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Nota Cientfica Rev. Fitotec. Mex. Vol.

34 (4): 285 - 289, 2011

MTODO ECONMICO Y EFICIENTE PARA LA CUANTIFICACIN COLORIMTRICA DE LISINA EN


GRANO DE MAZ

INEXPENSIVE AND EFFICIENT COLORIMETRIC METHOD FOR THE LYSINE CUANTIFICATION ON


WHOLE MAIZE GRAIN

Luis A. Galicia-Flores, Catalina Islas-Caballero,


Aldo Rosales-Nolasco y Natalia Palacios-Rojas*

Programa Global de Maz, Centro Internacional de Mejoramiento de Maz y Trigo (CIMMYT). km 45 va Mxico-Veracruz. 56130, Texcoco, Estado de Mxico,
Mxico. Tel. +52 (595) 9521900 Ext.1112

*Autor para correspondencia (n.palacios@cgiar.org)

RESUMEN Index words: Colorimetric method, modification, Quality protein


maize (QPM), lysine.
Los maces (Zea Mays L.) de alta calidad protenica (ACP) tienen
mayor contenido de lisina y triptfano, dos aminocidos esenciales INTRODUCCIN
que normalmente estn presentes en bajas cantidades en el grano de
maz. La metodologa colorimtrica que se usa actualmente para El maz (Zea mays L.) juega un papel importante en la
monitorear el contenido de lisina en el grano de maz es costosa y poco
reproducible. El presente trabajo es una modificacin a la metodologa
nutricin humana y animal. El grano de maz aporta entre
para la determinacin colorimtrica de lisina en grano completo de 15 y 56 % de la ingesta calrica diaria de la poblacin en
maz. Se hizo una reduccin de reactivos costosos como el acetato de alrededor de 25 pases en vas de desarrollo, particularmente
etilo, reduccin de riesgos al personal que se encarga de desarrollar este en frica y Amrica Latina (Atlin et al., 2011). El grano
anlisis por la disminucin en la emisin de residuos contaminantes,
y reduccin de pasos para desarrollar la curva de calibracin, lo cual
de maz normalmente es deficiente en los aminocidos
aumenta la capacidad de anlisis por da. La metodologa descrita se esenciales tales como lisina, triptfano y metionina,
valid por comparacin con la metodologa colorimtrica de referencia debido principalmente a la proporcin alta de prolaminas
y con NIR, y se obtuvieron coeficientes de determinacin (R2) de 0.97 como protenas de almacenamiento que carecen de dichos
y de 0.85, respectivamente. El mtodo desarrollado es econmico,
preciso y rpido, y puede ser usado para la determinacin de lisina en
aminocidos (Prasanna et al., 2001; Sofi et al., 2009).
un gran nmero de muestras durante los programas de mejoramiento.
El trmino QPM (Quality Maize Protein o ACP, alta
Palabras clave: Mtodo colorimtrico, modificacin, maz de alta calidad protenica), se refiere al maz que tiene el gen opaco
calidad protenica (ACP), lisina.
2 (o2) junto con genes modificadores, cuya accin origina
SUMMARY un maz con mayor contenido de lisina y triptfano y un
endospermo relativamente duro, que lo hace resistente a las
Quality protein maize (QPM, Zea mays L.) has higher content plagas durante el almacenamiento. El maz ACP no es un
of lysine and tryptophan, two essential amino acids usually present producto de eventos transgnicos y tiene el mismo aspecto
in low quantities in maize kernels. The colorimetric method y se desarrolla de la misma forma que el maz convencional
used currently to measure lysine in maize is time consuming and
poorly reproducible. This paper describes a modification to the
(normal); puede ser diferenciado nicamente por medio
methodologyfor colorimetric determination of lysine in whole grains de anlisis de laboratorio que cuantifican su contenido de
of maize. Reduction of costly reagents, risks for operators and reduction lisina y triptfano (Sierra-Macas et al., 2004; Krivanek
in the number of steps to prepare the calibration curve are the main et al., 2007). El consumo de maz ACP contribuira al
modifications done to the previous protocol and which largely improve
the efficiency and cost of the analysis. The alternative methodology was
aseguramiento de la cantidad de protena e ingesta de
validated by comparison with the reference colorimetric method and aminocidos esenciales requeridos por el ser humano (Nuss
NIR, obtaining high coefficients of determination (R2)0.97 and 0.85, y Tanumihardjo, 2011).
respectively.The modified method is inexpensive,reliable and fast, and
can be used for the determination of lysine inlarge number of samples
for breeding programs.
De esta forma, se hace necesaria la cuantificacin de
lisina y triptfano durante las etapas del mejoramiento

