COMPOSICION QUIMICA

Los cidos nucleicos estn compuestos por una

reducida variedad de molculas ms pequeas
llamadas nucletidos.
Los nucletidos estn constituidos por:

1- un azcar de 5 carbonos: la ribosa o desoxirribosa

2 - Una base nitrogenada, que puede ser una purina o

pirimidina.

3- Un compuesto de fsforo, el cido fosfrico.

Repasemos lo que es el ADN y el ARN
El AZUCAR
Siempre es un azcar de 5 carbonos. Dependiendo del
grupo que tenga en posicin 2 puede ser desoxirribosa o
ribosa. Por lo tanto hay dos tipos de cidos nucleicos
segn tengan una u otra azcar:

Los cidos ribonucleicos o ARN: que

tienen como azcar a la ribosa.

Los cidos desoxirribonucleicos o ADN:

tienen como azcar a la desoxirribosa.
BASE NITROGENADA
Son compuestos organicos ciclicos que tienen 2 o mas N.
Se asocian al carbono en posicin 1 del azcar.
Presentan uno o dos anillos de C y N, y puede actuar como
una base aceptando iones de H.
Las bases con un solo anillo son las
pirimidinas y las que tienen dos anillos purinas.
 Nucleosido y Nucleotido

La unin del azcar con una La unin entre el nuclesido y

base constituye un nuclesido. el cido fosfrico, da lugar al
nucletido
Los 4 nucleotidos que componen elADN:

Deoxy TTP
(deoxythymidine
Triphosphate)
Las cadenas de nucletidos
que lo forman se enrollan
formando, una en torno a
otra, una estructura
especial que se conoce como
doble hlice ( -hlice ). Son
cadenas complementarias
con direccin opuesta
antiparalela.
 Como es la relacion entre las bases?

guanina
citocina

adenina timina
 ESQUEMA DE UNA DOBLE HEBRA DE DNA

Las uniones
entre las bases
se dan siempre:

A=T

CG

Son uniones
relativamente
dbiles, de tipo
puente de H
La molecula de ADN esta formada por dos hebras de nucleotidos
antiparalelas que forman una doble helice, que se mantienen
unidas por puentes de hidrogeno.
En cambio, las uniones entre el
grupo fosfato de un
nucletido, y el OH del
nucletido siguiente, son de
tipo COVALENTE, uniones
fuertes, que se pueden romper
nicamente por mtodos
bioqumicos.
Veamos rapidamente el ciclo celular

Fase G1: Fase de crecimiento

celular.

Fase G2: la celula ya duplic su

material genetico, y se
prepara para la mitosis.

Fase M: fase de divisin

propiamente dicha.

Fase S: fase de sntesis

Duplicacion del ADN
 Y DNA? S !
por DNA polimerasas DNA-dependientes

Historia: Arthur Kornberg

modelo elegido: E. 1918-2007

coli.. Premio Nobel 1959
1 solo cromosoma
circular
Cuando hablamos de replicacin del ADN, se
mencionan tres caractersticas:

vSemiconservativa

v Bidireccional

v Discontinua o Asimetrica
 La replicacion es Semiconservativa

Significa que como resultado de la

Duplicacion, se obtienen
dos molculas de ADN-dos dobles
hlices- ambas compuestas
por una hebra parental, y una
recientemente sintetizada.
 Naturaleza semi-conservativa de la
replicacin
Demostracin: experimento
de Meselson-Stahl (PNAS, 1958)
Viven!

Confirmacin moderna: E. coli mutante con

mismatch en gen reportero (-gal)
(se ve en clase de problemas)
al dividirse la clula fundadora de la colonia, el mismatch desaparece y genera una clula
hija WT ( progenie derivada WT) y otra mutante ( progenie derivada mutante)

Bender y Kleckner (1986)

Cell 45: 801-815
Tema 6: Estructura y replicacin del 22
material gentico
 Bidireccional
Origenes de replicacion

Como la molecula de ADN es muy larga, existen multiples

Origenes de replicacion para hacer la duplicacion mas rapida
( si lo hiciera a partir de un extremo, tardara 30 das!!!!)
 Discontinua o Asimetrica
Por que? Si yo miro el resultado de la duplicacin, me
encuentro con dos hebras perfectamente formadas,
y sin ningun hueco.

Pero, si analizo el proceso en forma ms detallada, y

paso a paso, ver que la duplicacin no es tan sencilla
como parece.

