Estudio Enzimas - Novozymes

MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA DO AMBIENTE 2015/2016
MATRIAS-PRIMAS SUSTENTVEIS PARA PRODUO DE BIODIESEL:

AVALIAO DE PROCESSOS ENZIMTICOS PARA ESTERIFICAO DE
RESDUOS CIDOS
MARIANA DE SOUSA CRUZ
Dissertao submetida para obteno do grau de
MESTRE EM ENGENHARIA DO AMBIENTE
___________________________________________________________
Orientador acadmico: Joana Maia Moreira Dias
(Professor Auxiliar Convidado do Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais da
Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto)
Coorientador acadmico: Slvia Cardinal Pinho

(Professor Auxiliar Convidado do Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais da
Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto)
Orientador na empresa: Ricardo Mota

(Diretor de Produo, Nature Light, S.A.)
Junho, 2016
AGRADECIMENTOS
Pela total disponibilidade para transmitir conhecimentos, pelo permanente apoio
demonstrado, pelas pertinentes sugestes, e sobretudo, por ter acreditado em mim, quero
expressar o meu sincero agradecimento Professora Joana Dias, minha orientadora acadmica.
Gostaria de agradecer igualmente Professora Slvia Pinho, minha coorientadora

acadmica, pela total disponibilidade, pelos conhecimentos transmitidos e por todo o auxlio no
laboratrio.
Ao Eng. Ricardo Mota, pelo apoio e pela oportunidade de parceria com a empresa
Nature Light S.A.
Ao Emanuel e ao Joab, meus colegas no Laboratrio de Engenharia de Processos,

Ambiente, Biotecnologia e Energia (LEPABE), por toda ajuda laboratorial, e por todas as
respostas s minhas infindveis perguntas. Sara, por todo o companheirismo, apesar de no
ter estado presente desde do incio.
Obrigada aos meus amigos Ana Filipa, Marco e Ricardo por terem facilitado a minha
passagem na FEUP, tornando-a muito mais divertida.
Ju porque mesmo cansada de me ouvir falar vezes sem conta da esterificao

enzimtica, tentou sempre mostrar interesse.
E finalmente, mas no menos importante, minha me, por todo o apoio ao longo
destes anos, pela dedicao e carrinho e por toda a compreenso nos meus dias de mau
humor.
iii
iv
RESUMO
A economia mundial, principalmente o sector dos transportes, est fortemente dependente dos
combustveis fsseis, o que leva a que pases como Portugal passem a encarar os biocombustveis como um
elemento chave para a estratgia nacional da energia.
A presente dissertao pretende contribuir para a produo de biocombustveis sustentveis a partir

de fontes residuais e teve como principais objetivos: i) caracterizar resduos de elevada acidez - olenas de
pastas de neutralizao de leos vegetais (girassol ou misturas), tendo em considerao a obteno de
matria-prima de valor acrescentado para produo de biodiesel; ii) avaliar processos de pr-tratamento; iii)
estudar a esterificao enzimtica (com enzima pr-selecionada) incluindo estudos preliminares de
otimizao, variando a concentrao de enzima e forma de adio do metanol e complementares (alterao
da razo molar cido: leo e do tipo de lcool); e, iv) selecionar o processo que conduz maior reduo de
acidez com o menor custo operacional.
As olenas estudadas apresentaram valores de acidez na ordem dos 60 % m/m e um teor de

humidade na ordem dos 2 % m/m. Os estudos de pr-tratamento mostraram que a centrifugao (3000 rpm,
3 min) era eficiente para a olena proveniente da refinao de leo girassol, devido concentrao do
enxofre mineral na fase retida sendo que para a olena das misturas de sementes o processo mostrou-se
invivel. O processo que permitiu a obteno de melhores resultados foi a lavagem com NaOH (750 ppm)
seguida de duas lavagens com gua destilada, tendo a utilizao de NaHCO3 mostrado no ser vantajosa.
O processo foi otimizado variando a concentrao de enzima (Novozym 40116) entre 2 e 5 % m/m e
a adio fracionada do metanol em 3 at 12 partes, mantendo a temperatura de 35 C, agitao magntica
vigorosa; razo molar cido: lcool 1:1,5 e monitorizando a reao durante 24 h.
A adio fracionada no metanol apenas se mostrou relevante quando se usou 3 % m/m de enzima;
contudo, a reduo de acidez obtida no final do processo foi baixa (45 %). Por outro lado, a concentrao de
enzima apresentou um efeito expressivo, sendo que a condio tima correspondeu utilizao de 4 % m/m
de enzima que permitiu obter uma reduo de acidez de 80 %. Estudos complementares mostraram que nas
condies estudadas a utilizao de etanol no traz vantagens e que possvel obter uma reduo de acidez
de 89,3 % por aumento da razo molar cido:lcool para 1:3 e adio fracionada em duas partes, usando 5 %
m/m de enzima, sendo que o rendimento em produto obtido foi cerca de 90 % m/m. O estudo mostrou
tambm que a enzima permite no s a esterificao dos cidos gordos mas a transesterificao dos tri, di ou
monoglicridos presentes, tendo o produto final obtido nas melhores condies um teor de steres metlicos
de 68,4 % m/m.
PALAVRAS-CHAVE: Biocombustveis; Resduos cidos; Esterificao Enzimtica; Lipases; cidos Gordos Livres.
v
vi
ABSTRACT
The world economy, particularly the transport sector, is heavily dependent on fossil fuels, which
leads countries like Portugal to start looking at biofuels as a key element for their national energy
strategy.
The present work aims to contribute for the production of sustainable biofuels from waste
sources and the main objectives were: i) to characterize high acid waste acid oil from soapstock of
vegetable oil refining (sunflower or mixtures), considering the production of added value materials for
biodiesel synthesis; ii) to evaluate pre-treatments processes; iii) to study enzymatic esterification (with a
pre-selected enzyme) including preliminary studies of optimization, by varying the enzyme
concentration and the methanol addition, as well as complementary studies (variation of methanol: oil
molar ratio and type of alcohol); and, iv) to select the process that leads to greater reduction of acidity
with the lowest operating costs.
The studied waste materials had an acid value of around 60 wt. % and a water content
approximately of 2 wt. %. The pre-treatment studies showed that the centrifugation (3000 rpm, 3 min)
was efficient using the acid oil from sunflower oil refining, because it was possible to concentrate the
mineral sulfur in the retained phase. For the acid oil obtained from seed mixtures was unviable.
The process that allowed better results was the washing of the acid oil with NaOH (750 ppm)
followed by two washings with distilled water. The use of NaHCO3 did not present advantages.
The process was optimized by varying the concentration of enzyme (Novozym 40116) between 2
and 5 wt.% and the stepwise addition of methanol in 3 to 12 portion, maintaining the temperature of 35
C, vigorous magnetic stirring; molar ratio of acid: alcohol of 1: 1.5 and monitoring the reaction during
24 h.
The stepwise methanol addition has only shown to be relevant when 3 wt. % of enzyme was
used; however, the final acidity reduction was low (45 %).
Furthermore, the enzyme concentration showed a significant effect, and the optimum
conditions corresponded to the use of 4 wt. % of enzyme which afforded a 80 % reduction of acidity.
Additional studies showed that under the studied conditions the use of ethanol is not advantageous and
it is possible to obtain a reduction of 89.3 % in acidity by increasing the molar ratio of acid: alcohol to 1:
3 and adding methanol fractionated in two parts, using 5 wt. % of enzyme, with the final product yield
being around 90 wt.%.
The study also showed that the enzyme allows not only the esterification of the fatty acids but
the transesterification of tri-, di- or monoglycerides present, with the final product having a content of
methyl esters of 68.4 wt.%.
KEY-WORDS: Biofuels; Acid waste; Enzymatic esterification; Lipases; Free Fatty Acids.
vii
viii
NDICE
AGRADECIMENTOS............................................................................................................. III
RESUMO ....................................................................................................................... V
ABSTRACT ................................................................................................................... VII
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ XIII
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ XV
LISTA DE SIGLAs ............................................................................................................ xix
1 INTRODUO ...........................................................................................21
1.1 ENQUADRAMENTO E APRESENTAO DO ESTUDO ..............................................21
1.2 OBJETIVOS .......................................................................................23
1.3 ESTRUTURA DO DOCUMENTO ....................................................................23
2 ESTADO DA ARTE ......................................................................................25
2.1 A SITUAO DOS BIOCOMBUSTVEIS EM PORTUGAL .............................................25
2.2 O BIODIESEL ......................................................................................30
2.2.1 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO BIODIESEL ........................................................... 32
2.2.2 REAO DE TRANSESTERIFICAO ...................................................................... 33
2.2.3 REAO DE ESTERIFICAO ............................................................................. 36
2.3 PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL ..........................................................37
2.3.1 AS LIPASES COMO BIOCATALISADORES .................................................................. 38
2.3.2 REVISO BIBLIOGRFICA SOBRE ESTERIFICAO ENZIMTICA .......................................... 39
2.4 A MATRIA-PRIMA: OLENA ......................................................................45
3 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................49
3.1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA ..........................................................50
3.1.1 NDICE DE ACIDEZ E ACIDEZ ............................................................................. 50
3.1.2 TEOR DE HUMIDADE ..................................................................................... 51
3.1.3 TEOR DE ENXOFRE ...................................................................................... 51
ix
3.1.4 TEOR DE FSFORO ...................................................................................... 52
3.2 ATIVIDADE DA ENZIMA ...........................................................................52
3.3 PR-TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA ..........................................................52
3.3.1 CENTRIFUGAO ........................................................................................ 52
3.3.2 NEUTRALIZAO DA MATRIA -PRIMA ................................................................... 53
3.4 ENSAIOS DE ESTERIFICAO ENZIMTICA........................................................55
3.4.1 ENSAIOS PRELIMINARES ................................................................................. 56
3.4.2 ENSAIOS DE PR -TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA ..................................................... 57
3.4.3 OTIMIZAO DAS CONDIES DE ESTERIFICAO ENZIMTICA.......................................... 58
3.4.4 EFEITO DA ALTERAO DA RAZO MOLAR CIDO: METANOL ........................................... 59
3.4.5 EFEITO DA ALTERAO DO LCOOL ..................................................................... 59
3.5 DETERMINAO DO TEOR EM STERES METLICOS ..............................................59
4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................61
4.1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA ..........................................................61
4.1.1 ACIDEZ .................................................................................................. 61
4.1.2 TEOR DE HUMIDADE ..................................................................................... 61
4.1.3 TEOR DE ENXOFRE ...................................................................................... 63
4.1.4 TEOR DE FSFORO ...................................................................................... 65
4.2 ATIVIDADE DA ENZIMA ...........................................................................66
4.3 ENSAIOS PRELIMINARES ..........................................................................67
4.4 PR-TRATAMENTO DA MATRIA -PRIMA ..........................................................70
4.4.1 CENTRIFUGAO ........................................................................................ 70
4.4.2 NEUTRALIZAO DA MATRIA -PRIMA ................................................................... 71
4.5 OTIMIZAO DAS CONDIES REACIONAIS DA ESTERIFICAO .................................79
4.5.1 EFEITO DA ALTERAO DA RAZO MOLAR CIDO: METANOL ........................................... 82
4.5.2 EFEITO DA ALTERAO DO LCOOL ..................................................................... 84
4.6 DETERMINAO DO TEOR EM STERES METLICOS ..............................................85
5 CONCLUSES E TRABALHOS FUTUROS.................................................................89
5.1 CONCLUSES .....................................................................................89
x
5.2 TRABALHOS FUTUROS ...........................................................................90
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................91
ANEXO A - ENSAIO DE DETERMINAO DA ATIVIDADE DA ENZIMA ............................................99
ANEXO B - ENSAIO DE NEUTRALIZAO COM NAOH ....................................................... 101
ANEXO C RESULTADOS OBTIDOS NA OTIMIZAO DAS CONDIES REACIONAIS DE ESTERIFICAO ...... 103
xi
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Contribuio (percentagem em base volmica) dos biocombustveis introduzidos
no mercado em 2014. ................................................................................................................... 29
Figura 2.2 - Total de leos (vegetais e residuais) processados em 2014 para biocombustveis. . 30
Figura 2.3 - Reao de transesterificao. ................................................................................... 33
Figura 2.4 - Reao dos cidos Gordos Livres com o catalisador bsico KOH .............................. 35
Figura 2.5 - Reao de saponificao. ........................................................................................... 36
Figura 2.6 - Reao de glicerlise. ................................................................................................. 36
Figura 2.7 - Reao de esterificao. ............................................................................................ 37
Figura 2.8 - Processo de refinao de leos vegetais. .................................................................. 46
Figura 3.1 - Matria-prima (olena de girassol). ............................................................................ 49
Figura 3.2 Enzima pr-selecionada (Novozym 40116). .............................................................. 49
Figura 3.3 - Bomba calorimtrica usada na combusto das amostras, no processo de

determinao do teor de enxofre. ................................................................................................ 51
Figura 3.4 Centrfuga usada nos ensaios de centrifugao da matria-prima. ......................... 53
Figura 3.5 Lavagem com soluo de NaOH: I funil de decantao aps adio da soluo; II
funil de decantao no final da lavagem ...................................................................................... 54
Figura 3.6 - Incubadora utilizada durante os ensaios com placa de agitao incorporada. ......... 55
Figura 3.7 Exemplo de um ensaio de esterificao com seis amostras. .................................... 55
Figura 3.8 Cromatgrafo Dani Master GC utilizado na determinao dos steres metlicos. ... 60
Figura 4.1 - Fases formadas depois da centrifugao: I-a) Fase retida no tubo da olena de
sementes II; I -b) Fase oleosa da olena de sementes II; II-a) Fase retida no tubo da olena de
girassol; II-b) Fase oleosada olena de girassol. ............................................................................ 62
Figura 4.2 - Precipitado de sulfato de brio. ................................................................................. 64
Figura 4.3 - Complexo azul com uma soluo de molibdato de sdio: I - Olena de sementes II; II-
Olena de girassol. ......................................................................................................................... 65
xiii
Figura 4.4 - Evoluo da acidez (%m/m, expressa em termos de cido oleico) nas diferentes
concentraes de NaOH. ............................................................................................................... 72
Figura 4.5 - Evoluo do pH da gua destilada ao fim de 10 lavagens. ........................................ 73
Figura 4.6 - Evoluo do pH da gua destilada, aps lavagem com soluo de NaOH a 250 ppm.
....................................................................................................................................................... 74
Figura 4.7 - Evoluo do pH da gua destilada, aps lavagem com soluo de NaOH a 500 ppm.
....................................................................................................................................................... 75
Figura 4.8 - Evoluo da acidez com adio de metanol em fraes quando usadas diferentes
concentraes de enzima: A - 2 % (m/m); B 3% (m/m); C 4% (m/m); D 5% (m/m)............. 80
Figura 4.9 - Reduo da acidez para as diferentes quantidades de enzima, quando adicionado o
metanol em diferentes fraes: A 1, B 3, C 6, D 12 . ........................................................ 82
Figura 4.10 - Evoluo de acidez quando usado razo molar cido: metanol 1:3 adicionado em 2
fraes. .......................................................................................................................................... 83
Figura 4.11 - Produto final da esterificao: I - Aps centrifugao; II - Funil de decantao com
o produto final centrifugado; II - Produto final aps se rejeitar a gua. ...................................... 84
Figura 4.12 - Evoluo de acidez quando usado razo molar cido: etanol 1:3 adicionado em 2
fraes. .......................................................................................................................................... 85
Figura 4.13 - Cromatograma resultante da anlise....................................................................... 86
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Tipos de biocombustveis segundo Decreto- Lei n.117/2010 .................................. 28
Tabela 2.2 Alguns parmetros de qualidade do biodiesel e limites segundo a norma

