Agentes Físicos

AGENTES FSICOS
1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS
2 EFECTO DE LA TEMPERATURA
2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS
2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOS
2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOS
2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOS
2.3 EFECTO LETAL DEL CALOR
2.3.1 CALOR HMEDO
2.3.2 CALOR SECO
2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS
3 LIOFILIZACION
4 EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS
5 EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS
5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULAS
5.2 EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES
5.3 EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA
5.3.1 FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV
5.3.2 MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS
5.3.3 APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV
5.4 EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE
6 EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS
7 EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA
8 EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA
9 EFECTO DEL pH
1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS
Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas procariticas sufren los
cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que las clulas de los organismos
pluricelulares. A lo largo de miles de millones de aos, los procariotas han venido estando sometidas
a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos
de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes
extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es
la vida normal, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo cmodamente a
pHs muy cidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproducindose a
temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan
medios que los humanos consideramos como extremos reciben el calificativo de extremfilos. En
este captulo veremos algunas de estas notables adaptaciones.
Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su

fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas).
Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores
ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que
1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de

dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;
2) condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales;
3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de

parmetros para:
a) la mutagnesis,
b) la esterilizacin y desinfeccin,
c) la quimioterapia.
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As,
unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser
neutras o beneficiosas para otra.
Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los
efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden
simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la hubiera) o de
reproduccin.
Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:
Agentes fsicos (tema 13) Agentes qumicos (tema 14)
Temperatura Desinfectantes y antispticos
Desecacin Quimioterpicos de sntesis
Radiaciones Antibiticos
Ondas sonoras
Presin hidrosttica
Presin osmtica
pH
2 EFECTO DE LA TEMPERATURA
2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
La temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos.
La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de

generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten
constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en funcin de la temperatura,
donde podemos distinguir tres puntos caractersticos llamados temperaturas cardinales:
Temperatura mnima: por debajo de ella no hay crecimiento;

Temperatura mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento;
Temperatura ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo).
El margen entre la temperatura mnima y la mxima se suele llamar margen de crecimiento, y en
muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.
La temperatura mnima se puede explicar en funcin de un descenso de la fluidez de la

membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes y el gradiente de
protones.
Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando

proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, debido a que las reacciones metablicas
catalizadas por enzimas se van aproximando a su ptimo. En dicha temperatura ptima las enzimas y
reacciones se dan a su mxima tasa posible.
A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un
descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura mxima. Dicha
temperatura refleja desnaturalizacin e inactivacin de protenas enzimticas
esenciales, colapsamiento de la membrana citoplsmica y a veces lisis trmica de la bacteria.
Obsrvese en el grfico que la temperatura ptima est ms cerca de la mxima que de la mnima.
2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS
Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo que una
bacteria puede presentar una temperatura ptima superior a la temperatura mxima de otra, o
inferior a la temperatura mnima de una tercera. Segn el rango de temperaturas al que pueden
crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales:
2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOS
Las psicrfilas o crifilas: crecen a partir de entre -5 a 5C.
a) Las llamadas psicrfilas obligadas tienen temperatura ptima a 15-18C, como por
ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas
de la Antrtida es lo que pudiramos llamar un psicrfilo extremo: tiene su ptimo de crecimiento en
4C, y es incapaz de crecer a 14C (se muere de calor!).
b) Las psicrfilas facultativas o psicrotolerantes (tambin llamadas psicrotrofas) presentan

temperatura ptima en torno a los 20-30C y mximas a los 35C. Las bacterias y hongos psicrotrofos
son los responsables de que los alimentos guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo.
Ejemplos de medios permanentemente fros son la mayor parte de las aguas ocenicas (cuya
temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan slo 1-2C por encima de
cero) y las reas permanentemente heladas del rtico y de la Antrtida. En los medios helados
existen pequeas bolsas o microcavidades de agua lquida, donde pueden medrar algunos
microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muy caracterstico es el alga de las
nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de
montaa a mitad de la estacin estival.
Las principales adaptaciones bioqumicas a medios fros exhibidas por estos microorganismos
psicrfilos son:
enzimas ms resistentes al fro;

sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas;
los fosfolpidos de la membrana celular aumentan la proporcin de cidos grasos insaturados (y en
algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces); ello supone que la membrana
sigue en su estado semifluido, evitndose su congelacin.
Los psicrotrofos (psicrfilos facultativos) son ms abundantes, ya que estn adaptados a
soportar grandes oscilaciones trmicas, y en verano pueden crecer a unos 30C-40C. Algunas
bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y hortalizas) que se guardan en
frigorficos, alterando las cualidades organolpticas e incluso, echndolos a perder (una experiencia
que casi todos hemos tenido).
2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOS

Los mesfilos presentan temperaturas ptimas a los 25-40C y mximas entre 35 y 47C. La
mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patgenas) pertenecen a esta categora. La mayor
parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y tropicales, incluyendo los
simbiontes y parsitos, pertenecen a esta categora.
2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOS
Las nicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65C son todas procariotas.
Los termfilos presentan ptimos a 50-75C y mximos entre 80 y 113C. Dentro de esta categora se
suele distinguir las termfilas extremas (=hipertermfilas), que pueden llegar a presentar ptimos
cercanos a los 100C, y que taxonmicamente pertenecen al dominio de las Archaea.
Los hbitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima de 45-50C)
estn restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente relacionadas con fenmenos
volcnicos:
fuentes termales volcnicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japn, Nueva Zelanda e Islandia);
fuentes termales submarinas: los llamados humeros (fumarolas hidrotermales) asociados a las
grandes dorsales ocenicas);
fumarolas
Los materiales en fermentacin como acmulos de abono (compost) y ensilados pueden alcanzar
65C.
Como ejemplo clsico, muy conocido por documentales de divulgacin, recordemos que en el
famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentracin mundial de fuentes
volcnicas, con giseres que emiten a ms de 100 oC, siendo esta temperatura bastante constante, con
oscilaciones de +/- 1 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullicin. El riachuelo que
genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente de
temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas
diversas temperaturas. All fue donde T.D. Brock descubri la eubacteria termfila Thermus aquaticus,
de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente (Taq) empleada en la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) automatizada. Recientemente se est recurriendo a usar la polimerasa de una
arquea hipertermfila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100C.
Los hipertermfilos, con ptimos por encima de los 80C son de hecho incapaces de crecer a
menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La
arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su ptimo nada
menos que a 105C y puede llegar a aguantar 113C, y parece que detiene su metabolismo (por
fro) a la agradable temperatura de 90C (!).
Las termfilas facultativas pueden crecer a menos de 37C, como p. ej. la eubacteria Thermus
aquaticus.
Se han aislado bacterias termfilas en medios artificiales, como calentadores de agua
domsticos e industriales.
Las principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas en clulas vegetativas

bacterianas son:
enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrfobo;

ribosomas termorresistentes;
membranas ricas en cidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofbicos ms fuertes.
En Arqueas hipertermfilas los lpidos son muy especiales: en vez de basarse en steres de cidos
grasos con el glicerol, se trata de teres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace ter es ms
resistente). Algunas, adems, en vez de la tpica bicapa lpdica, exhiben una monocapa
bioqumica de C40-bifitanil-tetrateres (resultado de unirse cola con cola dos C 20-fitanil-diteres),
que condicionan una extrema resistencia a agentes ambientales. (repasar tema 6).
2.3 EFECTO LETAL DEL CALOR
Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir

los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces
de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idneo. La muerte por calor es una
funcin exponencial de primer orden:
dN/dt = -KTN
O sea, y como se puede constatar en el grfico adjunto, la accin del calor supone la muerte de una
fraccin constante (KT) de la poblacin sobreviviente en cada momento.
La cintica de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la muerte se debe
a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como p. ej. el ADN
cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana).
Cmo podemos caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de una suspensin
bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados:
tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de
una determinada suspensin a una determinada temperatura;
tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la
suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D);
punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo
determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).
Ejemplos
punto trmico mortal Especies