El problema surge a partir del modo de accin de la enzima

Encargada de agregar los nucleotidos a la cadena en crecimiento
La ADN polimerasa es la encargada de copiar la doble hebra
a partir del ORI, en una de las cadenas.
ESQUEMA DE LA DNA POLIMERASA
Adicin 35
(hipottica)

28
 OH
OH

P
3 5

P P + H2O
P

OH
Adicin 35
OH

(hipottica) 29
P

P
La ADN polimerasa solamente puede agregar
nucletidos a un cadena polinucleotidica que ya
esta apareada con una cadena complementaria,
o, mejor an: necesita un extremo 3libre para
poder comenzar a polimerizar.
No puede INICIAR la sintesis de una cadena
de novo.

Quien le va a dar ese extremo 3libre? Otra

enzima que recibe el nombre de PRIMASA o
ADN primasa. Sintetiza una pequena porcion de
ARN que recibe el nombre de cebador o primer,
de unos 10 nucleotidos de longitud.
 5 3
Como hace la ADN polimerasa para
sintetizar las cadenas en
ambos sentidos?

La DNA polimerasa solamente es

capaz de agregar nucletidos
a partir de un extremo 3libre, y
haciendo crecer la cadena
en sentido 5-3.

NUNCA lo hace en sentido opuesto.

5 3 5 3
Cmo se logra que ambas se cadenas se copien?
En esa hebra problema, otra ADN polimerasa (la ADN
polimerasa ), se adelanta un poco, y sintetiza un fragmento
pequeo.
A medida que la burbuja crece, este ciclo se repite nuevamente.

Estos fragmentos reciben el nombre de

FRAGMENTOS DE OKAZAKI, en honor a su descubridor.
Finalmente, esos cebadores de ARN son removidos o sacados
Por una nucleasa reparadora, y el espacio que queda es
Rellenado por una tercera ADN polimerasa especial, la ADN
Polimerasa

Sintesis de la cadena adelantada

Sintesis de la cadena atrasada

Crece la horquilla
de replicacion

Cadena de ADN
recien sintetizada
EL PROCESO CONSTA DE TRES
FASES: INICIACIN,
ELONGACIN Y
TERMINACIN.
 viendo toda la pelcula
en cromosoma circular
ORI

TER

ORI

velocidad: 2.500 b/seg = 150 kb/min

suficiente para replicar genoma circular de 3 Mb en 20 min
marcacin flurescente de ORI y TER en
bacterias vivas confirma modelo a nivel
posicional

Bates & Kleckner (2005) Cell 121: 899911

 in vivo: Origen de Replicacin (ORI)
genera burbuja y dos horquillas (forks)
(secuencia corta particular)

nico
primer 1ro primer RNA
RNA
DNA

3
2do primer RNA
5

1ro primer RNA

DNA

los primers RNA sern reemplazados por DNA

 FASE DE INICIACIN
Para que el proceso se lleve a cabo con la mxima celeridad, la
duplicacin comienza simultneamente en muchos puntos de la doble
cadena, puntos de iniciacin (oriC) en los que abundan las secuencias
GATC.

...ACGTGATCGGGCTA....ACCGATCACATCGG.....AGGCGATCTTACG...
...TGCACTAGCCCGAT....TGGCTAGTGTAGCC .... TCCGCTAGAATGC...

Los puntos de iniciacin son reconocidos por protenas especficas,

entre las que caben citar a las helicasas, que rompen los puentes
de hidrgeno entre las bases nitrogenadas, las girasas, las
topoisomerasas, y las protenas SSB (single Strand Binding-DNA)
o protenas estabilizadoras de las dos hebras de ADN cuando
estn separadas.

 detalle molecular del mecanismo
Protagonista : DNA Pol III de E. Coli
oligmero con 10 tipos de subunidades (PM = 700 kDa)
sliding clamp sliding clamp

Kornberg pudo separar las subunidades

y luego reconstituir nuevamente la holoenzima
incompleta o completa
 Fidelidad
frecuencias aproximadas de error

In vitro
DNA Pol III de E coli completa: 10-6/sitio
sin : 10-5/sitio

In vivo
tasa de mutacin en E coli: 10-9/sitio
mutante sin : no viable

Fijalkowska et al (1996)
PNAS 93: 2856-2861
 Protenas accesorias, que ayudan a la
Topoisomerasas
DNA Pol III
Clamp loader carga a la en el replisoma
Helicasa separa las hebras molde en la horquilla
ssBP estabiliza ssDNA
Primasa fabrica el primer RNA
DNA Pol I reemplaza al primer RNA al estilo pacman movimiento
del nick. Activ proof-read en el mismo polipptido donde residen sus actividades
polimerasa y 53 exonucleasa a partir de un nick

