Inmovilizacin de Enzimas

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Inmovilizacin de Enzimas
Galrraga Marco; Martnez Katherine; Sandoya Lita

Escuela Politcnica Nacional, Facultad de Ingeniera Qumica y Agroindustria, Quito, Ecuador

Resumen: Este informe detalla el procedimiento de inmovilizacin de la enzima papana para construir un
cromatograma y determinar la proporcin de papana fijada al gel. Para preparar la columna cromatogrfica, se
elabor un gel a partir de 100 mL de DEAE Sepharosa CL-6B a la cual se le elimin el etanol mediante un embudo
con frita y una bomba de vaco para despus realizar 3 lavados con sosa custica y regular el pH a 7.5 con tampn
fosfato 50mM. La solucin se empac en una columna y se coloc el segundo pistn para finalmente lavar con el
mismo tampn durante 30 min. A continuacin, se prepar la muestra del ltex del babaco, obtenida anteriormente,
diluyendo el extracto con agua des-ionizada hasta que alcance la conductividad tampn. Finalmente, se aliment 25
mL de la muestra en la columna con la enzima inmovilizada mediante una bomba peristltica a velocidad constante.
Una vez que se termin de alimentar la muestra, se lav la columna con tampn hasta que no exista presencia de
protenas. Luego se aadi a la columna la solucin de sustrato p-NPA de 15 mg/mL en una relacin de 1/20 y se
recogi fracciones para medir la absorbancia de cada una a 348 nm. El valor de absorbancia mximo obtenido para
la concentracin de protena fue 1,41 mg/mL con lo que se determin que la cantidad de enzima inmovilizada fue
de 11,93 mg, mientras que la absorbancia mxima obtenido para la actividad enzimtica fue 0,811 u/mL dando una
actividad enzimtica de 1,33793 u/mL*min.

Palabras clave: Inmovilizacin enzimas, Absorbancia, Cromatografa.

Enzyme Immobilization
Abstract: This report details the immobilization procedure of the enzyme papain to construct a chromatogram and
determine the proportion of papain fixed to the gel. To prepare the chromatographic column, a gel was elaborated
from 100 mL of DEAE Sepharose CL-6B to which the ethanol was removed by means of a frit funnel and a
vacuum pump to then perform 3 washes with caustic soda and to regulate the PH to 7.5 with 50mM phosphate
buffer. The solution was packed in a column and the second piston was placed to finally wash with the same buffer
for 30 min. Next, the babaco latex sample obtained above was prepared by diluting the extract with deionized water
until it reached the buffer conductivity. Finally, 25 mL of the sample was fed into the column with the enzyme
immobilized by a peristaltic pump at constant speed. After the sample was finished feeding, the column was washed
with buffer until no protein was present. The 15 mg / mL p-NPA substrate solution in a ratio of 1/20 was then added
to the column and fractions were collected to measure the absorbance of each at 348 nm. The maximum absorbance
value obtained for the protein concentration was 1.41 mg / mL whereby it was determined that the amount of
immobilized enzyme was 11.93 mg, while the maximum absorbance obtained for the enzyme activity was 0.811 u /
ML giving an enzymatic activity of 1.33793 u / mL * min.

Keywords: Enzyme immobilization, Absorbance, Chromatography.

1 1. INTRODUCCIN La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que

los componentes que se han de separar se distribuyen entre
dos fases: estacionaria y mvil (Marn, 2010).

marco.galarraga@epn.edu.ec; Katherine.martinez@epn.edu.ec;
lita.sandoya@epn.edu.ec