55oC Escherichia coli
60oC Mycobacterium tuberculosis

120oC endosporas de especies muy resistentes de Bacillus.
Estos tres parmetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en las de

fabricacin de conservas, centrales lecheras, etc.
Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el

tiempo a que sometamos un material a tratamiento trmico, lograremos inactivacin parcial de la
poblacin microbiana (es decir, queda una fraccin de clulas viables) o bien esterilizacin
(=inactivacin total).
En general, entendemos por esterilizacin todo tratamiento de un material con un agente

fsico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o qumico (como veremos en el captulo 14)
que acarrea la eliminacin de toda forma de vida en l. Una vez estril, el material sigue estril
indefinidamente con tal de que est encerrado en un compartimento estanco, sellado y libre del
contacto con microorganismos del ambiente exterior.
Centrndonos de nuevo en el calor, la inactivacin parcial o la esterilizacin se pueden lograr por

calor hmedo o por calor seco.
La inactivacin (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalizacin de protenas y a la

fusin de lpidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces dbiles, sobre todo los
puentes de hidrgeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlaces se rompen ms fcilmente por calor
hmedo (en atmsfera saturada de vapor de agua), debido a que las molculas de agua pueden
desplazar a los puentes de hidrgeno.
2.3.1 CALOR HMEDO
Por lo tanto, la inactivacin por calor hmedo requiere menores temperaturas que la que se
realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones de inactivacin total por calor
hmedo:
Microorganismo condiciones
La mayora de clulas vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos 80oC , 5-10 min
Bacilo tuberculoso 58oC , 30 min
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC , 60 min
La mayora de esporas de bacterias patgenas 100oC , pocos min
esporas del patgeno Clostridium botulinum 100oC , 5,5 horas
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC , muchas horas
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC , 15 minutos
Veamos los mtodos principales de lograr esterilizacin de materiales por calor hmedo:
Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentar muestras por
calor hmedo a temperaturas superiores a las de ebullicin del agua (sin que sta hierva), debido a
que el tratamiento se efecta en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a
presiones superiores a la atmosfrica. (El funcionamiento del autoclave ser oportunamente
explicado en clases prcticas). Los parmetros de esterilizacin suelen ser: temperatura 121C y 10-
15 min. Como se puede deducir, estos parmetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de
especies saprofitas (ver ltima lnea de la tabla anterior), que son las formas de vida que ms
aguantan el calor sin perder viabilidad.
(Hay que tener en cuenta que, en la prctica, a veces hay que emplear condiciones diferentes; por
ejemplo: si queremos esterilizar grandes volmenes de lquido, habr que prolongar el tratamiento,
30 o 40 min, ya que el centro del recipiente donde va el lquido tarda ms en alcanzar la temperatura
de esterilizacin. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a 115 oC, ya que a
temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en estas ocasiones, el tiempo tambin
es mayor: 30 min).
La accin rpida del calor hmedo depende en buena parte del alto valor de calor latente del
agua (540 calg-1); ello hace que los objetos ms fros (como las muestras a esterilizar) se calienten
rpidamente por condensacin de agua en su superficie.
Tindalizacin (nombre en honor de John Tyndall): Es un mtodo de esterilizacin fraccionada para

materiales que se inactivan o estropean a ms de 100C. Consiste en someter el material a varios
ciclos (normalmente 3 4) de dos fases sucesivas cada uno:
a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100C, durante 1 2

horas;
b) en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37C durante 24 horas.
Durante las fases de tipo a) mueren todas las clulas vegetativas de la muestra, pero
permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se
produce la germinacin de las esporas activadas en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de
tipo a) morirn las clulas vegetativas procedentes de la germinacin en la fase anterior; y as
sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningun microrganismo en la
muestra.
Como se puede ver, este mtodo es bastante engorroso y consumidor de tiempo, por lo que
en los ltimos aos ha sido reemplazado por otro mtodo de esterilizacin, aunque ya no
dependiente del calor: se trata de la esterilizacin por filtracin. Consiste de hacer pasar una solucin
a travs de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que
presenta poros de un tamao inferior al de cualquier clula bacteriana (dimetro de poro =0,22 mm).
Aplicaciones principales del calor hmedo:
1. En la prctica cotidiana del laboratorio de microbiologa, en la esterilizacin de medios de

cultivo y soluciones.
2. En la esterilizacin de material quirrgico.
3. En la esterilizacin o inactivacin parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y

derivados).
a) En la industria lctea se emplean como mtodos de esterilizacin la llamada uperizacin.

La uperizacin o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de calor hmedo donde se emplean
temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. ej.: 135-150C durante 1-2 seg).
b) Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los
posibles microorganismos patgenos que pueden contaminarla, y que son ms sensibles al calor que
los saprfitos inofensivos. Con esta inactivacin parcial de la poblacin microbiana de la leche
logramos que sta se conserve durante unos das, sin alterar apenas sus cualidades organolpticas y
nutricionales. He aqu los procedimientos ms habituales para conseguir esto:
i. La pasteurizacin (en honor a Pasteur, que la introdujo en los aos 1860) consiste en tratar la
leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfra y envasa rpidamente.
ii. La pasteurizacin instantnea (tambin conocida por sus siglas en ingls HTST, de high
temperature-short time) se logra calentando a 72C durante slo 15 segundos, tras de lo cual la
muestra se enfra rpidamente. Esta tcnica es la ms usada actualmente, ya que:
mata ms rpidamente;
mata mejor organismos ms resistentes;
altera menos el sabor;
acta en flujos continuos (y permite procesar grandes volmenes de leche).
Tras la pasteurizacin, el nmero de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales
patgenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc) son
eliminados fcilmente. La pasteurizacin tambin se emplea para la preparacin de vacunas a base
de microorganismos inactivados por el calor.
2.3.2 CALOR SECO
Como ya dijimos, la esterilizacin por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que
la efectuada por el calor hmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrgeno y la
desnaturalizacin de protenas, as como la fusin de membranas, se efectan a mayores energas.
Otros efectos del calor seco son los daos por oxidacin y el provocar un aumento de la
concentracin de electrolitos.
Aplicaciones del calor seco:
1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170C durante 2-3 horas permite
esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metlico, aceites
y jaleas, etc.
2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metlicas de siembra, con las que se inoculan las
bacterias.
3. Incineracin de materiales de desecho.
2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS
Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mnima) no son tiles para la
esterilizacin, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelacin (p. ej., especies
patgenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo,
bacteriosttico, sin contar aquellos organismos psicrfilos o psicrotrofos.
Los efectos de someter una suspensin bacteriana a temperaturas menores de 0C dependen

de:
el medio donde estn suspendidas las bacterias;

el modo en que se realice la congelacin y una ulterior descongelacin.
Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelacin del medio, el
citoplasma queda en sobrefusin (sin congelar) entre -1 y -10C. Pero como la tensin de vapor de
agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio, que
puede ser:
por prdida de agua de la clula (cuando la congelacin se efecta lentamente), o bien
por cristalizacin de agua en el interior (cuando la congelacin se realiza rpidamente).
En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que supone que la
solucin del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitacin de sales. Ello conlleva varias
consecuencias: los cristales de sales y la alta concentracin de electrolitos provocan
la desnaturalizacin de protenas y daos a la membrana; otro efecto de menor importancia es
el dao mecnico a la pared celular y a la membrana provocado por los cristales de hielo.
En general, el enfriamiento rpido es ms lesivo que el lento, existiendo una velocidad