EN14214:2014 ............................................................................................................................... 32
Tabela 2.3 - Vantagens e desvantagens dos diferentes catalisadores usados na produo de

biodiesel ........................................................................................................................................ 34
Tabela 2.4 Reviso bibliogrfica de estudos de esterificao enzimtica de matrias-primas de

elevada acidez ............................................................................................................................... 43
Tabela 2.5 - Reviso bibliogrfica de estudos de esterificao enzimtica com adio de metanol
em etapas, incluindo condies reacionais, acidez inicial e converso final ................................ 44
Tabela 2.6 Propriedades de uma olena obtida de pasta de neutralizao de leo de soja ..... 45
Tabela 2.7 - Valores de acidez para diferentes olenas, obtidas de pastas de refinao de
diferentes leos vegetais .............................................................................................................. 46
Tabela 3.1 - Condies experimentais para a produo enzimtica de biodiesel ........................ 56
Tabela 3.2 - Condies experimentais dos ensaios preliminares ................................................. 57
Tabela 3.3 Condies experimentais utlizadas na avaliao do pr-tratamento da matria-

prima ............................................................................................................................................. 57
Tabela 3.4 - Condies experimentais utilizadas na otimizao da reao de esterificao

enzimtica ..................................................................................................................................... 58
Tabela 3.5 - Condies experimentais usadas para a avaliao do efeito da alterao da razo
molar cidos gordos livres: metanol ............................................................................................. 59
Tabela 4.1 - Valores de acidez das diferentes matrias-primas .................................................. 61
Tabela 4.2 Valores de teor de humidade nas diferentes matrias-primas................................ 62
Tabela 4.3 Valores de teor da fase oleosa obtida aps centrifugao nas diferentes matrias-
primas ............................................................................................................................................ 63
Tabela 4.4 Valores de teor de enxofre para a olena de sementes II......................................... 64
Tabela 4.5 - Valores de teor de enxofre para a olena de girassol................................................ 64

xv
Tabela 4.6 - Valores de teor de fsforo para a olena de sementes II e girassol ......................... 66
Tabela 4.7 - Resultados da acidez no ensaio da atividade enzimtica usando leo comercial de
soja ................................................................................................................................................ 66
Tabela 4.8 - Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio 1 (Olena de Sementes I; m=50
g; razo molar cido: metanol 1:1,5; 0,1 % m/m enzima) ............................................................ 67
Tabela 4.9 - Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio 2 (Olena de Sementes I;
m=150 g; razo molar cido: metanol 1:1,5; 0,1 % m/m enzima) ................................................ 67
Tabela 4.10 - Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio 3 (Olena de Sementes I;
m=15 g; razo molar cido: metanol 1:1,5; 1 % m/m enzima) ..................................................... 68
Tabela 4.11 Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio 4 (Olena de Girassol; m=20
g; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima) ............................................................... 69
Tabela 4.12 - Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio5 (Olena de Girassol; m=20 g;
razo molar cido: metanol 1:2; 5 % m/m enzima) ...................................................................... 69
Tabela 4.13 - Valores de reduo da acidez obtidos para os ensaios 1 a 5 .................................. 70
Tabela 4.14 - Evoluo da acidez para olena de girassol, aps centrifugao (Olena de Girassol;
razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima) ................................................................... 70
Tabela 4.15 - Evoluo da acidez para olena de sementes II, aps centrifugao (Olena de
Sementes II; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima) .............................................. 71
Tabela 4.16 - Evoluo da acidez, aquando da esterificao da matria-prima pr-tratada com

soluo de NaOH 500ppm (Olena de Sementes II; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m
enzima) .......................................................................................................................................... 75
Tabela 4.17 Valores de pH e condutividade obtidos nas lavagens com soluo de NaOH ....... 76
Tabela 4.18 Evoluo da acidez durante a esterificao com 1, 2 e 3 lavagens de NaOH 750
ppm (Olena de Sementes II; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima) .................... 77
Tabela 4.19 Valores de pH e condutividade obtidos na lavagem com soluo de NaHCO3 a 750
ppm ............................................................................................................................................... 78
Tabela 4.20 gua retida durante a lavagem da olena para a soluo de NaOH e HNaCO3 ...... 78
xvi
Tabela 4.21 Evoluo da acidez, aps lavagem com NaHCO3 (Olena de Sementes II; razo
molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima) ............................................................................. 79
Tabela 4.28 - steres metlicos presentes na amostra e massas molares de cada ster ............. 86
Tabela B. 1 - Diferentes quantidades de NaOH e gua destilada para os 6 reatores ...101
Tabela D. 1 - Evoluo da acidez para as diferentes formas de adio de metanol (razo molar
cido: metanol 1:1,5; 2 % (m/m) de enzima)....103
cido: metanol 1:1,5; 3 % (m/m) de enzima) ................................................................. ..103
cido: metanol 1:1,5; 4 % (m/m) de enzima) ........................................................................... 104
cido: metanol 1:1,5; 5 % (m/m) de enzima) .............................................................................. 104
Tabela D. 5 - Evoluo da acidez para a olena de sementes II (razo molar cido: metanol 1:3; 5
% (m/m) de enzima) .................................................................................................................... 104
Tabela D. 6 - Evoluo da acidez para a olena de semente II (razo molar cido: etanol 1:3; 5 %
(m/m) de enzima) ........................................................................................................................ 105
xvii
xviii
LISTA DE SIGLAS
AGL cidos Gordos Livres;
Bio-ETBE - bioter etil-ter-butlico;
Bio-MTBE - bioter metil-ter-butlico;
DRP Diferena Relativa Percentual;
ECS Entidade Coordenadora do Cumprimento dos Critrios de Sustentabilidade;
FAME Fatty Acid Methyl Esters/ steres metlicos de cidos gordos;
GC Gas Chomatography/ Cromatografia Gasosa;
GEE Gases de efeito de estufa;
IA ndice de acidez;
TdB Ttulos de Biocombustveis;
TE Teor de steres;
PNAER Plano Nacional de Ao para as Energias 2020;
PPD Pequenos Produtores Dedicados;
PRG Produtores de Regime Geral;
UE Unio Europeia.
xix
xx
AVALIAO DE PROCESSOS ENZIMTICOS PARA ESTERIFICA MATRIAS-PRIMAS SUSTENTVEIS PARA PRODUO DE BIODIESEL:
AVALIAO DE PROCESSOS ENZIMTICOS PARA ESTERIFICAO DE RESDUOS CIDOS
1 INTRODUO
1.1 ENQUADRAMENTO E APRESENTAO DO ESTUDO
Tendo em considerao as necessidades energticas atuais, a sociedade cada vez mais

dependente de combustveis fsseis. Uma vez que estes resultam de milhes de anos de
decomposio de organismos mortos, o seu uso excessivo origina o esgotamento das suas
reservas mundiais, com consequncias econmicas, ambientais e sociais (Doku and Falco,
2012).
Em particular, o impacte ambiental da queima de combustveis fsseis significativo

devido s emisses de dixido de carbono (CO2), um crtico Gs de Efeito de Estufa (GEE).
Devido escassez dos recursos fsseis ser cada vez mais intensificada, surge a
necessidade de adaptao, principalmente pelos pases que apresentam elevada dependncia
energtica do exterior, como o caso de Portugal. Assim, surge o interesse acentuado em
fontes de energia alternativas, onde os biocombustveis apresentam um papel fundamental no
setor dos transportes (Flodn and Williamsson, 2016).
De acordo com a Diretiva 2015/1513 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 9 de

setembro de 2015, que altera a Diretiva 98/70/CE relativa qualidade da gasolina e do
combustvel para motores diesel e a Diretiva 2009/28/CE relativa promoo da utilizao de
energia proveniente de fontes renovveis, cada Estado-Membro (EM) dever assegurar que,
em 2020, a quota de energia proveniente de fontes renovveis em todos os modos de
transporte represente, pelo menos, 10 % do consumo final. A Unio Europeia (UE) prev que a
quase totalidade da produo de biocombustveis em 2020 provir de culturas em terrenos que
poderiam ser utilizados para satisfazer os mercados de alimentos para consumo humano e
animal, e por isso necessrio incentivar a investigao sobre novos biocombustveis
avanados que no concorram com as culturas alimentares.
A Diretiva 2015/1513 refere que o aproveitamento de resduos como matrias-primas

sustentveis surge como uma opo vivel para a produo de biocombustveis. Uma forma de
promover o seu uso a dupla contagem, o que significa que os biocombustveis produzidos a
partir destes recursos podero ser contabilizados a dobrar para as metas estipuladas.
INTRODUO 21
Um caso a realar, segundo a Diretiva 2015/1513, que as gorduras animais da

categoria 3 passaro a no ser aceites para dupla contagem e todos os resduos presentes no
Anexo III da Portaria n8/2012 de 4 de janeiro passaro a estar includos na lista de matrias
residuais para dupla contagem. No caso de resduos como olenas e cidos Gordos Livres (AGL)
sero sujeitos a emisso de parecer pela Entidade Coordenadora do Cumprimento dos Critrios
de Sustentabilidade (ECS), o que torna assim os resduos cidos uma matria-prima
potencialmente sustentvel para produo de biodiesel (ENMC, 2016).
O biodiesel, sendo convencionalmente uma mistura de steres metlicos de cidos

gordos, pode ser obtido quer pela transesterificao dos triglicridos presentes em leos
vegetais e gorduras animais ou pela esterificao de cidos gordos livres, sendo que a produo
de biodiesel de leos e gorduras cidas resulta habitualmente de um pr-tratamento de
esterificao dos cidos gordos seguido de transesterificao dos triglicridos, diglicridos e
monoglicridos presentes.
A transesterificao homognea alcalina amplamente utilizada na indstria (hidrxido

de sdio e o respetivo metxido so os catalisadores mais utilizados), comparativamente com
catalisadores heterogneos cidos e bsicos ou enzimticos, por questes de simplicidade e
custo. No entanto, quando a matria-prima apresenta elevada acidez este processo invivel
pois leva ao consumo do catalisador e inviabilidade do processo (Rosset et al., 2013).
Os processos de catlise homognea cida em pr-tratamento para esterificao so

comumente usados, no entanto apresentam alguns inconvenientes como: a elevada
corrosividade (devido ao H2SO4 normalmente utilizado); condies operacionais mais onerosas
(quantidade de lcool e temperatura mais elevada); e, elevada quantidade de efluentes
contaminados resultantes do processo (Lotero et al., 2005; Rosset et al., 2013). Uma alternativa
a estes processos a utilizao de catalisadores heterogneos, onde os biolgicos
(biocatalisadores) como as enzimas se apresentam como promissores tendo em conta as
moderadas condies reacionais que se podem implementar e a sua possibilidade de
recuperao. Adicionalmente, reconhece-se a sua capacidade de catalisar a esterificao dos
AGL e a transesterificao de triglicridos (Christopher et al., 2014). Os biocatalisadores
apresentam tambm caractersticas importantes como a versatilidade, a seletividade para o
substrato, o uso limitado de reagentes perigosos, a reduo dos subprodutos, e a catlise em
temperaturas e presses moderadas (Voulgaris et al., 2015).
INTRODUO 22
Assim, numa perspetiva de valorizao de resduos cidos, surge o estudo da viabilidade

da utilizao de processos enzimticos para esterificao de matrias-primas cidas, onde se
insere a presente dissertao.
Nesse mbito, foi realizado um estudo em parceria com a empresa Nature Light S.A. e a
Novozymes, para estudar a viabilidade da esterificao enzimtica de matrias-primas cidas -
olenas de girassol e sementes que a empresa comercializa, utilizando para tal uma lipase da
empresa Novozymes (Novozym 40116) na reao.
Tal processo poder permitir a produo de um produto com maior valor acrescentado,
face ao atual, com implicaes econmicas de relevncia para a empresa, contribuindo
adicionalmente para uma correta gesto de resduos.
1.2 OBJETIVOS
A presente dissertao teve como principais objetivos:
Caracterizar resduos de elevada acidez tendo em considerao a obteno de matria-

prima de valor acrescentado para produo de biodiesel;
Estudar a esterificao enzimtica (com enzima pr-selecionada) tendo como passos
relevantes a implementao do processo experimental, a seleo de condies
reacionais chave, estudos de otimizao, e, monitorizao da eficincia do processo;
Definiram-se como objetivos especficos os seguintes:
Caracterizar a matria-prima tendo em conta os parmetros chave que
condicionam a reao de esterificao;
Realizar um conjunto de estudos preliminares tendo por base as
condies da literatura relativamente esterificao enzimtica;
Estudar alternativas de pr-tratamento para a matria-prima por forma a
garantir a viabilidade do processo enzimtico;
Selecionar variveis chave da reao e definir condies timas para
realizao do processo de esterificao cida.
1.3 ESTRUTURA DO DOCUMENTO
A dissertao constituda por 5 captulos.
INTRODUO 23
No captulo 1 apresenta-se uma breve introduo do tema, os objetivos principais e a

estrutura da dissertao.
O captulo 2 inclui uma reviso bibliogrfica sobre os diversos assuntos relevantes para
esta dissertao. Os temas abordados so: a situao dos biocombustveis em Portugal, as
vantagens e desvantagens do biodiesel, as rotas reacionais para a sua produo, a produo
enzimtica de biodiesel, os biocatalisadores, estudos recentes de esterificao enzimtica e
uma breve caracterizao das olenas, que so a matria-prima utilizada.
No captulo 3 apresentam-se os materiais e mtodos utilizados ao longo do trabalho

experimental.
No captulo 4 discriminam-se e discutem-se os resultados obtidos na caracterizao da

matria-prima; nos ensaios preliminares de acordo com as condies da literatura; nos estudos
de pr-tratamento da matria-prima; e por fim, na seleo das condies timas para a reao
de esterificao.
No captulo 5 so enunciadas as principais concluses, assim como, algumas

sugestes/recomendaes para estudos futuros.
INTRODUO 24
2 ESTADO DA ARTE
2.1 A SITUAO DOS BIOCOMBUSTVEIS EM PORTUGAL
O uso excessivo de combustveis fsseis, como o petrleo, levar mais tarde ou mais
cedo ao seu esgotamento, como resultado da diminuio acentuada das reservas existentes. A
crescente preocupao ambiental assim como a necessidade de garantir solues alternativas
fazem da produo de energias renovveis uma resposta inevitvel para esta problemtica
(Laitman, 2012).
A queima de derivados de petrleo origina altas emisses de dixido de carbono (CO2),

monxido de carbono (CO), xidos de azoto (NOX) e dixido de enxofre (SO2) com nefastos
efeitos sobre o ambiente, em particular no efeito de estufa e na produo de chuvas cidas
(Vieira, 2009).
Atualmente, a economia mundial, bem como o sector dos transportes, est fortemente
dependente dos combustveis fsseis, que apresentam constantes alteraes no seu valor. Isto
faz com que os pases com elevada dependncia externa de combustveis fsseis, como
Portugal, passem a encarar os biocombustveis como elemento chave para a estratgia nacional
da energia (Fernandes et al., 2015).
Entre 2005 e 2010 a produo nacional de biocombustveis refletiu a transposio da

Diretiva Europeia 2003/30/CE, de 8 de maio, relativa promoo da utilizao de
biocombustveis ou de outros combustveis renovveis nos transportes, que com incentivos de
natureza fiscal, nomeadamente atravs de isenes parciais ou totais de imposto, incentivavam
os Estados Membros (EM) atingir em 2010 uma quota de 5,75 % de substituio dos
combustveis fsseis no setor dos transportes (Grio et al., 2013). Segundo o artigo 11 do
Decreto-Lei n. 117/2010 de 25 de outubro, atualmente as petrolferas esto obrigadas a
incorporar 7,5 % de biocombustveis no mercado para consumo final, em teor energtico,
relativamente s quantidades de combustveis por si colocadas no consumo.
A UE definiu, atravs da Diretiva 2009/28/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de

23 de abril, relativa promoo de utilizao de energia proveniente de fontes renovveis, o
ESTADO DA ARTE 25
objetivo de alcanar, at 2020, uma quota de 20 % de energia proveniente de fontes renovveis

no consumo final bruto de energia e uma quota de 10 % no sector dos transportes.
De acordo com o quadro de ao da Unio Europeia relativo ao clima, em outubro de

2014, foi definida a meta vinculativa de pelo menos 27 % de energias renovveis no consumo
total de energia na UE em 2030. Com o contributo de todos os EM esta meta dever ser
atingida (Fernandes et al., 2015).
Em Portugal, o Decreto-Lei n. 141/2010, de 31 de dezembro, (alterado pelo Decreto-Lei

n. 39/2013, de 18 de maro) estabelece a meta de 31 % para a utilizao de energia renovvel
no consumo final bruto de energia e 10 % para o consumo energtico nos transportes, em
2020. A mistura de biocombustveis um dos mtodos que se dispem para atingir este
objetivo e o qual se prev que seja a principal contribuio.
Em alinhamento com o Plano Nacional de Ao para as Energias 2020 (PNAER) o

Compromisso para o Crescimento Verde, apresentado em abril de 2015, estabelece o objetivo
de reforar o peso das energias renovveis, determinando a meta de 31 % de renovveis no
consumo final bruto de energia em 2020 e 40 % em 2030.
De acordo com a Diretiva 2015/1513 do parlamento europeu e do conselho, de 9 de

Setembro de 2015, que altera a Diretiva 98/70/CE relativa qualidade da gasolina e do
combustvel para motores diesel e a Diretiva 2009/28/CE relativa promoo da utilizao de
energia proveniente de fontes renovveis, de forma a atingirem essa meta, os EM dispem de
mtodos os quais a introduo de biocombustveis sustentveis e o aumento da eficincia
energtica e a poupana de energia.
Os biocombustveis sero sustentveis se fornecerem uma reduo de GEE de 50 % em

comparao aos combustveis fsseis, e tero de satisfazer os critrios de sustentabilidade para
serem contabilizados para o cumprimento dos objetivos da referida Diretiva e serem elegveis
para incluso em regimes de apoio pblico (ENMC, 2016).
A promoo da produo e da utilizao de biocombustveis e de outros combustveis

renovveis no espao comunitrio uma importante medida para, no mbito do
desenvolvimento sustentvel da Comunidade Europeia, reduzir a dependncia das importaes
de energia e influenciar o mercado dos combustveis no sector dos transportes.
ESTADO DA ARTE 26
De acordo com a legislao em vigor, cabe ECS, emitir os Ttulos de Biocombustveis

(TdB) que comprovam a incorporao dos biocombustveis no mercado rodovirio nacional e
que, decorrente da sua produo sustentvel, asseguram a Portugal o cumprimento da meta
obrigatria de 10 % de biocombustveis em 2020 (LNEG, 2012). De acordo com o Decreto-Lei
n.117/2010, artigo 13., cada TdB representa a incorporao de 1 t equivalente de petrleo
(Tep) de biocombustveis destinados a ser incorporados no consumo nacional.
Comparativamente com os combustveis fsseis, os biocombustveis so capazes de

fornecer quantidades de energia igualmente elevadas, aquando da sua queima, mas tm a
vantagem de as emisses de CO2 para a atmosfera serem significativamente menores (Santos,
2008).
Com base no Decreto-Lei n. 117/2010 de 25 de outubro (alterado pelo Decreto-Lei n