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De acuerdo al Consejo Superior de Investigaciones
Cientficas de Espaa (2015), las tcnicas cromatogrficas
pueden clasificarse en:
Por el Mecanismo de Separacin:
Cromatografa de adsorcin. - Depende de la fuerza de
adsorcin-desorcin de los componentes de la mezcla.
Cromatografa de reparto. - Est basada en la separacin de
una mezcla de substancias mediante el reparto existente entre
la fase mvil (lquido o gas) y la fase estacionaria (lquida)
soportada o ligada sobre un slido adecuado.
Cromatografa por tamao molecular. - Consiste en la
separacin de las molculas basndose en su tamao en lugar
de en su solubilidad o polaridad.
Cromatografa de cambio inico. - Est basada en los
diferentes equilibrios de reparto de los iones y se lleva a cabo
con materiales insolubles y de textura porosa, las cuales
presentan grupos reactivos asociados a iones lbiles.
Por la Forma de Separacin son:
Anlisis por desarrollo. - El cromatograma se desarrolla hasta
que el frente de disolvente alcanza el final del lecho
estacionario, de forma que los constituyentes de la mezcla
una vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la
separacin.
Anlisis por elucin. - El paso de la fase mvil se contina
indefinidamente hasta que los componentes separados de la
mezcla emergen al final del lecho cromatogrfico.
Anlisis frontal. - Se utiliza una pequea columna, que es
saturada sucesivamente por cada una de las substancias a
separar, emergiendo de ella el primer componente puro hasta
que la columna se satura del segundo componente, momento
en el que empezar a emerger ste mezclado con el primero.
Anlisis por desplazamiento. - En este caso la substancia
desplazante va incorporada dentro de la fase mvil.
De acuerdo a Marn (2010), por el estado Fsico de las
Fases son:
Cromatografa de gases. - Su fase mvil es gaseosa. Pude ser
cromatografa gas-lquido o cromatografa gas-slido.
Cromatografa lquida. - Su fase mvil es lquida. Puede ser
cromatografa lquido-lquido o cromatografa lquido-slido.
HPLC. - Cromatografa lquida de alta presin o de alta
eficacia (. [HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography
/ High Performance Liquid Chromatography].
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Confinamiento fsico de una enzima o clula en una
determinada regin de espeacio de manera que su actividad
cataltica se retenga y pueda ser utilizada (Sanchz, 2008).
Segn (Sanchz, 2008) las ventajas de la inmoviliacin
enzimtica son:
1. Disminucin de problemas de autolisis (proteasas) o
de agregacin, al estar limitados los movimientos
rotacionales y translacionales.
2. En sistemas entrecruzados, se pueden fijar
interacciones con fosfolpidos, polisacridos, para
simular orgnulos celulares.
3. Se pueden simular reacciones in vivo.
4. Se pueden simular sistemas estructuralmente
asimtricos como el estudio de membranas.
Tipos de inmovilizaciones
1. Mtodos de Inmovilizacin Irreversibles
Enlaza el biocatalizador a un soporte permanentemente. Los
procedimientos ms comunes son:
Formacin de enlaces covalentes
Su ventaja radica en la naturaleza estable de los enlaces
formados entre enzima y soporte. Las enzimas en este
mtodo no son liberadas en la solucin en uso, para lograr
altos niveles de enlace, los residuos de aminocidos
esenciales para la actividad cataltica no deben involucrar un
enlace covalente con el soporte, lo cual es complicado en
muchos casos. (Katchalski-Katzir, E, 2012).
Formacin de enlaces cruzados
Con esta tcnica los soportes no son necesarios, ya que la
inmovilizacin se da por un enlace directo entre enzimas, que
puede ser mediado o no por un agente de unin.
Generalmente se aade el agente de bajo peso molecular (ej.
glutaraldehdo). Es susceptible a cambios pequeos de pH y
temperatura en las condiciones de operacin (Abbott, 2006).
Atrapamiento
El mtodo de atrapamiento est basado en la oclusin de las
enzimas dentro de una red polimrica que permite al sustrato
y a los productos pasar a travs de ellos y retener las enzimas
(Taylor, 2007).
Atrapamiento por inclusin.
La enzima queda atrapada dentro de una matriz de origen
natural o sinttico y de diversos materiales (Slica gel,
poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), que
posteriormente son gelificados (por temperatura o adicin de
polimerizantes), quedando atrapadas dentro de la matriz.
(Vuillemard, et al. 2008).
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Atrapamiento por micro-encapsulacin.
El mtodo puede ser de dos tipos: por microencapsulacin en
soportes porosos (con un dimetro de 2-50 nm), que
posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento
nanocompuesto, atrapan la enzima en su interior y permiten
el paso de sustratos y productos; por microemulsin
combinando la enzima con agentes emulsificantes y agitando
para formar micelas que la protegen de medios
cidos/alcalinos, proteasas y durante los periodos de
almacenamiento (Germain et al., 1999; Honda et al., 2008).
2. Mtodos de Inmovilizacin Reversible
En el mtodo de inmovilizacin reversible, las enzimas
inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo
condiciones no extremas. (Magee, et al. 2011).
Por adsorcin
Emplea soportes orgnicos o inorgnicos que presentan un
adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas, oro,
entre otros) en los cuales, las enzimas son atradas y retenidas
por medio de interacciones inicas o fuerzas dbiles (puentes
de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones
hidrofbicas) (Magee, et al. 2011).
Adsorcin no especfica.
Es el mtodo de inmovilizacin reversible ms simple, se
basa en la adsorcin fsica o enlace inico (Messing, 1976;
Woodward, 1985). En la adsorcin fsica las enzimas son
unidas a la matriz a travs de puentes de hidrgeno, fuerzas
de van der Waals, o interacciones hidrofbicas; mientras que
enlaces inicos de enzimas son producidos a travs de
uniones con sales (Magee, et al. 2011).
Adsorcin hidrofbica.
La resistencia de las interacciones radica en la hidrofobicidad
del adsorbedor y de la protena. La hidrofobicidad del
adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitucin del
soporte y por el tamao de la molcula ligante hidrofbica.
(Piffer et al. 2007).
Quelacin o enlace metlico.
Sales de metales de transicin o hidrxidos depositados en la
superficie de soportes orgnicos han podido ser enlazados
gracias a la coordinacin de los grupos nucleoflicos en la
matriz. (Roland, 2005).
Formacin de enlaces disulfuro.
Estos mtodos son nicos porque, aunque se forma un enlace
covalente estable entre la matriz y la enzima, es posible que
se rompan los enlaces por medio de una reaccin utilizando
agentes apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves
condiciones. (Roland, 2005).
Efectos de la inmovilizacin
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Segn Arroyo, (2008) la inmovilizacin produce cambios en
su estabilidad, adems la enzima inmovilizada es un sistema
heterogneo en el cual todos los componentes que interviene
en el proceso cataltico (pH, sustrato, etc) se encuentra en
interfase: en el medio de reaccin y en el centro cataltico por
ello la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo
difusional, estrico y del microentorno.
Efectos en la estabilidad se da por:
1. Estabilizacin conformacional por la existencia de
uniones multi-puntuales enzima-soporte.
2. Proteccin frente a las proteasas del medio.
3. Existe alteracin del micro-entorno de la enzima
debido a las interacciones con el soporte.
Efectos en la actividad enzimtica
1. Puede disminuir debido a que la unin al soporte se
produce de tal forma que al pasar el sustrato el
centro activo est impedido.
2. La inmovilizacin puede originar un cambio
conformacional que da lugar a una forma inactiva.
3. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con
algn aminocido que conforme el centro activo o
sea esencial en la actividad cataltica en la enzima.
Segn Johnson, (2012) uno de los mtodos para determinar la
concentracin proteica es de absorcin UV en el que la
absorcin es de 280nm debido a que dichas protenas pueden
contener aminocidos aromticos tirosina y triptfano en su
estructura tambin la presencia de fenilalanina y puentes
disulfuro pueden contribuir a la longitud de onda, determina
volmenes pequeos pero este debe ser pura y no contener
componentes no proteicos con el mismo espectro de
adsorcin como cidos nucleicos contaminantes, es rpido y
econmico, sin embargo este presenta alta variabilidad
adems es incompatible con detergentes y agentes
desnaturalizante, es propenso a errores. Su lmite de
deteccin va de (0.1-100) ug/ml.
Las enzimas son catalizadores proteicos que no intervienen
en la reaccin, la velocidad de reaccin puede aumentar de
106 a 1012 veces, poseen alto grado de especificidad la parte
de la enzima que se une con el sustrato se denomina centro
cataltico que es un in metlico como Fe2+; Zn2+ ;Mo2+ .
Algunas enzimas necesitan de una coenzima que se sintetiza
de vitaminas esta funciona como sustrato ya que se une
transitoriamente como es el caso de las deshidrogenasas. En
la cintica enzimtica la actividad enzimtica relaciona la
concentracin del sustrato o producto que se usa o forma la
enzima durante un intervalo de tiempo, este ensayo se
denomina ensayo cintico (Sobeida, 2013) .
2. METODOLOGA
2.1. Preparacin de la Columna Cromatografa
Se tom 100 mL de DEAE Sepharosa CL-6B, se elimin el
etanol en la que se encontraba por medio de un embudo con
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frita y una bomba de vaco, luego se dej el gel en agua ml de cada tubo de ensayo analizado sumado hasta la
destilada y se agit por 10 min, se coloc el gel en el filtro fraccin nmero 16, de lo cual se obtuvo el resultado de
con frita en donde se realizaron 3 lavados con sosa custica y 13,065 mg de protena eluida, por tanto en la columna de
se coloc el gel en tampn fosfato 50mM para regular el pH a cromatografa en gel se logr inmovilizar 11,93 mg de
7.5. A continuacin se empaco la solucin en una columna de enzima.
5cm del extremo superior y se coloc el segundo pistn. Se
lav el sistema preparado con el mismo tampn durante 30 Concentracin vs. nmero de
min para evitar la agitacin en la Sepharosa.
fracciones
2.2. Preparacin de la Muestra y = 0,003x6 - 0,2405x5 + 7,9644x4 - 139,7x3 + 1368x2 -
1.6 7086,2x + 15164
1.4 R = 1

