PRODUCCIN DE CAROTENOIDES Y LPIDOS POR RHODOCOCCUS OPACUS PD630 EN CULTIVO

DISCONTINUO Y ALIMENTADO

Anusith Thanapimmetha1 Tharatron Suwaleerat1 Maythee Saisriyoot1

Yusuf Chisti2 Penjit Srinophakun1

ABSTRACT

Se informa sobre la produccin de carotenoides por Rhodococcus opacus PD630. Para la fermentacin se utiliz un medio de sal
mineral modificado formulado con glicerol como fuente barata de carbono. El acetato de amonio fue la fuente de nitrgeno. Se
puede producir una concentracin de masa de clulas secas de aproximadamente 5,4 g / L en matraces de agitacin con una
concentracin de carotenoides de 0,54 mg / l. En el cultivo discontinuo en un biorreactor de 5 l, sin control del pH, la concentracin
mxima de biomasa seca fue * 30% menor que en los frascos de agitacin y la concentracin de carotenoides fue de 0,09 mg / L.
Tanto la concentracin de biomasa como la concentracin de carotenoides podran aumentarse utilizando una operacin alimentada
por lotes con una mezcla de alimentacin de acetato de amonio y cido actico. Con esta estrategia, la concentracin final de
biomasa fue de 8,2 g / L y la concentracin de carotenoides fue de 0,20 mg / L en una fermentacin de 10 das. Un control de pH
demostr ser innecesario para maximizar la produccin de carotenoides en esta fermentacin.
Palabras clave Rhodococcus opacus PD630 Carotenoids
Fermentacin Cultivo de lotes

INTRODUCCIN

Los carotenoides son pigmentos tetraterpenoides producidos por las plantas y muchos microorganismos [1 - 4]. Los carotenoides
varan en color de amarillo a rojo intenso y son solubles en lpidos. En la naturaleza, los carotenoides protegen las membranas
celulares contra los daos causados por la luz, la oxidacin y los radicales libres [5]. Uno de los carotenoides ms conocidos es el
b-caroteno (C40H56), un precursor de la vitamina A. Los carotenoides son beneficiosos para la salud [6, 7] y se utilizan como
colorantes alimentarios [2, 8]. Los carotenoides como el b-caroteno y la astaxantina se producen comercialmente principalmente
por sntesis qumica, pero existe una gran demanda de carotenoides naturales. Por ejemplo, el b-caroteno natural se asla de la
microalga Dunaliella salina cultivada en lagunas al aire libre [9]. Del mismo modo, la astaxantina natural se produce
comercialmente en los estanques al aire libre utilizando el alga verde Haematococcus pluvialis [10]. Lagunas y estanques estn
abiertos a la atmsfera, ocupan grandes reas de tierra y su entorno de produccin no est controlado. La fermentacin microbiana
es una fuente alternativa prometedora de carotenoides naturales [4, 6]. La biomasa microbiana rica en carotenoides se puede cultivar
como cultivo puro en biorreactores compactos utilizando sustratos econmicos y las condiciones de cultivo pueden ser controladas
para maximizar la produccin [3, 5].
Este trabajo informa sobre la produccin de carotenoides utilizando la bacteria del suelo Gram-positiva no patgena Rhodococcus
opacus PD630. Esta bacteria es conocida por producir carotenoides [11], pero no ha sido previamente examinado en detalle para
su produccin. Se evalan diferentes estrategias de fermentacin para la produccin de carotenoides. El efecto del pH del cultivo
sobre la produccin de carotenoides se discute como el pH influye significativamente en el crecimiento celular y la produccin de
carotenoides en otros microorganismos [1]. La concentracin de oxgeno disuelto puede influir en la produccin de carotenoides
debido a que las clulas sometidas a estrs oxidativo responden elevando la produccin de los antioxidantes carotenoides. Por
ejemplo, el estrs oxidativo a altos niveles de oxgeno disuelto estimul la produccin de b-caroteno en el hongo patognico de la
planta aerbica Blakeslea trispora [5, 12].
Adems de los carotenoides, R. opacus produce grandes cantidades de otros aceites [13, 14], incluidos los triacilgliceroles (TAG).
Las TAG son de inters potencial como materia prima para producir biodiesel y cidos grasos de alto valor. Bajo condiciones
adecuadas, R. opacus PD630 puede acumular hasta 87% del peso de la pila seca como aceites [15]. En vista de esto, la produccin
de TAG por R. opacus PD630 se evalu en paralelo con la produccin de carotenoides.