6/2012 de 17 de janeiro), artigo 2, os biocombustveis so combustveis lquidos ou gasosos
para transportes, produzidos a partir de biomassa.
Na Tabela 2.1 esto apresentados as diferentes formas como podem ser

disponibilizados.
Em Portugal foram at ao momento introduzidos no mercado trs tipos de

biocombustveis: biodiesel, tambm designado por steres metlicos de cidos gordos Fatty
acid Methyl esters (FAME), produzido localmente por Produtores de Regime Geral (PRG) e por
Pequenos Produtores Dedicados (PPD), leo vegetal hidrogenado e bio-ETBE, proveniente de
importao (LNEG, 2012).
De acordo com Portaria n.8/2012 de 4 de janeiro, so considerados PRG os produtores

de biocombustveis com capacidade instalada superior a 20 000 t/ano. Com base no Decreto-
Lei n.117/2010 de 25 de outubro, so considerados PPD quando apresentam um
aproveitamento de resduos ou detritos igual ou superior a 60 %, em massa, da matria-prima
consumida na instalao para a produo de biocombustveis.
ESTADO DA ARTE 27
Tabela 2.1 - Tipos de biocombustveis segundo Decreto- Lei n.117/2010

Etanol produzido a partir de biomassa e ou da frao biodegradvel de
Bioetanol
resduos para utilizao como biocombustvel.
ster metlico produzido a partir de leos vegetais ou animais, com
Biodiesel qualidade de combustvel para motores diesel, para utilizao como
biocombustvel.
Gs combustvel produzido a partir de biomassa e ou da frao
Biogs biodegradvel de resduos, que pode ser purificado at qualidade do
gs natural, para utilizao como biocombustvel, ou gs de madeira.
Metanol produzido a partir de biomassa para utilizao como
Biometanol
biocombustvel.
Butanol produzido a partir de biomassa para utilizao como
Biobutanol
biocombustvel.
Bioter ter dimetlico produzido a partir de biomassa para utilizao como
dimetlico biocombustvel.
Bio-ETBE
ETBE produzido a partir do bioetanol, sendo a percentagem
(bioter etil-ter-
volumtrica de bio-ETBE considerada como biocombustvel de 47 %.
butlico)
Bio-MTBE
Combustvel produzido a partir do biometanol, sendo a percentagem
(bioter metil-
volumtrica de bio-MTBE considerada como biocombustvel de 36 %.
ter-butlico)
Biocombustveis Hidrocarbonetos sintticos ou misturas de hidrocarbonetos sintticos
sintticos produzidos a partir de biomassa.
leo vegetal
leo vegetal tratado termoquimicamente com hidrognio.
hidrogenado
Hidrognio produzido a partir de biomassa e ou da frao
Biohidrognio
biodegradvel de resduos para utilizao como biocombustvel.
leo vegetal
leo produzido por presso, extrao ou mtodos comparveis, a
puro produzido
partir de plantas oleaginosas, em bruto ou refinado, mas
a partir de
quimicamente inalterado, quando a sua utilizao for compatvel com
plantas
o tipo de motores e os respetivos requisitos relativos a emisses.
oleaginosas
ESTADO DA ARTE 28
A Figura 2.1 apresenta a caracterizao global do sector por tipo de biocombustvel, em

volume, produzido/importado em Portugal para o ano de 2014 (LNEG, 2015).
Figura 2.1 Contribuio (percentagem em base volmica) dos biocombustveis

introduzidos no mercado em 2014 (LNEG, 2015).
A falta de competitividade da agricultura em Portugal no permite o aproveitamento da

gerao atual de biocombustveis. A produo nacional de matrias-primas para
biocombustveis restringe-se atualmente s matrias residuais, sendo que 98 % do total de
biocombustveis produzidos recorre importao de soja, colza, girassol e palma, quer sob a
forma de gros quer sob a forma de leo (Grio et al., 2013).
A Figura 2.2 apresenta a distribuio das quantidades relativas utilizadas por tipo de
leo, processados em 2014 para biocombustveis. Verifica-se que cerca de 96 % produzido a
partir de leos vegetais virgens, havendo predomnio do leo de colza com cerca de 58 %
(LNEG, 2015). Segundo dados do Laboratrio Nacional Energia e Geologia (LNEG), em 2014
houve uma significativa diferena em relao a anos anteriores no tipo de leos vegetais
utilizados como matria-prima. A colza veio substituir o leo de soja que at 2013 era o mais
utilizado.
ESTADO DA ARTE 29
Figura 2.2 - Total de leos (vegetais e residuais) processados em 2014

para biocombustveis (LNEG, 2015).
Segundo dados do LNEG, em Portugal, durante o ano de 2014, foram utilizadas para
produo de biodiesel (FAME) 328 076 toneladas de leos vegetais virgens, os quais: leo de
soja, leo de colza, leo de girassol, olena de palma e cerca de 718 toneladas de matrias
residuais como a gordura animal (81,6 %) e leos alimentares usados (18,4 %) (LNEG, 2015).
Em termos percentuais verificou-se que, para a produo de FAME no ano de 2015, os

produtores nacionais utilizaram aproximadamente 50 % de leo de colza e foram usados, em
termos globais, 17 % de matria residual (ENMC, 2016).
2.2 O BIODIESEL
O biodiesel um biocombustvel alternativo ao gasleo. Em Portugal produzido

industrialmente em grande escala desde 2006, sendo visto quer a nvel nacional quer a nvel da
UE como uma alternativa sustentvel, assim como uma ferramenta de reduo de emisses de
CO2 pelos motivos anteriormente explicitados (Knothe et al., 2010).
Existe uma grande variedade de matrias-primas que podem dar origem ao biodiesel,
tais como leos vegetais (de soja, colza, girassol, coco, palma, crtamo, entre outros), gorduras
animais, leos alimentares usados e biomassa de algas e cianobactrias (Knothe et al., 2010).
Este pode ser usado em motores de ignio por compresso (diesel) sem necessidade
de modificaes expressivas e com vantagens sobre o diesel fssil, pois apresenta reduzida
ESTADO DA ARTE 30
toxicidade e uma melhor qualidade das emisses durante o processo de combusto. Embora o
biodiesel fornea uma quantidade de energia cerca de 10 % menor que o diesel fssil, estudos
mostram que o seu desempenho no motor praticamente o mesmo no que diz respeito
potncia (Lbo et al., 2009; CEPSA, 2010).
O nome biodiesel muitas vezes confundido com a mistura de diesel com biodiesel,
pelo que a designao correta para a mistura vendida deve ser precedida pela letra B do ingls
Blend (Santos, 2008); por exemplo, quando se tem uma mistura de 5 % de biodiesel e 95 % de
diesel, esta recebe o nome de B5.
No mercado de combustveis, a utilizao de biodiesel pode ser feita em quatro nveis

de concentrao (CEPSA, 2010):
Puro (B100)
Misturas (B20 - B30)
Aditivo (B5)
Aditivo de lubricidade (B2)
Segundo a norma de qualidade diesel EN590:2014, atualmente, em Portugal permitida

a incorporao de 7% (B7) sem necessidade de adaptao dos veculos e motores.
A qualidade do biodiesel um fator fundamental, que condiciona o modo de

funcionamento e o tempo de vida de um motor; assim, para uma utilizao segura de biodiesel,
este deve seguir um conjunto de requisitos de qualidade, tendo em conta parmetros como o
ndice de acidez (IA), a pureza/teor em steres metlicos, a viscosidade e a humidade, entre
outros.
Tal como o gasleo, todo o biodiesel comercializado tem de cumprir os parmetros

estabelecidos na norma europeia EN14214:2014. Alguns dos limites definidos na norma
encontram-se descritos na Tabela 2.2.
ESTADO DA ARTE 31
Tabela 2.2 Alguns parmetros de qualidade do biodiesel e limites segundo a norma EN14214:2014
Parmetro Limite mnimo Limite mximo
Viscosidade cinemtica a 40 C (mm-2 s-1) 3,50 5,00
Massa volmica a 15 C (kg m-3) 860 900
ndice de acidez (mg KOH g-1) - 0,5
Teor em gua (mg kg-1) - 500
Teor em esteres metlicos (% m/m) 96,5 -
2.2.1 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO BIODIESEL
O biodiesel apresenta elevada biodegradabilidade, livre de enxofre e apresenta baixa

toxicidade. Tem um valor acrescentado significativo em relao ao gasleo devido sua maior
capacidade de lubrificao, maior ponto de inflamao e menor teor de aromticos. Em virtude
das caractersticas referidas, pode prolongar a vida til do motor e reduzir os custos de
manuteno (Knothe et al., 2010).
Este produto apresenta comparativamente com o combustvel fssil, um maior

consumo e ligeiramente menor poder calorfico, bem como uma maior instabilidade oxidativa
(Luque et al., 2008). No obstante, quando se compara a sua combusto com a de combustveis
fsseis, as emisses de material particulado e hidrocarbonetos so inferiores.
Por outro lado, a utilizao do biodiesel tambm tem desvantagens, nomeadamente: o

aumento das emisses de NOx, referido por vrios estudos; em perodos frios como o Inverno,
pode congelar (temperatura limite de filtrabilidade mais elevada); quando armazenado por
perodos longos sofre degradao (menor estabilidade oxidao); tem pouca compatibilidade
com alguns materiais e pode causar entupimento dos filtros durante o uso inicial (Wardle,
2003).
Particularizando, veculos mais antigos (fabricados antes de meados dos anos 1990) so
mais suscetveis a conter muitos dos tipos de materiais que seriam afetados, o caso de
algumas mangueiras, juntas, O-rings, colas e plsticos quando sujeitos a contacto prolongado.
Isto, porque o biodiesel funciona como um solvente destes materiais, provocando a sua
degradao e afetando assim as suas funcionalidades (Mofijur et al., 2013).
ESTADO DA ARTE 32
No que diz respeito s emisses de NOX, esto fundamentalmente descritas como

associadas ao maior teor de oxignio do combustvel e caractersticas fsico-qumicas do
produto (Knothe, 2005; Nie et al., 2015).
2.2.2 REAO DE TRANSESTERIFICAO
O biodiesel produzido atravs de um processo qumico chamado transesterificao ou

alcolise, na qual os triglicridos presentes no leo reagem com um lcool na presena de um
catalisador e do origem a uma mistura de steres de cidos gordos e glicerol (Vicente et al.,
2007), de acordo com a Figura 2.3.
Figura 2.3 - Reao de transesterificao (Dias, 2010).
Este processo pode ser conduzido atravs de catalisadores cidos, bases fortes ou
enzimas. A catlise homognea bsica , indiscutivelmente, a mais utilizada, uma vez que exige
menor tempo de reao, menor razo molar lcool: leo e geralmente menos custos (Dias et
al., 2008).
As transesterificaes catalisadas por cidos so, geralmente, muito mais lentas do que
as reaes catalisadas por bases e exigem temperaturas e presses mais elevadas, bem como
maiores quantidades de lcool (Mittelbach and Remschmidt, 2004).
Na Tabela 2.3 encontram-se agrupadas as vantagens e desvantagens para diferentes

tipos de catalisadores usados na produo de biodiesel.
ESTADO DA ARTE 33
Tabela 2.3 - Vantagens e desvantagens dos diferentes catalisadores usados na produo de biodiesel
(Guldhe et al., 2015)
Tipo de
Vantagens Desvantagens
catalisador
Alto rendimento; Saponificao dos AGL1;
Baixo custo; Gerao de efluentes lquidos;
Homogneo
Velocidade de reao rpida. Difcil recuperao do catalisador;
alcalino
Necessria purificao dos
produtos.
Rendimento mdio; Gerao de efluentes lquidos;
Converso de AGL1 a biodiesel; Difcil recuperao do catalisador

Homogneo difcil;
Baixo custo;
cido Necessria purificao dos
Velocidade de reao mdia. produtos;
Corroso de equipamentos.
Alto rendimento;
Custo mdio;
Exigncia de alta energia;
Heterogneo Capacidade de reutilizao;
Lixiviao do catalisador;
alcalino Taxa de reao rpida;
Saponificao dos AGL1.
Ausncia de guas residuais;
Pode ser utilizado em contnuo.
Alto rendimento;
Capacidade de reutilizao;
Custo mdio; Exigncia de alta energia;
Heterogneo
Velocidade de reao rpida; Lixiviao do catalisador;
cido
Converso de AGL1 a biodiesel; Corroso dos equipamentos.
Podem ser utilizados em contnuo.
Alto rendimento;
Converso de AGL1 para biodiesel;
Baixo consumo de energia;
Enzimas Inibio por lcoois;
Pureza elevada do produto;
Custo elevado
Capacidade de reutilizao;
Pode ser utilizada em contnuo.
1AGL (cidos Gordos Livres)
ESTADO DA ARTE 34
Esta uma reao reversvel, que evolui ao longo de 3 etapas, onde os triglicridos so
convertidos a diglicridos, monoglicridos e finalmente glicerol e onde em cada uma das
etapas/reaes se produz uma mol de ster.
leos e gorduras com elevados teores em AGL so muitas vezes usados na produo de
biodiesel, como por exemplo, leos alimentares usados que contm tipicamente 2 7 % AGL, e
gorduras animais que contm de 5 % a 30 % de AGL. Algumas matrias-primas de qualidade
muito baixa, como obtidas de caixas de gordura, podem-se aproximar dos 100 % de AGL
(Gerpen, 2005).
No entanto, quando se realiza a transesterificao homognea bsica, ao adicionar o

catalisador alcalino a estas matrias-primas, os AGL reagem com o catalisador, formando sabo
e gua, como mostra a reao apresentada na Figura 2.4.
Figura 2.4 - Reao dos cidos Gordos Livres com o catalisador bsico KOH (Adaptado
de Gerpen, 2015)
A formao de sabes dificulta a posterior separao do biodiesel do glicerol e diminui o

rendimento da reao (Dias et al., 2009). Desta forma, de extrema importncia proceder
realizao de um pr-tratamento em matrias-primas com caractersticas de elevada acidez.
Alguns procedimentos/tecnologias que podem ser usados como pr-tratamentos deste

tipo de matria-prima so a esterificao cida ou esterificao enzimtica, a saponificao e a
glicerlise, que se descrevem de seguida.
SAPONIFICAO
A saponificao utilizada para remover cidos gordos livres na forma de sabes, e

consiste na reao destes com uma base, normalmente hidrxido de sdio (Dias, 2010). A
reao global encontra-se descrita na Figura 2.5.
Tal como avaliado por Jansri and Prateepchaikul (2011) usando a matria-prima leo de
coco bruto, com uma acidez de 20 % m/m, este pr-tratamento s deve ser aplicado para
ESTADO DA ARTE 35
baixos teores de AGL, pois caso contrrio ao eliminar-se os AGL tambm a matria-prima para
biodiesel ser eliminada, reduzindo assim o rendimento da reao (Dias, 2010).
Figura 2.5 - Reao de saponificao.
GLICERLISE
A glicerlise uma reao de esterificao, na qual o lcool usado o glicerol. Os cidos

gordos reagem com o glicerol, formando steres (mono, di ou triglicridos) (Felizardo et al.,
2011). usada somente quando o teor de cidos gordos livres elevado (5 60 % de AGL). A
reao decorre tal como mostra a reao apresentada na Figura 2.6.
A glicerlise pode ser uma alternativa til, mas tem a limitao em termos de exigncia
de temperaturas mais elevadas e a necessidade de incluir um sistema de remoo de gua
(Gole and Gogate, 2014).
Figura 2.6 - Reao de glicerlise (Felizardo et al., 2011).
2.2.3 REAO DE ESTERIFICAO
Tal como o prprio nome indica, a esterificao uma reao na qual se forma um
ster. Na presena de metanol, calor e um catalisador, os AGL presentes na matria-prima
reagem formando esteres metlicos (FAME) e gua. A reao apresenta-se descrita na Figura
2.7.
ESTADO DA ARTE 36
Figura 2.7 - Reao de esterificao (Marchetti et al., 2007).
A esterificao uma das reaes mais importantes na indstria, onde os FAME podem
ser produzidos usando catalisadores cidos homogneos ou catalisadores heterogneos
(incluindo enzimticos) e recorrendo a fluidos supercrticos (Liu et al., 2014). uma reao
reversvel que exige uma mole de metanol por mol de AGL, sendo que a adio de metanol em
excesso permite que a reao inversa possa ser desconsiderada (Chai et al., 2014).
Em processos de esterificao convencionais para a produo de biodiesel (catlise

homognea), cidos fortes so utilizados como catalisadores, caso do H2SO4. O processo
altamente consumidor de energia, pois necessita de temperaturas elevadas e quantidades de
lcool maiores. Os fluidos so difceis de manusear, causando problemas de corroso no
equipamento e produzindo efluentes cidos, com um impacte ambiental srio se no
devidamente tratados (Souza et al., 2009).
2.3 PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL
A presena de AGL na matria-prima representa um grande problema para a

transesterificao por mtodos tradicionais, como j referido, sendo que este problema poder
ser ultrapassado pela utilizao de enzimas, que tanto podem catalisar a esterificao dos AGL
como a transesterificao de triglicridos (Christopher et al., 2014).
A produo enzimtica de biodiesel tem como principais vantagens (Christopher et al.,

