MICROPROPAGACIN

1. Introduccin.
La microspropagacin consiste en la propagacin de un genotipo a gran
escala a travs del empleo de tcnicas de cultivo in vitro.
El cultivo es una herramienta para el mejoramiento ya que se producen
plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo
selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada.
Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas
vegetales, esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando
estn sujetas a estmulos adecuados.
As las clulas somticas de cualquier tejido podran formar tallos, races o
embriones somticos de acuerdo con la competencia que posean y al
estmulo que reciban.
Esta regeneracin ocurre en fases consecutivas:

- Fase de desdiferenciacin, donde las clulas se vuelven

competentes para responder a cualquier estmulo organogentico
o embriogentico.
- Fase de induccin, donde las clulas se determinan para formar un
rgano o un embrin.
- Fase de realizacin. Donde se forma el rgano o embrin
propiamente dicho.
Estas fases estn directamente afectadas por el balance hormonal del medio
de cultivo. As en general puede decirse que el proceso de desdiferenciacin
generalmente es promovido por una auxina, la de induccin por un balance
hormonal especfico del rgano que va a formarse y la de realizacin por
una disminucin de la concentracin hormonal en el medio de cultivo.

2. Etapas de la micropropagacin

2a. Etapa 0. Preparacin del material vegetal.

Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son

1. El tipo de rgano que sirve como explanto

 2. La edad ontogentica y fisiolgica del mismo. Los rganos jvenes
o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el
establecimiento que los obtenidos de materiales adultos.
3. La estacin en la que se colecta el material. Se recomienda la
recoleccin durante la estacin estival o primaveral, cuando existe
una brotacin activa de las yemas, el uso de yemas en dormicin
ocasiona problemas de contaminacin.
4. El tamao.
5. El estado sanitario general de la planta donante. Es recomendable
hacer crecer las plantas donantes en invernaderos con el fin de
controlar el estado sanitario.

2b. Etapa 1. Establecimiento del cultivo

El objeto de esta etapa es establecer cultivos viables y axnicos. El xito

depende de:

- La edad de la planta donante

- La edad fisiolgica
- El estado del desarrollo
- Tamao del explanto

Los materiales que muestran tener mayor capacidad regenerativa son los
obtenidos de tejidos meristemticos jvenes, sean yemas axilares o
adventicias, embriones o semillas en plantas herbceas y tejido
meristemticos que como el cambium determinan el crecimiento en grosor
de las plantas leosas.
Las yemas adventicias (yemas formadas de novo) tienen una mayor tasa de
variacin somaclonal en cultivo.
Para asegurar las condiciones de esterilidad del cultivo se pueden hacer a
priori anlisis que detecten patgenos (ELISA, PCR).
En el momento de manejar el explante se procede a la desinfeccin del
mismo (etanol, hipoclorito de Na).
Una vez establecido el cultivo, la aparicin de hongos y bacterias puede
hacer necesario la utilizacin de fungicidas y antibiticos.

2c. Etapa 2. Multiplicacin

El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes
para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos y poder destinar parte de
ellos a la siguiente etapa de produccin (enraizamiento, bulbificacin, etc.)
En esta etapa es conveniente evitar la formacin de callo para evitar la
variacin somaclonal.
En esta etapa los medios de cultivo, los reguladores del crecimiento como
auxinas, giberelinas y citoquininas y las condiciones de crecimiento juegan
un papel muy importante sobre la multiplicacin clonal de los explantos.
Existen dos vas de regeneracin, ambas pueden darse directa o
indirectamente a travs de la formacin de callo:

- Organognesis. Mediante la induccin de yemas axilares o

adventicias.
- Embriognesis
La embriognesis somtica es una va ms conveniente porqu permite
saltar las etapas de formacin de yemas y enraizamiento, regenerando
plantas de una forma ms rpida y eficiente, disminuyendo adems el
riesgo de variacin somaclonal y adems disminuye costos para su
implementacin a escala comercial.
Los principales problemas de esta etapa son la vitrificacin y la acumulacin
de compuestos fenlicos.
Las condiciones culturales en las que crece el explanto son el resultado de
la interaccin de tres factores:

- El estado del explanto o material vegetal (determinado en parte por el

medio de cultivo)
- El recipiente de cultivo
- Condiciones del cuarto de cultivo

La capacidad de respuesta de los explantos a un mismo medio de cultivo

cambia con:

- El nmero de subcultivos
- El tipo de explanto subcultivado
- Mtodo de repique.