Recibido: 04 de Abril del 2011.


Aceptado: 09 de Octubre del 2011.
CUANTIFICACIN EFICIENTE DE LISINA EN GRANO DE MAZ Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (4), 2011

de los maces ACP. Debido a que estos aminocidos USA) se adquirieron el 2-cloro-3, 5-dinitripiridina (Cat.
guardan una proporcin aproximadamente constante de 22,404-9) y la mezcla de aminocidos: cistina, metionina,
4:1, normalmente se da seguimiento slo al contenido de prolina, histidina, alanina, isoleucina, treonina, tirosina,
triptfano como parmetro para la evaluacin de la calidad glicina, fenilalanina, valina, arginina, serina, cido asprtico,
nutricional de la protena de maz (Vivek et al., 2008). Por leucina y acido glutmico (Cat. LAA21-1KT). La papana
su parte, el anlisis de lisina usado para apoyar programas purificada 0.32 MCU (Milk Cloth Units) Proteoferm
de mejoramiento de maces ACP (Villegas et al., (1984), fue adquirida con la empresa Mixim (Naucalpan, Estado
presenta caractersticas que limitan su implementacin: de Mxico, Mxico). La lisina (L-Lisina monoclorhidrato,
a) La hidrlisis enzimtica se debe realizar en tubos de Cat. 6364) fue adquirida con la empresa Nutritional
ensayo porque se usan 100 mg de muestra previamente Biochemicals Corp. (Cleveland Ohio, USA).
acondicionada y el volumen de la solucin de extraccin
es de 5 mL; b) En la reaccin colorimtrica por cada Las soluciones de papana (4 mg mL-1 y 5 mg mL-1) se
muestra a analizar se requieren 15 mL de acetato de etilo prepararon diariamente a temperatura ambiente con una
como solucin de lavado, volumen que prolonga el tiempo solucin amortiguadora de fosfatos 0.03 M con pH 7.4
del anlisis puesto que se debe pipetear repetidamente (mezcla de fosfato de sodio dibsico y fosfato de potasio
para remover el solvente antes de hacer la lectura en el monobsico). Diariamente se prepar la suspensin de
espectrofotmetro; c) Elaboracin de la curva de calibracin cobre al disolver 2.8 g de cloruro cprico en 100 mL de gua
con numerosas diluciones, que provocan que se prolongue y 13.6 g de fosfato de sodio tribsico en 200 mL de agua.
el tiempo requerido en esta fase y que aumentan el error Se mezclaron ambas soluciones, se centrifugaron a 800 x g
durante su preparacin. durante 5 min (aprox. 37.5 mL en cada tubo) y se descart
el sobrenadante. El precipitado se lav tres veces con 15
La cuantificacin se basa en la reaccin entre el compuesto mL (por tubo) de solucin amortiguadora de boratos 0.05
2-cloro-3, 5-dinitripiridina y el grupo -amino de lisina, M con pH 9, y al final se resuspendi el precipitado con 80
despus de haber bloqueado con cobre los grupo -amino mL de la misma solucin.
de los aminocidos y de los pptidos de bajo peso molecular
presentes en el hidrolizado protenico. El complejo La solucin de 2-cloro-3,5-dinitropiridina a 3 % (p/v)
-dinitropiridil-lisina que se forma es soluble en agua pero en metanol, se prepar minutos antes de ser utilizada. La
insoluble en acetato de etilo, lo que permite remover los solucin de aminocidos se prepar mediante la dilucin
dems compuestos formados durante la reaccin, y adems 100 mg de la mezcla de aminocidos en 10 mL de una
eliminar el exceso del reactivo 2-cloro-3, 5-dinitripiridina solucin amortiguadora de carbonatos 0.05 M con pH 9. La
(Tsai et al., 1972). solucin concentrada de lisina se utiliz como estndar y se
prepar utilizando la solucin reguladora de carbonatos a
El objetivo del presente trabajo fue modificar la una concentracin de 1000 g mL-1.
metodologa para que la cuantificacin de lisina sea un
anlisis til para apoyar los programas de mejoramiento. Muestras de maz
Con base en el mtodo de Villegas et al. (1984), se optimiz
el desarrollo de las curvas de calibracin, se redujeron los Se utilizaron maces (no-ACP y ACP) del programa
volmenes para la reaccin y se implement el uso de de mejoramiento del CIMMYT (Centro Internacional
microplacas, todo lo cual reduce tiempo de trabajo ya que del Mejoramiento del Maz y Trigo). La metodologa fue
permite analizar hasta 36 muestras por duplicado, en una validada en 70 muestras de maz ACP y 70 muestras maz
sola lectura. no-ACP.