MATERIALES Y MTODOS

CEPA Y MEDIOS
Rhodococcus opacus PD630 (DSM 44193) se obtuvo de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(DSMZ, Alemania). Los medios de cultivo utilizados fueron caldo de nutrientes (NB) [16] y un medio de sal mineral modificado
(MSM) formulado con glicerol y una solucin de oligoelementos (SL6). El MSM original contena los siguientes componentes en
980 ml de agua destilada: 2,9 g de Na2HPO4 2H2O, 2,3 g de KH2PO4, 1,0 g de NH4Cl, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 0,5 g de NaHCO3,
0,01 g de CaCl2, 20 ml de solucin frrica de citrato de amonio citrato de amonio por 20 ml de agua destilada) y 5 ml de la solucin
de elementos traza SL6. El SL6 contena lo siguiente (por L de agua destilada): 0,5 g de MnCl _ {2} 4H _ {2} O, 0,03 g de Na _
{2} MoO _ {4} 2H _ {2} O, 0,02 g de NiCl _ {2}
0,3 g de H3BO3, 0,1 g de ZnSO _ {4} 7H _ {2} O y 0,2 g de CoCl _ {2} 6H _ {2} O

[17]. En el MSM modificado utilizado en este trabajo, el acetato de amonio (1,44 g) reemplaz al cloruro de amonio del medio
original de tal manera que la concentracin molar de amonio en los dos medios fue idntica. El acetato de amonio fue la principal
fuente de nitrgeno. El MSM modificado se formul con glicerol (100 g / L) como la fuente de carbono [18, 19]. El microorganismo
se mantuvo rutinariamente en medio agar NB (8 g / l de caldo NB suplementado con 15 g / l de agar) a 4C.

PREPARACIN DEL CULTIVO DE SIEMBRA

Se us un bucle de clulas de una sola colonia cultivada en una placa de agar de NB a 30C durante 3 das para inocular 5 ml de
medio NB lquido en un tubo de ensayo. El cultivo se incub en una incubadora de agitacin (200 rpm, 30C) hasta que se alcanz
una densidad ptica de aproximadamente 0,6

660 nm (Secomam Anthelie Advanced Spectrophotometer, Secomam, Francia). Este cultivo (25 lL) se us para inocular 50 ml de
medio NB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml incubado como anteriormente durante 27 h.

CONDICIONES DE CULTIVO
Los experimentos en matraz de agitacin se realizaron por triplicado usando

Frascos Erlenmeyer de 250 ml. Cada matraz contena 50 ml de MSM modificado con diferentes concentraciones iniciales de acetato
de amonio (ya sea 1,44 7,70 g / L, como se observ ms adelante para experimentos especficos) y glicerol (100 g / l). El pH
inicial se ajust a 6,8 0,1. El cultivo de siembra antes mencionado se us para inocular los matraces de tal manera que el inculo
constituyese el 25% del volumen de cultivo final. Los matraces se incubaron en una incubadora de agitacin (200 rpm,

30C) durante 10 das.

Los cultivos discontinuos de biorreactor se realizaron en un biorreactor de tanque de 5 l con agitador (FS-02-B05P-110/220 V,
Scien- te Mayor, Taiwn) agitado con tres impulsores de 6 paletas. El volumen de trabajo fue de 3 L. Cada fermentacin dur 7
das. El bioreactor contena MSM modificado con glicerol (100 g / l). La velocidad de agitacin y la temperatura de incubacin
fueron 200 rpm y 30C, respectivamente. La concentracin inicial de acetato de amonio fue 1,44 g / L, igual a la concentracin
molar de cloruro de amonio en el MSM original.

El tamao del inculo era 15 20% (v / v) del volumen de cultivo inicial en el biorreactor. El pH no se control en vista de los
resultados de los experimentos preliminares. La velocidad de aireacin vari en el intervalo de 1-2 vvm en respuesta al controlador
de oxgeno disuelto. Si se produjo espuma, se aadi manualmente un agente antiespumante a base de silicio.

En los experimentos de lote alimentado en el biorreactor, el tamao del inculo era siempre del 15% (v / v) del volumen de trabajo
inicial. Las otras condiciones fueron las mismas que se indicaron anteriormente para los cultivos discontinuos. La alimentacin de
una dosis fue acetato de amonio (1,44 g / l, o 19,1 mmol / l), o cido actico (1,15 g / l, o 19,1 mmol / l), o una combinacin de
ambos. Cuando se utilizaron ambos piensos, se aliment por pulso el acetato de amonio (1,44 g / l) el primer da, seguido de
alimentacin de un solo da de cido actico (1,15 g / L) el segundo da y de nuevo al tercer da. Los cultivos se alimentaron una
vez al da hasta el final del cultivo (un total de 6 tomas), o cada da durante los primeros 3 das (un total de 3 tomas). El ltimo
cultivo alimentado en lote en el biorreactor utiliz un perfil de alimentacin modificado como se muestra en la Tabla 1.

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE BIOMASA

La concentracin de peso seco celular (CDW) se determin midiendo la densidad ptica de una muestra de caldo diluida
adecuadamente a una longitud de onda de 660 nm y convirtindola en una concentracin de peso en seco a travs de una curva de
calibracin. El ltimo
se haba preparado midiendo la densidad ptica de una muestra de cultivo diluida en serie con una concentracin de peso en seco
de clulas exactamente conocida. El CDW en esta muestra se determin recuperando la biomasa de 10 ml del caldo por
centrifugacin (60009 g, 15 min, 4C), lavando el sedimento de clulas dos veces con agua desionizada, secando en un horno a
90C durante la noche, enfriando a habitacin temperatura en un desecador y pesaje.