2014; Novozymes, 2014):
O uso de temperaturas de reao mais baixas, na ordem dos 30C 40C,

contrariamente com temperaturas na ordem dos 60C usadas na esterificao cida;
Alta seletividade e especificidade de trans/esterificao em diferentes substratos;
Permite a produo de um glicerol de elevada pureza, com vantagens do ponto de vista
da sua separao da fase do ster;
Eliminao de custos de tratamento associados recuperao de catalisadores
qumicos;
As enzimas so biodegradveis;
ESTADO DA ARTE 37
Maior aceitabilidade ambiental.
Os biocatalisadores esto a tornar-se uma ferramenta importante para a produo de

produtos qumicos, principalmente do ponto de vista da sustentabilidade ambiental.
Estes apresentam um considervel potencial industrial, e permitem catalisar reaes de

esterificao e transesterificao em meios no-aquosos (os solventes orgnicos e fluidos
supercrticos) (Stergiou et al., 2013).
No entanto, existem vrios desafios tcnicos que interferem na viabilidade econmica

do processo, tais como: alto custo das enzimas, perda de atividade durante o processo, a
inibio das enzimas por reagentes e produtos, e as baixas velocidades de reao (Christopher
et al., 2014).
Comparativamente com a transesterificao alcalina, a reao catalisada por lipases

apresenta uma eficincia mais baixa, pois implica um tempo de reao maior e o uso de
concentraes mais elevadas de catalisador (Mittelbach and Remschmidt, 2004).
Assim, e tendo em conta as desvantagens conhecidas do pr-tratamento de catlise

cida, o processo enzimtico poder consubstanciar-se como uma alternativa promissora para
o pr-tratamento por forma a reduzir a acidez.
2.3.1 AS LIPASES COMO BIOCATALISADORES
As lipases so enzimas que fazem parte da classe classificada como hidrlases, as quais
catalisam a hidrlise de ligaes ster (Krishna and Karanth, 2002).
Apresentam tanto atividade hidroltica como atividade sinttica. A reao hidroltica

geralmente ocorre na interface leo-gua, o que ajuda no metabolismo de lpidos, tais como
gordura (Narwal and Gupta, 2013).
Estas enzimas so geralmente usadas para a produo de biocombustveis, pois tm a

capacidade de converter triglicridos, AGL e glicerol. So usadas em reaes esterificao,
transesterificao e hidrlise (Christopher et al., 2014).
Como j referido, o elevado custo destes catalisadores, a velocidade de reco

relativamente mais lenta e problemas como a inibio da enzima podem surgir e so os
principais obstculos para a produo enzimtica de biodiesel. Sendo molculas biolgicas, as
enzimas so geralmente estveis em condies prximas das do ambiente, mas so sensveis a
ESTADO DA ARTE 38
condies extremas, tais como temperaturas elevadas e um pH baixo (Novozymes, 2014;

Mulalee et al., 2015).
Uma forma de ultrapassar o seu elevado custo a imobilizao da lipase, o que facilita a
separao do catalisador com a mistura da reao, e permite a sua reutilizao. O principal
objetivo da imobilizao de enzimas melhorar as suas propriedades de estabilidade trmica,
para um melhor tratamento, recuperao e reciclagem do biocatalisador (Narwal and Gupta,
2013). Materiais como resinas polimricas, slica, nanotubos de carbono, partculas magnticas
e microesferas so usados para imobilizar lipases (Zhao et al., 2015).
lcoois de cadeia curta, em particular metanol e etanol so amplamente utilizados na

produo de biodiesel, sendo o metanol o mais utilizado devido ao seu custo. Contudo, quando
o metanol usado em condies que seriam as ideais para a reao da transesterificao (3:1),
este dificulta a atividade de vrias lipases, sendo comum haver problemas para valores de razo
molar lcool:leo superiores a 1,5:1 (Lotti et al., 2015; Stergiou et al., 2013).
Quando o metanol excede o limite de solubilidade na mistura de reao, a lipase

irreversivelmente desativada, devido ao contacto mais direto do lcool com a enzima. Uma
forma de resolver este problema a adio de metanol por passos ou a utilizao de solventes,
como tert-butanol (Lpez et al., 2015; Stergiou et al., 2013), por forma a minimizar a presena
de lcool livre ou em concentrao elevada no meio.
2.3.2 REVISO BIBLIOGRFICA SOBRE ESTERIFICAO ENZIMTICA
De acordo com Mittelbach and Remschmidt (2004), o interesse do uso de lipases para a
produo de steres que compem o biodiesel surgiu em 1986, quando Choo and Ong
apresentaram um pedido de patente para a metanlise catalisada por lipases na presena de
gua. Vrios estudos foram realizados, desde ento, e na Tabela 2.4 esto sumariados
diferentes trabalhos desenvolvidos escala laboratorial com aplicao de lipases em reaes
de esterificao enzimtica e que tm interesse para o presente estudo (matrias primas com
elevado teor de cidos gordos livres ou cidos).
A maioria das reaes de esterificao apresentadas foram catalisadas por lipases

imobilizadas (Tabela 2.4) o que explica as altas taxas de converso quando usadas razes
molares leo: metanol mais elevadas. De acordo com Watanabe et al. (2007) e Pang et al.
(2016) foi possvel obter converses de 90 % e 86,4 % utilizando razes molares leo: metanol
ESTADO DA ARTE 39
de 1:5 e 1:20, respetivamente. Watanabe et al. (2005), Gumbyte et al. (2011) e Chowdhury and
Mitra (2015) atingiram converses de 90 %, 82,2 % e 95 % com razes molares leo: metanol
de 1:3, 1:0,5 e 1:2,5 respetivamente.
Segundo Soares et al. (2013) foi possvel atingir uma converso de 93 % com uma razo
molar etanol: leo de 1:3 e Mulalee et al. (2015) com uma razo molar octanol: leo atingiu
uma converso de 91 %.
Tal como se pode observar na Tabela 2.4, em alguns estudos utilizado como substrato
o cido oleico, por ser um cido gordo presente na maioria dos triglicridos.
De acordo com a Tabela 2.4, os principais fatores a ter em considerao na esterificao

enzimtica so:
1. A qualidade da matria-prima
Durante a catlise, a gua desempenha vrias funes e influencia fortemente a

atividade cataltica e a estabilidade da lipase, e por isso caracterizar a matria-prima
relativamente ao teor em humidade essencial (Nie et al., 2015).
As enzimas tm a capacidade de catalisar a esterificao dos AGL e a transesterificao

de triglicridos, uma vez que a matria-prima pode apresentar composies muito
diversificadas, o seu conhecimento de elevada importncia (Christopher et al., 2014).
2. A razo molar lcool: cidos gordos livres
O efeito do lcool sobre a atividade da enzima inclui inibio reversvel e inativao

(Mulalee et al., 2015). O tipo de lcool usado tambm afeta o desempenho da enzima, por
exemplo o etanol menos txico para a enzima, em comparao com o metanol (Sinknien
and Adlercreutz, 2014). Uma estratgia adotada para reduzir a inibio por parte do lcool, a
sua adio fracionada, como j referido (Lotti et al., 2015). Tendo em considerao a
importncia desta questo, foram analisados mais detalhadamente estudos onde o metanol
adicionado em fraes, e cujos resultados se apresentam na Tabela 2.5.
Pela anlise da Tabela 2.5, verifica-se que quando a razo molar maior que 1:1 a
adio fracionada. A maioria dos autores efetuam a adio do metanol em 3 fraes,
conseguindo assim elevadas converses.
Bernardes et al. (2007), Wang and Cao (2011) e Babaki et al. (2016) ao adicionarem
uma razo molar de 1:3 em 3 fraes alcanaram uma converso de 60 %, 98,4 % e 98 %,
ESTADO DA ARTE 40
respetivamente. Shimada et al. (1999) ao adicionar uma razo molar de 1:4 em 4 fraes
alcanou uma converso de 99 %.
3. Quantidade de enzima
Geralmente, quantidades elevadas de enzima (caso de Soares et al. (2013) que utiliza 12
% m/m de enzima) facilitam as reaes, contudo, por razes econmicas deve usar-se, sempre
que possvel, o limite inferior (Nie et al., 2015).
Na Tabela 2.4 so apresentadas gamas de quantidade de enzima entre 0,5 % m/m a 12

% m/m e todos os estudos apresentam um rendimento acima dos 80 %. A maior converso que
consta acontece com 3 % m/m imobilizada em polipropileno. A imobilizao permite com
menos quantidade de enzima obter maiores converses, como por exemplo quando Gumbyt
et al. (2011) utiliza 3 % m/m de enzima e consegue uma converso de 97,7 %,
comparativamente com a converso de 93 % obtida por Soares et al. (2013) com 12 % m/m no
imobilizada.
Quando a enzima est imobilizada em polipropileno, acrlica macroporosa ou

nanopartculas de slica podem ser obtidas converses de 82,2 %, 91 % e 95 % (Mulalee et al.,
2015; Chowdhury and Mitra, 2015; Pang et al., 2016).
4. Temperatura
Como se verifica na Tabela 2.4, dependendo do tipo de enzima, conseguem-se elevadas

converses para diferentes intervalos de temperatura (30 C e 60 C).
Segundo Mulalee et al. (2013), para a enzima Novozyme 435, temperaturas mais
elevadas de reao (45 C) resultam numa maior taxa de converso inicial (91 % nas primeiras 8
h das 24 h de reao), no entanto, pode ocorrer desativao trmica das enzimas o que afeta
negativamente a sua atividade.
5. Agitao
A velocidade de agitao do meio reacional afeta a taxa de reao e converso, isto

porque promove a transferncia de massa. Em sequncia, espera-se que melhores resultados
sejam obtidos para velocidades de agitao mais elevadas (Nie et al., 2015). Krishna and
Karanth (2002) referem que a agitao dever melhorar a transferncia de massa, no entanto
pode conduzir a desativao da enzima.
ESTADO DA ARTE 41
No que diz respeito aos estudos revistos, verifica-se que se utilizam velocidades de
agitao na ordem dos 200 rpm.
Segundo Novozymes (2014) velocidades de agitao entre 350-700 rpm so as mais

adequadas para a realizao de esterificao enzimtica. Wang et al., (2016) refere a taxa de
converso pode considerar-se quase independente da velocidade de agitao, a nveis
superiores a 170 rpm.
ESTADO DA ARTE 42
Tabela 2.4 Reviso bibliogrfica de estudos de esterificao enzimtica de matrias-primas de elevada acidez
Matria-prima/ Razo molar Quantidade de enzima Tempo de reao/ Temperatura/

lcool Referncia
Acidez % (m/m) leo: metanol % (m/mleo) Converso Agitao
leo cido de
Soapstock da 10 h/ (Watanabe et
Metanol 1:3 0,5 % (imobilizada) 30 C/ (NE) 2
refinao de leo de >90 % al., 2005)
colza/ (NE) 2
24 h/ 30 C/ (Watanabe et
leo cido1/ 76,3 Metanol 1:5 1,5 % (imobilizada)
90 % 120 rpm al., 2007)
3 % (imobilizada em 7 h/ (Gumbyt et al.,

cido oleico Metanol 1:0,5 40 C/ (NE)2
polipropileno) 82,2 % 2011 )
3 % (imobilizada em 7 h/ (Gumbyt et al.,

cido oleico Glicerol 1:1 50 C/ (NE)2
polipropileno) 97,7 % 2011 )
leo cido de
Soapstock da 31 h/ (Soares et al.,
Etanol 1:3 12 % 50 C/ (NE)2
refinao de leo 93 % 2013)
soja1/97,8
5 % (imobilizada em resina 8 h/ 45 C/ (Mulalee et al.,
cido oleico Etanol 1:2
acrlica macroporosa) 91 % 200 rpm 2015)
leo alimentar 5 % (imobilizada em resina 3 h/ 60 C/ (Chowdhury and
Octanol 1:2,5
usado / (NE)2 acrlica macroporosa) 95 % 250 rpm Mitra, 2015)
leo vegetal usado/ 24 h/ 40 C/ (Lpez et al.,
Metanol 1:1,5 2,5 %
(NE)2 92,6 % 200 rpm 2015)
2 % (imobilizada em 12 h/ (Pang et al.,
cido oleico Metanol 1:20 45 C/ (NE)2
nanopartculas de slica) 86,4 % 2016)
1Foi realizada uma hidrlise antes da reao de esterificao; 2 NE No especificado pelos autores.
ESTADO DA ARTE 43
Tabela 2.5 - Reviso bibliogrfica de estudos de esterificao enzimtica com adio de metanol em etapas, incluindo condies reacionais, acidez inicial e
converso final
Acidez inicial Converso
Condies de ensaio Quantidade e tempos de adio do lcool Referncia
% (m/m) (%)
28,95 g leo vegetal
4,15 % de enzima (m/m) Razo molar leo: metanol 1:1, adicionado s 0 h, 10 h, 14 (Shimada et
(NE)2 99
T=30C h e 24 h al., 1999)
t reao = 48 h
leo de soja comercial
7 % de enzima (m/m) Etanol (3,7 m/m) adicionado 1/3 s 0 h, 1/3 s 4 h e 1/3 s (Bernardes et
(NE)2 60
T=40C 6h al., 2007)
t reao = 8 h
leo alimentar usado
9 % enzima (m/m) Razo molar leo: metanol 1:3, adicionado 1/2 s 0 h, 1/2 (Laura Azcar,
4,5 (NE)2
T = 45C, 200 rpm s 8 h 2010)
treao = 48 h
Soapstock da refinao de leo de
camlia1
(Wang and
5 % de enzima (m/m) 36,6 Razo molar leo: etanol 1:1, adicionado s 0 h, 7 h e 14 h 98,4
Cao, 2011)
T=50C, 180 rpm
t reao = 24 h
1 L leo de colza
5 % enzima (m/m) Razo molar leo: metanol 1:1, adicionado 1/3 s 0 h, 1/3 (Firdaus et al.,
(NE)2 (NE)2
T = 37C, 200 rpm s 24 h e 1/2 s 48 h 2016)
treao = 72 h
0,65 g leo cr de colza
3,8 % enzima (m/m) Razo molar leo: metanol 1:3, adicionado 1/3 s 0 h, 1/3 (Babaki et al.,
8,4 98
T = 50C, 250 rpm s 24 h e 1/3 s 48 h 2016)
t reao = 72 h
1Foi realizada uma acidificao ao Soapstock, seguida de clarificao, antes da reao de esterificao; 2NE No especificado pelos autores.
ESTADO DA ARTE 44
2.4 A MATRIA-PRIMA: OLENA
A utilizao de matrias-primas residuais de interesse estratgico para reduo do

custo do biodiesel, alm de possibilitar a valorizao de resduos, o que contribui para a
diminuio dos impactes ambientais relacionados com a sua indevida gesto.
De forma a tornar o biodiesel competitivo, matrias-primas de baixo custo, tais como

leos no alimentares, leos alimentares usados, gorduras animais e olenas obtidas de pastas
de neutralizao (soapstock) podem ser utilizadas na sua produo (Jin et al., 2008).
As pastas de neutralizao so um resduo do processo qumico usado na refinao de

leos vegetais, resultante da neutralizao dos AGL (Figura 2.8). Normalmente estes so
acidificados com um cido mineral forte, tal como o cido sulfrico ou clordrico, para produzir
um leo cido (olenas) composto essencialmente por AGL, contendo tambm triglicridos,
diglicridos, monoglicridos e alguns outros componentes menores incluindo tais como os
fosfolpidos, esteris, tocoferis e pigmentos, entre outros (Basheer and Watanabe, 2016).
A pasta tem um aspeto de emulso, sendo esta destruda aquando da adio do cido
mineral, o que resulta na separao espontnea de duas fases, uma aquosa e uma camada de
leo (olena). gerada a uma taxa de cerca de 6 % do volume do leo refinado, e o seu valor de
mercado cerca de um dcimo do preo de leo vegetal bruto (Park et al., 2008).
Na Tabela 2.6 encontra-se descrita a caracterizao de um leo cido de leo de soja

(Park et al., 2008).
Tabela 2.6 Propriedades de uma olena obtida de pasta de neutralizao de leo de soja (adaptado
de (Park et al., 2008)
cido Gordo Livre (%) Teor de gua (%) Matrias gordas (%)
54,9 1,4 42,6
ESTADO DA ARTE 45
Figura 2.8 - Processo de refinao de leos vegetais (Adaptado de Moretto and Fett, 1998).
Na Tabela 2.7, encontram-se quatro exemplos do valor de acidez para diferentes

olenas, obtidas de pastas de refinao de diferentes origens.
Tabela 2.7 - Valores de acidez para diferentes olenas, obtidas de pastas de refinao de diferentes
leos vegetais
Olena Valor de acidez % (m/m) Referncia
Olena de leo soja 54,9 (Park et al., 2008)
Olena de leo de colza 94,8 (Li et al., 2010)
Olena de leo soja 97,8 (Serres et al., 2015)
Olena de leo de girassol 65 (Chiplunkar and Pratap, 2016)
ESTADO DA ARTE 46
As olenas tm atualmente como destino final fundamentalmente a utilizao na

formulao de raes animais assim como fonte de cidos gordos para fins industriais.
Tendo em considerao o baixo custo desta matria-prima e a sua elevada acidez, as

olenas parecem ser matrias-primas sustentveis promissoras para a produo de biodiesel,
produto de maior valor acrescentado, utilizando para tal a rota enzimtica para a esterificao
(uma vez que a transesterificao bsica se figura invivel), estudo sobre o qual incide o
presente trabalho.
ESTADO DA ARTE 47
ESTADO DA ARTE 48
3 MATERIAIS E MTODOS
Inicialmente procedeu-se caracterizao da matria-prima (Figura 3.1), tendo em
conta o teor de humidade, ndice de acidez, teor de enxofre e teor de fsforo. Procedeu-se
tambm avaliao da atividade da enzima pr-selecionada (Figura 3.2).
Figura 3.1 - Matria-prima Figura 3.2 Enzima pr-