MATERIALES Y MTODOS Procedimiento de extraccin


Reactivos y soluciones
Se molieron 30 semillas por cada muestra de maz, en un
El fosfato de sodio dibsico (Cat. 3828), borato de sodio molino Cyclotec 1093 (manufacturado por Foss Tecator,
(Cat. 3568), carbonato de sodio (Cat. 3602), bicarbonato de Hoganas, Sweden) con una malla de acero inoxidable de
sodio (Cat. 3506-05), fosfato de sodio tribsico (Cat. 3836), 0.5 mm. La harina obtenida se desengras con hexano en
fosfato de potasio monobsico (Cat. 3246) y el cloruro un extractor intermitente Soxhlet durante 6 h continuas.
cprico (Cat. 1792-01) se adquirieron con la empresa J. Posteriormente se evapor el excedente de hexano. En
T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA). El cido clorhdrico microtubos se digirieron 30 mg de harina desengrasada con
(Cat. 1.00317.2500) y el acetato de etilo (Cat. EX0240-5) 1.55 mL de la solucin de papana (4 mg mL-1), verificando
se obtuvieron de la empresa Merck KGaA (Darmastadt, la ausencia de partculas de harina adheridas a la paredes
Germany). Con la empresa Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, del microtubo y sin estar en contacto con la solucin de

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extraccin. La solucin de papana sin muestra fue utilizada Cuadro 1. Curva de calibracin para la cuantificacin de lisina.
como blanco. Las muestras se incubaron a 64 C por 16 h, mL de solucin mL de solucin mL de solucin Concentracin
con agitacin por lo menos dos veces durante la primera hora Tubo concentrada de lisina amortiguadora de de papana final de lisina
de incubacin. Se asegur que los microtubos estuvieran (1 000 g mL-1) carbonatos (5 mg mL-1) (g mL-1)
perfectamente cerrados para evitar la evaporacin de la 1 0 2.0 8 0
solucin. Una vez completada la incubacin, los extractos 2 0.5 1.5 8 50
se enfriaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 3 1.0 1.0 8 100
20160 x g por 5 min, para as agregar un sobrenadante libre 4 1.5 0.5 8 150
de partculas de harina. 5 2.0 0 8 200

Reaccin colorimtrica
de cada dilucin y 0.5 mL de la solucin de carbonatos
Se transfirieron 500 L del hidrolizado (sobrenadante) que contiene la mezcla de aminocidos y 0.5 mL de la
a un nuevo microtubo de 1.5 mL y se adicionaron 250 suspensin de cobre. La adicin de solucin de papana con
L de la solucin amortiguadora de carbonatos y 250 concentracin de 5 mg mL-1 y la mezcla de aminocidos,
L de suspensin de cobre. Se agitaron manualmente tiene por objeto garantizar la accin bloqueadora del
durante 5 min y se centrifugaron a 1333 x g por 5 min. Se cobre y evitar sobreestimaciones. El resto de la reaccin
transfirieron 125 L de sobrenadante a un microtubo nuevo colorimtrica se hizo como se describi previamente.
de 2 mL y se adicionaron 12.5 L de reactivo 2-cloro-3,
5-dinitropiridina. Despus de una fuerte agitacin en Validacin del mtodo modificado para la
vrtex, las muestras se protegieron de la luz y se incubaron cuantificacin de lisina
a temperatura ambiente durante 2 h con agitacin cada
30 min; despus de la incubacin se les agreg 625 L de Para verificar la precisin y exactitud de la modificacin
cido clorhdrico 1.2 N y se agitaron nuevamente hasta propuesta, 140 muestras se analizaron tambin por el
homogenizar. Posteriormente, se adicionaron 650 L de mtodo colorimtrico descrito por Villegas et al. (1984) y
acetato de etilo y la solucin se mezcl por inversin de los por NIR (espectrofotometra en el infrarrojo cercano).
tubos por 10 veces; luego se dejaron en reposo para permitir
la formacin de dos fases, y se elimin el sobrenadante Clculos y anlisis estadstico
resultante. El lavado con acetato de etilo se repiti dos veces
ms, pero en la ltima repeticin, despus de mezclar la El porcentaje de lisina se obtuvo al multiplicar la DO
solucin, los tubos se centrifugaron a 1333 x g por 5 min corregida (DO390nm muestra DO390nm promedio de los blancos de papana)
para asegurar la separacin de las dos fases formadas y la a 390 nm por el cociente volumen del hidrolizado/(pendiente
remocin del acetato de etilo. Los tubos con la tapa abierta de la curva estndar x peso de la muestra). Se utiliz un
se colocaron por 5 min en la campana de extraccin para diseo completamente al azar con dos repeticiones. Se
asegurar la eliminacin de cualquier remanente de acetato efectu un anlisis de varianza y comparacin de medias
de etilo, y finalmente se transfiri una alcuota de 200 L a con el mtodo de Tukey ( = 0.05) con el programa SAS 9.2
microplacas de 96 pocillos. La lectura se llev a cabo en un (SAS Institute, 2008).
lector de microplacas (Quant (MQX200), BioTek) para
determinar la densidad ptica (DO) a 390 nm. RESULTADOS Y DISCUSIN

Curva de calibracin Por lo general, en los programas de fitomejoramiento


de maces ACP nicamente se monitorea el contenido de
Semanalmente se prepar una solucin concentrada triptfano, debido a la alta correlacin que existe entre
(1000 g mL-1) de lisina con una solucin amortiguadora el contenido de triptfano y el de lisina, principalmente
de carbonatos 0.05 M con pH 9. La solucin concentrada en programas de conversin de lneas normales a ACP.
de lisina se almacen a 4 oC. La curva de calibracin se Otras razones para monitorear nicamente el contenido de
desarroll diariamente en un rango de 50 a 200 g mL-1 triptfano en programas de mejoramiento de maces ACP
de lisina, para lo cual se diluyeron distintos volmenes de son el costo y el tiempo requerido por el anlisis de lisina
la solucin concentrada en la solucin amortiguadora de con la metodologa propuesta por Villegas et al. (1984),
carbonatos y la solucin de papana (5 mg mL-1), como se segn Vivek et al. (2008). Sin embargo, la modificacin
muestra en el Cuadro 1. realizada en este trabajo ofrece la posibilidad de realizar
ambos anlisis (lisina y triptfano) a un menor costo y en
Posteriormente, en tubos de vidrio se hizo la etapa inicial un mayor nmero de muestras, con ms rapidez del anlisis
de la reaccin colorimtrica, con una alcuota de 1 mL y con un mtodo reproducible.