DETERMINACIN DE LAS CONCENTRACIONES DE GLICEROL Y ACETATO

Las concentraciones residuales de glicerol y acetato se midieron en el filtrado de cultivo obtenido filtrando el caldo a travs de un
filtro de 0,2 lm (tamao de poro). El acetato se midi como cido actico. Para estas mediciones se utiliz cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC, Spectra-Physics, Thermo Finnigan, EE.UU.). El sistema de HPLC se instal con una columna Aminex
HPX-87H (300 9 7,8 mm) (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.) y un detector de ndice de refraccin. La columna
se eluy con cido sulfrico 5 mM a 50C y un caudal de 0,6 ml / min.

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE CAROTENOIDES

Los carotenoides se midieron espectrofotomtricamente (espectrofotmetro HACH modelo DR6000, HACH Company, Loveland,
CO, EUA) como equivalentes de b-caroteno despus de la extraccin con disolvente de la biomasa [1, 20, 21]. Las clulas se
recuperaron a partir de un volumen conocido (aproximadamente 1 ml) del caldo de cultivo por centrifugacin (10.0009 g, 10
minutos), se lavaron una vez con agua destilada, se resuspendieron en 1 ml de acetona y se mantuvieron a 55C durante 15 minutos
en el medio oscuro. El sedimento de clulas casi incoloro se elimin por centrifugacin (10.0009 g, 10 min) y se midi la
absorbancia (A454) del sobrenadante a 454 nm contra un blanco de acetona. Esta medida se compar con una curva de calibracin
que se haba preparado utilizando b-caroteno como un carotenoide estndar puro. Casi todos los carotenoides tienen un alto
coeficiente de absorcin a una longitud de onda de alrededor de 450 nm [22]. La concentracin de carotenoides (C, mg / L) se
relacion con la absorbancia medida (A454) como sigue:

C 3: 994A454 1

El coeficiente de regresin (R2) para la ecuacin anterior fue 0,994.

DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS

Las clulas se recuperaron del caldo de cultivo por centrifugacin (60009 g, 15 minutos), se lavaron una vez con agua desionizada
y se liofilizaron. La biomasa resultante se extrajo con una mezcla disolvente de cloroformo y metanol (2: 1, v / v) durante 1 h
mientras se sonicaba a temperatura ambiente. Despus, se centrifug la suspensin sonicada (10.0009 g, 10 min), se retir la capa
de cloroformo (la capa inferior) que contena los lpidos disueltos y se evapor el disolvente para obtener los lpidos. Los lpidos
extrados se convirtieron en steres metlicos de cidos grasos (FAME) por reaccin con metanol y se analizaron por cromatografa
de gases (GC) [23] usando un sistema GC Shimadzu GC-2010 Plus GC equipado con una columna Agilent BD-EN14103 (30 m 9
0,32 mm, 0,25 lm de pelcula) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). El helio era el gas portador. Se inyect una
porcin de 1 lL de la muestra con una relacin de divisin de 50: 1. La entrada se mantuvo a 250C. El perfil de temperatura de la
columna fue el siguiente: 60C durante 2 min; calentado a 200C a 10C / min; calentamiento adicional a 240C en

5 C / min y se mantuvo durante 7 min. Se utiliz un detector de ionizacin de llama a 250C. Los cidos grasos fueron identificados
y cuantificados por comparacin con cromatogramas de FAME estndar.
El contenido de cidos grasos se defini como el porcentaje en masa de los cidos grasos en el peso seco de las clulas (% CDW).
El contenido total de lpidos se calcul como la suma de los cidos grasos en las cinco FAME siguientes: palmitato de metilo (C16:
0), estearato de metilo (C18: 0), oleato de metilo (C18: 1), linoleato de metilo (C18: , y eicosapentaenoato de metilo (C20: 5). Se
estim el contenido de lpidos (% p / p) de la biomasa como los lpidos totales cuantificados anteriormente como porcentaje del
peso seco de biomasa utilizado en la extraccin.

RESULTADOS
Efectos de la concentracin de acetato de amonio (cultivos de frascos de agitacin)

Los efectos de la concentracin inicial de acetato de amonio en el medio de cultivo (1,44 7,70 g / L) sobre la produccin de
biomasa y carotenoides en matraces de agitacin se muestran en la Figura 1. Ambos medios contenan la misma concentracin
inicial de glicerol g / l) como un resto de carbono adicional

El consumo de acetato (derivado del acetato de amonio) se midi como cido actico [24]. Tanto en las altas como en las bajas
concentraciones de acetato de amonio, esencialmente todo el acetato se consumi en los primeros 2 das (Figura 1). Aunque el
acetato se consumi fcilmente, la concentracin inicial ms alta de acetato de amonio tuvo un impacto adverso sustancial sobre la
concentracin final de biomasa (Figura 1). Despus del segundo da, la biomasa dej de crecer en el medio con la alta concentracin
de acetato de amonio (Figura 1b) produciendo slo 1,8 g / L, pero el crecimiento continu hasta la cosecha en el da 10 en el medio
de acetato de amonio bajo (Figura 1a ), con una concentracin final de biomasa de 5,4 g / l (Fig. 1a). La alta concentracin de
amonio derivado de acetato de amonio despus del consumo de acetato suprimi la produccin de biomasa [18, 25] a pesar de la
disponibilidad de una gran cantidad de glicerol como la fuente de carbono.

