Efecto de la va de la quinurenina

12/Mayo/2017 sobre la progresin de la

esclerosis mltiple
Protocolo de investigacin

Adn Rodrguez Chvez 128539

Programa Mdico Cirujano, Universidad Autnoma de Ciudad Jurez, Divisin

Multidisciplinaria en Cuauhtmoc, Km. 3.5 Carretera Anhuac S/N, Cuauhtmoc, Chih.

Investigacin Cnica

Docente: Hctor Lechuga Prez

 Efecto de la va de la quinurenina sobre la
progresin de la esclerosis mltiple
Adn Rodrguez Chvez FM UACJ

Resumen
La esclerosis mltiple (EM) se considera el prototipo de la enfermedad
desmielinizante inmunomediada del sistema nervioso central, es una enfermedad
crnica inflamatoria y degenerativa del SNC, con resultados muy heterogneos. En
la cual se destruye la mielina y el axn en grados variables. La ruta de la quinurenina
(KP) es la ruta principal que descompone el triptfano que conduce posteriormente
a la produccin de NAD +. En presencia de citoquinas pro-inflamatorias la KP es
inducida por la activacin de su primera enzima, indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO-
1). Los metabolitos producidos a lo largo del PK pueden tener efectos neurotxicos
o neuroprotectores.
Objetivo general: Determinar el efecto que ejerce la va de la quinurenina sobre la
progresin de la esclerosis mltiple.
Objetivo especfico: Conocer cules son los principales metabolitos de la va de la
quinurenina que intervienen en la esclerosis mltiple.

Para la realizacin del estudio se pretende utilizar un estudio de cohorte prospectivo,

En este caso se manejarn dos poblaciones, en las cuales la primera incluir a
personas completamente sanas, mientras que en la segunda se seleccionarn
pacientes que sufren de esclerosis mltiple.

Justificacin y antecedentes
Esta investigacin/proyecto tiene como finalidad conocer el efecto que ejerce la va
de la quinurenina y sus diferentes metabolitos tanto en la progresin de la esclerosis
mltiple, como en sus sntomas.
Las estimaciones de prevalencia de Esclerosis Mltiple (EM) en los Estados Unidos
varan de 58 al 95 por 100.000 habitantes. De acuerdo con la Sociedad Nacional de
Esclerosis Mltiple, 400.000 personas en los Estados Unidos se ven afectados por
la EM. Como ocurre en enfermedades autoinmunes en general, la EM es ms
comn en las mujeres. La relacin de mujer-hombre de en MS ha aumentado desde
la mitad del siglo 20, de un estimado de 1,4 en 1955 a 2,3 en 2000. La EM por lo
general se diagnostica en personas de 15-45 aos; Sin embargo, tambin puede

Protocolo de Investigacin 1
ocurrir en personas de cualquier edad. La edad media al diagnstico es de 29 aos
en las mujeres y 31 aos en los hombres.
A nivel mundial, aproximadamente 2,1 millones de personas estn afectadas por la
EM. La enfermedad se observa en todas partes del mundo y en todas las razas,
pero las tasas varan ampliamente. Se ha reportado un aumento sustancial en la
incidencia de MS en diferentes regiones, lo que sugiere que los factores
ambientales, as como los geogrficos y genticos, juegan un papel importante en
la EM. Los estudios epidemiolgicos indican un aumento de la prevalencia de EM
en Amrica Latina.
La esclerosis mltiple (EM) se considera el prototipo de la enfermedad
desmielinizante inmunomediada del sistema nervioso central, es una enfermedad
crnica inflamatoria y degenerativa del SNC, con resultados muy heterogneos. En
la cual se destruye la mielina y el axn en grados variables. En la mayora de los
casos, la enfermedad sigue un patrn recada-remitente (RRMS), con episodios a
corto plazo de dficits neurolgicos que se resuelven completa o casi
completamente. Una minora de pacientes experimentan un deterioro neurolgico
progresivamente progresivo.
La ruta de la quinurenina (KP) es la ruta principal que descompone el triptfano que
conduce posteriormente a la produccin de NAD +. En presencia de citoquinas pro-
inflamatorias la KP es inducida por la activacin de su primera enzima, indolamina
2,3-dioxigenasa (IDO-1). Los metabolitos producidos a lo largo del PK pueden tener
efectos neurotxicos o neuroprotectores. El cido quinolnico (QA) es quiz el ms
importante, conduciendo agudamente a la muerte neuronal y crnicamente a la
disfuncin por al menos 7 mecanismos separados, de los cuales, la excitotoxicidad
del receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) es la mejor caracterizada.

Objetivos del estudio

Objetivo general: Determinar el efecto que ejerce la va de la quinurenina sobre la
progresin de la esclerosis mltiple.
Objetivo especfico: Conocer cules son los principales metabolitos de la va de la
quinurenina que intervienen en la esclerosis mltiple.