Absrobancia (mg/mL)
Se tom muestras de enzimas del ltex del babaco, obtenidas
en la prctica que se realiz anteriormente. Por medio de un 1.2
conductivmetro se midi la conductividad del tampn con el 1
que se equilibra la columna. Se diluy el extracto con agua 0.8
des-ionizada hasta que alcance la conductividad tampn. 0.6
0.4
2.3. Alimentacin de la Muestra 0.2
0
Se aliment 25 mL de la muestra preparada a la columna, con 0 5 10 15 20
la ayuda de una bomba peristltica a velocidad constante.
Una vez que se termin de alimentar la muestra se lav la Nmero de fracciones
columna con tampn hasta que no exista presencia de Figura 3.1.2. Pico de Concentracin de Protena
protenas, lo cual sucede cuando la absorbancia de las
fracciones a 280 nm es cercano a cero. 3.2. Actividad enzimtica
Se aadi a la columna la solucin de sustrato p-NPA de 15 Para el clculo de la actividad enzimtica se grafic la
mg/mL en una relacin de 1/20. Finalmente se recogi Absorbancia vs. Nmero de fracciones como se indica en la
fracciones y se midi la absorbancia de cada una a 348 nm. Figura 3.2.1. Cromatograma de Absorbancia vs. Nmero de
Fracciones (400nm), en el cual se ubic el pico ms alto.
3. RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1. Concentracin de protena Absorbancia vs. Nmero de