ptima. Cuando una bacteria se enfra rpidamente a -35C se producen cristales de hielo que
provocan daos cuando la muestra se descongela.
Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la descongelacin, y

el nmero de ciclos de congelacin-descongelacin. La descongelacin lenta es ms letal que la
rpida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo.
Aplicaciones de la congelacin:
La congelacin se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas durante largos

periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de maximizar la viabilidad bacteriana el
mayor tiempo posible, es importante cmo se efecta tanto la congelacin como la descongelacin.
Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo,
siempre que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutctico:
en nieve carbnica (CO2 slido), a -78C;

en nitrgeno lquido, a -180C.
Por ello, este mtodo es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas
temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbnica o nitrgeno lquido es que hay que
reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay mtodos menos engorrosos y
caros de mantener viables muestras microbianas durante largos periodos de tiempo.
Para preservar an mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a aadir a la

suspensin ciertas sustancias, como por ejemplo:
Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificacin amorfa y vtrea, en
lugar de la cristalizacin, evitando as la formacin de zonas intracelulares con alta concentracin
de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfxido (DMSO).
Materiales ricos en protena: leche, suero, extracto de carne.
Protenas purificadas (p. ej., la albmina).
Determinadas macromolculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.
La suspensin bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas sustancia entre
-25 a -30C, en congelador. Si se hace con nitrgeno lquido, la conservacin puede ser de varios
aos.
3 LIOFILIZACION
La liofilizacin es la desecacin al vaco de una muestra previamente congelada. Aplicada a

bacterias, es uno de los mtodos que mantiene por ms tiempo la viabilidad bacteriana (varios aos).
Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (vase epgrafe anterior), se congela
sobre nieve carbnica (-78C), y se conecta a una bomba de vaco, que provoca la desecacin. La
eliminacin de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la viabilidad de sta, que se guarda
en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente, hasta su uso, que como vemos, puede ser
incluso muchos aos despus.
4 EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS
La desecacin al aire (sin vaco) mata a las clulas vegetativas bacterianas, pero no a las
endosporas. La sensibilidad a la desecacin vara de una especie a otra. Ejemplos:
Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia de luz),
de ah que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos.
En cambio, el vibrin colrico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de slo dos horas.
Las causas de la muerte son, principalmente:
el aumento de concentracin intracelular de sales, lo que conlleva efectos txicos y

desnaturalizantes de protenas;
daos por oxidacin.
La mayor eficacia de la desecacin al aire se logra con 50% de humedad relativa.
5 EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS
5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULAS
Se puede definir la radiacin como la propagacin de energa por el espacio. Los principales
tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:
radiacin electromagntica l (longitudes de onda, en nm)
radiacin infrarroja (IR) 800-106
radiacin visible 380-800
ultravioleta (UV) 13,6-380
rayos X 0.14-13.6
rayos g 0.001-0.14
rayos csmicos < 0.001
Los efectos derivados de la absorcin de radiacin dependen de:
la energa de la radiacin absorbida;

la naturaleza del material.
1) Si la energa es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los rayos g (estos
ltimos se emiten como resultado de la desintegracin de radioistopos). Un fotn de gran energa
incide sobre un tomo, provocando la expulsin de un electrn de gran energa (fotoelectrn), y
quedando el tomo en forma ionizada (cargado positivamente). El electrn expulsado suele tener
energa suficiente para originar una nueva ionizacin, de la cual surge otro electrn de alta energa,
etc... producindose una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energa, hasta que sta
se disipa en el material: el ltimo electrn de la cadena es captado por otro tomo o molcula, que
queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones (uno positivo y
otro negativo). A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrnicas
ulteriores, que dan pie a cambios qumicos en el sistema que se haba sometido a la irradiacin.
2) Si la energa es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del tomo o molcula pasan
transitoriamente (de 10-8 a 10-10 segundos) a un nivel energtico superior (entonces se habla de que
el tomo o molcula estn excitados), pero enseguida dicho electrn vuelve al estado energtico
inicial. En su regreso a su nivel energtico previo, el electrn puede dar origen a una variedad de
fenmenos:
fluorescencia: emisin de energa a una longitud de onda mayor que la del fotn incidente;
fotosensibilizacin: la energa se transfiere a otra molcula;
reacciones fotoqumicas: se origina un cambio qumico;
emisin de calor: la energa simplemente se disipa en colisiones entre molculas.
La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoqumicas, aparte de calor. Pero la
radiacin infrarroja slo conduce a disipacin de calor, si bien ciertas bacterias fotosintticas
anoxignicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosntesis.
5.2 EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES
Aunque la unidad de radiacin emitida es el roentgen (R), a efectos biolgicos se usan

parmetros que miden la energa absorbida por el sistema: las unidades son el rad (100 erg/g) y el
gigaray (1Gy = 100 rads).
En general, los microorganismos son ms resistentes a las radiaciones ionizantes que los seres
superiores. Por ejemplo, la dosis de reduccin decimal (D10) para las endosporas de ciertas especies
de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las clulas vegetativas de la bacteria Deinococcus
radiodurans (observe el nombre especfico) es de 2.200 Gy. Otras especies ms normales poseen
una dosis de reduccin decimal en torno a 200-600 Gy. Compara estos datos con el valor de slo 10
Gy como dosis letal para humanos.
Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los rayos g y los
radioistopos, como el Co60 o el Cs137.
Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, as como
mutagnicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiacin, mientras que los letales
indirectos y mutagnicos se consiguen a menores dosis.
1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiacin ionizante sobre alguna molcula
esencial para la vida, que es el ADN (ya que obviamente es absolutamente esencial y suministra una
sola copia de la mayora de los genes bacterianos). Los daos al ADN son, principalmente: roturas en
ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse.
2. Efecto mutagnico: deriva de la produccin de daos menores al ADN que pueden repararse
por mecanismos propensos a error.
3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el ms importante, y deriva de la radiolisis del agua,
que genera hidrgeno naciente (H) y radical hidroxilo (OH). El radical hidroxilo reacciona fcilmente
con macromolculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce
en efectos de letalidad. Si, adems, la bacteria est expuesta al oxgeno mientras se la est irradiando,
el efecto es an ms intenso, debido a que el O 2 reacciona con los radicales libres, originando
cadenas de reacciones de autooxidacin, muy destructivas, y promoviendo la formacin de
perxidos y epxidos, asimismo letales.
H + O2 HO2
2 HO2 H2O2 + O2
Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilizacin de:
material farmacutico (antibiticos, hormonas, etc);

material mdico-quirrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas,
bistures, catteres, prtesis, etc);
alimentos envasados (aunque en algunos pases an sigue abierta la polmica por parte de ciertos
grupos sobre la seguridad de este tratamiento).
5.3 EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA
La radiacin UV tiene un efecto letal y mutagnico, que depende de su longitud de onda. Ello
se debe a la absorcin selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas molculas biolgicas:
Las protenas tienen dos picos (es decir, mximos) de absorcin: uno a 280 nm, debido a los
aminocidos aromticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptdicos.
El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases
pricas y pirimidnicas.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios qumicos en las molculas
absorbentes, de modo que aparecen molculas alteradas denominadas
genricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivacin de macromolculas,
aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas
modificaciones potencialmente lesivas.
Las consecuencias de inactivar protenas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad, ya

que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromolculas, y se pueden volver a
sintetizar. En cambio, la inactivacin del nico cromosoma de la bacteria tiene efectos letales
primarios y efectos mutagnicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de accin biolgica de la luz
UV equivale al de absorcin del UV por el ADN (260 nm).
5.3.1 FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV
Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de alteraciones