Metodologa
Diseo del estudio
Para la realizacin del estudio se pretende utilizar un estudio de cohorte, la
caracterstica que define a los estudios de cohorte es que los sujetos de estudio se
eligen de acuerdo con la exposicin de inters; en su concepcin ms simple se
selecciona a un grupo expuesto y a un grupo no-expuesto y ambos se siguen en el
tiempo para comparar la ocurrencia de algn evento de inters.

Protocolo de Investigacin 2
En este caso se manejarn dos poblaciones, en las cuales la primera incluir a
personas completamente sanas, mientras que en las segunda se seleccionarn
pacientes que sufren de esclerosis mltiple, excluyendo a todos aquellos pacientes
que se encuentren en tratamiento con inmunomoduladores. En ambas poblaciones
la seleccin se realizar de forma aleatoria.
Para la obtencin de un perfil completo del metabolismo de la quinurenina en la
esclerosis mltiple (EM), se obtuvieron las muestras de la cohorte 1 a travs del
Proyecto de Curacin para Esclerosis mltiple, y consistieron en muestras de suero
de pacientes con EMRR, EMSP, Esclerosis Mltiple Progresiva Primaria (EMPP).
Los criterios de exclusin incluyeron pacientes con EM que reciban actualmente
frmacos modificadores de la enfermedad o que tenan corticosteroides en los
ltimos 3 meses, o presencia de otras condiciones mdicas. En el caso de cohorte
2 se trata de muestras de pacientes completamente sanos funcionando como
sujetos control (SC). Los puntos aleatorizados de este estudio son la edad y el
gnero de los participantes, con el fin de abarcar lo ms ampliamente posible las
variantes en las que se puede presentar la Esclerosis Mltiple
Metabolitos de la va de la quinurenina.
Todos los reactivos y los metabolitos de KP sern de grado reactivo analtico y sern
adquiridos a travs de Sigma-Aldrich (San Luis, Misuri, EE. UU.), a menos que se
indique lo contrario. Se adquirirn patrones internos deuterados por parte de
Medical Isotopes, Inc (100 Bridge St, Pelham, NH 03076, EE. UU.). Los metabolitos
de KP se extraern utilizando cido tricloroactico (TCA) al 10% (p / v) con igual
volumen de muestras de suero. Las muestras de sanas se prepararon de forma
similar a las muestras de suero, excepto que no se llev a cabo la desproteinizacin
con TCA.
El anlisis simultneo de triptfano, kynurenina, 3-hidroxiquinrenina (3-HK), cido
3-hidroxiantranlico (3-HAA) y cido antranlico (AA) se realizar con UHPLC,
usando un volumen de inyeccin de 20 l del extracto preparado de cada muestra.
La deteccin de KA se realizar usando una fase mvil de gradiente que comprende
un suplemento de tampn de acetato sdico 50 mM con acetato de zinc (dihidrato)
25 mM para aumentar la intensidad de fluorescencia y 2,25% de acetonitrilo como
modificador orgnico (Disolvente A) y 10% de acetonitrilo (Disolvente B).
Cada muestra (10 l) se inyectar en una columna Poroshell RRHT C-18, 1,8 m
de 2,1 x 100 mm (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA) mantenida a 38C
durante 15 minutos a un caudal unsono de 0,75ml/min. La elucin de gradiente
consistir en 100% de disolvente A durante 3 min y despus 50% de disolvente A y
50% de disolvente B durante 2 min, seguido de 100% de B durante 2 min y 100%
de disolvente A (tiempo de ejecucin 10 min). Este gradiente asegura un tiempo
suficiente para la retencin de KA mientras se minimiza la acumulacin potencial de
presin debido a la precipitacin del tampn de alta salinidad.

Protocolo de Investigacin 3
La deteccin de KA necesitar fluorescencia (excitacin y emisin de longitudes de
onda de 344 y 388 nm, respectivamente, con un tiempo de retencin de 1,5 min).
Para analizar los cromatogramas se utilizar el sistema de datos cromatogrficos
Agilent OpenLAB CDS ChemStation (Edicin C.01.04).
Perfil de los mediadores inflamatorios.
La cuantificacin de citoquinas de multiplexacin, quimiocinas y factores de
crecimiento se realiz utilizando kits comerciales de inmunoensayos basados en
perlas magnticas 27-plex (Bio-Rad, Hercules, CA) en la Cohorte 1.
La lectura final de la concentracin de muestra se expresar como picograma por
mililitro (pg / ml) basado en las curvas estndar integradas en el ensayo utilizando
el software Bio-Plex Manager v6.0.

Anlisis estadstico y modelizacin.

