mediante la centrifuga, la fuerza producida ()
= (9)
forzara a los slidos suspendidos a
precipitarse.[4] Y finalmente la ecuacin del balance de materia
Las ventajas y desventajas son las siguientes: de una fermentacin alcohlica es:
Ventajas
Econmico = (10)

Sencillo de trabajar
Genera medida directa en masa 5. Rendimientos (clculos de
Desventajas rendimientos sustrato/biomasa,
Es lento sustrato/producto,
Poca variacin biomasa/producto)
No es sensible
El rendimiento es una relacin lineal que se da
para conocer el rendimiento del proceso
4. Balances de materia de una
respecto a la biomasa, el producto y el sustrato.
fermentacin alcohlica.
Por lo tanto la ecuacin para obtener el
rendimiento para biomasa/sustrato es:

= = (11)

Para el rendimiento producto/sustrato es:

Tomada: NDUSTRIA QUMICA.NE.2006

= = (12)

Para la fermentacin alcohlica en un bio-
reactor, se realiza el siguiente balance de Y por ltimo para el rendimiento de
materia: producto/biomasa es:

+ = (1)
Dnde: i= entrada, s= salida, f= formacin, a= = = (13)

acumulacin
Para trminos prcticos se utilizara la Donde:
nomenclatura siguiente de cada parmetro Nf= Numero de clulas finales
mencionado en la ecuacin (1).
 No= nmero de clulas iniciales
Sf= Sustrato final
So= Sustrato Inicial
Pf= Producto final
Po= Producto inicial
X= Biomasa
S= sustrato
P= Producto
6. Produccin de etanol a partir de
materias primas de segunda
generacin.
Se le llama bioetanol de segunda generacin al
etanol obtenido a partir de material
lignocelulsico (residuos agrcolas, residuos
forestales y madera), a menudo llamado biomasa,
la biomasa puede ser usada para la produccin de
energa y cubre un amplio rango de materiales y
fuentes los residuos de la industria forestal y
agricultura, los desechos urbanos y las
plantaciones energticas se usan, generalmente
para procesos modernos de conversin que
involucra la generacin de energa a gran escala,
enfocada hace la sustitucin de combustibles
fsiles.[16] Esto quiere decir material de origen
biolgico que contiene azucares, pero es
clasificado como desecho, para la fermentacin
es usada la celulosa pero este material no es muy
accesible como lo es el almidn o el azcar, ya que
se encuentra ntimamente unida a otros
materiales como la lignina o las sustancias
pcticas.[15]
El proceso de produccin de etanol a partir de
material lignocelulosico consta en general de 4
pasos principales: Pre-tratamiento, hidrolisis,
fermentacin y la purificacin/separacin del
producto (figura 1). [6]
El pre tratamiento se hace con el fin de alterar la
estructura y tamao macroscpico y
microscpico de la biomasa (material
lignocelulosico: tres polmeros; celulosa,
hemicelulosa y lignina), al igual que su
composicin y estructura qumica
submicroscpica. [10] Debido a que la
hemicelulosa posee estructura muy compleja de
polmeros de diferentes azucares como la xilosa
y la arabinosa (pentosas), manosa, glucosa y
galactosa (hexosas) y cidos de azcar adems el
componente dominante de la hemicelulosa de la
madera y plantas es el xilano. Por otra parte la
lignina es despus de la celulosa y la
hemicelulosa, uno de los polmeros ms
abundantes en la naturaleza y est presente en la
pared celular [16] .Debido a la composicin del
material lignocelulosico la hidrolisis enzimtica
de esta biomasa es elevadamente limitada debido
a varios factores, como la cristalinidad de la
celulosa, el grado de polimerizacin, el contenido
de humedad, la superficie de contacto disponible
y el alto contenido en lignina.
Es por ello que los pre-tratamientos llevados a
cabo varan de diversas maneras, existen los
fsicos; mecnicos y trmicos, los qumicos;
empleando cidos o bases y la combinacin de los
mismos, a continuacin una breve descripcin de
los mismos.
- Mecnico: reduccin fsica de la
biomasa, cristalinidad de la misma,
mayor rea de contacto, y reduccin del
grado de polimerizacin
- Trmico: calentamiento de la biomasa
lignocelulsica (150-180C) pero tener
en cuenta la reactividad trmica de la
biomasa
- Pre-tratamiento con vapor de agua:
biomasa a altas temperaturas (240C) y
presin durante unos minutos, esto con
el objetivo de solubilizar la hemicelulosa
para tener mejor acceso en hidrolisis
enzimtica para evitar formacin de
inhibidores
- Pre-tratamiento con agua caliente: agua
lquida, que solubiliza la hemicelulosa
para tener mejor acceso a la celulosa y
evitar la formacin de inhibidores
(4<Ph<7)
- Pre-tratamiento acido: cidos a
temperatura tambin usados con el
 objetivo de mejorar la digestibilidad
anaerobia, y con ello solubilizar la
hemicelulosa y obtener acceso a la
celulosa, esto se lleva acabo con cidos
diluidos o fuertes (tener en cuenta las
concentraciones de los cidos,
formacin de furfural).
- Pre-tratamiento alcalino: reaciones
como la solvatacin y la saponificacin
aparecen provocando que la biomasa se
expanda dndole lugar a las enzimas y
bacterias que puedan hidrolizar.
Una vez terminado dicho proceso (pre-
tratamiento) salen dos partes, una de ellas es una
fraccin solida insoluble en agua (celulosa y
lignina) y la otra liquida (hemicelulosa), luego se
hidroliza la celulosa y la hemicelulosa para
obtener los monmeros [16].
En la hidrolisis ocurre la conversin de los
polmeros carbohidratados a monmeros de
azcar. La hidrolisis enzimtica (sacarificacin)
brinda grandes oportunidades tecnolgicas y
reduce los costos en los equipos por efecto de la