en las bases pirimidnicas (citosina, timina):
a) dmeros de pirimidina (anillo ciclobutano)
b) fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)
c) hidratos de pirimidina
Los dmeros de pirimidina son los fotoproductos ms importantes en las clulas vegetativas
bacterianas. El principal es el dmero de timina (T-T), aunque tambin se producen T-C y C-C. Como se
puede observar, se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de
ADN, mediante la creacin de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsin local de la
configuracin de la doble hlice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases
complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicacin y
transcripcin, y secundariamente en el crecimiento y la respiracin.
A dosis muy altas de rayos UV se forman tambin dmeros entre pirimidinas de las dos
cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente afectan a la
replicacin y a la transcripcin, aunque este tipo de daos reviste menos significacin biolgica.
El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el captulo 9, se forma

en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratacin, pudiendo ejercer igualmente
efectos inactivantes.
Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis de luz UV.
Tienen efecto mutagnico (no letal), favoreciendo la aparicin de transiciones T=A a CG.
5.3.2 MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS
Debido al carcter esencial del ADN como molcula central informativa de los seres vivos, la
evolucin ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles
daos ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos hallados en bacterias se
pueden agrupar as:
1) Mecanismos prerreplicativos:
a) reparacin fotoenzimtica o fotorreactivacin, que permite la reparacin directa del dao en s
b) reparacin por escisin y resntesis
2) Mecanismos posreplicativos:
a) reparacin por recombinacin
b) reparacin inducible de emergencia (SOS)
A) Reparacin fotoenzimtica
Se debe a la actuacin de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante, que

muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparan directamente los dmeros
de pirimidina, en una reaccin que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul).
Estas enzimas poseen dos grupos prostticos coloreados (cromforos):
flavina reducida (FADH2)

una pterina.
Mecanismo
1) La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dmero de

pirimidina, y se une a l, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
2) La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz (l=300-500), se excita, y dona

electrones al anillo de ciclobutano del dmero de pirimidina, rompindolo, y regenerando las dos
pirimidinas sin alterar.
Aunque se sabe que el segundo cromforo (la pterina) favorece la reparacin, no est claro
cul es su papel exacto.
No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la fotorreparacin est muy
extendida entre eucariotas.
B) Reparacin por escisin-resntesis
La distorsin en la doble hlice provocada por el dmero es reconocida por un complejo

proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o
escinucleasa. El dao se repara indirectamente (es decir, no se acta sobre el propio fotoproducto),
sino que las bases daadas se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucletido, y el
hueco resultante se rellena por resntesis reparadora de ADN.
Mecanismo:
1) Un complejo formado por dos subunidades de la protena UvrA y una de la UvrB (Uvr[A2B]) se
une cerca del dmero de pirimidina, usando la energa de la hidrlisis del ATP, y merced a su actividad
helicasa, desenrolla localmente la doble hlice.
2) Se une la protena UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr[A2BC], es decir, la

correndonucleasa, unido a la cadena daada del ADN, cerca del dmero.
3) La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dmero: corta el 8 enlace
fosfodister a la izquierda del dmero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localizacin del dmero
y corta el 4 o 5 enlace fosfodister a la derecha (en direccin 3' del dmero). Por lo tanto, se
produce y libera un fragmento de unos 12 nucletidos de longitud, que incluye al dmero de
pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipptidos
constituyentes.
4) Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-
polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la sntesis de nuevo
ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5' 3'), tomando como molde la cadena intacta,
y usando como cebador (primer) el extremo 3'-OH que se haba generado en la fase anterior.
5) Finalmente, la actuacin de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneracin del enlace fosfodister

del lado 5').
C) Reparacin por recombinacin
Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente replica el

cromosoma) se encuentra, en la cadena que est usando como molde, con un dmero de pirimidina,
deja de replicar esa zona, y salta unos 1000 nucletidos ms adelante para seguir la replicacin. Por
lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos 1000 nucletidos. Esta discontinuidad (llamada mella
post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparacin por recombinacin general,
recurriendo a la protena RecA, que verifica una recombinacin con la hebra parental homloga
intacta.
Mecanismo:
1) Numerosas unidades de protena RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella

posreplicativa, formando estructuras helicoidales.
2) La protena RecA promueve emparejamiento homlogo de la cadena sencilla a la que recubre

con la doble cadena hermana intacta.
3) Se produce un intercambio recproco de cadenas.
4) El extremo 3'-OH libre de la cadena daada (que merced al intercambio recproco est ahora
emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hlice hermana) sirve de
cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena
complementaria intacta del dplex.
5) Ligacin e isomerizacin espontneas, que produce la llamada estructura de Holliday, una

figura en X donde hay dos sobrecruzamientos (crossing-over) que mantienen unidos entre s a los
dos duplex.
6) Resolucin de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual genera dos
dobles hlices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos dplex lleva el dmero de
pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contien ADN de nueva sntesis.
Como se puede ver, el mecanismo de reparacin por recombinacin no repara por s mismo la
lesin en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitando que se detenga la replicacin
del cromosoma. Al final del proceso el dmero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendr una
oportunidad de ser reparado por algn otro mecanismo, como el de escisin-resntesis.
D) Reparacin de emergencia (SOS) propensa a error
Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados agentes qumicos

que daan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la replicacin, puede ocurrir que
los sistemas de reparacin que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los
daos; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que
calificamos como de emergencia, ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la clula, a costa de
acumular mutaciones con frecuencia elevada (y por eso lo llamamos tambin propenso a error).
Descripcin del sistema en una clula normal (no sometida a daos al ADN):
El gen lexA posee un nivel basal de expresin, de modo que codifica la protena LexA, que
acta como represor sobre su propio gen (represin autgena), as como sobre los genes recA, uvrA,
B, C, umuDC. La represin no es total, sino que se da un nivel basal de produccin de los polipptidos
correspondientes a estos genes. As, por ejemplo, el nivel de protena RecA es suficiente para
efectuar los procesos normales de recombinacin, y los niveles de UvrABC son suficientes para
reparar pequeos daos en el ADN.
Descripcin del sistema en una clula severamente daada:
Una clula seriamente afectada por un agente que daa el ADN o interfiere con su replicacin
poseer zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de
c.s. constituye una seal de situacin de emergencia para la protena RecA: dicha protena se une a
esas regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy especfica (para distinguir
esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La protena RecA* (activada como proteasa) induce la
proteolisis del represor LexA (rompindolo entre dos aminocidos concretos hacia la mitad de la
molcula). Por lo tanto, ya no hay suficiente protena LexA intacta como para seguir reprimiendo a los
genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes (llamados genricamente genes SOS) se pueden
expresar ahora a altos niveles, de modo que:
Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparacin por
recombinacin;
Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A 2BC]), lo que supone mejorar la reparacin por
escisin-resntesis;
Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagnesis. Pero por qu
aumenta la mutagnesis? El mecanismo exacto no est claro. Se sabe que en esta situacin de
emergencia algunos dmeros de pirimidina son procesados con la intervencin de los productos
de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una sntesis de emergencia de ADN que acarrea la
frecuente introduccin de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparacin propenso a
error).
De esta manera, la clula salvara su integridad en esta situacin lmite, pero a costa de
adquirir frecuentes mutaciones. (Es mejor sobrevivir aunque sea con unas cuantas mutaciones a
morirse!).
5.3.3 APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV
La luz UV se puede producir artificialmente en lmparas de vapor de mercurio de baja presin,

que emiten el 90% de su radiacin a 254 nm. La unidad de energa de radiacin se mide en watts/
(segcm2).
Por ejemplo, una lmpara de 15 watios emite una energa de 38mwattscm -2seg-1, a una muestra
situada a 1 metro de la lmpara.
La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La dosis letal para