(olena de girassol). selecionada (Novozym 40116).
Apresenta-se de seguida uma viso geral dos estudos realizados.
Antes de se iniciarem os ensaios de otimizao da esterificao enzimtica, realizaram-

se ensaios preliminares de acordo com a literatura (Soares et al., 2013; Novozymes, 2014;
Mulalee et al., 2015; Chowdhury and Mitra, 2015; Lopz et al., 2015), com a matria-prima sem
qualquer pr-tratamento. Seguiram-se estudos de pr-tratamento: centrifugao e lavagem
com NaOH e NaHCO3, seguindo-se ensaios de esterificao de acordo com os resultados
anteriormente obtidos.
Na otimizao das condies reacionais foram fixados os seguintes parmetros:

temperatura e razo molar cido: metanol, tendo-se variado a concentrao de enzima e a
forma de adio do lcool e monitorizada a reao durante 24 h.
A eficincia da esterificao foi avaliada pela reduo da acidez, calculada pela Equao
1.
= 24
=
100 (1)
MATERIAIS E MTODOS 49
Adicionalmente, no final, foi realizado um estudo pontual do efeito da alterao da

razo molar cido: metanol e da alterao do tipo de lcool utilizado.
Para alm da avaliao da reduo da acidez ao longo do perodo reacional, para o

produto obtido nas condies timas, o teor em steres metlicos foi tambm determinado.
Todos os resultados que foram realizados em duplicado apresentam as variaes

expressas em termos de diferena percentual em relao mdia (DRP).
3.1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA
A caracterizao da matria-prima foi realizada atravs da determinao do ndice de

acidez, teor de humidade, teor de enxofre e teor de fsforo. Todas as anlises foram realizadas
em duplicado.
As diferentes matrias-primas estudadas foram classificadas como Olena Sementes I,

Olena Sementes II e Olena Girassol e representam olenas obtidas de pastas de neutralizao
de diferentes misturas de leos (sementes) ou de um leo selecionado (girassol).
importante referir que os estudos remetem para utilizao de matrias-primas

distintas uma vez que decorrem do envio por parte da empresa de quantidades disponveis de
amostras em diferentes perodos de tempo. Assim, inicialmente foram rececionadas as olenas
de Sementes I e Girassol com as quais se fizeram estudos preliminares e de pr-tratamento.
Posteriormente solicitou-se empresa uma maior quantidade de amostra para concretizar os
estudos de pr-tratamento e realizar os estudos de otimizao, sendo que esta corresponde
matria-prima referenciada como olena de sementes II.
3.1.1 NDICE DE ACIDEZ E ACIDEZ
O IA corresponde quantidade em mg de hidrxido de potssio (KOH) necessria para

neutralizar os cidos gordos livres presentes em 1 g de leo ou gordura. A acidez corresponde
ao teor de cidos gordos livres expressos em percentagem mssica, relativamente a um cido
gordo de referncia.
Realizou-se a determinao por titulao volumtrica segundo a norma NP EN ISSO 660

(2009), e o resultado foi expresso em percentagem de massa relativamente ao cido oleico.
3.1.2 TEOR DE HUMIDADE
Devido interferncia da percentagem de gua nas enzimas, tornou-se fundamental

determinar a quantidade de humidade presente na matria-prima.
Tendo em considerao os valores de humidade esperados, a determinao foi

realizada por perda de massa a T=105 C 2 % at peso constante de acordo com a norma EN
12880 (2000), e os resultados esto expressos em percentagem mssica.
3.1.3 TEOR DE ENXOFRE
O teor de enxofre foi analisado segundo a norma ASTM D129:2013 Standard Test
Method for Sulfur in Petroleum Products (General Pressure decomposition device method). Esta
norma usada na determinao da quantidade de enxofre em leos lubrificantes com aditivos,
concentrados de aditivos, graxas lubrificantes e outros derivados de petrleo com baixas
volatilidades.
Este mtodo consiste na oxidao da amostra por combusto numa bomba

calorimtrica e numa atmosfera rica em oxignio sob presso (Figura 3.3). O enxofre libertado
durante a combusto absorvido numa soluo de Carbonato de Clcio (NaCO3, Panreac 99,5
%), a uma concentrao de 50 g/L, e a quantidade de enxofre determinada por gravimetria
sob a forma de sulfatos, por precipitao com BaCl2 (Merck, 99 %). Em cada ensaio foram
usadas 0,6 g de amostra.
Figura 3.3 - Bomba calorimtrica usada na combusto das amostras, no processo de

determinao do teor de enxofre.
Aps a lavagem do reator, recolheu-se a soluo de absoro e as guas de lavagem. A

precipitao do enxofre, sob a forma de Sulfato de Brio (BaSO4), foi realizada a 90 C (durante
12 h) aps a adio de 5 mL de BaCl2. Posteriormente, as amostras foram filtradas e calcinadas
a uma temperatura de 850 C durante 1 h. Aps o arrefecimento os precipitados foram
pesados.
A determinao do enxofre realizou-se para a olena de sementes II nas duas fases

resultantes da centrifugao e para a olena de girassol na fase retida no tubo. No primeiro caso
foi feito em duplicado sendo que no segundo caso apenas foi analisada uma amostra, para se
ter uma ideia das ordens de grandeza.
3.1.4 TEOR DE FSFORO
O fsforo encontra-se naturalmente nas gorduras e nos leos comestveis, como

elemento constituinte dos respetivos fosfolpidos (NP 1994:2000).
O teor de fsforo foi analisado segundo a norma NP 1994:2000 que consiste na digesto
da matria orgnica por via seca, na presena de xido de zinco (Carlo Erba, 99,5 %), seguida
da formao de um complexo azul com uma soluo de molibdato de sdio (Merck, 99,5 %)
sendo a determinao feita por espectrofotometria UV.
A determinao do fsforo realizou-se para a olena de girassol e olena de sementes II.
3.2 ATIVIDADE DA ENZIMA
Foi realizado um ensaio, baseado nas condies referidas em Novozymes (2014) para
determinar a atividade da enzima.
No ensaio foi utilizado um leo vegetal comercial (leo de soja da marca Olisoja) de
acidez residual, ao qual se adicionou gua destilada, enzima e glicerol. A partir da quantidade
de AGL presente no leo num tempo fixo (1 h) foi calculada a atividade da lipase. O
procedimento extrado da referncia indicada, apresenta-se no Anexo A.
3.3 PR-TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA
3.3.1 CENTRIFUGAO
Devido matria-prima no se apresentar completamente homognea, procedeu-se a

uma centrifugao, para averiguar a existncia de uma separao de fases, bem como fazer a
sua quantificao.
O processo de centrifugao foi realizado durante 3 minutos a uma velocidade de 3000

rpm (Figura 3.4). Deu-se a separao de fases, surgindo uma fase lquida (designada fase do
leo) e outra com um aspeto mais espesso, que foi rejeitada. A quantificao de cada uma das
fases foi realizada em duplicado para as diferentes matrias-primas.
Figura 3.4 Centrfuga usada nos ensaios de centrifugao da matria-prima.
Aps a centrifugao, foram realizados ensaios de esterificao apenas com a fase oleosa.
3.3.2 NEUTRALIZAO DA MATRIA-PRIMA
Segundo Novozymes (2014), a neutralizao da acidez mineral (note-se que o leo

obtido aps um processo de acidificao) por adio de NaOH um dos mais importantes pr-
tratamentos realizados a um leo, antes de se iniciarem processos enzimticos, para evitar a
inibio da enzima por efeito do baixo pH do meio. Desta forma, foram efetuados estudos de
lavagem com uma soluo de NaOH (Sigma Aldrich, 97 %). Todos os ensaios, nesta fase,
foram realizados em duplicado, e com a olena de sementes II.
Inicialmente procedeu-se a um ensaio de neutralizao de acordo com Novozymes

(2014), que se encontra descrito no Anexo B. Posteriormente, em virtude dos resultados
insatisfatrios obtidos, realizaram-se ensaios com uma soluo de NaOH a diferentes
concentraes, as quais: 250 ppm, 500 ppm e 750 ppm.
Os ensaios foram executados num funil de decantao (Figura 3.5), onde se procedeu
lavagem com a soluo de NaOH, seguida de lavagens com gua destilada. A massa de soluo
alcalina ou gua destilada usada foi sempre igual massa de olena lavada e tanto a soluo de
NaOH como a gua destilada foram aquecidas acerca de 60 C. No final de cada lavagem,
determinou-se o valor de pH e da condutividade da fase aquosa.
Figura 3.5 Lavagem com soluo de NaOH: I funil de decantao aps

adio da soluo; II funil de decantao no final da lavagem
O procedimento adotado foi o seguinte:
1. Pesar a massa de olena e adicionar ao funil de decantao;

2. Aquecer a soluo de NaOH, adicionar olena, agitar suavemente e deixar decantar;
3. Recolher a fase aquosa e medir o seu pH e condutividade;
4. Aquecer a soluo de gua destilada, adicionar olena neutralizada, agitar suavemente
e deixar decantar;
5. Recolher a fase aquosa e medir o seu pH e condutividade;
Seguindo o procedimento indicado anteriormente, foi tambm avaliado qual o nmero

de lavagens com a soluo de NaOH concentrao de 750 ppm (1, 2 ou 3) que seria a ideal
como pr-tratamento, seguindo-se um ensaio de esterificao. Por fim, avaliou-se a utilizao
de uma soluo de bicarbonato de sdio (NaHCO3, Panreac 99,5 %), segundo o procedimento
adotado para a soluo de NaOH, onde se procedeu a uma lavagem com concentrao de 750
ppm, seguida de esterificao enzimtica.
Uma vez que se observou que parte da gua ficava retida juntamente com a fase
orgnica, foi avaliada a reteno dessa gua aquando da lavagem com soluo de 750 ppm
NaHCO3 comparativamente com a lavagem com soluo de 750 ppm de NaOH (melhores
condies estabelecidas).
3.4 ENSAIOS DE ESTERIFICAO ENZIMTICA
As experincias realizadas foram planeadas de forma a ser possvel monitorizar a

reduo do teor de cidos gordos livres. A esterificao enzimtica foi realizada numa
incubadora a uma temperatura de 35 C, onde foi incorporada uma placa de agitao (Figura
3.6), de modo a garantir uma agitao magntica constante em todas as amostras. A placa
agitadora usada, marca Aqualytic modelo AL 353, apresentava duas possibilidades de agitao:
fraca ou intensa. Os ensaios foram realizados com agitao intensa e em bales Erlenmeyer
esmerilados de 100 mL, rolhados (Figura 3.6).
Figura 3.6 - Incubadora utilizada durante os ensaios com placa de agitao incorporada.
Figura 3.7 Exemplo de um ensaio de esterificao com seis amostras.
Em todos os ensaios de esterificao seguiu-se um procedimento experimental, que

passa a ser descrito de seguida:
1. Pesar a matria-prima;
2. Adicionar o lcool (Metanol, Fischer Scientific 99%; etanol Panreac 99,8 %), de
acordo com a razo molar cido: lcool definida;
3. Colocar os bales Erlenmeyer esmerilados na incubadora, em agitao, at atingir a

temperatura desejada;
4. Adicionar a enzima (Novozym 40116), previamente pesada.
Com base na bibliografia consultada (Watanabe et al., 2007; Wang and Cao, 2011;
Novozymes, 2014; Lpez et al., 2015) estabeleceu-se 24 horas como o tempo de reao e uma
temperatura de 35 C para todos os ensaios realizados. Ao longo desse tempo, foram recolhidas
amostras, com aproximadamente 0,5 mL, em diferentes instantes, garantindo que no se
retiraria mais de 10 % do contedo no perodo reacional.
Em cada instante foi efetuada a determinao do ndice de acidez de acordo com o

descrito no subcaptulo 3.1.1. Os resultados que reportam a reduo da acidez tm em
considerao o teor de acidez inicial da olena e o final obtido, no resultando portanto
exclusivamente da converso dos cidos gordos.
3.4.1 ENSAIOS PRELIMINARES
Com base na Tabela 3.1, e devido ao facto da concentrao de enzima indicada por
Novozymes (2014) ser to dspar da verificada na restante bibliografia consultada (Soares et al.,
2013; Mulalee et al., 2015; Chowdhury and Mitra, 2015; Lopz et al., 2015) realizaram-se
ensaios preliminares com quantidades de enzima de 0,1 % m/m, 1 % m/m e 5 % m/m
(relativamente massa de olena), (condies na Tabela 3.1, comparativamente com Tabelas
2.4 e 2.5 anteriormente apresentadas).
Tabela 3.1 - Condies experimentais para a produo enzimtica de biodiesel (Novozymes, 2014)
Razo molar cido: metanol 1:1,5
Temperatura de reao (C) 35
Quantidade de enzima % (m/m) 0,04 0,7
Nesta fase foram realizados 5 ensaios e as condies utilizadas em cada um deles

encontram-se descritas na Tabela 3.2. Todos os ensaios foram realizados a uma temperatura
constante de 35 C, com agitao intensa, durante 24 horas. Por serem os primeiros estudos
realizados e de forma a avaliar a evoluo da reduo de acidez foram retiradas amostras para
anlise em intervalos de tempo menores (caso do ensaio 1, onde nas primeiras 6,5 h de reao
se analisou a acidez em intervalos de 1,5 h).
Tabela 3.2 - Condies experimentais dos ensaios preliminares

Quantidade de Razo molar
Ensaio Olena Massa olena (g)
enzima % (m/m) cido: metanol
1 Sementes I 50 0,1 1:1,5
2 Sementes I 150 0,1 1:1,5
3 Sementes I 15 1 1:1,5
4 Girassol 20 5 1:1,5
5 Girassol 20 5 1:2
3.4.2 ENSAIOS DE PR-TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA
Com o intuito de avaliar o sucesso dos pr-tratamentos realizados matria-prima,

foram efetuados ensaios de esterificao. Tanto para a centrifugao, como para a
neutralizao com NaOH e NaHCO3 os ensaios realizaram-se de acordo com o procedimento
descrito no subcaptulo 3.3 e nas condies indicadas na Tabela 3.3.
Tabela 3.3 Condies experimentais utlizadas na avaliao do pr-tratamento da matria-prima
Razo molar cido: metanol 1:1,5
Temperatura de reao (C) 35
Quantidade de enzima % (m/m) 5
Tempo de reao (h) 24
3.4.3 OTIMIZAO DAS CONDIES DE ESTERIFICAO ENZIMTICA
Nesta fase foram realizados 16 ensaios com a olena Sementes II. Todos os ensaios
foram realizados com a matria-prima neutralizada com soluo de 750 ppm de NaOH (25 g de
olena por ensaio), sendo efetuados em duplicado, a uma temperatura constante de 35 C, com
agitao magntica intensa e durante 24 horas. As condies utilizadas em cada ensaio
encontram-se descritas na Tabela 3.4. A forma de adio do metanol encontra-se representada
em fraes, sendo que quando se adiciona por exemplo em 3 fraes, significa que a
quantidade de metanol foi dividida por 3 e adicionada em tempos separados.
Tabela 3.4 - Condies experimentais utilizadas na otimizao da reao de esterificao enzimtica

Quantidade de Forma de adio do
Ensaio Razo molar cido: metanol
enzima % (m/m) metanol
6 2 1:1,5 1 Frao
7 2 1:1,5 3 Fraes
8 2 1:1,5 6 Fraes
9 2 1:1,5 12 Fraes
10 3 1:1,5 1 Frao
11 3 1:1,5 3 Fraes
12 3 1:1,5 6 Fraes
13 3 1:1,5 12 Fraes
14 4 1:1,5 1 Frao
15 4 1:1,5 3 Fraes
16 4 1:1,5 6 Fraes
17 4 1:1,5 12 Fraes
18 5 1:1,5 1 Frao
19 5 1:1,5 3 Fraes
20 5 1:1,5 6 Fraes
21 5 1:1,5 12 Fraes
O metanol fracionado foi adicionado na totalidade nas 5,5 primeiras horas da reao. A
adio das 3 fraes foi realizada em intervalos de 2,5 h, nos tempos 0 h, 2,5 h e 5 h. As 6
fraes foram efetuadas em intervalos de 1 h, com a primeira adio s 0 h e a ltima s 5 h.