El perfil de crecimiento de la biomasa en el medio de acetato de amonio bajo (Fig. 1a) fue consistente con el crecimiento diauxico:
inicialmente, hubo un rpido crecimiento en acetato hasta que se consumi completamente. A esto sigui un perodo de 3 das de
crecimiento lento durante el cual las clulas se adaptaron para con- sumir glicerol. Posteriormente, se produjo un crecimiento rpido
adicional sobre el glicerol (Figura 1a). La produccin de carotenoides fue claramente asociado con el crecimiento de la biomasa.
Durante el da 1 del cultivo, la concentracin de carotenoides en el medio de acetato de alto am- nio aument, pero la produccin
ces en cuanto la biomasa dej de crecer (Figura 1b). Por consiguiente, la concentracin final de carotenoides en el medio de
acetato de amonio alto fue inferior a 0,05 mg / l (figura 1b). Por el contrario, la concentracin de carotenoides aument
prcticamente en paralelo con la concentracin de biomasa en el medio de acetato de amonio bajo (Figura 1a) y la concentracin
final fue casi 0,54 mg / L (Fig. 1a), o ms de diez veces mayor que la concentracin de carotenoides concentracin en el medio de
acetato de amonio alto.

EFECTO DEL TAMAO DEL INCULO EN LA PRODUCCIN DE CAROTENOIDES EN CULTIVOS

DISCONTINUOS DE BIORREACTORES

El efecto del tamao del inculo sobre el crecimiento de la biomasa y la produccin de carotenoides se
examin en cultivos de biorreactores discontinuos. El pH no se control, ya que se haba producido un
buen crecimiento de la biomasa y la produccin de carotenoides en matraces de agitacin discontinuos
sin control del pH (Figura 1a). La concentracin inicial de acetato de amonio en estas fermentaciones fue
1,44 g / l, ya que la mayor concentracin haba inhibido el crecimiento.

El tamao del inculo influye en la duracin de la fermentacin en lotes, reducindose generalmente el tiempo de fermentacin por
un aumento en el tamao del inculo. Tamao del inculo tambin afecta a la produccin de metabolitos en ciertas fermentaciones
[26, 27]. Se ensayaron tamaos de inculo de 15% (v / v) y 20%. Los resultados se muestran en la Fig. 2.

La fermentacin se inici con el inculo ms pequeo con el tiempo dio una mayor concentracin de biomasa en comparacin con
la fermentacin comenz con el inculo ms grande (Fig. 2a]. Al final de la fermentacin de 7 das, las concentraciones mximas
de biomasa fueron 2,6 g / L para la fermentacin con el inculo ms grande y 3,8 g / l para la fermentacin con el inculo ms
pequeo (Figura 2a). En ambas fermentaciones, el acetato se consumi en un da y los perfiles de consumo de acetato fueron
idnticos (figura 2b). En ambos casos, se produjo un perodo de crecimiento lento (es decir, la fase de retardo del crecimiento
diahlico) despus del consumo del acetato, pero esta ralentizacin del crecimiento fue ms severa en la fermentacin iniciada con
el inculo ms pequeo (figura 2a). Los perfiles de consumo de glicerol de las dos fermentaciones fueron casi idnticos (figura
2b). La concentracin de glicerol residual fue de casi 90 g / l, confirmando un exceso de glicerol. El consumo de glicerol fue
siempre mucho ms lento que el consumo de acetato, lo que sugiere que el acetato sea una fuente de carbono ms fcilmente
metabolizada. Un inculo ms pequeo tambin redujo la formacin de espuma en las primeras etapas de la fermentacin.

La produccin de carotenoides es en general paralela al crecimiento de la biomasa (Figura 2a). Aunque inicialmente la
concentracin de carotenoides fue mayor en el inculo alto

fermentacin, una vez que el crecimiento de la biomasa ces, la produccin de carotenoides no se mantuvo. Por lo tanto, la
fermentacin de bajo inculo, que dio una mayor concentracin final de biomasa, tambin alcanz una concentracin
significativamente mayor de carotenoides que la de la fermentacin con alto inculo (Figura 2a). Las concentraciones finales de
carotenoides fueron 0,070 y 0,088 mg / L en las fermentaciones con inculo alto y bajo, respectivamente (Figura 2a).

Los perfiles de pH fueron poco afectados por el tamao del inculo (Figura 2c). En ambos casos, el pH aument rpidamente
durante el primer da (figura 2c). Durante este perodo, el acetato derivado del acetato de amonio estaba siendo consumido (Figura
2b) y la concentracin de amonaco en el medio de cultivo probablemente aument para causar un aumento del pH [28].
Posteriormente, el glicerol se consumi como fuente de carbono y el amonio que qued del acetato de amonio proporcion el
nitrgeno. Consumo de amonio por la biomasa suelen liberar H? [29, 30] y esto explica la disminucin del pH del da 2 al da 5 del
cultivo (Figura 2c].