Ligasa forma el enlace covalente entre dos nt vecinos, elimina el nick

Replicacin del DNA
El replisoma: complejo enzimtico de la
replicacin que coordina la sntesis de las
dos cadenas, maquinaria molecular
Dmero de la DNA pol III (ncleos
catalticos)
Primosoma: formado por dos enzimas
Primasa
Helicasa (desenrolla el DNA)
Protena de unin a cadena sencilla, ssb
(Unin Y, estabiliza el DNA de cadena
sencilla)
Topoisomerasas tipo I (rotura una cadena)
y II (rotura de dos cadenas) junto a DNA
ligasa -> Relajacin del
Tema 6: Estructura superenrollamiento
y replicacin del 43
material gentico
El replisoma: una maquinaria de replicacin extraordinar

Tema 6: Estructura y replicacin del 44

material gentico
 Proteinas que ayudan a desestabilizar la doble helice

5
3

Topoisomerasas I y II
o Girasa y Topo II
El replisoma: una maquinaria de replicacin extraordinar

Tema 6: Estructura y replicacin del 46

material gentico
El replisoma: una maquinaria de replicacin extraordinar

DNA pol III + abrazadera beta -> Enzima procesiva

Tema 6: Estructura y replicacin del 47

material gentico
El replisoma: una maquinaria de replicacin extraordinar

Tema 6: Estructura y replicacin del 48

material gentico
Cual es la funcin de las
topoisomerasas?
Topoisomerasas

Tema 6: Estructura y replicacin del 50

material gentico
 FASE DE ELONGACIN
Se inicia con la enzima PRIMASA, que coloca en cada horquilla unas hebras
cortas de ARN complementarias llamadas CEBADORES en el sentido 5 a 3.
Posteriormente, la ADN polimerasa comienza la sntesis aadiendo
nucletidos en el extremo 3
3
5
PRIMASA

5
3
ADN polimerasa 3

CEBADOR 3
ADN COMPLEMENTARIO 5

La hebra que vemos arriba crece de forma continua, mientras

que la otra lo va a hacer de forma discontinua
 Polimerasas de mamiferos

ENZIMA FUNCIN

Sntesis Hlice retardada. Sntesis del cebador: 10 bases de

ADN Pol
ADN y 25 de ARN.

ADN Pol Sntesis de la Hlice conductora.

Unin de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente

ADN Pol
250 pb).

ADN Pol Sntesis ADN mitocondrial.

 Finalizacion

ORI

TER

ORI

velocidad: 2.500 b/seg = 150 kb/min

suficiente para replicar genoma circular de 3 Mb en 20 min
 Telomeros
Los telmeros son estructuras
nucleoproteicas especializadas
que constituyen las
extremidades de los
cromosomas.

Son regiones de ADN no codificante, altamente

repetitivas, cuya funcion principal es brindar
estabilidad estructural a los cromosomas de las
clulas eucariotas durante:
la divisin celular.
en el tiempo de vida de las estirpes celulares.
 Como lo solucionan las clulas?
 Telomerasas
la enzima que sintetiza el ADN telomrico
y, por tanto, controla la sntesis de los
telmeros, jugara un papel importante en el
proceso de inmortalizacin de las clulas.
Es una transcriptasa inversa que sintetiza
ADN a partir de un molde de ARN. Se trata
de una ribonucleoprotena que contiene en
su molcula la secuencia AAUCCC capaz
de crear e insertar los fragmentos TTAGGG
que se pierden en cada divisin.
 Telomerasas
Cuando la DNA polimerasa llega al
extremo de la cadena de DNA, se
encuentra con otro problema ms, ya
que no tiene molde para copiar.
 CONCLUSIN

La replicacin es un proceso clave en el ciclo celular y necesario para que

se lleve a cabo la divisin celular.

Las ADN polimerasas necesitan siempre un fragmento corto de ARN,

cebador, con un extremo hidroxilo 3 libre para aadir nucletidos. Las
ADN polimerasas siempre recorren la hebra molde en el sentido 3- 5.

