COLORACIONES O TINCIONES

1. Resumen

Esta prctica realizada en la Universidad Nacional de Cajamarca se estudi

COLORACIONES O TINCIONES; la prctica se bas estudiar la tincin de Gram,
tambin conocida como coloracin de Gram que es una tcnica de laboratorio que se
utiliza rutinariamente en los estudios microbiolgicos de las bacterias. Fue diseada
por Christian Gram, un cientfico dans, en el ao 1884. El objetivo de Gram era
conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de
bacterias para as poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba result todo un xito y
pronto se convirti en una tcnica muy til no solo para el estudio de las bacterias,
sino tambin para poder identificarlas rpidamente en una infeccin y seleccionar
el antibitico ms adecuado para tratarla.

1. Introduccin
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin
de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide las
bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas.
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se
aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado
tincin primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a todas las
clulas. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo
usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la clula completa o solo
parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las clulas
decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario.

2. Objetivos
Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos,
aligual de la aplicabilidad clnica de la tincin.

Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de

GRAM

Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de

Gram.
 MARCO TEORICO
5.1 TINCIN
5.2 La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examenmicroscpico de las
bacterias. Casi todas las bacterias de importanciaclnica pueden detectarse con este mtodo
Se denomina tincin al proceso y el resultado de teir (otorgar un color a una cosa). El
concepto deriva del vocablo latino tincto.
Es importante destacar que el acto y la consecuencia de
teir tambin se conocen como tintura. De este modo,
mientras que en el lenguaje coloquial suele emplearse la
idea de tintura, en el campo de la qumica y de
la medicina se prefiere el trmino tincin.
En este sentido, se llama tincin a una tcnica que se
emplea en los laboratorios con el objetivo de optimizar
la visin de aquello que se observa a travs de
un microscopio. La tincin, de este modo, consiste en
aplicar una tintura a una sustancia o un tejido para que
resulte ms simple detectarlo y analizarlo.
Con la tincin, es posible mejorar la definicin de grupos de clulas o de fragmentos de tejido,
por citar algunas opciones. Tambin, mediante tinturas especiales, se puede medir la presencia
de ciertas sustancias o elementos en un compuesto.
5.3
COLORANTE

Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catinicos
y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como
los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos (las envueltas externas de los
microorganismos estn por lo general cargadas negativamente).

Segn su naturaleza:
Naturales: Rojos Amarillo (de insectos, plantas, frutos, etc).
Artificiales: Azul de Metileno

Por su afinidad:
cidos: Eosena
Bsicos: Azul de Metileno
Neutros: Ni cido ni bsico, reacciona en ambos. Ejemplo: Para tejidos de sangre -
Wright

dominar los fundamentos y la tincion de gran

TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM.

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los

casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento
explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica
clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales
 adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos
iguales (un clon bacteriano).

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la

desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los
trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).

5.4 DESCRIPCIN DE LA TINCIN DE GRAM.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de
cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las gram positivas
como las gram negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una
solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas gram positivas como las gram negativas se
encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos)
lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su
resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y
disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano).

5.5 TINCIN DIFERENCIAL: Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN)

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias

contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50
a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la
tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-
alcohol resistente. El frotis se tie durante unos 5 min con
Fucsina fenicada aplicando calor suave. Lavar con agua.
Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH
concentrado. Lavar y teir durante 30-60 segundos con Azul de
Metileno (color de contraste). Lavar y secar.
5.6 TINCIN DIFERENCIAL PARA REVELAR ESTRUCTURAS CELULARES.

Mtodo de Wirtz. Algunos gneros bacterianos, entre los que

destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior
formas de resistencia denominadas esporas. Se producen
cuando las condiciones ambientales son desfavorables
(agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas,
radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora
por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora
al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad
de germinar perdura durante aos. La tincin especfica de
esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz
de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de
contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas,
tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado
con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn
teidas con el segundo colorante.