Como se ha indicado anteriormente, los experimentos anteriores se llevaron a cabo sin controlar el pH. Slo el pH inicial se haba
ajustado a 6,8. Esto se debe a que se ha comprobado que el pH no afecta la produccin de carotenoides, como se confirma en la
figura 3. La figura compara la produccin de biomasa, la produccin de carotenoides, el consumo de glicerol y el consumo de
acetato para los casos con el pH controlado a 6,8 y sin control del pH (es decir, slo el pH inicial ajustado a

6,8). Los datos mostrados (Figura 3) se obtuvieron usando un tamao de inculo de 15% v / v. La biomasa creci y se produjeron
carotenoides independientemente de si el pH estaba controlado (Fig. 3a), pero las concentraciones finales de biomasa y carotenoides
eran claramente ms altas en ausencia de control del pH (Figura 3a). Si el pH estaba controlado apenas haba efecto en los perfiles
de consumo de glicerol y acetato (Fig. 3b). Los perfiles de pH para las fermentaciones se muestran en la figura 3c. En vista de estos
resultados, el control del pH era completamente innecesario para esta fermentacin.

CULTIVOS DE LOTE ALIMENTADO EN EL BIORREACTOR

Como se discuti en la seccin anterior, en fermentaciones discontinuas el acetato se consumi en las primeras 24 h (figura 2b).
Por lo tanto, se evaluaron tres operaciones separadas alimentadas por lotes para reponer peridicamente los nutrientes mientras se
evitaba un aumento de concentraciones a niveles inhibidores. Las tres fermentaciones en lote alimentado se muestran en la figura
4. En un caso, slo se aliment por pulso el cido actico. En el segundo caso, slo se aliment por pulso el acetato de amonio. En
el tercer caso, se utiliz alimentacin por pulsos y la alimentacin fue una combinacin de acetato de amonio y cido actico.

La alimentacin intermitente evit con xito la inhibicin asociada con una alta concentracin de acetato de amonio tal y como se
observ en fermentaciones en matraz de agitacin discontinua. As, el da 5, la fermentacin alimentada con una combinacin de
cido actico y acetato de amonio (AA \ alpha MA, figura 4a) tena una concentracin de biomasa mayor que la mejor fermentacin
por lotes (15% de inculo, figura 2a) del biorreactor.

Se examinaron los efectos de la alimentacin de los diferentes sustratos y el nmero de etapas de alimentacin en la produccin de
biomasa y carotenoides (Figura 4). En cada alimentacin,

Se alimentaron 70 ml del sustrato de tal manera que la concentracin en el fermentador despus de la alimentacin fue 1,44 g / l de
acetato de amonio, o 1,15 g / l de cido actico. En la fermentacin alimentada con cido actico, el crecimiento de la biomasa se
desaceler 1 da despus del inicio y la concentracin final de la biomasa fue mucho menor en comparacin con las fermentaciones
alimentadas con acetato de amonio y la fermentacin alimentada con ambos sustratos (una alimentacin de acetato de amonio sobre
da 1
seguido por una alimentacin de cido actico en cada uno de los das 2 y 3) (Figura 4a). A medida que el consumo de cido actico
cesaba en el da 3 (o el da 4, dependiendo de la alimentacin) (Figura 4b), su concentracin aumentaba con las alimentaciones
subsiguientes (Figura 4b). Se haba acumulado tanto cido actico al da 3 en el cido actico alimentado con fermentacin que el
pH del cultivo disminuy a alrededor de 4,9 (figura 4c). El consumo de cido actico ces tempranamente en la fermentacin
alimentada con cido actico porque la alimentacin no contena nitrgeno y no exista otra fuente de nitrgeno en el medio de
cultivo. Parte del carbono necesario para el crecimiento se deriv del glicerol que se consumi hasta el da 2 en el cultivo alimentado
con cido actico (figura 4b). Una vez que ces el crecimiento de la biomasa, no hubo consumo adicional de glicerol (Figura 4b).

Las fermentaciones alimentadas con acetato de amonio o una combinacin de los dos sustratos (una alimentacin de acetato de
amonio seguida de dos aportaciones de cido actico) contenan nitrgeno en la alimentacin y ambos alcanzaron una concentracin
final de biomasa igual a casi 4 g / L Fig. 4a). Esto fue casi un 70% mayor que la concentracin mxima alcanzada en la fermentacin
alimentada con cido actico solo (Figura 4a). Ambas estas fermentaciones consumieron glicerol, pero la tasa de consumo y la
cantidad final total consumida fueron mayores para la fermentacin alimentada con acetato de amonio puro (Figura 4c). Esto se
debi a que el acetato proporcionado en acetato de amonio no se consumi completamente y se acumul en el medio de cultivo
con cada paso de alimentacin (figura 4b) de modo que se obtuvo ms carbono para el crecimiento a partir de glicerol. El pH de
esta fermentacin se elev inicialmente a casi 8,5 (da 2, figura 4c), pero posteriormente disminuy con cada alimentacin para
eventualmente convertirse en ligeramente cido.

En la fermentacin alimentada con las dos alimentaciones (una alimentacin de acetato de amonio seguida de dos aportaciones de
cido actico), no hubo acumulacin de acetato (Fig. 4b). Como parte del carbono requerido para el crecimiento se deriv del
acetato, el consumo de glicerol fue menor que en la fermentacin alimentada con acetato de amonio solo (Figura 4b). Al igual que
con la fermentacin alimentada con acetato de amonio puro, el pH inicialmente aument a casi 8,5, pero disminuy con las
alimentaciones subsiguientes a valores ligeramente cidos (Figura 4c).

