Universidad Andrs Bello

Facultad de ciencias biolgicas

Laboratorio de bio-133
Profesore: Alejandro Arriagada

TRABAJO PRCTICO N9:

Organizacin subcelular.

BIO133

02-11-2017 Autores: Paula Janampa

Rodolfo Castillo
Introduccin.
Hace 3.5 billones de aos aparecieron las primeras clulas las cuales eran simples y pequeas similares a las
que hoy conocemos como procariontes, por otro lado, se han desarrollado a travs del tiempo otras clulas
llamadas eucariotas las cuales son ms complejas y ms grandes. Commented [pc1]: explica como son mas complejas

Estas clulas eucariontes tienen varios componentes llamados organelos, los cuales son: Mitocondrias, Ncleos,
Membrana Plasmtica, Cloroplastos, Retculo Endoplasmtico, Peroxisomas, Lisosomas, Aparato de Golgi,
Citoesqueleto. (1)
As como las clulas pueden ser extradas de un tejido, los organelos y macromolculas pueden ser extrados de
las clulas, para esto se usa el fraccionamiento celular, el cual consiste en una serie de procesos y tcnicas las
cuales nos pueden ayudar a observar/estudiar de manera precisa las partes de las clulas. (2)
En este informe se presenta un ejemplo de la ejecucin de algunos de los procesos que se pueden usar para el
fraccionamiento celular.

Objetivos.
El objetivo general del presente trabajo consiste en reconocer los componentes subcelulares y su observacin a
travs de un microscopio.
Conocer las tcnicas de homogeneizacin usadas en el fraccionamiento subcelular.
Comprender los fundamentos de la tcnica de centrifugacin usada en el fraccionamiento celular.
Comprender el concepto de molculas marcadoras y su utilidad en la evaluacin del fraccionamiento
subcelular.

Materiales y mtodos.
Se proporciono un trozo de hgado de pollo previamente lavado con suero fisiolgico (NaCl 0.15M) para
eliminar los restos de sangre, en el cual se toma un trozo del tejido y secndolo con una toalla de papel se
transfiere a un vaso precipitado que se encuentra en hielo, usando unas tijeras se corta el tejido en trozos
pequeos al cual se le agrega la solucin tampn de homogeneizacin (sacarosa 0.25M, cloruro de calcio 3mM
y Tris-HCL 20mM; pH 7.4), el cual tambin permanece en hielo y se tendr que suspender el tejido con esta
solucin, luego se transfiere a un homogeneizador para romper el tejido.
El tejido homogeneizado se filtra atreves de un embudo que contiene gasa y se deposita en un tubo limpio el
cual se mantiene en hielo (HC); la muestra en el tubo se centrifuga (1000 rmp x 2 min), del cual se extrae S1
(sobrenadante) en otro tubo, el sobrante del primer tubo son los ncleos (FN) al cual se le agrega 2ml de suero
fisiolgico para re-suspender los ncleos, y en 2 portaobjetos se agrega una gota de la muestra y en uno de los
portaobjetos una gota de azul de tripan, para la observacin en microscopio.
El S1 se centrifuga a 6000 rpm x 20 min, luego se extrae el S2 en un nuevo tubo y el contenido sobrante de la
S1 (FM) se le practica el mismo mtodo de la FN. La muestra S2 que contiene la fraccin microsomal (FMicro)
y los ribosomas se mantienen en frio.
En 5 tubos de ensayo rotulados como Blanco (B), HC, FN, FM y FMicro se le agregan las soluciones indicadas
en la tabla, despus se agrega vaselina (2mL aprox.) liquida para evitar que la muestra reaccione con l oxgeno.
Tubo Succinato Azul de Agua Solucin HC FN FM FMicro
0.1 M metileno destilada de
sacarosa
B 1mL 1mL 1mL 1mL --- --- --- ---
HC 1mL 1mL 1mL --- 1mL --- --- ---
FN 1mL 1mL 1mL --- --- 1mL --- ---
FM 1mL 1mL 1mL --- --- --- 1mL ---
FMicro 1mL 1mL 1mL --- --- --- --- 1mL

Resultados.
FN
Muestra: fresca.
Objetivo: 40x.
Tincin: ninguna.
Observacin: se distinguen con dificultad a falta de tincin, presenta glbulos
rojos y partculas irregulares.

FN
Muestra: fresca.
Objetivo: 40x.
Tincin: azul de tripan.
Observacin: se distinguen formas redondeadas de un azul ms fuerte, lo que se
asume que son nucleos.

FM
Muestra: fresca.
Objetivo: 40x.
Tincion: ninguna.
Observacin: formas semi circulares translucidas.
FM
Muestra: fresca.
Objetivo: 40x.
Tincin: ninfuna
Observacin: no se pudo observar estructuras.
FM
Muestra: fresca.
Objetivo: 40x
Tincin: azul de tripan
Observacin: formas circulares ms azules que el habiente.

Discusin.
Esto resultados se obtuvieron debido al azul de tripn, que se le conoce como un colorante bsico, que se une al
ADN localizado dentro de los ncleos, y que los colorantes bsicos se unen a ella cuando se encuentra ionizada.
En el primer caso, al no tener azul de tripn, nada marcaba al ADN, por lo que, no se podan ver los ncleos con
claridad, que al no estar marcados con el microscopio ptico no se logra identificar. En cambio en el segundo
caso, los puntos azules, si correspondan a los ncleos, ya que, en esta muestra si contena azul de tripn, por lo
que, su ADN fue marcado logrando ver los ncleos. (2)
Para poder evaluar el fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares, primero se colocaron en
distintos tubos de ensayo muestras obtenidas, a travs, de una centrifugacin diferencial, la cual separa la
muestra dependiendo del tamao de cada componente celular del hgado de pollo, el cual fue tratado con un
buffer de suero salino0,9% cloruro de sodio, para evitar que las clulas se reventaran adems, se homogeneizo
con el Ultra-Turax, para obtener un homogeneizado total, que es filtrado para que este no est contaminado,
obtenindose el homogeneizado crudo (HC). Parte de este HC es guardado, y la otra parte centrifugada 2 veces
a distintas velocidades y distintos tiempos para obtener el fraccionamiento celular.

Bibliografa.
(1) Universidad Andrs Bello, gua n 9 Organizacin subcelular, laboratorio de biologa celular 133, pagina 70.
(2) Universidad Andrs Bello, gua n 9 Organizacin subcelular, laboratorio de biologa celular 133, pagina 73.