fracciones (400nm)
A continuacin la Figura 3.1.1. Cromatograma: Absorbancia
vs. Nmero de Fracciones 280 nm, se puede observar la 1
Absobancia mg/mL

variacin de concentracin de protena con respecto a cada 0.8

fraccin obtenida despus de que se pas por la columna de 0.6
cromatografa en gel la cual inmoviliz la enzima, de esta 0.4
grfica se seleccion el pico ms alto para calcular la 0.2
concentracin de protena eluida. 0
0 5 10 15 20

Concentracin vs. nmero de

Nmero de fracciones
fracciones (280 nm) Figura 3.2.1. Cromatograma: Absorbancia vs. Nmero de Fracciones
(400nm)
1.5
Absrobancia (mg/mL)

La Figura 3.2.2. Pico de actividad enzimtica el cual es dado

1
por la cantidad de sustrato inmovilizado, para este clculo se
0.5 obtuvo la lnea de tendencia desde la fraccin nmero 5 hasta
la fraccin nmero 8, se obtuvo una actividad enzimtica de
0 1,33793 u/mL*min; segn estudios previos la actividad de la
0 10 20 30 enzima inmoblilizada es de 1,92 u/mL*min, esta actividad se
da ya que en la pared del gel de DEAE Sepharosa CL-6B, el
Nmero de fracciones centro activo de la enzima no siempre queda a disposicin
Figura 3.1.1. Cromatograma: Absorbancia vs. Nmero de Fracciones 280 para la hridrlisis del sustrato como indica Arroyo (2008) lo
nm que indica que esta actividad disminuye de igual manera otro
efecto segn el autor es que cuando se utilizan mtodos de
Con base a la Figura 3.1.2. Pico de Concetracin de Protena inmovilizacin, otra razn es que el soporte, en este caso el
se calcul la concentracin de protena eluida al multiplicar gel, que se encuentra en la columna puede reaccionar con
cada punto de absorbancia desde la fraccin nmero 10 por 3

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algn aminocido del sustrato y esto puede disminuir la Germain, P.; Crichton, R. (1999). Characterization of a chemically modified
a-amilase immobilized on porous silica. J. Chem. Technol.
actividad enzimtica.
Biotechnol. 41: 297-315.
Honda, Y.; Kako, M.; Abiko, K.; Sogo, Y. (2008). Industrial Application of
immobilized enzymes. Tanaka, A. et al. eds. Marcel Dekker, pg.
Absorbancia vs. Nmero de 209-234.
Johnson, M. (2012). Concentracin Proteca. MATER METHODS, 2(115).
fracciones http://dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.115
1 y = 0.2727x3 - 5.511x2 + 36.463x - 78.469
Katchalski-Katzir, E. (2012) Immobilized enzymes: learning from past
Absorbancia (u/mL)

R = 1
0.8 successes and failures. Trends Biotechnol. 11:471-478.