La concentracin final ms alta de carotenoides se alcanz en la fermentacin alimentada con los dos alimentos (una alimentacin
de acetato de amonio seguido de dos tomas de cido actico) (Figura 4a). En la fermentacin limitada por nitrgeno alimentada
con cido actico puro, la concentracin final de carotenoides fue realmente mayor que la concentracin final de la fermentacin
alimentada con acetato de amonio puro (Figura 4a). As, la limitacin del nitrgeno mejor la produccin especfica de carotenoides
y el exceso de nitrgeno suprimi fuertemente la produccin. Los carotenoides no contienen nitrgeno y, por tanto, pueden
producirse en principio bajo condiciones de limitacin de nitrgeno, siempre que haya suficiente biomasa viable y una fuente de
carbono. De hecho, microorganismos como las microalgas se sabe que producen ms carotenoides en condiciones de hambre de
nitrgeno [31].

Para la fermentacin alimentada con una mezcla de cido actico y acetato de amonio, la concentracin de carotenoides fue la ms
alta a casi 0,09 mg / L (Figura 4a). En esta fermentacin, no hubo acumulacin de acetato (Fig. 4b), lo que sugiere un consumo
completo de cido actico y acetato de amonio. El carbono disponible como glicerol no se consumi completamente (figura 4b).
Por lo tanto, el nitrgeno era limitante, aunque suficiente para soportar una concentracin final de biomasa de alrededor de 4 g / l.
La alta concentracin final de la biomasa combinada con una limitacin de nitrgeno condujo a la alta concentracin observada de
carotenoides (Figura 4a)
A pesar de este aumento sustancial de la concentracin de carotenoides, la produccin especfica de carotenoides en la biomasa fue
realmente ms alta en la fermentacin severamente limitada con nitrgeno alimentada con cido actico puro (Figura 4a).

La primera fermentacin por lotes de la Fig. 5 se aliment de acuerdo con los datos de la Tabla 1. Las tres primeras alimentaciones
(es decir, los das 1, 2 y 3, Tabla 1) se basaron en los mejores resultados de la Fig. 4 en trminos de produccin de carotenoides.
Este enfoque se utiliz para: prevenir la limitacin del nitrgeno demasiado temprano en la fermentacin; potenciar el consumo de
glicerol y, por tanto, la produccin de la biomasa; y evitar la acidificacin excesiva del caldo de cultivo. Todos estos objetivos
fueron alcanzados, como lo muestran los datos de la Fig. 5: el pH no baj de 5 (Fig. 5b); la biomasa

continu creciendo alcanzando una concentracin de 8,2 g / l (Fig. 5); la concentracin de carotenoides alcanz 0,20 mg / l (figura
5b); y se consumi casi el 40% del glicerol inicial. La biomasa de esta fermentacin tena un contenido total de lpidos de 40,8% p
/ p en base seca y la concentracin de lpidos en el caldo de cultivo era de 3,3 g / l. El perfil de cidos grasos de los lpidos se
muestra en la Tabla 2. El cido esterico (C18: 0) constituy el 34,3% de los cidos grasos totales. Los cidos grasos saturados (es
decir, C18: 0 y C16: 0) constituan el 63,8% de los cidos grasos totales (Tabla 2). Los cidos grasos poliinsaturados (es decir,
C18: 2 y C20: 5) constituan una cantidad relativamente menor

11,3% de los cidos grasos totales. Este perfil de cidos grasos (Tabla 2] fue en general similar a los datos comunicados por otros
para R. opacus [15, 23, 32, 33].
DISCUSIN
El intenso color rojo anaranjado de la biomasa producida con una baja concentracin inicial de acetato de amonio (Fig. 6a) se debi
a un alto contenido de carotenoides. La biomasa cultivada con una alta concentracin de acetato de amonio tena un color menos
intenso (Fig. 6b). Por lo tanto, dadas las condiciones adecuadas, R. opacus puede ser inducido a sobreproducir carotenoides. Aunque
la produccin de carotenoides es bien conocida en algunos miembros del gnero Rhodococcus [34-37], no ha sido previamente
estudiado en detalle en R. opacus.

En un frasco de agitacin, un estudio anterior identific el acetato de amonio como la mejor fuente de nitrgeno en MSM para el
crecimiento de R. opacus PD630 y produccin de lpidos [18]. El presente estudio confirm esto, pero una concentracin inicial
demasiado alta (por ejemplo, 7,7 g / l) de acetato de amonio inhibi claramente la produccin de biomasa y carotenoides (Figuras
1, 6). Una alta concentracin de acetato de amonio es tambin conocido para inhibir el crecimiento de algunas otras bacterias [38],
pero el mecanismo detrs de este efecto sigue siendo desconocido.