Relativamente s 12 fraes, dosearam-se em intervalos de 30 min, das 0 h at s 5,5 h.
Ao fim das 7 horas e das 24 horas de reao foi determinado o valor de acidez, de
acordo com o subcaptulo 3.1.1.
3.4.4 EFEITO DA ALTERAO DA RAZO MOLAR CIDO: METANOL
De acordo com o melhor resultado obtido da otimizao, procedeu-se a um ensaio de

esterificao com o dobro da razo molar cido: metanol, adicionado em 2 fraes. A primeira
frao foi adicionada no incio da reao e a segunda ao fim de 7 horas. As condies usadas
encontram-se na Tabela 3.5.
Mais uma vez o valor de acidez foi determinado de acordo com o subcaptulo 3.1.1, ao
fim das 7 horas (antes de adicionar a segunda frao) e das 24 horas de reao.
Tabela 3.5 - Condies experimentais usadas para a avaliao do efeito da alterao da razo molar
cidos gordos livres: metanol
Quantidade de Razo molar cido: Forma de adio
Massa olena (g)
enzima % (m/m) metanol do metanol
25 2 1:3 2 Fraes
3.4.5 EFEITO DA ALTERAO DO LCOOL
Adotando as mesmas condies que no subcaptulo 3.4.4, procedeu-se a um ensaio de

esterificao com etanol, adicionado em 2 fraes. A primeira frao foi adicionada no incio da
reao e a segunda ao fim de 7 horas.
3.5 DETERMINAO DO TEOR EM STERES METLICOS
A determinao do teor em steres metlicos foi realizada com base na norma EN

14103:2003, sendo utilizado o mtodo de cromatografia gasosa com heptadecanoato de metilo
(C17:0) como padro interno. A anlise foi realizada, em duplicado, apenas para o ensaio que
apresentou uma maior reduo da acidez inicial.
O equipamento usado foi o cromatgrafo gasoso da marca Dani, modelo Master GC

(Figura 3.8), o qual possui uma coluna DN-WAX com 30 m, 0,25 mm de dimetro interno e 0,25
m de espessura de filme. As temperaturas do injetor split e do detetor FID (detetor de

ionizao da chama) foram colocadas a 250 C e 255 C, respetivamente.
Figura 3.8 Cromatgrafo Dani Master GC utilizado na

determinao dos steres metlicos.
O volume de amostra injetado foi de 1 L, no modo split a um caudal de 50 ml/min. O

programa da temperatura usado foi o seguinte: inicialmente selecionou-se 120C como
temperatura de arranque, seguido de um aumento de temperatura taxa de 4C por minuto,
at 220C, mantidos por 10 min. O tempo total da corrida foi de 35 minutos.
Atravs do software associado ao cromatgrafo gasoso foi possvel identificar-se os

steres metlicos da amostra por comparao com os tempos de reteno dos padres
cromatogrficos.
O clculo do teor de steres (TE) foi efetuado com base na Equao 2, onde A
representa o somatrio das reas de todos os picos, corresponde rea do pico referente
heptadecanoato de metilo (C17:0), a concentrao exata em mg/ml da soluo de
heptadecanoato de metilo, o volume em ml da soluo de heptadecanoato de metilo e a
massa em mg de amostra analisada.
()( )
= 100 (2)

4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA
4.1.1 ACIDEZ
A determinao da acidez (calculada a partir do ndice de acidez) crucial para o

trabalho realizado, uma vez que quantifica o teor em cidos gordos livres das amostras, os
quais so transformados em steres no processo de esterificao enzimtica.
Na Tabela 4.1 esto apresentados os valores de acidez obtidos para os trs tipos de
matria-prima usados neste trabalho.
Tabela 4.1 - Valores de acidez das diferentes matrias-primas
Matria-prima Acidez a) % (m/m) DRP b) (%)
Olena de sementes I 60,9 0,5
Olena de girassol 60,5 0,1
Olena de sementes II 65,5 0,7

a)Expressa em cido oleico; b)Diferena relativa percentual
Segundo a literatura as olenas so compostas essencialmente por cidos gordos livres.

Mateos et al. (1996) indica que uma olena de palma apresenta cerca de 50 % de AGL, Irandoust
et al. (2012) indica 67,4 % de acidez para uma olena de soja e Chiplunkar and Pratap (2016)
refere que uma oleina de girassol apresenta 65% de acidez. Desta forma eram expectveis
valores to elevados de acidez.
4.1.2 TEOR DE HUMIDADE
Como referido anteriormente, o teor de humidade ir influenciar a atividade da lipase

no processo de esterificao e por isso procedeu-se anlise deste parmetro para as
diferentes matrias-primas. Os resultados obtidos encontram-se descritos na Tabela 4.2.
R ESULTADOS E DISCUSSO 61
Tabela 4.2 Valores de teor de humidade nas diferentes matrias-primas
Matria-prima Teor em humidade % (m/m) DRP b) (%)

b)Diferena relativa percentual
Pela anlise das Tabelas 4.1 e 4.2, pode afirmar-se que em termos de acidez e teor de
humidade as diferentes olenas apresentaram caractersticas muito similares. Prez-Bonilla
(2011) refere que olenas vegetais apresentam cerca de 2,2 % de humidade, o que confirma os
valores obtidos.
Tendo em considerao que a centrifugao foi estudada como um pr-tratamento,

realizou-se a quantificao das duas fases obtidas. A fase lquida (designada a fase do leo) e
uma fase que ficou retida no tubo de centrifugao, que foi rejeitada. Na Figura 4.1 est
presente o resultado final da centrifugao para a olena de sementes II e olena de girassol.
Este processo tambm foi realizado para a olena sementes I.
Figura 4.1 - Fases formadas depois da centrifugao: I-a) Fase retida no tubo
da olena de sementes II; I -b) Fase oleosa da olena de sementes II; II-a) Fase
retida no tubo da olena de girassol; II-b) Fase oleosada olena de girassol.
Na Tabela 4.3 esto descritos os valores de teor da fase oleosa para cada uma das
olenas, expresso em percentagem mssica.
Tabela 4.3 Valores de teor da fase oleosa obtida aps centrifugao nas diferentes matrias-primas
Matria-prima Teor de leo (aps centrifugao) % (m/m) DRP b) (%)

Ao contrrio do que acontece com o valor de acidez e o teor de humidade, onde os

valores so aproximadamente iguais em todas as olenas, neste parmetro a olena de
sementes II apresenta um valor de teor de leo muto superior em comparao com as
restantes. Estes resultados so particularmente importantes em termos de avaliao da
viabilidade do processo, isto, porque do interesse da empresa maximizar o produto (note-se
que ele atualmente vendido para formulao de razes) pelo que aproveitar apenas 50 ou 60
% poder figurar-se invivel. No foram encontrados estudos na literatura referentes a esta
questo.
4.1.3 TEOR DE ENXOFRE
Avaliar este parmetro tornou-se de enorme relevncia, visto as olenas serem

resultado da acidificao do soapstock com cido sulfrico.
Para a olena de sementes II o teor de enxofre foi analisado, na amostra tal e qual e nas
duas fases originadas do processo de centrifugao. Para a olena de girassol apenas se analisou
na amostra tal e qual e na fase retida no tubo de centrifugao, dada a relevncia. Nas Tabelas
4.4 e 4.5 esto apresentados os resultados obtidos.
Tabela 4.4 Valores de teor de enxofre para a olena de sementes II
Olena Sementes II
Tal e qual Fase oleosa Fase retida no tubo
Concentrao (ppm) 10400 12200 12300
DRP b) (%) 24,4 23,8 74,3
Tabela 4.5 - Valores de teor de enxofre para a olena de girassol
Olena de girassol
Tal e qual Fase retida no tubo
Concentrao (ppm) 2300 5300
A DRP dos resultados obtidos foi elevada para este ensaio, facto que pode ser explicado
por no processo de combusto da amostra se ter como limite uma massa de 0,6 g. Na Figura
4.2 esto presentes os cadinhos com o precipitado de sulfato de brio, depois de 12 horas na
mufla a 850 C.
Figura 4.2 - Precipitado de sulfato de brio.
Como o principal objetivo desta anlise era perceber a presena do enxofre e devido a
limitaes temporais, no foi possvel explorar em detalhe este procedimento analtico e
otimiz-lo.
Tendo em considerao os valores de concentrao obtidos e a massa de cada uma das

fases possvel determinar a distribuio do enxofre em cada uma destas, assim como
confirmar se a quantidade de enxofre presente na olena corresponde quantificada em cada
uma das fases. Analisando os resultados obtidos e considerando o valor de 81,0 % de teor de
leo obtido na centrifugao da olena de sementes II (Tabela 4.3) os valores so coerentes e
mostram que a maior parte do enxofre se encontra na fase oleosa (cerca de 95 %). No entanto,
para a olena de girassol, considerando o valor de teor de leo obtido na centrifugao (54,2 %)
os resultados revelam que a maior parte do enxofre se encontra na fase retida no tubo (cerca
de 73,6 %).
4.1.4 TEOR DE FSFORO
Tal como referido anteriormente, a olena composta essencialmente por cidos

gordos livres, no entanto pode conter outros componentes menores, incluindo fosfolpidos,
esteris, tocoferis, pigmentos, e outros materiais inertes (Basheer and Watanabe, 2016). A
relevncia da determinao deste parmetro tambm se associa s limitaes na aplicao do
processo de produo de biodiesel e qualidade deste, funo do teor deste elemento. Assim,
foi avaliado o teor em fsforo para a olena de sementes II e a olena de girassol (Figura 4.3).
Neste parmetro apenas foi avaliado o teor de fsforo na amostra tal e qual, sem separao de
fases, pois o interesse da separao de fases seria auxiliar a remoo do enxofre mineral.
Figura 4.3 - Complexo azul com uma soluo de molibdato de

sdio: I - Olena de sementes II; II- Olena de girassol.
Os resultados obtidos esto descritos na Tabela 4.6. Pela anlise desta, pode concluir-se
que a olena de girassol apresenta uma concentrao de fsforo muito superior olena de
girassol, facto que tambm pode ser aferido pela Figura 4.3. Apesar de no ter sido possvel
apurar pela literatura valores deste parmetro, foi indicado pela empresa que os valores
obtidos esto dentro do encontrado para este tipo de matria-prima.
Verifica-se na Tabela 4.6 que para a olena de sementes II o DRP bastante superior ao
obtido com a olena de girassol. Ainda assim, sendo o objetivo ter uma ordem de grandeza,
considerou-se no ser de elevada relevncia repetir os ensaios.
Tabela 4.6 - Valores de teor de fsforo para a olena de sementes II e girassol
Matria-prima Concentrao (ppm) DRP b) (%)
Olena de girassol 313 5,27

b)Diferena relativa percentual.
4.2 ATIVIDADE DA ENZIMA
A atividade da enzima definida como a quantidade de enzima que promove a gerao

de 1 mol de cido gordo por minuto (Amoah et al., 2016; Tran et al., 2016).
No ensaio realizado foi determinada a acidez do leo vegetal comercial antes da reao
e ao fim de 1 hora de reao. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 4.7, onde se
verifica que ocorreu uma converso de cidos gordos na ordem dos 99,3 %, o que permitiu
assumir que a enzima estava ativa e operacional.
O clculo da converso de cidos gordos foi realizado segundo a Equao 3.
(3)
= 100

Tabela 4.7 - Resultados da acidez no ensaio da atividade enzimtica usando leo comercial de soja
Tempo Acidez a) % (m/m) DRP b) (%)
0h 0,16 1,8
1h 24,4 6,7
a)Expressa em cido oleico; b)Diferena relativa percentual.
4.3 ENSAIOS PRELIMINARES
Os ensaios de esterificao nesta fase realizaram-se sem qualquer tratamento

matria-prima a uma temperatura de 35 C, agitao magntica vigorosa, e fazendo variar a
quantidade de enzima e a razo molar cido: metanol, tal como indicado na Tabela 3.2. Os
resultados apresentam-se nas Tabelas 4.8 4.12
Tabela 4.8 - Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio 1 (Olena de Sementes I; m=50 g;
razo molar cido: metanol 1:1,5; 0,1 % m/m enzima)
Tempo de reao (h) Acidez a) % (m/m) DRP b) (%)
0 47,4 0,6
1,5 47,8 1,1
3 47,4 1,9
6,5 46,9 1,0
18,5 46,1 0,7
20 46,2 2,2
24 53,1 1,1
razo molar cido: metanol 1:1,5; 0,1 % m/m enzima)
0 53,6 1,2
4,5 55,3 1,6
24 54,4 1,1
O ensaio 1 e o ensaio 2 foram realizados com a mesma quantidade de enzima, mas com
uma massa de olena diferente, uma vez que a quantidade de 0,1 % m/m de enzima tem um
grande erro associado, por se tratar de uma massa muito pequena. No entanto, mesmo com
um volume maior a converso dos AGL no ocorreu de forma efetiva, tendo no ensaio 1 uma
reduo de 12,8 % e no ensaio 2 de 10,7 %, relativamente acidez inicial da matria-prima.
Relativamente ao ensaio 1, pela anlise da Tabela 4.8 verifica-se que existe um aumento
de acidez do tempo 20 h para o tempo 24 h. Este aumento deve-se possivelmente
reversibilidade associada reao e presena de gua no meio.
De acordo com Novozymes (2014) (condies reacionais: leo vegetal comercial;

T=35C; razo leo: metanol 1:1,5) com a quantidade de enzima de 0,7 % m/m ser possvel
atingir valores de rendimento na ordem dos 90 % sendo que Watanabe et al. (2005) (condies
reacionais: leo cido de leo de colza; T= 30C; razo leo: metanol 1:3) com uma quantidade
de enzima imobilizada inferior (0,5 % m/m) conseguiu um rendimento superior a 90 %.
Por se considerar que a quantidade de 0,1 % m/m seria insuficiente para catalisar a
reao, de acordo com os resultados obtidos, mantendo todas as outras condies, aumentou-
se a quantidade de enzima para 1 % (m/m) (Tabela 4.10). Ainda assim, com 10 vezes mais de
quantidade de enzima, a reduo de acidez foi muito baixa (16,4 %).
Contrariamente ao obtido nestes ensaios, Watanabe et al. (2007) conseguiu atingir com
1,5 % m/m de enzima imobilizada (condies reacionais: leo cido; T= 30C; razo leo:
metanol 1:5) uma reduo de acidez de 90 %. Com um cido oleico como substrato, Pang et al.
(2016) atingiu uma reduo de 86,4 % com 2 % m/m de enzima imobilizada (condies
reacionais: T= 30C; razo leo: metanol 1:20).
De realar que a maior parte dos estudos referenciados referem-se transesterificao

de leos vegetais.
razo molar cido: metanol 1:1,5; 1 % m/m enzima)
0 54,2 3,9
4,5 54,9 1,9
24 50,9 1,1
Visto se manterem os elevados teores de acidez ao fim das 24 horas com 1 % m/m de
enzima, decidiu-se aumentar para 5 % m/m (Tabela 4.11), no entanto e apesar de a olena ser
diferente, a reduo de acidez manteve-se baixa (11,0 %).
Wang and Cao (2011) (condies reacionais: olena de Soapstock da refinao de leo
de camlia; T=50C; 180 rpm; razo molar leo: etanol 1:3), Mulallee et al. (2015) (condies
reacionais: cido oleico; T=45C; 200 rpm; razo molar leo: etanol 1:2) e Chowdhury and Mitra
(2015) (condies reacionais: leo comercial usado; T=60C; 250 rpm; razo molar leo: octanol
1:2,5) referem que ao utilizarem 5% m/m de enzima atingem rendimentos de 98,4 %, 91 % e 95
%, respetivamente.
Tabela 4.11 Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio 4 (Olena de Girassol; m=20 g; razo
molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima)
0 61,7 3,9
3 57,8 0,3
6 55,1 1,6
21 54,4 3,1
24 54,2 0,6
Mantendo a mesma olena e concentrao de enzima, fez-se variar a razo molar cido:
metanol, pois pretendia-se avaliar se seria este parmetro que no estava adequado.
Os resultados encontram-se na Tabela 4.12 sendo que a reduo de acidez se manteve

baixa (14,0 %), no sendo verificada nenhuma alterao face s condies anteriores utilizadas,
decidindo-se assim que a olena necessitaria de uma pr-tratamento antes de se realizar a
reao de esterificao.
Tabela 4.12 - Evoluo da acidez ao longo do tempo para o ensaio5 (Olena de Girassol; m=20 g; razo
molar cido: metanol 1:2; 5 % m/m enzima)
Tempo de reao (h) Acidez a) % (m/m)
0 56,1
3,5 53,6
5 52,8
7,5 52,6
24 52,4
a)Expressa em cido oleico;
O resumo dos resultados de reduo de acidez nos ensaios preliminares encontram-se

resumidos na Tabela 4.13.
Tabela 4.13 - Valores de reduo da acidez obtidos para os ensaios 1 a 5
Ensaio Reduo de acidez (%)
1 12,8
2 10,7
3 16,4
4 11,0
5 14,0
4.4 PR-TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA
4.4.1 CENTRIFUGAO
Depois do processo de centrifugao descrito no subcaptulo 3.3.1, realizaram-se

ensaios de esterificao de acordo com a Tabela 3.3, para a olena de girassol e sementes II. Os
ensaios foram realizados, como j referido, apenas utilizando a fase oleosa.
Os resultados da evoluo da acidez esto descritos nas Tabelas 4.14 e 4.15, para olena
de girassol e sementes II, respetivamente.
Tabela 4.14 - Evoluo da acidez para olena de girassol, aps centrifugao (Olena de Girassol; razo
molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima)
0 61,6 0,2
6,5 16,1 3,1
24 15,7 7,0
Pela anlise da Tabela 4.14 e comparativamente com os resultados obtidos no ensaio 4