Por esto mismo el medio de cultivo debe optimizarse a fin de lograr la

mayor tasa de multiplicacin vegetativa. Comnmente se usa como medio
basal el MS complejo (Murashige and Skool, 1962) suplementado con un
30% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan
auxinas y citoquininas.
La etapa de multiplicacin comprende dos periodos

- Fase de induccin. Implica el empleo de altas concentraciones de

reguladores del crecimiento (generalmente de auxinas ms que de
citoquininas), para favorecer la desdiferenciacin
- Fase de multiplicacin propiamente dicha. Requiere un balance
hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciacin
y multiplicacin celular(en este caso el sistema es ms dependiente de
citoquininas).

2d. Etapa 3. Enraizamiento y aclimatacin

En esta etapa se produce la formacin de races adventicias ms fcilmente

en las herbceas que en las leosas dada su limitada capacidad rizognica.
Puede realizarse el enraizamiento in vitro o ex vitro.
In vitro:

-Sustrato: medio solidificado con agar, perlita o vermiculita humedecidos

en medio nutrtivo o H 2 O
- Auxinas: promueven rizognesis a concentraciones elevadas. La ms
utilizada es el IBA (cido 3-indolbutrico) a concentraciones de 1-10 M
unas pocas horas (altas concentraciones de auxinas pueden inducir la formacin de callo
por lo que para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizognesis).
Posteriormente se transfieren los vstagos a un medio sin reguladores de
crecimiento para permitir el desarrollo de las races. Aproximadamente a los
20 das se observan una cantidad adecuada de races funcionales que
permiten que se contine con la etapa de aclimatacin.

Ex vitro: Permite enraizamiento y aclimatacin simultaneamente. Sin

embargo el estrs debido a la evapotranspiracin acelerada de las plantas
en las primeras etapas de l transplante pueden reducir mucho se
supervivencia.
Se utilizan distintos sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos que
convienen que estn esterilizados. La aclimatacin debe llevarse a cabo en
invernaderos o cmaras con temperatura y humedad relativa moderadas.
 Cultivo in vitro
Definicin

Cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estriles, de plantas,

semillas, embriones, rganos, tejidos, clulas y protoplastos, debido a la
propiedad de totipotencia de las clulas vegetales.

ETAPAS DEL CULTIVO IN VITRO

1. ELECCIN DEL EXPLANTE
2. PREPARACIN MEDIO DE CULTIVO
3. DESINFECCIN EXPLANTE, MEDIO Y MATERIALES
4. CULTIVO DEL EXPLANTE EN SU MEDIO EN CONDICIONES DE
ASPSIA
5. DESARROLLO DEL CULTIVO EN CMARA EN CONDICIONES
DETERMINADAS

1. Preparacin del medio de cultivo.

Los alumnos prepararn medio ACM de enraizamiento, siguiendo el
protocolo facilitado y a partir de soluciones madres ya constituidas. Una vez
preparado lo distribuirn en vasos de cultivo que sern precintados y
envueltos en papel para su siguiente esterilizacin.

2. Cultivo del explante en su medio

- Cultivo de ajo en un medio MS + 2,4, D con el fin de obtener callo

para saneamiento vegetal
- Germinacin de semillas de Jatropha en un medio MS 50% sales.
- Medio ACM de proliferacin. Para chopo.
- Medio ACM de enraizamiento. Para chopo.
- Medio MS de proliferacin donde se cultivar Paulonia.