La normalidad de las variables, cuando sea requerida, sern verificadas por las
pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk o Kolmogorov Smirnov y la igualdad de las
varianzas por el test de Levene para la igualdad de varianzas. Las comparaciones
entre los diferentes subtipos de EM y el grupo de control se realizarn por ANOVA
o prueba de Kruskal Wallis, dependiendo de los anlisis de normalidad y varianzas
iguales. Todos los clculos estadsticos sern realizados mediante el software IBM
SPSS Statistic 23.
En cuanto a los modelos de clasificacin de EM se desarrollarn mediante el
software de IBM SPSS Modeler 14.2, y R22 incorporado con varios paquetes R tales
como Rcmdr, Lawstat, MASS23, CAR y Lattice.

Consideraciones de seguridad y seguimiento

Para la garantizacin de la seguridad de las personas que participarn en este
estudio nicamente sern llevadas al laboratorio para la obtencin de las muestras,
las cuales solo constan de una tcnica sencilla, con riesgo mnimo de extraccin de
suero y posteriormente para la notificacin de los resultados. Para la realizacin del
traslado de los sujetos de prueba se habilitarn vehculos de transporte para facilitar
el mismo, sin la necesidad de que las personas tengan que realizar un gasto extra
o emplear sus autos.
Como mtodo de seguimiento de los pacientes se habilitar una lnea telefnica con
la cual se pueda mantener un contacto permanente con ellos y monitorearlos sin la
necesidad de mantenerlos recluidos en un hospital. A su vez esta lnea telefnica
servir para que los pacientes notifiquen si es necesaria su salida del estudio por
factores externos.

Protocolo de Investigacin 4
Resultados Esperados del Estudio
Con los datos obtenidos a la finalizacin de este estudio, se espera poder identificar
los elementos que intervienen en la progresin de la Esclerosis Mltiple, de tal
manera que en un futuro o en investigaciones siguientes seamos capases de
encontrar medicamentos, procedimientos o tcnicas para eliminar dichos elementos
o para controlar su proliferacin, con el fin de disminuir la progresin de la
enfermedad y mejorar la calidad de vida de los pacientes que sufren de esta
enfermedad degenerativa, as como tambin la de sus familias.

Duracin del Proyecto

Se tiene contemplado que el estudio tenga una duracin aproximada de 3 aos los
cuales estarn distribuidos de la siguiente manera:
Ao 2017 2018 2019
Julio - Marzo - Junio -
Meses Junio - Julio Abril - Octubre
Agosto Mayo Agosto

Reclutamiento Obtencin Estudios de las Anlisis

Publicacin
Actividad de los sujetos de las muestras estadsticos
del estudio
de prueba Muestras obtenidas y resultados

Problemas previstos
Durante la realizacin del estudio podemos enfrentarnos a ciertos problemas entre
los cuales contemplamos el abandono del estudio por parte de los sujetos de
prueba, para lo que se tiene planeado reclutar a un mayor nmero de personas de
las que realmente se requieren, para en caso de abandono de uno de los
participantes activos, llamar inmediatamente a alguno de los inactivos, tambin se
tiene contemplado la adquisicin de los reactivos y materiales suficientes para evitar
retrasos debido a que se tenga que coneguir mas reactivos por falta de los mismos.

Gestin del Proyecto

Adn Rodrguez Chvez - Responsable directo del estudio
Dr. Hctor Lechuga Prez - Asesor acadmico y de investigacin del estudio

tica
Todos los estudios se llevarn a cabo de acuerdo con las directrices del comit de
tica de investigacin humana institucional y aprobado por el Hospital General Dr.
Javier Ramrez Topete de Cd. Cuauhtmoc y la Universidad Autnoma de Ciudad
Jurez, Divisin Multidisciplinaria en Cuauhtmoc. El estudio se adhiere a "El cdigo

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de tica de la Asociacin Mdica Mundial (Declaracin de Helsinki)" para
experimentos con seres humanos.
Adems, Se obtendr el consentimiento escrito de las fuentes respectivas que
proporcionaron las muestras.

Referencias
1. Chai K. Lim, Ayse Bilgin, David B. Lovejoy, Vanessa Tan, Sonia
Bustamante, Bruce V. Taylor, Alban Bessede, Bruce J. Brew, and Gilles J.
Guillemin. Kynurenine pathway metabolomics predicts and provides
mechanistic insight into multiple sclerosis progression. Scientic Reports,
7:41473+, February 2017.
2. Davis, I., & Liu, A. (2015). What is the tryptophan kynurenine pathway and
why is it important to neurotherapy? Expert Review of
Neurotherapeutics, 15(7), 719721.
http://doi.org/10.1586/14737175.2015.1049999
3. Chen, Y., & Guillemin, G. J. (2009). Kynurenine Pathway Metabolites in
Humans: Disease and Healthy States. International Journal of Tryptophan
Research: IJTR, 2, 119.
4. Ruth A. Marrie. Comorbidity in multiple sclerosis: implications for patient
care. Nature Reviews Neurology, March 2017
5. Christopher Luzzio, et al. Multiple Sclerosis. Medscape. Mar 01, 2017.
http://emedicine.medscape.com/article/1146199-overview

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