Las hebras que se sintetizan en cada divisin celular siempre son

ligeramente ms cortas que las parentales, debido al hueco dejado por
los ARN cebadores.
Como es fcil de adivinar, con las sucesivas divisiones celulares se irn
acortando progresivamente las copias de las nuevas hebras que se
sinteticen. Estos dficits son los causantes de los acortamientos de los
TELMEROS. La prdida de los telmeros trae consecuencias fatales
para las clulas.
 Protenas accesorias, que ayudan a la
Topoisomerasas
DNA Pol III
Clamp loader carga a la en el replisoma
Helicasa separa las hebras molde en la horquilla
ssBP estabiliza ssDNA
Primasa fabrica el primer RNA
DNA Pol I reemplaza al primer RNA al estilo pacman movimiento
del nick. Activ proof-read en el mismo polipptido donde residen sus actividades
polimerasa y 53 exonucleasa a partir de un nick

Ligasa forma el enlace covalente entre dos nt vecinos, elimina el nick

 y en eucariotas? 5 diferencias
1) Muchos ORI (separados por 105 kb) en cada cromosoma
2) Complicacin por histonas
 ms diferencias en eukariotas

3) no todo el tiempo

4) Velocidad = 30 b/seg = 2 kb/min

5) En los extremos de los cromosomas lineales (telmeros), lo
terminales no pueden ser reemplazados por DNA se acorta
de replicacin, excepto en clulas que tienen TELOMERASA
 Resumen de Pols
DNA Pol DNA-dep
ej: DNA Pol III y DNA Pol I de E. coli

DNA Pol RNA-Dep

ej: Trancriptasa Reversa (RT), Telomerasa

RNA Pol DNA-dep

ej: nica de procariotas, realiza transcripcin
RNA Pol I, II y III de eucariotas (transcripcin)
Primasa de prokas y eukas

RNA Pol RNA-dep

Replicasas de RNA virus (no retrovirus)
RNA (ribozima) de supuestos riboorganismos
 Qu clulas tienen Telomerasa
y mantienen el largo de sus telmeros
a lo largo de sus divisiones?
Embrionarias tempranas
Stem cells (clulas madre) derivadas de
embriones (cl. pluripotentes) o las presentes
en tejidos diferenciados
Germinales (= precursoras de gametas)
en situaciones patolgicas: tumorales
(inmortales)
En el labo: lneas celulares (inmortales)
Kary Mullis
hay que mandar a fabricar
PCR (Kary Mullis, 1980s)
in vitro dos primers, c/u aparea
a cada hebra en la regin de inters

95 separac y desnaturaliz
de hebras
50-60 apaream de primers
(no dibujados)
37 extension por la Pol
a partir de primers

Nf = Ni #ciclos-1
mostrando los primers (flechas rojas)

temp depende de
estabilidad de DNA Pol
Mirar video de animacin subida a la pgina web materia o en
youtube::
http://video.search.yahoo.com/search/video?fr=tightropetb&p=PCR+animation#id=1&vid=e
847ed0f0d2a9e75146393cde569edc0&action=click

rectangulitos brillantes simbolizan los

primers.
molcula azul es la Taq Pol
miren el termmetro en el angulo superior
izquierdo, para seguir las tres etapas de cada
ciclo
pero DNA Pol de E. coli se desnaturaliza e
inactiva a altas temp necesidad de
agregar fresca en cada ciclo
entonces se usa DNA Pol de Thermus
aquaticus,
termo-resistente = Taq Pol
 1 duplex

temp depende de % GC

2 duplexe

Termociclador
~ U$ 5.000 .y as sucesivamente
 los productos de amplificacin se analizan por electroforesis
en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio fluorescente, se
intercala entre las bases nitrogenadas. Ojo! txico
 y si la muestra es RNA?

1) Primero hay que convertir RNA en DNA

mediante la Transcriptasa Reversa (RT)

2) Luego se sigue igual que con PCR comn

qPCR (cuantitativa) o PCR en Tiempo Real
usa un intercalante fluorescente

registro de equipo

cuanto menos DNA hay originalmente,

ms tarda en dar seal de amplificacin

nmero de ciclo
qPCR (cuantitativa) o PCR en Tiempo Real

~ U$ 30.000
 Aplicaciones de PCR

p ej en evolucin: amplifica
DNA de Neanderthal
Investigacin
Medicina

Agricultura

Anlisis forenses

filiaciones