El acetato de amonio es potencialmente una fuente tanto de carbono como de nitrgeno. Mientras que el acetato de amonio
proporcion el acetato fcilmente asimilado (por ejemplo, el consumo rpido de acetato en la Fig. 1), no podra ser una nica fuente
de carbono porque la biomasa bacteriana tiene tpicamente un contenido de nitrgeno de entre 9,5 y 12,8% en peso seco [39] ,
mientras que el contenido en N de acetato de amonio es mucho mayor en casi

18%. Por lo tanto, el acetato de amonio tuvo que ser suplementado con una fuente adicional de carbono. El glicerol se utiliz como
ms barato que la glucosa.

Una alta concentracin inicial de un compuesto de carbono como el glicerol puede suprimir el crecimiento microbiano aumentando
la presin osmtica en un medio de cultivo [40], pero en el presente trabajo, una concentracin inicial de glicerol de 100 g / L fue
bastante satisfactoria para la produccin de la biomasa y los carotenoides (por ejemplo, Fig. 1a). Anteriormente, para R. opacus
MITGM-173, una cepa genticamente modificada, una concentracin ptima de glicerol de 80 g / L se inform [17] para lograr
una alta concentracin de la biomasa en un cultivo de 6 das por lotes. Una concentracin inicial de glicerol de alrededor de

120 g / l caus una reduccin sustancial de la tasa de crecimiento de la biomasa [23], pero se conocen cepas de R. opacus capaces
de crecer en concentraciones de glicerol superiores a 100 g / l. Adems, R. opacus tolera concentraciones de sacarosa tan altas
como 240 g / L sin experimentar inhibicin [41].

En los cultivos discontinuos de biorreactores, un tamao de inculo del 15% (v / v) del volumen de trabajo inicial en el biorreactor
proporcionaba un buen crecimiento de la biomasa y una produccin de carotenoides en comparacin con un inculo ms grande
(figura 2). Las diferencias en las concentraciones finales de biomasa (Fig. 2a) en las fermentaciones realizadas con diferentes
tamaos del inculo se explicaron en parte por las diferencias en las concentraciones iniciales totales de los nutrientes en estos
cultivos:
el volumen inicial (= 3 L) fue el mismo en ambos casos; por lo tanto, con un inculo de 15% v / v el volumen del medio fresco en
el biorreactor fue de 2,55 L pero con un inculo ms grande del 20%, el volumen del medio fresco fue menor (es decir, 2,40 l).
Como el inculo en s mismo se agota en su mayora de nutrientes, al comienzo del cultivo el biorreactor con un inculo ms
pequeo tena una concentracin un poco mayor (* 6% ms grande) de todos los nutrientes en comparacin con el biorreactor que
comenz con un inculo ms grande [26, 42]. Adems, un inculo ms pequeo tambin tiene el potencial de reducir el coste total
de produccin de un producto de fermentacin.

En todos los cultivos discontinuos de biorreactor (Figuras 2, 3), el consumo de glicerol fue bajo y la mayor parte del glicerol inicial
permaneci en el medio al final de la fermentacin. Esto fue el resultado de una insuficiencia de nitrgeno. El medio de cultivo
discontinuo (Figuras 2, 3) contena inicialmente todos 1,440 g / l de acetato de amonio como fuente de nitrgeno. Esto fue
equivalente a una concentracin de N inicial de aproximadamente 0,262 g / l. Como la biomasa bacteriana contiene tpicamente
entre 9,5 y 12,8% de nitrgeno en peso seco [39], el nitrgeno disponible podra apoyar una concentracin mxima de biomasa
seca de aproximadamente

0,262 / 0,14, o 2,75 g / l. Una concentracin mxima de biomasa de

3,8 g / l en la Fig. 2a sugiere una biomasa deficiente en nitrgeno como se producira en condiciones deficientes en N.

Un medio de cultivo idntico al usado en los biorreactores discontinuos (Fig. 3) haba dado anteriormente una concentracin de
biomasa de aproximadamente 5,5 g / L en un matraz de agitacin (Figura 1a) y la concentracin final de carotenoides en el cultivo
de matraz de agitacin era casi 0,55 mg / l (figura 1a). Por lo tanto, un suministro limitado de nitrgeno por s solo no explic los
menores resultados de biomasa y carotenoides de los cultivos discontinuos de biorreactor (Figura 3). Una diferencia clave entre el
frasco de agitacin y los cultivos discontinuos de biorreactor fue la forma en que se agitan. Aunque en ambos casos se utiliz una
velocidad de agitacin de 200 rpm, el biorreactor utiliz agitacin mecnica con tres impulsores, mientras que los matraces de
agitacin utilizaron mezcla sin impulsor a travs de un agitador orbital. Estas diferencias significaron que en el biorreactor
prevaleca un entorno de esfuerzo cortante mucho mayor que en los matraces de agitacin. Rhodococcus opacus tiene una
morfologa filamentosa y puede ser susceptible de dao mecnico en un campo de corte de alta intensidad. Esto puede explicar el

crecimiento en el biorreactor y, por lo tanto, una menor concentracin final de carotenoides. Aunque no hay datos publicados sobre
la sensibilidad al corte de R. opacus, se ha encontrado que otro miembro del mismo gnero (Rhodococcus erythropolis) es sensible
al cizallamiento [43, 44].