clulas vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 mwattcm-2, pero las endosporas requieren 10 veces
ms dosis.
El uso prctico de la luz UV como agente esterilizante est limitado, ya que tiene poco poder
penetrante: no entra en objetos slidos, y adems se ve apantallada por el cristal y penetra poco en
los lquidos. Su aplicacin concreta ms frecuente es en el control de infecciones por va area:
lmparas de desinfeccin en salas de hospitales y de laboratorios de investigacin. En Microbiologa
se emplea la luz UV como agente mutagnico en bacterias (en muchos estudios que requieran
obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes
bases genticas).
5.4 EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE
A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energa, y adems, sus cuantos no tienen efectos
selectivos sobre el ADN, por lo que no sera de esperar, en principio, que este tipo de radiacin
tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible puede ejercer un efecto
negativo indirecto, en el fenmeno de sensibilizacin fotodinmica.
La luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposicin a pleno sol) es capaz de matar las
bacterias, debido a que ciertas molculas de stas (riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la
energa de los cuantos y se excitan durante 10 -6-10-8 seg, tras lo cual reemiten la energa a otras
molculas, originando fotooxidaciones en residuos His y Trp de las protenas y en las bases de los
cidos nucleicos. Tambin se puede generar oxgeno singlete ( 1O2), que es un radical muy reactivo,
oxidante, que puede destruir la clula con rapidez.
As pues, la moraleja prctica es: no dejarse los cultivos bacterianos expuestos a la luz solar,
sino que habrn de cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacterias fototrofas).
Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintticas, y las que se propagan va area) poseen
abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos fotosensibilizadores.
(Los carotenoides captan la energa del oxgeno singlete y la reenvan al estado basal, no excitado).
6 EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS
Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias entre los 9
kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitan las ondas supersnicas (hasta los
200 Kc/seg) y las ultrasnicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg). Estos tipos de ondas de frecuencias
superiores a las audibles (sobre todo las ultrasnicas) tienen el efecto de desintegrar las clulas.
El fundamento de esta accin es el siguiente: el paso del sonido a travs de un lquido

produce cambios de presin alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que a grandes
frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 mm de dimetro (fenmeno
de cavitacin). Dichas cavidades van aumentando de tamao y terminan colapsando violentamente,
dando lugar a enormes presiones locales (de hasta 1000 atmsferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias
del colapso son:
la clula se desintegra;
si existe oxgeno en el lquido de suspensin, se forman perxidos (como el H 2O2);
despolimerizacin de macromolculas;
cortes en ambas hebras del ADN.
Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones sonoras. En general,
son ms sensibles las Gram-negativas y ms resistentes las Gram-positivas. Sin embargo, ante un
tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que sobrevivan algunos individuos, por lo
que este mtodo no tiene utilidad para la esterilizacin.
El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la

llamada sonicacin o disrupcin ultrasnica de clulas para obtener extractos celulares, en
investigaciones bioqumicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de
ultrasonidos o sonicador, que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100 Kc/seg.
7 EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA
La mayor parte de las especies bacterianas de hbitats continentales no pueden crecer (e

incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm 2). Ello se debe a los
siguientes efectos adversos:
aumento de la viscosidad del citoplasma;

disminucin de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos;
interferencia en la divisin celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin produccin de
tabique transversal (crecimiento sin divisin celular).
Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas presiones
(barotolerantes y barfilas, respectivamente):
Bacterias barotolerantes: Crecen a la presin atmosfrica, pero aguantan hasta unas 500
atmsferas. Su hbitat son las aguas ocenicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad.
Bacterias barfilas: Crecen ptimamente a ms de 400 atmsferas. Podemos distinguir entre
barfilas moderadas (facultativas) y barfilas extremas (obligadas):
Las barfilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presin
atmosfrica, aunque su ptimo est a unas 400 atmsferas. Habitan profundidades entre los
5000 y 7000 metros.
Las barfilas extremas presentan ptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de
600-700 atmsferas), y son incapaces de crecer a presin atmosfrica. Se han llegado a aislar a
ms de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la temperatura del
agua es de slo 2-3oC, suelen ser simultneamente crifilas. Este tipo de bacterias est
empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas
en cmaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones que requieren.
Aplicacin prctica de las altas presiones a bacterias barosensibles:
La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente como

prensa francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes presiones y brusca
descompresiones, lo que logra la rotura mecnica de las bacterias, con objeto (al igual que la
sonicacin) de obtener extractos libres de clulas.
8 EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA
(Repasa en el captulo 11 el concepto de potencial de agua o actividad de agua, a w)
Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en
medios tanto hipotnicos como hipertnicos, debido a la proteccin de una pared celular rgida y a la
membrana citoplsmica semipermeable.
Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la del
entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. La presin de turgor es relativamente constante
porque la membrana citoplsmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta presin de turgor
permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentracin de solutos en su entorno (dentro
de ciertos lmites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos responder a continuacin):
cmo logra la bacteria ajustar su osmolaridad interna a esos cambios exteriores?
A) En medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el
papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplsmica
tienda a sufrir una presin de turgor excesiva.
B) En medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias
poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por
encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su
metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentracin de un soluto muy soluble en
agua en el interior celular, soluto llamado genricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr
por varios posibles mecanismos:
bombeando iones al interior;

sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa;
bombeando sustancias osmoprotectoras.
1) En el caso de los iones, el in bombeado suele ser el potasio (K+), por un sistema de antiporte
K+/H+.
2) Como ejemplos de sntesis de solutos orgnicos compatibles y osmticamente activos tenemos

el glutamato, la glutamina y la trehalosa. En levaduras es frecuente que el soluto compatible sea un
poliol (sorbitol, manitol, etc.).
Ahora bien, si el medio es muy hipertnico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar la salida de
agua desde el citosol, lo cual conlleva una retraccin de la membrana citoplsmica. La prdida de
agua puede suponer la deshidratacin del citoplasma, lo que conlleva la detencin del crecimiento.
En Gram-positivas se produce una plasmolisis autntica (retraccin de la membrana citoplsmica

respecto de la pared rgida suprayacente)
En Gram-negativas no existe autntica plasmolisis, ya que la pared celular y la membrana
citoplsmica se retraen al mismo tiempo. Las bacteria entricas crecen lentamente por encima de
0.65M de NaCl.
3) Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la mxima terica, si en
el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores. La bacteria bombea esos
compuestos a su interior, usndolos como solutos compatibles. Ejemplos de osmoprotectores
exgenos que pueden ser bombeados al interior celular:
Prolina (p. ej., en Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus)