0.6 Magee, E.L.; Olson, N.F.; Linslay, R.C. (2011). Microencapsulation of

cheese ripening systems: production of diacetyl and acetoin in
0.4
cheese by encapsulated bacterial cell free extract. J. Diary Sci.
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0 Marn L. (2010). Cromatografa. Recuperado de:
0 2 4 6 8 10 https://es.slideshare.net/luisdracons/cromatografia-5540749 (Mayo, 2017).
Nmero de fracciones
Piffer, P.G.; Spagna, G.; Bustetto, L. (2007). Immobilization of endo-
polygalacturonase on g-alumina for the treatment of fruit juices.
Figura 3.2.2. Pico de actividad enzimtica J. Mol. Catal. 42: 137-149.

4. CONCLUSIONES Roland, J.F. (2005). Requirements unique to the food and beverage industry.
Pitcher, W.H. et al. (eds.) Immobilized enzymes for food
processing, CRC Press, Boca Raton, pp. 55-80.
El valor de absorbancia mximo obtenido para la
concentracin de protena fue 1,41 mg/mL. Snachez, J. (2008).Inmovilizacin de Enzimas. Recuperado de:
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/btg/personales/jmsanche
z/00_INMOVILIZACION_Introduccion.pdf (Mayo, 2017).
En la columna de cromatografa en gel se logr inmovilizar
11,93 mg de enzima. Sobeida, S. (2013).Actividad enzimtica. Recuperado de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYO
El valor de absorbancia mximo obtenido para la actividad ANTECEDENTES_22427.pdf (Junio,2017).
enzimtica fue 0,811 u/mL. Taylor, R.F. (2007). Protein Immobilization: fundamentals and applications,
Marcel Dekker, New York.
Se obtuvo una actividad enzimtica de 1,33793 u/mL*min.
Vuillemard, J.C.; Goulet, J.; Amiot, J.; Vijayalakshmi, M.A. (2008).
Continuous production of small peptides from milk proteins by
REFERENCIAS extracellular proteases of free and immobilized Serratia
marcescens cells. Enzyme Microb. Technol. 10:2-8.
Arroyo, M. (2008). Inmovilizacin de enzimas, fundamentos , mtodos y
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Abbot, B.J. (2006). Preparation of pharmaceutical compounds by

immobilized enzymes and cells. Adv. Appl. Microbiol. 20: 203-
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Consejo Superior de Investigaciones Cientficas de Espaa. (2015).

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http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cr
omatografia/principios_de_cromatografia.pdf (Mayo, 2017).

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Anexos

Clculos

Datos obtenidos en el Espectofotmetro a 280 nm para la concetracin protica

Nmero
Absorbancia
de
(u/mL) Concentracin vs. nmero de
fracciones
1 0,25
fracciones
2 0,135 1.5

Absrobancia (u)
3 0,056
4 0,04 1
5 0,04
0.5
6 0,073
7 0,028 0
8 0,027
0 5 10 15 20 25 30
9 0,045
Nmero de fracciones
10 0,229
11 1,181 Valores de absorbancia
12 1,41 considerados para el
13 0,82
clculo de la
concertacin protica en Concentracin vs. nmero de
14 0,358
el eluido
15 0,208 fracciones
16 0,149
2 y = 0.003x6 - 0.2405x5 + 7.9644x4 - 139.7x3 + 1368x2 -
Absrobancia (u)

17 0,117 7086.2x + 15164

18 0,089 1.5 R = 1
19 0,074 1
20 0,076
0.5
21 0,055
22 0,045 0
23 0,039
0 5 10 15 20
24 0,082
Nmero de fracciones

Clculo de Concentracin de protenas:

16

[ ] = 3 ( )

=10
[ ] = 3(0,229 + 1,181 + 1,41 + 0,82 + 0,358 + 0,208 + 0,149)

[ ] = 13,65

Clculo para la cantidad de enzima inmovilizada:

[ ] = []0 [ ]

[ ] = 25 16,65 = 11,93

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Datos obtenidos en el Espectofotmetro a 400 nm para la actividad enzimtica

Nmero
de Absorbancia Absorbancia vs. Nmero de
fracciones fracciones (400 nm)
1 0,058
2 0,192 1

Absobancia (u)
3 0,258 0.8
4 0,154 0.6
5 0,156 Valores de absorbancia 0.4
6 0,811 considerados para el
7 0,26 clculo de la actividad 0.2
8 0,139 enzimtica 0
9 0,093
0 5 10 15 20
10 0,075
Nmero de fracciones
11 0,064
12 0,057
13 0,052 Absorbancia vs. Nmero de
14 0,047 fracciones
15 0,044
1 y = 0.2727x3 - 5.511x2 + 36.463x - 78.469
16 0,043
R = 1
Absorbancia (u)

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10
Nmero de fracciones

Actividad enzimtica de estudios previos:

0,032 (/ )

0,032 60
= 1,92( )
1

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