(Tabela 4.11), realizado nas mesmas condies, a reduo de acidez significativamente mais
elevada (74 %). Verificou-se tambm que a maioria da reduo foi conseguida antes das 6,5 h
de reao.
Assim, este desfasamento nos resultados pode ser justificado pelos teores de enxofre,
apresentados na Tabela 4.4. Isto , na olena de girassol, a centrifugao permite a separao
da maior parte do enxofre mineral.
Apesar dos bons resultados para a olena de girassol, no se optou por este pr-
tratamento, uma vez que apenas se utilizava cerca de 50 % da matria-prima.
No entanto, foi realizado um ensaio nas mesmas condies para a olena de sementes II
(Tabela 4.15) e a reduo de acidez foi significativamente inferior (15,9 %) obtida para a
olena de girassol. Da mesma forma que os valores de enxofre justificam o sucesso na olena de
girassol, na olena de sementes II, sabe-se que a maioria do teor de enxofre se concentra na
fase oleosa, da se verificar a inibio da enzima em virtude da sua presena, levando a uma
reduo de acidez inferior.
Tabela 4.15 - Evoluo da acidez para olena de sementes II, aps centrifugao (Olena de Sementes
II; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima)
0 61,7
6,5 57,8
24 55,1
a)Expressa em cido oleico
4.4.2 NEUTRALIZAO DA MATRIA-PRIMA
ENSAIO DE NEUTRALIZAO SEGUNDO CONDIES DA LITERATURA
O ensaio foi realizado de acordo com Novozymes (2014), e encontra-se descrito no

subcaptulo 3.3.2. Neste documento refere-se a utilizao deste ensaio para determinar a
quantidade tima de NaOH para neutralizar a acidez mineral. As experincias consideram a
realizao de reaes de esterificao enzimtica de 1 hora, usando diferentes quantidades de
NaOH.
Novozymes (2014) refere que o valor tpico de NaOH usado num processo industrial
de 50-600 ppm, no entanto, para leos altamente cidos podem atingir-se valores de 2000 ppm
de NaOH ou superiores.
Os resultados encontram-se na Figura 4.4. De acordo com o Novozymes (2014), a curva

deveria mostrar uma tendncia decrescente seguida por um patamar, o qual indicaria a
concentrao de NaOH ideal para o pr-tratamento. No entanto, tal no se observou,
mantendo-se a acidez aproximadamente constante para todos os valores de concentrao de
NaOH adicionados. Tais resultados levaram realizao de estudos adicionais com recurso a
lavagem.
Figura 4.4 - Evoluo da acidez (%m/m, expressa em termos de cido oleico) nas diferentes
concentraes de NaOH.
ENSAIOS DE NEUTRALIZAO: LAVAGEM COM SOLUO DE NaOH
Como o ensaio de neutralizao de acordo com o Novozymes (2014), anteriormente

referido, no foi conclusivo, optou-se por efetuar lavagens com solues de NaOH a diferentes
concentraes. O procedimento das lavagens encontra-se descrito no subcaptulo 3.3.2.
Contrariamente ao que acontece com o processo de neutralizao com soluo de

NaOH, onde a soluo adicionada mistura e interfere na reao de esterificao, espera-se
que as lavagens permitam a neutralizao sem interferncias posteriores.
Antes de se iniciarem os testes com as concentraes de NaOH a 250 ppm, 500 ppm e
750 ppm, foi realizado um ensaio apenas com lavagem da olena com gua destilada, no qual se
monitorizou o pH das guas de lavagem. A evoluo no valor de pH encontra-se descrita na
Figura 4.5.
Posteriormente, realizaram-se lavagens com a soluo de NaOH a concentrao de 250

ppm e 500 ppm (Figura 4.6 e Figura 4.7 respetivamente). Utilizou-se como matria-prima a
olena de sementes II.
3
pH
0
0 2 4 6 8 10
Nmero de lavagens
Figura 4.5 - Evoluo do pH da gua destilada ao fim de 10 lavagens.
Nas lavagens efetuadas olena de sementes II com a soluo de NaOH de 250 ppm,
verificou-se que, o pH manteve-se contante entre os valores de 3 4, mesmo ao fim de 30
lavagens com gua destilada (Figura 4.6), resultado semelhante ao obtido sem adio de NaOH.
Este resultado mostra que no existe vantagem de efetuar lavagens com solues de NaOH a
250 ppm e que tanto esta soluo como a gua no conseguem remover a acidez mineral.
3
pH
0
0 5 10 15 20 25 30
Nmero de lavagens
Figura 4.6 - Evoluo do pH da gua destilada, aps lavagem com soluo

de NaOH a 250 ppm.
Em sequncia, aumentou-se a concentrao da soluo de NaOH para o dobro (500

ppm), e na primeira lavagem com gua destilada o pH j foi superior a 6, tal como se pode
observar na Figura 4.7.
Como ao fim de 7 lavagens com gua destilada o pH ainda se mantinha prximo de 6,

assumiu-se que a acidez mineral estivesse neutralizada, pois o pH da gua destilada
aproximadamente 5,8 e prosseguiu-se com um ensaio de esterificao enzimtica nas
condies indicadas na Tabela 3.3. Os resultados obtidos neste ensaio so apresentados na
Tabela 4.16.
4
pH
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Nmero de lavagens
Figura 4.7 - Evoluo do pH da gua destilada, aps lavagem com soluo

de NaOH a 500 ppm.
Tabela 4.16 - Evoluo da acidez, aquando da esterificao da matria-prima pr-tratada com soluo
de NaOH 500ppm (Olena de Sementes II; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima)

0 64,8 1,7
6,5 31,4 1,6
24 33,3 1,4
Desta forma, utilizando a concentrao de 500 ppm, conseguiu-se uma reduo de

acidez de 49,2 %. No entanto, procedeu-se ainda a um ensaio com a concentrao de 750 ppm,
para se verificar se ocorriam melhorias no processo.
No ensaio de 750 ppm, alm de se analisar o pH das guas de lavagem analisou-se

tambm a condutividade. Como j referido, nesta fase testou-se ainda se o aumento de
nmero de lavagens com NaOH trazia melhorias no processo final de esterificao.
Deste modo, realizou-se uma lavagem com soluo de NaOH seguida de duas lavagens
com gua destilada, onde se analisou o pH e condutividade. Essa massa foi dividida em duas
partes iguais, e numa delas lavou-se mais uma vez com soluo de NaOH (o que faz um total de
2 lavagens com NaOH) e duas vezes com gua destilada. Por ltimo, voltou a dividir-se esta
massa em duas partes iguais, onde uma delas voltou a adicionar-se uma nova soluo de NaOH
(fazendo um total de 3 lavagens).
Os resultados de pH e a condutividade obtidos para as guas de lavagens encontram-se

descritos na Tabela 4.17.
Pela anlise da Tabela 4.17 verifica-se que os valores de pH obtidos para as lavagens
com soluo de NaOH 750 ppm so iguais aos valores para a concentrao de 250 ppm. Desta
forma, por se considerar que a medio do pH nas guas de lavagem podia no ser exata
(presena do sal resultante da neutralizao e de substncias orgnicas que interferem com a
medio) optou-se por analisar a condutividade. De considerar tambm que alguns cidos
gordos apresentam pequena solubilidade em gua.
A medio da condutividade um procedimento mais sensvel que permite medir as

concentraes inicas, desta forma seria expectvel que com o aumento das lavagens se
verifica-se uma diminuio da condutividade. Reala-se que neste caso apenas se realizaram 3
lavagens, uma com a soluo bsica e duas com gua destilada.
Tabela 4.17 Valores de pH e condutividade obtidos nas lavagens com soluo de NaOH
1 Lavagem com soluo de NaOH
Condutividade (S/cm) pH
1 gua de lavagem 61,2 3,90
2 Lavagens com soluo de NaOH
3 Lavagens com soluo de NaOH
Analisando a tabela 4.17, e contrariamente ao esperado os valores da condutividade na

3 lavagem apresentaram valores mais elevados do que na 2 lavagem. O estudo detalhado dos
motivos para tal ter ocorrido no foi realizado sendo que os resultados podero dever-se a
oscilaes na temperatura da gua de lavagem. No entanto, e apesar da disparidade de valores
de condutividade entre as lavagens, prosseguiu-se com os ensaios de esterificao nas
condies indicadas na Tabela 3.3.
Os resultados obtidos encontram-se descritos na Tabela 4.18, e pode-se concluir que

independentemente do nmero de lavagens a esterificao apresenta a mesma percentagem
de reduo de acidez, tendo-se obtido bons resultados, com redues de acidez na ordem dos
80%.
Tabela 4.18 Evoluo da acidez durante a esterificao com 1, 2 e 3 lavagens de NaOH 750 ppm
(Olena de Sementes II; razo molar cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima)
Acidez b) % (m/m)
Tempo de reao (h) N. de lavagens com NaOH 750 ppm
1 2 3
0 47,9 44,5 42,7
6,5 12,6 12,8 11,4
24 12,1 12,1 11,2
Converso (%) 81,5 81,5% 82,9

ENSAIO DE NEUTRALIZAO: LAVAGEM COM SOLUO DE NaHCO3
Adicionalmente, testou-se nas melhores condies de lavagem (1 lavagem com NaOH

750 ppm, seguida de duas lavagens com gua destilada) a lavagem com uma soluo de
bicarbonato de sdio (NaHCO3) por teoricamente reduzir a formao de emulses e ser de mais
acessvel manuseamento. Analisou-se de seguida o pH e a condutividade da fase aquosa.
Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 4.19. Tal como acontece com a lavagem
de NaOH 750 ppm o pH manteve-se entre 3,5 3,4, no entanto verifica-se uma reduo no
valor da condutividade na segunda lavagem, considerando-se assim que ocorreu a

neutralizao e se podia prosseguir com a esterificao.
Tabela 4.19 Valores de pH e condutividade obtidos na lavagem com soluo de NaHCO3 a 750 ppm
No processo de lavagem verificou-se que quando se separava a fase aquosa da fase

orgnica, no caso das lavagens com NaHCO3, comparativamente com a soluo de NaOH, ficava
bastante gua retida juntamente com a fase orgnica, aumentando assim a massa final de
olena. Assim, fez-se um ensaio para verificar a quantidade de gua retida na matria-prima
quando lavada com soluo de NaOH e NaHCO3, comparando a massa inicial com a final de
olena. Os resultados obtidos apresentam-se na Tabela 4.20.
Tabela 4.20 gua retida durante a lavagem da olena para a soluo de NaOH e HNaCO3
Lavagem com soluo de NaOH 750 ppm
gua retida durante a lavagem % (m/m) DRP b) (%)
26,3 1,04
Lavagem com soluo de NaHCO3 750 ppm
gua retida durante a lavagem % (m/m) DRP b) (%)
44,4 14,2
Uma vez que a lavagem com a soluo de bicarbonato de sdio retia 44,4 % de gua na
fase orgnica, aproximadamente o dobro de quando usado NaOH, definiu-se como condio
tima a lavagem NaOH a uma concentrao de 750 ppm, seguida de duas lavagens com gua
destilada.
Ainda assim, realizou-se um ensaio de esterificao, nas condies estabelecidas na

Tabela 3.3, para a olena resultante da lavagem com bicarbonato de sdio. Os resultados da
evoluo de acidez so descritos na Tabela 4.21.
Tabela 4.21 Evoluo da acidez, aps lavagem com NaHCO3 (Olena de Sementes II; razo molar
cido: metanol 1:1,5; 5 % m/m enzima)
0 42,3
6,5 11,7
24 11,4
a)Expressa em cido oleico
Pela anlise da Tabela 4.21, verifica-se que com a lavagem de NaHCO3 em comparao
com o NaOH consegue-se atingir uma reduo de acidez semelhante, cerca de 82,6 %.
4.5 OTIMIZAO DAS CONDIES REACIONAIS DA ESTERIFICAO

Tal como indicado no subcaptulo 3.4.3, nesta fase foram realizados 16 ensaios com a
matria-prima Sementes II, nas condies descritas na Tabela 3.4.
Tendo em conta os ensaios preliminares, onde se verificou que a maior reduo ocorria
nas primeiras horas de reao, apenas se analisou a acidez s 7 h, confirmando assim os
resultados obtidos.
Os dados so apresentados de seguida, onde feita uma anlise relativa s variveis

otimizadas: i) concentrao de enzima, e ii) forma de adio de metanol.
A Figura 4.8 sumaria todos os resultados obtidos. Os valores obtidos em todos os casos
assim como os desvios associados encontram-se discriminados no Anexo C.
60
Acidez % m/m
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
A
60
Acidez % m/m
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
B
60
Acidez % m/m
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
C
60
Acidez % m/m
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
1 Frao 3 Fraes 6 Fraes 12 Fraes
D
Figura 4.8 - Evoluo da acidez com adio de metanol em fraes quando usadas diferentes
concentraes de enzima: A - 2 % (m/m); B 3% (m/m); C 4% (m/m); D 5% (m/m).
Como mostra a Tabela 4.1, a acidez inicial da olena de 65,5 %, pelo que o valor de
acidez correspondente ao tempo 0 h se deve ao processo de neutralizao com a soluo de
NaOH e ao efeito de diluio da mistura.
Os resultados mostram claramente que, nas condies estudadas, o efeito da

concentrao de enzima mais expressivo do que a alterao da forma de adio do metanol.
De facto, o efeito da adio repartida do metanol visvel para as menores concentraes de
enzima, sendo apenas expressivo aquando da utilizao de 3 % m/m de concentrao de
enzima, onde se verifica um efeito positivo ao adicionar o metanol em 3 ou mais partes (cerca
de 45 % de reduo de acidez comparativamente com 35 % de reduo da acidez sem adio
repartida). Contudo, os ensaios utilizando 2 ou 3 % de enzima foram insatisfatrios em termos
de reduo da acidez (redues entre 29 e 45 %), o que no justificar fazer a referida adio
repartida.
No que diz respeito s concentraes de 4 e 5 % m/m de enzima, verifica-se um efeito

desprezvel em realizar a adio do lcool em etapas, mas um efeito muito expressivo do
aumento da concentrao de enzima relativamente aos estudos anteriores, tendo os valores de
reduo da acidez variado entre 79,7 e 81,7 %.
Na Figura 4.9 sumariam-se os resultados de reduo da acidez nas diferentes condies

estudadas onde se apresentam claramente os efeitos comprovados relativamente s variveis
estudadas.
Tal como referido no captulo 2, Bernardes et al. (2007), Wang and Cao (2011), Babaki et
al. (2016) e Shimada et al. (1999) realizaram estudos com adio fracionada do lcool (3,7 m/m
de etanol em 3 fraes e 7 % m/m de enzima; razo molar leo: etanol 1:3 em 3 fraes e 5 %
m/m de enzima; razo molar leo: metanol 1:3 em 3 fraes e 3,8 % m/m de enzima; e razo
molar oleo: metanol 1:4 em 4 fraes e 4,15 % de enzima, respetivamente) onde conseguiram
atingir converses entre 60 99%. Tal como acontece na literatura referida, no trabalho
realizado apenas se conseguiram converses nessa gama ( cerca de 80 %) a partir de 4 % m/m
de concentrao de enzima.
A B
C D
Figura 4.9 - Reduo da acidez para as diferentes quantidades de enzima, quando adicionado o
metanol em diferentes fraes: A 1, B 3, C 6, D 12.
4.5.1 EFEITO DA ALTERAO DA RAZO MOLAR CIDO: METANOL
Adicionalmente, tal como indicado no subcaptulo 3.4.4 foi realizado um ensaio com o
dobro da razo molar testada anteriormente. Este volume foi adicionado em 2 fraes, de
forma a no se ultrapassar o valor da razo molar 1:1,5, uma vez que, como j foi referido,
elevadas quantidades de metanol podem inibir a enzima (Stergiou et al., 2013).
De acordo com a bibliografia consultada (Soares et al., 2013; Laura Azcar et al., 2016;
Babaki et al., 2016; Fridaus et al., 2016) utilizando uma razo molar cido: metanol 1:3
possvel atingir-se rendimentos superiores aos 80 %.
Com este ensaio pretendia-se testar se a razo molar cido: metanol usada nos ensaios
da otimizao foi insuficiente para a reao, e se com a adio ao fim das 7 horas de um
volume igual ao adicionado inicialmente, se alcanava uma reduo de acidez mais significativa.
Os resultados apresentam-se na Figura 4.10, estando detalhados no Anexo C.
Adicionando o dobro da razo molar, foi possvel obter uma reduo de acidez no valor
de 89,3 %, cerca de 9 % superior ao obtido nas condies estabelecidas inicialmente (razo
molar cido: metanol igual a 1:1,5).
Adio
60
metanol
50
40
Acidez % m/m
30 Adio
metanol
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
Figura 4.10 - Evoluo de acidez quando usado razo molar cido: metanol 1:3 adicionado em 2
fraes.
Como verificado pela Figura 4.10, nas primeiras 7 horas deu-se a maior reduo de
acidez (cerca de 80 %), o que confirma os valores obtidos anteriormente nas mesmas condies
de volume de metanol adicionado. O aumento da razo molar apenas acrescentou uma
reduo de acidez de cerca de 9 %, revelando que a partir das 7 horas a reao apresenta uma
velocidade de reao mais baixa.
Na Figura 4.11 encontra-se representado o produto final da reao de esterificao,

depois de efetuado um processo de centrifugao para separao dos produtos. Aps
separao de fases e pesagem do produto final, determinou-se o rendimento em produto
(Figura 4.11 III) de cerca de 90% m/m relativamente massa de olena.
Figura 4.11 - Produto final da esterificao: I - Aps centrifugao; II -