corrosin, haciendo el etanol resultante de este
proceso de combustible competitivo a gran
escala comparado con otros combustibles
lquidos [6]. En este proceso de hidrolisis
enzimtica la celulosa es transformada en
glucosa, galactosa y manosa, azucares de 6
carbonos (hexosas), las cuales pueden ser
fermentadas a etanol por varios microrganismos.
Por otro lado las pentosas como xilosa y
arabinosa (las cuales contiene 5 carbonos) son
inmediatamente fermentadas por algunas cepas
nativas, usualmente con bajas conversin [6].
Aquellas pentosas que no se pueden fermentar
en el paso anterior son fermentadas a etanol por
S. pombe, S. cerevisiae, S. amucae. Para terminar
el proceso las corrientes resultantes de la
fermentacin son purificadas por procesos de
destilacin o con la utilizacin de membranas,
generando una corriente de etanol de alta
pureza.
El desarrollo de etanol con materias primas de
segunda generacin presenta ventajas respecto
al de primera generacin porque son fuentes
renovables y abundantes, se realiza mediante
tecnologas limpias, no son fuentes de alimentos,
su generacin no es competitiva con las tierras de
uso agrcola caso contrario a los de primera
generacin [5]. El bio-etanol es limpio y no es tan
txico como los combustibles fsiles, hace que se
reduzcan las emisiones de CO2 a la atmosfera, ya
que estas especies agrcolas van absorbiendo
C02 a medida que se van desarrollando, pero
emiten una cantidad similar que los carburantes
minerales (carbn) o fsiles (petrleo) en el
momento de la combustin, lo que hace que el
balance neto de emisiones sea positivo. [9]
La produccin de materia prima para su
fabricacin se realiza de manera local, por lo que
puede ser impulsor de la generacin de empleo
en areas rurales y por tanto tiene gran valor
como estimulacin econmica. [9]
La desventaja de la produccin de etanol de
segunda generacin es que los costos de
produccin son ms altos que los de primera
generacin, ya que la tecnologa de
procesamiento de la materia prima es ms
compleja, por lo que los costos de inversin y
produccin asociados son elevados. [5]
Las tecnologas de segunda generacin ofrecen
un mayor rendimiento de las materias primas
porque permiten aprovechar toda la celulosa y
no solamente el azcar, almidn o aceite. De esta
manera es posible aprovechar una mayor parte
de un cultivo existente, maximizando su
rendimiento por hectrea, minimizando al
mismo tiempo, la necesidad de expandir las reas
cultivadas o de usar cultivos alimenticios para
producir biocombustibles.
un claro ejemplo de esto en Colombia se puede
ver tambin con el caso de la cascarilla de arroz
que es uno de los desechos agrcolas que se
genera en grandes proporciones y es una fuente
de desecho muy difcil de biodegradacin
convirtindose en un gran problema ambiental y
de costos, segn estadsticas de Fedearroz, el
rea destinada a la siembra de arroz en Colombia
es de aproximadamente 400.000 hectreas en las
cuales se produce alrededor de 2.000.000 de
toneladas de arroz paddy seco y 400.000
toneladas de cascarilla anualmente. La industria
arrocera dentro de su visin estratgica tiene
como meta, el aumento del consumo per cpita
de arroz hasta el doble del valor actual
(39kg/persona/ao), lo anterior supone un
incremento en la produccin de arroz y en
consecuencia de la cascarilla.
Segn estudios la cascarilla de arroz posee en
composicin lo siguiente: 33% de celulosa15%
de hemicelulosa y 20% de lignina, siendo esto
una alternativa para el aprovechamiento integral
de este material, siendo usado en la fabricacin
de bio-etanol y diversos productos qumicos [16].
7. CONCLUSIONES
Los biocombustibles de segunda generacin
elaborados a partir de materias primas
lignocelulsicas presentan un cuadro
completamente diferente en cuanto a sus
repercusiones para la agricultura y la seguridad
alimentaria. Podra usarse una mayor variedad
de materias primas, adems de los cultivos
agrcolas que se utilizan actualmente con las
tecnologas de primera generacin, y con
mayores rendimientos de energa por hectrea.
Tambin variarn sus efectos para los mercados
de productos bsicos, los cambios en el uso de la
tierra y el medio ambiente, as como su influencia
en las futuras tecnologas de produccin y
conversin.
Existen muchos y variados mtodos de medicin
de biomasa ya sea directos o indirectos, que a su
vez cada uno presenta cierto tipo de ventajas y
desventajas en cuanto a su aplicacin o a la
obtencin de los resultados. Es decir, algunos
mtodos indirectos presentan un sesgo puesto
que no se refiere directamente al conteo de
clulas sino al metabolismo del microorganismo,
referido a los componentes celulares. Entonces,
tales medidas son ms propensas a la aparicin
del error.
La garanta que ofrecen los mtodos directos
para la toma de datos, se fundamenta a partir de
las prcticas de laboratorio que tenga cada
persona. Si se cumpliese en detalle los protocolos
para cada mtodo de biomasa, de todas formas,
habra una variacin entre uno u otro miembro
del grupo.
La obtencin de etanol a partir de materias
primas de segunda generacin, se postula como
una de las prcticas mejor valoradas en cuanto a
las tecnologas limpias empleadas, la fuente de
sustrato como recurso renovable y el
aprovechamiento de desechos agrcolas y/o
forestales. Lo anterior fortalece la idea de la
bsqueda de fuentes de energa ms amigables
con el medio ambiente.
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