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Entre las modificaciones realizadas al mtodo de Comparacin de dos mtodos para la cuantificacin de
referencia se incluye la reduccin de reactivos de elevado lisina
costo, como el acetato de etilo, y reduccin de los riesgos al
personal que se encarga de desarrollar este anlisis debido La correlacin para las 140 muestras analizadas con
a la disminucin en la emisin de residuos contaminantes. ambos mtodos fue de 0.96 (Figura 1), aunque se observ
La cantidad de acetato que se requiere para el mtodo una menor correlacin entre los materiales con contenido
aqu propuesto representa solamente 13 % del volumen de lisina menor a 0.3 % (maz normal). Segn Nurit et al.
original. Otra ventaja importante es la reduccin de pasos (2009), este tipo de diferencias son atribuibles a las bajas
para desarrollar la curva de calibracin, lo cual aumenta la concentraciones de lisina y a los mayores errores estndar,
capacidad de anlisis por da. lo que disminuye la precisin de los valores obtenidos. El
valor mnimo detectado con el mtodo modificado es de
El Cuadro 2 muestra el intervalo de valores de la DO para 0.19 % de lisina en grano completo.
cada una de las concentraciones conocidas evaluadas en las
curvas de calibracin desarrolladas y ledas en microplaca.
Los rangos presentados corresponden a 11 curvas de
calibracin efectuadas en diferentes das, con un R2 superior

Lisina (%) por LMP


a 0.98 en cada curva.

Cuadro 2. Rango de densidad ptica (DO) a 390 nm, de la curva de


calibracin de lisina.

Concentracin
Rango de DO a Promedio de Desviacin
de lisina
390 nm DO a 390 nm estndar
(g mL-1)
0 0.119 - 0.148 0.134 0.0084
Lisina (%) por Esp
50 0.158 - 0.185 0.175 0.0091
100 0.209 - 0.250 0.229 0.0154 Figura 1. Correlacin entre el porcentaje de lisina cuantificado
mediante el mtodo en espectrofotmetro (Esp) y la cuantificacin en
150 0.280 - 0.289 0.285 0.0026 microplaca (LPM) (n = 140 muestras).
200 0.297 - 0.324 0.313 0.0080
Con base en la comparacin de medias (P 0.05),
los dos mtodos evaluados no presentaron diferencia
Existen otros mtodos para la cuantificaron de lisina significativa, con medias de porcentaje de lisina de 0.359
que se basan en la reaccin del cido 1-sulfnico-2,4,6- y 0.355 para LMP y Esp, respectivamente. Al comparar los
trinitrobenceno (TNBS) o en la reaccin colorimtrica de datos obtenidos con el mtodo qumico modificado y los
la nihidrina (Beckwith et al., 1975; Obi, 1982). Sin embargo, datos obtenidos por NIR (Modelo Lysun1), la correlacin
stos presentan algunas desventajas, como requerir un obtenida es de 0.83 (Figura 2), valor similar al que se ha
tratamiento previo de la muestra para la remocin de obtenido previamente con dicho modelo y con datos
aminocidos libres o varias filtraciones de soluciones provenientes del mtodo en espectrofotmetro.
durante el desarrollo del anlisis, lo cual demanda ms
manipulacin y tiempo. Se han propuesto tambin
metodologas bacteriolgicas para la cuantificacin de
lisina, pero dado que son mtodos semi-cuantitativos
Lisina (%) por NIR

dependientes del tiempo de crecimiento de las bacterias,


su aplicabilidad en programas de mejoramiento ha sido
restringida (Nurit et al., 2009). El mtodo que aqu se
propone mantiene un proceso de acondicionamiento de
muestras y de hidrlisis enzimtica que requieren poca
manipulacin por parte del personal del laboratorio.

La cromatografa lquida (HPLC) es otra tcnica utilizado


para la cuantificacin de lisina (Paulis et al., 1991). Sin Lisina (%) por Esp
embargo, su elevado costo y tiempo de anlisis hace que esta
Figura 2. Correlacin entre el porcentaje de lisina cuantificado mediante
metodologa no sea una alternativa para apoyar programas NIR y la cuantificacion en microplaca (LPM) (n = 140 muestras).
de mejoramiento.