El efecto del pH en una fermentacin depende en gran medida del microorganismo que se est usando. En estudios con otras espe-
cies, el control del pH ha sido til para mejorar la pro- duccin de ciertos carotenoides. Por ejemplo, se encontr un pH controlado
para mejorar la produccin de b-caroteno por una levadura recombinante [1]. Del mismo modo, un pH controlado aument la
produccin de astaxantina por la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous [45]. Sin embargo, en el presente trabajo, siempre que
el pH inicial se ajustara a 6,8, un control adicional del pH era totalmente innecesario tanto para la produccin de la biomasa como
de los carotenoides por R. opacus. Por ejemplo, el cultivo en matraz de agitacin sin control de pH (figura 1a) proporcion una
concentracin final de carotenoides casi nueve veces mayor que el cultivo de biorreactor controlado por pH (figura 3a).

El uso del mtodo de alimentacin de la Tabla 1 en una operacin alimentada por lotes mejor la produccin tanto de la biomasa
como de los carotenoides por casi dos veces en comparacin con el mejor cultivo de lotes en el biorreactor. Mientras que los
cultivos discontinuos haban usado slo glicerol como fuente de carbono, las operaciones alimentadas por lotes utilizaron cido
actico adems del glicerol. Se utiliz cido actico para proporcionar acetato ya que antes se haba demostrado que el acetato (a
partir de acetato de amonio) se consuma rpidamente (por ejemplo, la figura 1), mientras que el glicerol slo se metabolizaba
lentamente (por ejemplo, la figura 3b). Esta combinacin de una fuente de carbono rpidamente metabolizada (es decir, acetato) y
una fuente de carbono metabolizada lentamente (es decir, glicerol) impeda una limitacin de carbono mientras se permita controlar
la velocidad de crecimiento a un valor menor que el mximo posible. Se ha encontrado que el crecimiento limitante es necesario
para inducir la acumulacin de compuestos ricos en carbono ricos en energa, tales como carotenoides y lpidos de almacenamiento
en muchos microorganismos [41]. La supresin del crecimiento sin una limitacin de carbono permite que la energa metablica
sea canalizada a la sntesis de molculas ricas en energa y ricas en carbono, tales como carotenoides que no se producen o se
producen a niveles bajos durante un crecimiento rpido.

Aunque se sabe que muchos microorganismos producen carotenoides [1, 45-47], no se han reportado datos cuantitativos en la
literatura para la produccin de carotenoides por R. opacus. En la mejor fermentacin en lotes alimentados en este trabajo, la
concentracin final de carotenoides fue de 0,20 mg / L y el contenido de carotenoides de la biomasa fue 24 9 10-3 mg / g. En
cultivos discontinuos de matraz de agitacin, se pudo producir biomasa con un contenido de carotenoides de 0,1 mg / g. Comparado
con algunos microorganismos, R. opacus parece ser un relativamente buen productor de carotenoides. Por ejemplo, se ha informado
que la levadura Rhodo- torula glutinis alcanza un contenido de b-caroteno de 0,07 mg / g de biomasa seca [48]. Mucho ms pro-

en algunos otros microorganismos. Por ejemplo, la levadura X. dendrorhous alcanza un contenido de astaxantina de alrededor de
1,7 mg / g de biomasa seca [45]. Una levadura recombinante (Saccharomyces cerevisiae T73-

63) se ha reportado que produce niveles de b-caroteno de 4,6 mg / g de biomasa seca [1]. Una de las especies ms productivas es
el hongo patgeno B. trispora. Se ha informado que este hongo acumula carotenos a niveles de 85 mg / g de biomasa seca [49]. A
diferencia de B. trispora y muchos otros productores de carotenoides, R. opacus puede suministrar simultneamente aceites
triglicridos para su uso en la produccin de biocombustibles.

Junto con los carotenoides, la biomasa producida usando el perfil de alimentacin de la Tabla 1 contena 40,8% de lpidos totales.
Los cidos grasos saturados constituan casi el 64% de los cidos grasos totales y el 25% de los cidos grasos estaban
monoinsaturados (Tabla 2). Teniendo en cuenta una preponderancia abrumadora (casi 89%) de cidos grasos saturados y
monoinsaturados y una cantidad relativamente baja de poliinsaturados, los TAG de R. opacus son adecuados para la fabricacin de
biodiesel.

OBSERVACIONES FINALES
En matraces de agitacin, el acetato de amonio a una concentracin inicial de 1,44 g / L result ser satisfactorio para apoyar el
crecimiento de la biomasa y la produccin de carotenoides en el medio MSM modificado que contena glicerol a una concentracin
de 100 g / l. Una concentracin inicial de acetato de amonio demasiado alta era inhibidora. En cultivos discontinuos de biorreactor
sin control de pH, un tamao de inculo del 15% (v / v) del volumen de trabajo inicial en el biorreactor proporcion un buen
crecimiento de la biomasa y la produccin de carotenoides en comparacin con un inculo ms grande. El uso del mtodo de
alimentacin de la Tabla 1 en una operacin alimentada por lotes mejor la produccin tanto de la biomasa como de los carotenoides
por casi dos veces en comparacin con el mejor cultivo de lotes en el biorreactor. Un control del pH no era necesario para maximizar
la produccin de carotenoides. La biomasa contena casi 41% p / p de lpidos totales.