Funil de decantao com o produto final centrifugado; II - Produto final
aps se rejeitar a gua.
4.5.2 EFEITO DA ALTERAO DO LCOOL
Tal como indicado no subcaptulo 3.4.5 realizou-se um ensaio nas condies anteriores,
mas utilizando o etanol como lcool, com o objetivo de estudar se este beneficiaria a reao,
uma vez que est referenciado como menos txico para a enzima. Hernandez-Martn (2008) fez
a comparao numa reao de transesterificao de um leo de girassol com dois lcoois,
metanol e etanol, e indica que a desativao foi maior quando usado metanol do que com
etanol.
Os resultados apresentam-se na Figura 4.12 estando detalhados no Anexo C.
Adio
60 etanol
50
40
Acidez % m/m Adio
etanol
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (h)
Figura 4.12 - Evoluo de acidez quando usado razo molar cido: etanol 1:3 adicionado em 2
fraes.
Contrariamente ao que era expectvel, tal como se pode observar pela Figura 4.12 e
comparativamente com a Figura 4.10, o uso do etanol no trouxe nenhum benefcio para a
reao, tendo uma reduo de acidez inferior (81,7 %) relativamente ao ensaio nas mesmas
condies utilizando metanol. De realar uma maior variabilidade dos resultados obtidos, facto
que no foi possvel estudar em maior detalhe no decurso do presente trabalho.
4.6 DETERMINAO DO TEOR EM STERES METLICOS
Tal como j referido, a determinao do teor em steres metlicos foi realizada apenas
para o ensaio que apresentou uma maior converso de cidos gordos em steres, ou seja, o
que resultou dos resultados descritos no subcaptulo 4.5.1, que apresentou uma reduo de
acidez de 89,3 %.
Na Figura 4.13 encontra-se o cromatograma resultante da anlise. O pico C17:0

corresponde ao padro interno (metil-heptadecanoato) e os restantes correspondem aos
steres metlicos de cidos gordos presentes na amostra.
Depois de aplicado o processo de tratamento de dados, descrito no subcaptulo 3.5,

obteve-se um teor em steres metlicos de 68,4 % m/m com uma DRP associado de 0,6 %. Os
steres metlicos presentes na amostra encontram-se descritos na Tabela 4.22.
Figura 4.13 - Cromatograma resultante da anlise.
Tabela 4.22 - steres metlicos presentes na amostra e massas molares de cada ster
Ester metlico Composio % (m/m)

.
Palmtico (C16:0) 10,9
Esterico (C18:0) 3,81
Oleico (C18:1) 44,0
Linoleico (C18:2) 41,3
Sabendo que neste ensaio a massa de olena usada foi de 25,0 g e a percentagem inicial
de AGL foi 47,7 %, determinou-se a massa de AGL:
= 25 0,477 = 11,925
Admitindo que a massa molar de AGL correspondente massa molar do cido oleico,
determinou-se o nmero de moles de AGL:
11,925
= = 0,0423
282 1
Atravs da equao de esterificao, representada na Figura 2.7, sabe-se que uma mol
de AGL d origem a um ster. Assim, determinou-se o nmero de moles de steres e
consequentemente a sua massa. No clculo da massa molar dos steres considerou-se a massa
molar do ster de cido oleico (296,5 g mol-1).
= = 0,0423
= 0,0423 296,5 1 = 12,45
Como se pode verificar, a massa resultante de steres no difere muito da massa inicial
de cidos gordos livres pelo que o valor de percentagem obtido da anlise cromatogrfica
comparvel com a reduo de acidez obtida.
No entanto sabe-se, pela anlise no GC, que cerca de 68,4 % m/m do produto final so
steres, tendo em considerao que a acidez inicial era menor que este valor (65,5 % m/m) e
que se atingiu uma reduo de acidez de 89,3 %, conclui-se assim que no ocorreu apenas a
converso dos AGL, pelo que para alm de esterificao enzimtica ter tambm ocorrido
transesterificao de mono, di ou triglicridos presentes.
5 CONCLUSES E TRABALHOS FUTUROS
5.1 CONCLUSES
Na presente dissertao realizou-se o estudo da utilizao de olenas de pastas de
neutralizao de leos vegetais como matria-prima para produo de biodiesel, tendo-se
estudado o processo de esterificao enzimtica com a enzima pr-selecionada Novozym
40116 para reduo da acidez dos resduos. Os resultados mostraram ser vivel a realizao do
processo enzimtico para pr-tratamento dos resduos, sendo que se sumariam de seguida as
principais concluses dos estudos:
As olenas de pastas de neutralizao de leos vegetais apresentaram valores de acidez

na ordem dos 60 % m/m e teor de humidade na ordem dos 2 % m/m
independentemente da sua origem (misturas de refinao de diferentes leos ou de
leo de girassol);
O teor de enxofre das olenas diferiu significativamente, tanto na fase tal e qual como
nas fases separadas por centrifugao (3000 rpm, 3 min). Esta diferena nas
concentraes provavelmente deve-se a ajustes no processo de acidificao a que o
resduo sujeito;
A olena de mistura de sementes (sementes II) apresentou uma concentrao de fsforo

superior olena de girassol (313 e 52,4 ppm, respetivamente);
O pr-tratamento realizado por centrifugao apenas se mostrou eficiente para a olena

de girassol, por permitir a separao da maior parte do enxofre mineral na fase retida;
As condies timas referidas por Novozymes (2014) para a esterificao enzimtica

estudadas nos ensaios preliminares no revelaram resultados satisfatrios (redues na
ordem dos 10 16%);
O pr-tratamento com NaHCO3 leva a uma maior reteno de gua na fase orgnica
tornando-se menos vantajoso que a lavagem com NaOH;
O pr-tratamento definido como o ideal para viabilizar as matrias-primas para a

realizao da reao de esterificao enzimtica consiste numa nica lavagem com uma
soluo de NaOH de 750 ppm seguida de duas lavagens com gua destilada;
CONCLUSES E TRABALHOS FUTUROS 89

A adio fracionada de metanol apenas se mostrou vantajosa quando se usou 3 % m/m,

resultando contudo numa baixa reduo de acidez (45 %);
Foram estabelecidas as seguintes condies timas para o processo de esterificao:

temperatura de 35 C, agitao magntica vigorosa constante, 4 % m/m de enzima,
razo molar cido: metanol de 1:1.5 e um tempo de reao de 24 horas, sendo que ao
fim de 7 horas de reao a maioria da reduo de acidez conseguida.
Estudos complementares mostraram que:
o A utilizao de etanol em vez de metanol no apresenta nenhuma vantagem na

reao de esterificao;
o O aumento da razo molar cido: metanol para 1:3 com adio do lcool em 2
fraes permite um aumento de 9 % de reduo de acidez, face s condies
estabelecidas como timas (89,3 %) em 24 horas utilizando as condies de 5 %
m/m de enzima, T = 35C e agitao magntica vigorosa. O rendimento em
produto obtido neste processo foi cerca de 90 % m/m.
5.2 TRABALHOS FUTUROS
De seguida apresentam-se alguns aspetos a ter em considerao para trabalhos futuros:
Realizar uma caracterizao das olenas por forma a determinar o seu teor em
triglicridos, diglicridos e monoglicridos;
Avaliar a aplicabilidade do processo desenvolvido a outras matrias-primas residuais;
Implementar as melhores condies estabelecidas escala piloto na empresa;
Otimizar o processo tendo em conta outras variveis, tais como: temperatura e tipo de
enzima;
Otimizar a determinao da acidez por um processo mais expedito: espectroscopia de

infravermelho (FTIR);
Complementar a monitorizao da reao ao longo do tempo com a determinao do

teor de steres metlicos;
Realizar o processo de transesterificao alcalina ao produto final e caracteriz-lo tendo

em conta o estabelecido na norma de qualidade do biodiesel EN 14214.
CONCLUSES E TRABALHOS FUTUROS 90

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Mercado de Biocombustveis em Portugal: A atuao da ENMC desde abril de 2015. Retrieved
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ANEXO A - ENSAIO DE DETERMINAO DA ATIVIDADE DA
ENZIMA
O procedimento realizado no ensaio de determinao da atividade da enzima segue

descrito de seguida:
1. Determinar o valor de acidez do leo vegetal;

2. Adicionar 10 mL de leo vegetal e 10 mL de gua destilada num balo Erlenmeyer
esmerilado de 100 mL;
3. Colocar na incubadora a 35C, e esperar que a temperatura estabilize;
4. Adicionar 1 mL de glicerol;
5. Adicionar 5 % m/m de enzima;
6. Com agitao magntica vigorosa, manter a reao durante 1 hora;
7. Determinar o valor de acidez de uma amostra no final da reao.
ANEXO A 99
ANEXO A 100
ANEXO B - ENSAIO DE NEUTRALIZAO COM NAOH
O procedimento realizado no ensaio de neutralizao segue descrito de seguida:
1. Pesar 100g de olena em seis bales erlenmeyer esmerilados de 250 mL;

2. Colocar os seis reatores na incubadora a uma temperatura de 35C;
3. Iniciar a agitao magntica vigorosa em todos os seis bales;
4. Adicionar as diferentes quantidades de gua destilada (Tabela B.1), para cada um dos
seis bales;
Tabela B. 1 - Diferentes quantidades de NaOH e gua destilada para os 6 reatores
Reator 1 2 3 4 5 6
NaOH (ppm) 0 50 100 200 400 800
NaOH 4 % (m/m) [mL] 0 0,130 0,260 0,520 1,040 2,080
gua destilada (mL) 5 4,870 4,740 4,480 3,960 2,920
5. Adicionar as vrias quantidades de NaOH (4 % m/m);

6. Adicionar 10 ml de metanol a cada balo;
7. Adicionar 1 mL de enzima para cada reator e selar a tampa;
8. Manter a velocidade de agitao do reator e a temperatura constante durante 1 hora;
9. Aps 1 hora, extrai-se 2-4 ml de amostra de cada uma das seis reaes;
10. Imediatamente aquecer as amostras a 80 C durante 5 minutos para parar a reao
enzimtica
11. Aps a inativao da enzima, centrifugar as amostras durante 5 minutos a 3000 rpm;
12. Aps a centrifugao, extrair amostras da fase oleosa e determinar o valor de acidez,
em cada uma das seis amostras;
ANEXO B 101
ANEXO B 102
ANEXO C RESULTADOS OBTIDOS NA OTIMIZAO DAS
CONDIES REACIONAIS DE ESTERIFICAO
De seguida so apresentadas as Tabelas D.1 D.6 que resumem os resultados obtidos

para a evoluo da acidez nos diferentes ensaios realizados na otimizao das condies
reacionais de esterificao.
Tabela D. 1 - Evoluo da acidez para as diferentes formas de adio de metanol (razo molar cido:
metanol 1:1,5; 2 % (m/m) de enzima)
Acidez a) % (m/m)
Tempo Forma de adio de metanol
(h) DRP b) DRP b) DRP b) DRP b)
(%) (%) (%) (%)
0 48,8 1,8 47,7 4,4 49,7 2,1 50,8 2,5
7 45,9 1,0 45,2 0,3 45,8 4,5 44,2 2,7
24 46,3 3,5 46,1 1,8 45,3 3,2 43,4 5,5

Acidez a) % (m/m)
(h) 1 DRP b) 3 DRP b) 6 DRP b) 12 DRP b)
Frao (%) Fraes (%) Fraes (%) Fraes (%)
0 47,2 1,7 50,2 4,1 50,1 2,7 50,6 3,1
7 41,8 1,0 34,4 3,3 36,3 5,8 35,8 3,0
24 42,7 5,3 35,5 0,1 39,6 6,6 36,1 5,9
ANEXO C 103
Acidez a) % (m/m)
(%) (%) (%) (%)
0 47,7 1,1 49,4 0,6 49,8 1,3 51,9 1,2
7 13,4 6,3 13,2 4,2 16,4 4,0 15,5 1,6
24 12,6 6,3 12,3 1,3 12,6 5,2 13,3 2,8
Acidez a) % (m/m)
(%) (%) (%) (%)
0 46,2 7,4 47,7 1,3 53,1 4,3 51,9 3,3
7 12,8 1,1 12,4 4,2 15,4 1,6 13,4 8,2
24 12,1 0,1 11,8 0,6 12,0 10,6 13,3 5,1
Tabela D. 5 - Evoluo da acidez para a olena de sementes II (razo molar cido: metanol 1:3; 5 %
(m/m) de enzima)
0 47,7 1,3
7 12,7 1,2
24 7,0 1,7
ANEXO C 104
Tabela D. 6 - Evoluo da acidez para a olena de semente II (razo molar cido: etanol 1:3; 5 % (m/m)
de enzima)
Tempo de reao
Acidez a) % (m/m) DRP b) (%)
(h)
0 46,9 1,4
7 14,9 7,6
24 12,0 7,8
ANEXO C 105

Estudio Enzimas - Novozymes

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MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA DO AMBIENTE 2015/2016

MATRIAS-PRIMAS SUSTENTVEIS PARA PRODUO DE BIODIESEL:

MARIANA DE SOUSA CRUZ

Dissertao submetida para obteno do grau de

MESTRE EM ENGENHARIA DO AMBIENTE

Coorientador acadmico: Slvia Cardinal Pinho

Orientador na empresa: Ricardo Mota

Gostaria de agradecer igualmente Professora Slvia Pinho, minha coorientadora

Ao Emanuel e ao Joab, meus colegas no Laboratrio de Engenharia de Processos,

Ju porque mesmo cansada de me ouvir falar vezes sem conta da esterificao

A presente dissertao pretende contribuir para a produo de biocombustveis sustentveis a partir

As olenas estudadas apresentaram valores de acidez na ordem dos 60 % m/m e um teor de

ABSTRACT ................................................................................................................... VII

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ XIII

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ XV

LISTA DE SIGLAs ............................................................................................................ xix

1.1 ENQUADRAMENTO E APRESENTAO DO ESTUDO ..............................................21

1.2 OBJETIVOS .......................................................................................23

1.3 ESTRUTURA DO DOCUMENTO ....................................................................23

2 ESTADO DA ARTE ......................................................................................25

2.1 A SITUAO DOS BIOCOMBUSTVEIS EM PORTUGAL .............................................25

2.2 O BIODIESEL ......................................................................................30

2.2.1 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO BIODIESEL ........................................................... 32

2.2.2 REAO DE TRANSESTERIFICAO ...................................................................... 33

2.2.3 REAO DE ESTERIFICAO ............................................................................. 36

2.3 PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL ..........................................................37

2.3.1 AS LIPASES COMO BIOCATALISADORES .................................................................. 38

2.3.2 REVISO BIBLIOGRFICA SOBRE ESTERIFICAO ENZIMTICA .......................................... 39

2.4 A MATRIA-PRIMA: OLENA ......................................................................45

3 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................49

3.1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA ..........................................................50

3.1.1 NDICE DE ACIDEZ E ACIDEZ ............................................................................. 50

3.1.2 TEOR DE HUMIDADE ..................................................................................... 51

3.1.3 TEOR DE ENXOFRE ...................................................................................... 51

3.2 ATIVIDADE DA ENZIMA ...........................................................................52

3.3 PR-TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA ..........................................................52

3.3.1 CENTRIFUGAO ........................................................................................ 52

3.3.2 NEUTRALIZAO DA MATRIA -PRIMA ................................................................... 53

3.4 ENSAIOS DE ESTERIFICAO ENZIMTICA........................................................55

3.4.1 ENSAIOS PRELIMINARES ................................................................................. 56

3.4.2 ENSAIOS DE PR -TRATAMENTO DA MATRIA-PRIMA ..................................................... 57

3.4.3 OTIMIZAO DAS CONDIES DE ESTERIFICAO ENZIMTICA.......................................... 58

3.4.4 EFEITO DA ALTERAO DA RAZO MOLAR CIDO: METANOL ........................................... 59

3.4.5 EFEITO DA ALTERAO DO LCOOL ..................................................................... 59

3.5 DETERMINAO DO TEOR EM STERES METLICOS ..............................................59

4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................61

4.1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA ..........................................................61

4.1.1 ACIDEZ .................................................................................................. 61

4.1.2 TEOR DE HUMIDADE ..................................................................................... 61

4.1.3 TEOR DE ENXOFRE ...................................................................................... 63

4.1.4 TEOR DE FSFORO ...................................................................................... 65

4.2 ATIVIDADE DA ENZIMA ...........................................................................66

4.3 ENSAIOS PRELIMINARES ..........................................................................67

4.4 PR-TRATAMENTO DA MATRIA -PRIMA ..........................................................70

4.4.1 CENTRIFUGAO ........................................................................................ 70

4.4.2 NEUTRALIZAO DA MATRIA -PRIMA ................................................................... 71

4.5 OTIMIZAO DAS CONDIES REACIONAIS DA ESTERIFICAO .................................79

4.5.1 EFEITO DA ALTERAO DA RAZO MOLAR CIDO: METANOL ........................................... 82

4.5.2 EFEITO DA ALTERAO DO LCOOL ..................................................................... 84

4.6 DETERMINAO DO TEOR EM STERES METLICOS ..............................................85

5 CONCLUSES E TRABALHOS FUTUROS.................................................................89

5.1 CONCLUSES .....................................................................................89

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................91