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Beckwith A C, J W Paulis, J S Wall (1975) Direct estimation of lysine in


Actualmente el anlisis de lisina por qumica hmeda corn meals by the ninhydrin color reaction. Agric. Food Chem.
23:194-196.
tiene un costo de USD$ 7.90 por muestra. Con las Krivanek A F, H De Groote, N Gunaratna, A Diallo, D Friesen (2007)
modificaciones propuestas dicho costo se reduce hasta Breeding and disseminating quality protein maize (QPM) for
en 30 %. Adicionalmente, con la metodologa propuesta, Africa. African J. Biotech. 6:312-324.
un solo tcnico de laboratorio puede analizar hasta 100 Nurit E, A Tiessen, K Pixley, N Palacios-Rojas (2009) Reliable and
inexpensive colorimetric method for determining protein-bound
muestras por da, mientras que con el mtodo de referencia tryptophan in maize kernels. J. Agri. Food Chem. 57:7233-7238.
se requiere el trabajo de dos tcnicos por da para analizar Nuss E, S Tanumihardjo (2011) Quality protein maize for Africa: closing
igual nmero de muestras. the protein inadequacy gap in vulnerable populations. Adv. Nutr.
2: 217-224.
Obi I U (1982) Application of the 2, 4, 6-trinitrobenzene-1-sulfonic acid
El costo del anlisis por NIR es de USD$ 4.3 por muestra (TNBS) method for determination of available lysine in maize
y tiene la ventaja de ser una metodologa que no involucra seed. Agric. Biol. Chem. 46:15-20.
tratamiento previo ni extraccin de la muestra. No obstante, Paulis J W, J A Bietz, R J Lambert, E M Villegas (1991) Identification
un equipo NIR es costoso y se deben tener en cuenta of modified high-lysine maize genotypes by reversed-phase high-
performance liquid chromatography. Cereal Chem. 68:361-365.
los siguientes puntos: 1) Requiere curvas de calibracin Prasanna B M, S K Vasal, B Kassahun, N N Singh (2001) Quality protein
robustas, desarrolladas con un rango amplio de contenido maize. Curr. Sci. 81:1308-1319.
del analito y diferentes germoplasmas; 2) Transferencia SAS Institute Inc (2008) Statistical Analysis System (version 9.2). Cary,
adecuada de curvas de calibracin entre equipos distintos, Noth Carolina, USA.
Sierra-Macas M, A Palafox, O Cano, F Rodrguez, A Espinosa, A
mediante la verificacin de la compatibilidad de los Turrent, N Gomez, H Crdova, N Vergara, R Aveldao, J
programas de cmputo utilizados y de los criterios usados Sandoval, S Barrn, J Romero, F Caballero, M Gonzalez, E
en las ecuaciones generadas. Betanzos (2004) H-553C, hbrido de maz de calidad proteica
para trpico hmedo de Mxico. Rev. Fitotec. Mex. 27:117-119.
Sofi P A, S A Wani1, A G Rather, S H Wani (2009) Review article: Quality
De acuerdo con los resultados obtenidos con el mtodo protein maize (QPM): Genetic manipulation for the nutritional
descrito, se concluye que es viable su implementacin en fortification of maize. J. Plant Breed. Crop Sci. 1:244-253.
los programas de mejoramiento de maces ACP. Dada la Tsai C Y, L W Hansel, O E Nelson (1972) A colorimetric method of
simplificacin y bajo costo de la metodologa descrita, se screening maize seeds for lysine content. Cereal Chem. 49:572-
579.
convierte en una herramienta adecuada para el estudio de Villegas E, E Ortega, R Bauer (1984) Chemical methods used at
la variabilidad del contenido de lisina en maces criollos o CIMMYT for determining protein quality in cereal grains.
nativos como parte de la caracterizacin de la diversidad CIMMYT. Mexico, D. F. 35 p.
gentica del maz. Vivek B S, A F Krivanek, N Palacios-Rojas, S Twumasi-Afriyie, A Diallo
(2008) Breeding quality protein maize (QPM): Protocols for
developing QPM cultivars. CIMMYT. Mexico, D. F. 105 p.
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