5.7 TINCIN PRIMARIA

Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas moradas.

5.8 MORDIENTE
Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa
la afinidad del colorante primario con la clula, formando
complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-
yodo sirve para intensificar el color del tenido.

5.9 AGENTE DECOLORANTE

Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble funcin:
deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol
disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular
Gram-negativa, haciendo la pared ms porosa. De esta manera,
el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de
murena ms fina de las bacterias Gram negativas, mientras
 que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte
en su interior.

5.10 AGENTE DE CONTRASTE

Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo las clulas
previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

3. Materiales

6.1 MUESTRAS

Solucin Cristal Violeta al 1%

Solucin de Azul de Metileno 1%
Solucin de Safranina al 1%
Solucin decolorante (Alcohol etlico y acetona)
Solucin de Lugol / I2
Cultivo (una colonia)
Agua

6.2 MATERIALES Y EQUIPOS

Asa de siembra
Portaobjetos
Microscopio ptico
Mechero de alcohol
Fsforos

4. Mtodos

Las bacterias se dividen en Cocos y Bacilos, para esta prctica

tomamos especial inters en los estreptococos (cocos), que
 tiene importancia en la Industria Alimentaria por ejemplo
como: Estreptococus Lactis, en forma de cido lctico para la
produccin de quesos y manteca.
Estos cocos tienen 4 procedimientos para su coloracin:
Fijacin y Extensin.
Colonia con agua destilada (extender)
Fijar con calor.
Coloracin Gram.

Preparacin del extendido previa a la coloracin

Se toma un portaobjetoS previamente deSengraSado y Se
coloca en el centro del mismo una gota del cultivo lquido,
mediante ansa de platino. Si el cultivo es slido, se coloca
primero una gota de solucin fisiolgica o agua destilada
estril sobre el portaobjeto. Luego, con ansa de platino se
toma una colonia del medio slido y se emulsiona con la
solucin fisiolgica. Se extiende con el ansa en forma de capa
delgada y uniforme.
Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa
lentamente el portaobjeto, en forma horizontal, sobre la
llama del mechero manteniendo el extendido hacia arriba. La
operacin se repite hasta sequedad total, cuidando evitar la
combustin del extendido.

1. Cristal Violeta:
Alcohol bsico // Bacteria cida

Procedimiento:
Se extrae colonia del cultivo con asa de siembra
(extendiendo)
1 par de gotas en colonia
Esperar 2 minutos.
Lavar el exceso de colorante (a chorro lento).
Se le aplica calor.
Se evala en microscopio.
2. Lugol: Mordiente
Para que quede cristal violeta dentro de la bacteria porque
no tiene ncleo.

Procedimiento:
Ioduro de Potasio.
Se le aade 2 gotas.
Esperar 2 minutos.
Lavar.

3. Decolorante (Alcohol acetona).

Quita color a las clulas
Hidrocarburo (no polar)
Lava grasa (membrana de gran negativo).

4. Colorante de contraste: Safranina - Rojo

Procedimiento:
Agregar safranina por 30 segundos. (Pinta clulas
transparentes, no se lo debe dejar por mucho tiempo
porque ingresar a clula).
Lavar la muestra con agua.
Secar muestra
Evaluar en el microscopio.

5. Resultados
TINCIONES O COLORACIN

MEDIO DE CULTIVO
EXTRACCIN DE 1 COLONIA DE BACTERIAS
ASA ESTRIL CON FLAMA
SE EXTIENDE MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS SE FIJA
BACTERIAS CON MECHERO

SE COLOCA 2 GOTAS DE CRISTAL VIOLETA POR 1 MIN SE LAVA

CON AGUA
CON ACEITE DE INMERSIN, SE EVALA EN MICROSCOPIO GRAM
POSITIVAS, COLORACIN AZUL

MEDIO
DE CULTIVO EXTRACCIN DE 1 COLONIA DE BACTERIAS
ASA ESTRIL CON FLAMA
SE FIJA BACTERIAS EN MECHERO DE ALCOHOL
SE EXTIENDE MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS

SE

COLOCA 2 GOTAS DE CRISTAL VIOLETA POR 1

MIN SE LAVA CON AGUA
SE LAVA CON ACETONA SE VIERTE SAFRANINA POR
30 SEGUNDOS
 SE LAVA CON AGUA CON ACEITE
DE INMERSIN,
SE EVALA EN
MICROSCOPIO 100X

GRAM
NEGATIVAS,
COLORACIN ROJA

dISCUSIN

La reaccin a la tincin de Gram est basada en la diferencia en la composicin qumica de

la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de
peptidoglicano o murena, mientras que esta capa es ms fina en las Gram-negativas y est
rodeada por una bicapa lipdica externa. El Peptidoglicano es un polisacrido formado por
dos subunidades qumicas, N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico. (Eduardo
Santambrosio, 2009). Las paredes de las bacterias Gram Positivos presentan en su pared de
 80 90% de Murena Peptidoglucano y en las Gram Negativas, presentan una pared con
contenido de murena de 5 20% y que posee tambin una 2da membrana externa de
lipopolisacridos (grasas). (Mariana Jurez, 2012).

El cristal violeta es bsico (se une a componentes celulares de carga negativa). Atraviesa la
envuelta celular y se acumula en el citoplasma. Para facilitar la diferenciacin se mezcla
lugol con cristal violeta: el complejo cristal-violeta-lugol precipita. As el lugol dificulta la
salida del cristal violeta de ambos tipos de clulas, pero es ms fcil de extraerlo de las
Gram negativas que de las Gram positivas. (David Saceda Corralo, 2015).

Cuando se aade etanol a una mezcla de clulas Gram positivas y Gram negativas teidas
con cristal violeta, las clulas Gram positivas quedan teidas de violeta: no puede atravesar
la gruesa capa de murena (pueden hacerlo si se prolonga excesivamente el contacto con el
alcohol). La pared de las bacterias Gram negativas debe su rigidez a una capa de murena
ms delgada, a travs de la cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas clulas. Su
citoplasma queda incoloro y puede teirse de color rosa con el colorante de contraste: la
safranina. (David Saceda Corralo, 2015).
LUEGO DEL PERIODO DE INCUBACION UBO DESARRROLO PURO DE
PEQUEAS COLONIAS
LA TENSION REBELO LOS BACILIOS COCUS NEGATIVOS

1. Conclusin

Bacterias Gram positivas: Corresponden a las bacterias que mantienen la coloracin del
cristal violeta despus del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado.

Bacterias Gram negativas: Corresponden a las bacterias que pierden la coloracin del
cristal violeta despus del alcohol acetona y se tien con el colorante de contraste
(safranina), lo que les da un color rosceo/rojizo.

Lo ms recomendable es realizar el gram de los cultivos de agares enriquecidos y de

colonias aisladas y en crecimiento

El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso latincin de estas en la
microbiologa es un apartado sumamente trascendente.

La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y elmedio que
la rodea, y una de las ms importantes, tanto por su aplicacinclnica para hacer una
identificacin preliminar de la bacteria causal de lainfeccin y por su practicidad, es la
tincin de Gram. Es por eso que estatcnica se vuelve fundamental en el estudio de la
microbiologa

2. Bibliografa
 David Saceda Corralo, 2015. En: TINCIN GRAM. Recuperado de:
http://www.webconsultas.com/categoria/autores/david-saceda-licenciado-en-medicina-por-
la-universidad-de-alcala-de-henares

Mariana Jurez, 2012. En: TINCIN GRAM PRCTICA 2. Recuperado de:

http://www.slideshare.net/Mardj/prctica-2-tincin-de-gram

Eduardo Santambrosio, 2009. En: TINCIN Y OBSERVACIN DE

MICROORGANISMOS. Recuperado de:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf