Kultur sel 3-dimensi untuk mempelajari infeksi enterovirus pada sel epitel intestinal yang

dipolarisasi

Metode penelitian
Caco-2 cells (ATCC clone HTB-37) di kultur di medium Eagle dengan 10% serum fetal bovide,
asam amino nonessential, penicillin-streptomycin, dan sodium pyruvate. HeLa cells (CCL-2) di
kultur di medium Eagle dengan 5% serum fetal bovide, asam amino nonessential, penicillin-
streptomycin, dan sodium pyruvate. Kemudian ditanam dalam sistem bioreaktor Slow-Turning
Lateral Vessel (STLV). Sel kemudian dilepas dengan trypsin-EDTA 0,025% dan dihitung dengan
perhitungan sel otomatis TC20 dan dikombinasikan dengan 250 mg Cytodex-3 beads dalam 55 ml
media lengkap. Sel yang sudah dicampur ditambahkan ke SLTV steril dan diinkubasi pada suhu
370 pada kondisi statis selama 1 jam sebelum menempel pada sistem kultur sel rotary 4H. kemudian
retractor diputar pada kecepatan 20 rpm dalam incubator yang dilembabkan pada suhu 37oC dan
CO2 5% selama periode kultur. virus di test dengan CVB3-RD atau PV. Untuk semua infeksi, virus
diadsorpsi ke sel selama 1 jam pada suhu 16oC, untuk virus yang tidak terikat dipindahkan dengan
dicuci dengan phosphate buffered saline (PBS). Untuk uji plak, sel Caco-2 atau HeLa yang
terinfeksi CVB diambil pada waktu yang ditunjukkan dengan penguntingan sel. Secara parallel,
supernatant dikumpulkan untuk mengukur titer CVB ekstraselular.
Sel yang dicuci dengan PBS dan disatukan dengan paraformaldehida 4% atau dengan methanol
100% dingin diikuti permeabilisasi dengan 0,25% Triton X-100 di PBS dan inkubasi dengan
antibody primer yang ditunjukkan selama 1 sampai 2 jam pada suhu kamar. Setelah sel dicuci,
mereka diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 30 menit pada suhu kamar, dicuci, dan
dipasang dengan Vectashield (Laboratorium Vektor) yang berisi 4 ', 6-diamidino-2-fenilindola
(DAPI). Gambar ditangkap menggunakan mikroskop pemindaian mikroskop FV1000 confocal
(Olympus) dan kontras dan digabungkan menggunakan Adobe Photoshop. Antibodi atau reagen
lainnya untuk mikroskop fluoresensi adalah sebagai berikut: anti-enterovirus mouse VP1 (NC-
ENTERO; Leica), mouse anti-ZO-1 (daerah tengah; Invitrogen), antiezrin tikus (Millipore),
antioklludin kelinci (daerah N-terminal (Anti-GAPDH), anti-Ganggang (anti-GLUT5), antibodi
anti-GLUT5 (Sigma), kelinci anti-E-cadherin (Invitrogen), anti-gliseraldehid-3-fosfat
dehidrogenase kelinci (anti-GAPDH) (Santa Cruz Biotechnology ), dan Ulex europaeus agglutinin
FITC yang terkonjugasi I (UEA1; Sigma). Kelinci anti-CAR (45) dan mouse anti-DAF IF7
disediakan oleh Jeffrey Bergelson, Children's Hospital of Philadelphia. Antibodi sekunder
terkonjugasi Alexa Fluor dibeli dari Invitrogen
Sel yang di fiksasi 2,5% glutaraldehida, dicuci dengan PBS, dan dipasangkan dengan OsO4 1%
cair. Setelah sel fiksasi dicuci dengan PBS, sampel didehidrasi melalui etanol bergradasi (30%
sampai 100%) dan dicuci dengan etanol absolut sebelum dikeringkan dalam larutan
heksametildisilizana, dilanjutkan dengan pengeringan udara. Untuk kultur 3-D, cakram diambil
dengan pita tembaga dua sisi. Sel-sel tersebut kemudian disematkan di resin Epon dan disepuh
tipis untuk pencitraan dengan menggunakan mikroskop elektron JEOL 1011 atau dikenali batas
pengeringan dan dipasang pada rol alumunium untuk pencitraan dengan mikroskop elektron
scanning (JSM 6330F).
Kemudaian dilakukan immunoblotting dengan cara, Protein lysate dikumpulkan dalam buffer uji
radioimunopresipitasi (RIPA) (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,25% natrium deoksikolat, 150 mM NaCl, 1
mM EDTA) yang mengandung kokase inhibitor protease (Promega). Lysate dipisahkan pada 4 sampai
20% gradien Tris-HCl SDS-gel poliakrilamida, dipindahkan ke membran nitroselulosa, dan diblokir selama
1 jam di PBS yang mengandung (0,5%) Tween 20 (PBST) dan 5% susu. Setelah membran dicuci, mereka
diinkubasi dengan antibodi anti-kelinci atau anti-tikus yang dikonjugasikan ke IRDye 680LT atau 800CW
dan divisualisasikan dengan sistem pencitraan inframerah Odyssey.