Betana (glicnbetana), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y en algunas
Gram-positivas).
Colina (en Escherichia coli).
Ectona en enterobacterias.
Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero mejora si al medio se aade
1mM de prolina. Un mtodo normal de aislar S.aureus es comprobar el crecimiento en medio con
7.5% de ClNa en presencia de prolina.
Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertnicos, y en general se
llaman osmfilos. Entre los osmfilos podemos distinguir los sacarfilos y los halfilos.
Uno de los mejores ejemplos de microorganismos sacarfilos no es una bacteria, sino las
levaduras, que viven en jugos vegetales, nctares, zumos, etc. Utilizan como solutos compatibles
polioles como el sorbitol, el ribitol, etc.
Entre los organismos halfilos, podemos distinguir los halfilos moderados y los halfilos extremos
o hiperhalfilos.
Halfilos moderados: suelen ser bacterias marinas (ej.: Vibrio fischeri) que viven en 3.5% de
NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los
halfilos moderados tienen requerimientos concretos de una a w equivalente a la de agua de mar,
as como concentraciones determinadas de iones Na +. El papel jugado por este Na+ es:
mantenimiento de los sistemas de membrana citoplsmica y transporte;

estabilizacin de la pared celular;
requerimiento por parte de muchas enzimas.
Halfilos extremos (hiperhalfilos), representados paradigmticamente por las arqueas del
gnero Halobacterium, que viven en (y de hecho requieren) concentraciones saturantes de sales
(salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto compatible el K +, concentrndolo a partir del
medio donde viven, hasta que el citoplasma queda prcticamente saturado con l (4 a 7 M). Esta
gran concentracin de potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus
ribosomas, enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas
requieren altas concentraciones de cloruro sdico.
Dejando aparte las bacterias halfilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por
ejemplo, Staphylococcus aureus), pero la inmensa mayora de los procariotas viven a valores de
actividad de agua de 0.98. Por ello, un mtodo que ya se conoca empricamente en la antigedad
para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o aadirles grandes cantidades de
azcar (como en las mermeladas).
9 EFECTO DEL pH
La mayora de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, manteniendo al

mismo tiempo su pH interno ptimo prcticamente constante.
Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6
o muy cercano a ese valor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, stas se pueden clasificar en:
Neutrfilas, si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8).

Acidfilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
Alcalfilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias neutrfilas modifican el pH
del medio, y resisten entornos relativamente cidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias
fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a partir
de desaminacin de aminocidos. Por otro lado, la mayor parte de los hongos y levaduras requieren
pHs ligeramente cidos (en torno a 4-5).
Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen ms o menos amplio de pH (alrededor de

un ptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de
solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplsmico cae rpidamente hasta 5 o menos, la bacteria
puede morir.
Uno de los mecanismos que, al menos en neutrfilos parece controlar el pH interior es un sistema de
antiporte H+/K+: a pH cidos, el interior celular puede quedar en principio ms alcalino que el exterior.
Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH
interior y siguen teniendo un potencial de membrana para establecer una fuerza protn motriz que
les suministre energa.
Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una
respuesta de tolerancia a cidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones (expulsan
protones al exterior) y chaperonas (protenas celadoras) para corregir las protenas desnaturalizadas.
Existen algunos notables procariotas cuyo pH ptimo es muy bajo (acidfilos extremos u
obligados): Algunas eubacterias del gnero Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas
de los gneros Sulfolobus, Thermoplasma y Ferroplasma tienen su ptimo a pH 2, y generan ellas
mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta cido sulfrico. (Sulfolobus es un Secciones un
termoacidfilo). De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H + para mantener
la integridad de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran. Una arquea
sorprendentemente acidfila es Picrophilus oshimae, cuyo pH ptimo es nada menos que 0.7 (aparte
de que es una termfila que necesita temperaturas de ms de 60C).
Las especies alcalfilas obligadas tienen ptimos de pH en torno a 10-11. Por

ejemplo, Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9. Sus hbitats tpicos son suelos carbonatados
y lagunas alcalinas (algunos son tambin halfilos, como Natronobacterim gregoryi). Estos
organsimos tienen gran inters industrial, porque de ellos se obtienen enzimas hidrolticas como
proteasas y lipasas que se usan como aditivos en detergentes.
CICLO CELULAR Y CRECIMIENTO

1 INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANO
2 CICLO CELULAR PROCARITICO
2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN
2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR
3 MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS
3.1 MEDIDA DE MASA CELULAR
3.1.1 MTODOS DIRECTOS
3.1.2 MTODOS INDIRECTOS
3.2 MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS
4 CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)
4.1 EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
5 CULTIVO CONTINUO (SISTEMAS ABIERTOS). QUIMIOSTATO
6 CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS
6.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LQUIDO
6.2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS
1 INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANO

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el
incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo
cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la
multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se
traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares
que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la
poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del
genoma no se acompaa de divisn celular) el crecimiento se traduce en
aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano
podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:
A escala individual
A escala poblacional
Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia
al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas:
inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos (vase tema
7);
segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas;
sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared
celular (tema 5);
seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular.
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:
cintica del crecimiento;
factores que afectan al tiempo de generacin (g);
factores ambientales que limitan el crecimiento.
En el presente captulo nos dedicaremos al estudio de algunos aspectos
del ciclo celular procaritico, pero sobre todo nos centraremos en el
crecimiento de poblaciones (que es el ms frecuentemente empleado al
trabajar con microorganismos), con una visin de algunos mtodos para
obtener crecimientos balanceados. La influencia de los factores ambientales
sobre el crecimiento son el objeto de los temas 13 (agentes fsicos)
y 14 (agentes qumicos).
2 CICLO CELULAR PROCARITICO
Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados
que comienza con la formacin de una nueva clula y termina cuando dicha
clula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen
generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van
produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada
uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo
celular procaritico son:
fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico;
fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide
con el final de divisin celular;
fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica.
Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente
constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo
hace a expensas de la fase G1. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40
min, y D = unos 20 min.
2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN
Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qu ocurre con el ciclo celular
a distintos tiempos de generacin.
Cuando Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En
g>C+D estas condiciones podemos observar ntidamente periodos
diferenciados entre s (de sntesis de ADN y de divisin
celular).
Cuando Ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza
g=C+D inmediatamente tras la precedente divisin celular (es decir,
cada clula hija recin nacida se embarca inmediatamente
en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de
replicarlo, la clula inicia la divisin celular).
Cuando Las rondas de replicacin de un ciclo se inician antes de que
g<C+D haya terminado la divisin celular del anterior
(superposicin parcial entre fases C y D).
Cuando g<C ya no se puede detectar fase D como tal. La sntesis de ADN
es continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de
replicacin cromosmica antes de que haya terminado la
anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran
un tpico patrn de replicacin dicotmica y en que dichos
cromosomas pasan a cada clula hija ya embarcados en una
nueva ronda de replicacin.
Una caracterstica del ciclo es que, cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto
menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas.
Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est en un medio rico son
ms grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio
pobre.
2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR
De lo anterior se deduce que debe de existir algn tipo de acoplamiento
entre las ondas de replicacin y la divisin celular. Este es un campo de
investigacin an joven, del que no conocemos todava todos los detalles.
Las copias de cromosomas recin replicadas se encuentran en principio
adyacentes de la membrana citoplsmica (unidas a sendos mesosomas?)
probablemente unidas a travs de sus respectivos orgenes de replicacin
(oriC). No se sabe muy bien cmo esas copias se van separando de modo que
cada una va a parar a una clula hija. Se sabe que en este reparto o
particin de los cromosomas intervienen varias protenas, entre ellas ParA y
ParB, que en las clulas a punto de dividirse se sitan en los dos polos
opuestos. Es posible que exista algn mecanismo activo para separar estos
cromosomas, pero parece ser que tambin intervienen los mecanismos
pasivos de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique
transversal en crecimiento.
Tambin se sabe hoy que existen dos secuencias paralelas e
independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular: un control es
sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicacin
del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral (en el caso de los
bacilos) para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formacin del
tabique.
El comienzo de la replicacin del cromosoma se indica mediante la unin de
muchas unidades de la protena DnaA (unida a ATP) al origen de replicacin
(oriC). Una vez que se ha iniciado una ronda de replicacin en oriC, esta
regin queda hemimetilada, pero en vez de ser metilada inmediatamente,
queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa Dam y de la
maquinaria de replicacin. Se sugiere que en este fenmeno est implicada
una protena (SeqA), que a su vez ayudara a esconder a oriC en la membrana.
Slo ms tarde (y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que
ver de nuevo con la proporcin entre sitios de inicio y algn parmetro
celular como masa o volumen), vuelven a quedar las
secuencias oriC disponibles para su metalicin y uso en una nueva ronda.
NOTA: La metilasa Dam es una enzima que metila las dos adeninas de la
secuencia GATC/CTAG. El alumno seguramente sabr ya que esta metilasa
metila las adeninas de esa secuencia a partir de ADN hemimetilado. El ADN de
la clula est totalmente metilado en esas secuencias, pero cuando pasa la
horquilla de replicacin, la cadena recin sintetizada carece de esa
modificacin, hasta que llega la metilasa Dam, que reconoce la secuencia
hemimetilada y metila la adenina de la cadena no metilada. Un rasgo curioso
de la regin oriC para el inicio de la replicacin cromosmica es que contiene
una proporcin de secuencias GATC/CTAG muy superior a la media del resto del
genoma.
El comienzo de la tabicacin parece que requiere dos seales:
por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias
hijas deben de estar separadas en extremos opuestos
por otro lado, la clula debe haber alcanzado una longitud umbral
Como ya vimos en el captulo 5, llegado el momento, la protena FtsZ (que hasta
entonces estaba diseminada por toda la clula), se concentra ahora en la parte
central, sealando el plano de la tabicacin: se forma un anillo citocintico o
divisoma, en el que la FtsZ se va contrayendo hacia el interior (hidrolizando
GTP hasta GDP). A continuacin se van ensamblando en el divisoma varias
protenas Fts, entre ellas la PBP3, que como vimos es una transglucosidasa-
transpeptidasa especfica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el
septo transversal. La terminacin del tabique seala el final del ciclo celular.
3 MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS
En la prctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con
poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos
de su crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del captulo nos vamos a
referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con
algunos mtodos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de
los cuales sern aprendidos en vivo por el alumno en las prcticas de
laboratorio.
El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en
funcin de:
aumento de masa del cultivo
aumento del nmero de clulas
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn
en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes
aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo).
3.1 MEDIDA DE MASA CELULAR
En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas.
1) Determinacin del peso hmedo:
se tara un tubo de centrfuga;
se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya
cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa,
intensidad del empaquetamiento, etc.
2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca
antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas
de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo.
Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes
errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales
de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109bacterias.
3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl.
4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN,
ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc.
Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles
dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en
filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes
naturales.
1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito
por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de
carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin
de cidos.
2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana
del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la
cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.
Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que
cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin
de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.
a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio
de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la
absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la supensin).
Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de
A con la masa bacteriana en una muestra problema.
Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el
tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la
tcnica aumenta pues a longitudes de onda (l) cortas. La proporcionalidad entre
A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml.
b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est
situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se
mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor
sensibilidad que el espectrofotmetro.
3.2 MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS
1) Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial
con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas:
excavacin con 0.02 mm de profundidad;
rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes;
cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados
pequeos.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre
la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de
clulas en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los
cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16
celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer:
n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml.
Ventajas: es un mtodo muy rpido.
Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas
(>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el
campo del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente.
En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de
alcohol y agua.
2) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una
suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente
elctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm dimetro) pasa una partcula (p.
ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo
de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que
van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de
voltaje al paso de la partcula).
Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas
extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y
las mayores pueden obturar el orificio del aparato).
1) Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de
clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas
vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en
laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se
define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de
dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar
pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas
de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una
colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las
colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el
volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la
suspensin original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo,
estate atento a la prctica correspondiente, que se suele realizar en la 3
tanda).
Mientras tanto, y para luego repasar esa prctica, puedes realizar un
experimento on-line sobre crecimiento bacteriano
Precauciones:
para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar
5 placas de cada dilucin;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin;
contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un
indiviudo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman
agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables
reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC). Por lo tanto, una UFC
corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con
agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el nmero real de
individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que
estaban juntos al ser sembrados en la placa.
2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se
hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las
bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se
deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se
forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se
cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del
volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.
4 CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)
Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en
el que se mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y
ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de
masa celular, no de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y
similar en cada caso:
DM/M = DN/N = D[ADN]/[ADN] = D[protenas]/[protenas] = ... = K
As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el
cultivo se comporta como una reaccin autocataltica de primer orden:
velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente}
Tambin se puede decir que el no de clulas, la masa celular u otros
componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se
caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que
todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho
de otra manera:
aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un
mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente
exponencial de crecimiento (m), que es caracterstico para cada cepa
bacteriana en cada medio determinado.
4.1 EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
Para deducirla vamos a aprovechar la definicin emprica anterior,
atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento
del nmero de individuos.
a) En funcin del aumento de masa celular:
, y por lo tanto, dM = Mmdt
Si integramos, resulta: M/M0 = em(t-t0)
Aplicando logaritmos neperianos:
{12.1}
De aqu se puede deducir que el coeficiente m es
{12.2}
b) En funcin del aumento del nmero de clulas. Supongamos que partimos
de una clula. Tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos
divisiones tendremos 4, luego 8, etc: tenemos una serie geomtrica. 1, 2, 2 2, 23,
24, ... 2n (donde n es el nmero de generaciones transcurridas). Si en vez de
partir de una clula partimos de N0 clulas iniciales, tenemos:
N = N02n ; por lo tanto:
N/N0 = 2n {12.3}
Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente
teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de
generacin (g):
Sustituyendo esta expresin en la frmula {12.3} tenemos:

N/N0 = 2(t-t0)/g
Apliquemos logaritmos neperianos:
{12.4}
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones
matemticas {12.1} y {12.4} que hemos deducido (la de la seccin A, basada en
masa, y la de la seccin B, basada en nmero de individuos) son equivalentes:
, y por lo tanto:
m (t-t0) = (t-t0)/gln2, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento
exponencial:
, expresado en h-1 {12.5}

Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en
funcin del tiempo medio de generacin (g).
En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente
es m = mmx, o sea, el mximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese
medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido.
En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya
concentracin est por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas), el
crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real
de crecimiento es inferior al mximo, segn la frmula emprica siguiente
(ecuacin de Monod):
donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; KS es la

constante de saturacin, equivalente a la concentracin de nutriente para la
que el coeficiente es semimximo. Como se puede ver, la tasa de crecimiento
(medida por m) es una funcin hiperblica de la concentracin del sustratro
(nutriente) limitante (ver grfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o
de energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.
Ejemplos de KS:
la KS para la glucosa en E. coli es 110-6M
la KS para el triptfano en esta bacteria es 210--7 M
Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas de
membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptacin evolutivamente
adquirida de las bacterias a los medios muy diluidos en nutrientes en los que
normalmente viven. (Por el contrario, los medios de laboratorio donde se
suelen cultivar las bacterias suelen ser ms concentrados).
Como veremos en el apartado 6, en la naturaleza, y en los sistemas de
cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o
temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los
nutrientes o se acumulan sustancias de desecho.
5 CULTIVO CONTINUO (SISTEMAS ABIERTOS). QUIMIOSTATO
El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo
indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de:
una cmara de cultivo de volumen constante,
a la que llega un suministro de nutrientes,
y de la que se eliminan o separan los productos txicos de desecho (por un
dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y la
concentracin de nutrientes en la cmara permanecen constantes, y entonces
se dice que el sistema est en estado estacionario, con las clulas creciendo
exponencialmente.
Los parmetros a tener en cuenta son:
flujo (f), medido en ml/h
volumen de la cmara de cultivo (v, en ml)
densidad celular en la cmara (x)
factor de dilucin D = f/v (en h-1).
Existe una prdida de clulas por el rebosadero: -dx/dt = xD
El crecimiento bruto es dx/dt = xm
Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = xm - xD = x(m - D)
Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de
dilucin (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentracin de clulas se
hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinmico de
equilibrio. Las prdidas de clulas por drenaje se compensan con las ganancias
por crecimiento.
Una de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el
llamado quimiostato: en el quimiostato podemos controlar de modo
independiente la densidad de la poblacin celular y la velocidad de crecimiento
del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor
de dilucin (D), mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando
la concentracin del nutriente limitante en la cmara reservorio (SR).
En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia
variedad de tasas de crecimiento exponencial
El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que
existe un nutriente o sustrato presente en una concentracin suficientemente
baja como para limitar la densidad de poblacin.
As pues, el quimiostato tambin permite elegir la densidad de clulas a la
que se quiere trabajar.
Algunos comentarios sobre el grfico:
La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de
dilucin (D). Este margen es el ms adecuado para hacer estudios en el
quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generacin (g) vara
ampliamente. O sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy
diferentes, sin que se afecte la densidad celular.Sin embargo, a valores
extremos de dilucin, se puede ver que el equilibrio se rompe:
A altas tasas de dilucin la concentracin microbiana cambia rpidamente, y
en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilucin
crtica). Es decir, el cultivo se lava porque su velocidad de crecimiento es
inferior a la tasa de dilucin.
A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente
limitante es la fuente de energa. Ello se debe a que en esas condiciones, la
fuente de energa slo se usa para reacciones de mantenimiento de la
integridad celular, pero no queda para el crecimiento. A este valor lo
llamamos energa de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta
energa de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de
solutos y la renovacin de protenas.
Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:
Aportan una fuente continua de clulas en fase exponencial, lo que se aplica
a procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas alcohlicas,
de antibiticos, de aminocidos, etc).
En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite
estudiar:
aspectos fisiolgicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);
seleccin de mutantes
estudios ecolgicos.
6 CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS
En los sistemas cerrados (que pueden ser lquidos o slidos), no existe
aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de
desecho.
En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no
restringido dura slo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de
nutrientes y/o a la acumulacin de desechos.
6.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO
LQUIDO
Como se puede constatar en el anterior grfico, el crecimiento en un sistema

cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:
1) Fase de retardo (fase lag): Es el perodo de tiempo durante el que el
inculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha
sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende
de varios factores:
tamao del inculo;
bondad del inculo (estado metablico previo del inculo):
si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de un cultivo anterior,
la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros
constituyentes de las clulas son bajos, y las clulas deben reponerlos en el
medio fresco.
si las clulas estn daadas por algn agente, el lag tambin es largo, ya que
necesitan un tiempo para la reparacin de los daos.
si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase
logartmica, el lag es ms corto.
medio del que procede el inculo:
si el medio es similar al medio fresco, el lag es ms corto;
si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la
fase de retardo se hace ms larga, porque las bacterias necesitan un tiempo
adicional para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban
reprimidas en el medio rico.
Pero aun cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase
logartmica, cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una
fase lag. Por qu?:
necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco;
porque se produce dilucin de ciertos metabolitos intracelulares al inocular
las bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a
alcanzar una concentracin de esos metabolitos adecuada para el
crecimiento, ste no arranca.
Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrfica en un medio
ligeramente cido, sometido a aireacin: en un principio, se produce dilucin
de CO2, por lo que se retardan reacciones de carboxilacin que requieren este
CO2, y se produce un retardo.
2) Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a
3) Fase de crecimiento exponencial (= fase logartmica). La fase 2 se debe a
que cada clula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus
compaeras. Ello demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las
mismas condiciones fisiolgicas.
Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no
restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El
tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada
medio concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:
composicin del medio
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos heterotrofos suelen crecer ms rpidamente en los
medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos
ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos
microoorganismos tienen, a su temperatura ptima tiempos de generacin muy
cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen ms lentamente, con
tiempos de generacin que pueden ser de varias horas o incluso das.
4) Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce
a
5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de
crecimiento se hace nulo (m = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre
es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.
En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de
desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el
crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de
aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va
recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminocidos como
fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).
En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero
el metabolismo general es diferente al de la fase logartmica:
las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de
que se haya detenido el incremento de masa;
suelen ser ms resistentes a agentes fsicos y qumicos;
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;
baja el contenido en ARN.
6) Fase de transicin hacia
7) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del
cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las
clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas fantasmas,
ghost). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por
ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms
acentuada).
Te recuerdo que puedes hacer un experimento "virtual" con la curva de
crecimiento de una bacteria. Que disfrutes.
6.2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS
Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido),
pero incorporado a un gel, que le da consistencia.
Los tipos de gelificantes usados para los medios slidos (ms explicaciones en
la 2 tanda de prcticas):
agar-agar (o simplemente, agar): es el ms comnmente empleado;
gelatina (inconveniente de que se lica a temperaturas relativamente bajas, y
adems, algunos microorganismos lo degradan por gelatinasas);
silicagel (o gel de slice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para
quimioautotrofos.
Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o
esptula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes
adecuados, como las placas de Petri (ver prcticas). Tras la incubacin a la
temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupacin bacteriana
que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por
crecimiento, a una acumulacin de clulas, visible a simple vista,
denominada colonia.
La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 clulas para
una colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio slido, a diferencia
del lquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este
medio slido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusin desde el
entorno de la colonia, hacia ella), y eliminacin continua de productos de
desecho (por difusin desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un
cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de clulas.
Como el alumno comprobar en prcticas (2 tanda), cada especie
bacteriana suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio
concreto. Con vistas a la determinacin taxonmica, se suele tomar nota de una
serie de caractersticas de las colonias (caracteres culturales):
tamao (relativo)
forma general
forma de los bordes de la colonia
aspecto de la superficie y elevacin sobre el sustrato
color
consistencia, etc.

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AGENTES FSICOS

1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS

2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS

2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOS

2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOS

2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOS

2.3 EFECTO LETAL DEL CALOR

2.3.1 CALOR HMEDO

2.3.2 CALOR SECO

2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS

4 EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS

5 EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS

5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULAS

5.2 EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES

5.3 EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA

5.3.1 FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV

5.3.2 MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS

5.3.3 APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV

5.4 EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE

6 EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS

7 EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA

8 EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA

Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su

1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de

2) condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales;

3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de

Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:

Agentes fsicos (tema 13) Agentes qumicos (tema 14)

Temperatura Desinfectantes y antispticos

Desecacin Quimioterpicos de sntesis

2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

La temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que condicionan el

La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de

Temperatura mnima: por debajo de ella no hay crecimiento;

La temperatura mnima se puede explicar en funcin de un descenso de la fluidez de la

Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando

2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS

2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOS

Las psicrfilas o crifilas: crecen a partir de entre -5 a 5C.

b) Las psicrfilas facultativas o psicrotolerantes (tambin llamadas psicrotrofas) presentan

enzimas ms resistentes al fro;

2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOS

2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOS

Las principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas en clulas vegetativas

enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrfobo;

Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir

punto trmico mortal Especies

60oC Mycobacterium tuberculosis

Estos tres parmetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en las de

Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el

En general, entendemos por esterilizacin todo tratamiento de un material con un agente

Centrndonos de nuevo en el calor, la inactivacin parcial o la esterilizacin se pueden lograr por

La inactivacin (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalizacin de protenas y a la

2.3.1 CALOR HMEDO

La mayora de clulas vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos 80oC , 5-10 min

Bacilo tuberculoso 58oC , 30 min

Bacilo tuberculoso 59oC , 20 min

Bacilo tuberculoso 65oC , 2 min

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC , 60 min

La mayora de esporas de bacterias patgenas 100oC , pocos min

esporas del patgeno Clostridium botulinum 100oC , 5,5 horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC , muchas horas