DETERMINACION FENOTIPICA Y BIOQUIMICA DE Salmonella.

a Diana Marcela Galindo, b Richard Andrs Martnez, c Tatiana Zapata Gualtero.

a
diana.marcela.galindo@gmail.com, b richmart1996@gmail.com, c tatozetag@gmail.com
a, b y c
Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Bsicas, Programa de
Microbiologa, Laboratorio de Microbiologa de Alimentos,
Santiago de Cali, Colombia.
Noviembre 09 de 2017.

RESUMEN.
La salmonella en una bacteria gram negativa comn en ciertos alimentos como carnes, pollo,
huevos leche y sus derivados, pero en altas concentraciones provoca una enfermedad llamada
salmonelosis. La capacidad de causar enfermedades genera la necesidad de la bsqueda,
control e identificacin de este y otros microorganismos para evitar as crisis en la salud
pblica, por ello se desarroll esta prctica donde se busca identificar salmonella inoculada
en caldo selectivo selenito, asilada en agar Hecktoen y posteriormente realizar las pruebas
bioqumicas con las que revelan un conjunto de actividades metablicas nica en cada
especie, encontrndose Salmonella entendiritis en la muestra de alimento.

Palabras Clave: Salmonella, pruebas bioqumicas, Hektoen.

1. INTRODUCCIN.

El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae (ver Tabla 1) y est

constituido por bacterias Gram-negativas, intracelulares facultativas, que se han agrupado en
las especies S. enterica y S. bongori. Sin embargo, el potencial patognico est representado
por S. enterica y por sus ms de 2.600 serotipos descritos hasta la fecha. Aquellos serotipos
causantes de enfermedad en animales de sangre caliente pertenecen a la sub-especie enterica,
y comparten ms de 90% de su ADN. Sin embargo, tienen diferencias importantes tales como
el rango de hospederos a los cuales infectan y los sntomas clnicos de la enfermedad que
producen (Barreto, Castillo Ruiz , & Retamal, 2016).
La Salmonella son un grupo de bacterias que estn presentes en el intestino de personas y
animales sanos, de forma que las heces son el principal foco de contaminacin a los alimentos
y al agua. Cuando llega a los alimentos frescos, tiene la habilidad de multiplicarse muy
rpidamente, y cuando una persona ingiere dicho alimento contaminando, el gran nmero de
bacterias provoca salmonelosis, infeccin gastrointestinal provocada por dicha bacteria
(elika, 2013). Se estima que el 90-95% de los casos de salmonelosis estn asociados al
consumo de alimentos contaminados, otras vas de trasmisin incluyen: contacto con
personas infectadas, animales infectados (recientemente por reptiles utilizados como
mascotas siendo los nios el grupo ms importante) (Ministerio de la Proteccin Social,
2011). Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de
Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de
preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos
y diferenciales, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos
(Espinosa Garca, 2015).
La globalizacin del comercio de alimentos obliga tanto a los pases importadores como
exportadores a reforzar sus sistemas de control de alimentos basados en los perfiles de riesgo,
que consideren principios de carcter cientfico y que abarquen todos los actores de la cadena
alimentaria (Ministerio de la Proteccin Social, 2011). Por tanto, se han creado tcnicas de
identificacin de microorganismos. La identificacin fenotpica bacteriana se basa
fundamentalmente en la comparacin de las caractersticas fenotpicas de bacterias
desconocidas con aquellas de cultivos tipo. La fiabilidad de la identificacin esta en
proporcin directa al nmero de caractersticas similares (Fernndez Olmos , Garca de la
Fuente, Saz Nieto , & Valdezate Ramos, 2010).

Tabla 1. Taxonoma para la bacteria Salmonella (Parra, Durango, & Mttar, 2002).
Taxonoma (Salmonella)
Dominio Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Gammaproteobacteria
Orden Enterobacteriales
Familia Enterobacteriaceae
Gnero Salmonella

2. METODOLOGIA.
Para la identificacin fenotpica y bioqumica de Salmonella la prctica se dividi en dos
partes (A-B).

PARTE A. Identificacin fenotpica.

Inicialmente se desinfect con alcohol al 70% el sitio por donde se extrajo la muestra y se
abri asptica y adecuadamente la muestra. Despus, se mezcl para asegurar su
homogenizacin, en este punto se pesaron 25 g de una muestra de pastel casero y se aadieron
a 225 mL de caldo lactosado. Seguidamente, se homogeneiz la muestra con el diluyente
durante 10 minutos, despus, la docente nos proporcion una cepa de Salmonella ATCC pura
en agar Hektoen, de la cual se tom una colonia y se inoculo en el caldo, se incubo a 35C
+/-2 por 18 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin, se transfiri 1 mL de cultivo
obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 mL de Caldo selenito y se incubo en bao a
35C +/- 0.2 por 18-24 horas. Posteriormente, a las 24 horas se realiz una siembra por
agotamiento de estra por duplicado en Agar Hektoen en cual se dej en incubacin a 35C
+/- 0.2 por 18-24 horas.

Figura 1. Metodologa utilizada para la identificacin fenotpica de Salmonella (Parte A)

(Fuente: Zapata, T).

PARTE B. Identificacin mediante pruebas bioqumicas.

Para la identificacin de Salmonella por pruebas bioqumicas inicialmente a partir de una
cepa de Salmonella ATCC pura, se tom una colonia, se resembro en Agar Nutritivo y se
incubo a 35C +/- 0.2 por 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin, se sembraron las
pruebas bioqumicas como se describe en la siguiente tabla:
Tabla 2. Descripcin de siembra e interpretacin de pruebas bioqumicas realizadas para la
identificacin de Salmonella (Perz Luna, Caicedo, & Rivera, 2014)
Prueba Siembra Interpretacin
Citrato Siembra por estra en La prueba es positiva cuando se observa crecimiento
superficie con un color azul intenso. La prueba es negativa si no
se observa cambio de color y/o crecimiento.
MIO Asa recta en Resultado positivo: color prpura.
profundidad Resultado negativo: color amarillo.
LIA Asa recta en A: Reaccin cida. Color amarillo
profundidad y estra K: Reaccin alcalina. Color violeta
en superficie. R: Reaccin alcalina: color rojo
K/K: Descarboxilacion lisina
K/A: Fermentacin glucosa. Descarboxilacion lisina
R/A: Desaminacion lisina. Fermentacin glucosa
UREA Siembra por estra en La prueba es positiva cuando se observa cambio de
superficie color al rosado. La prueba es negativa cuando no hay
cambio de color.
TSI Asa recta en Reaccin Acida: Color amarillo
profundidad y estra A/A: Fermentacin 3 azucares
en superficie. K: Reaccin alcalina. Color rojo naranja
K/A: Fermentacin de la glucosa
Burbujas: Produccin de gas
K/K: No hay fermentacin de los 3 azcares
Precipitado negro: Formacin H2S

Figura 2. Metodologa utilizada para la identificacin de Salmonella mediante pruebas

bioqumicas (Parte B) (Fuente: Zapata, T).

RESULTADOS
En la Figura 3 se muestra el resultado de la siembra por agotamiento de estra en agar
Hektoen, realizada a partir de un caldo con una muestra de pastel inoculado con Samonella.
En el resultado, se puede observar un crecimiento de las colonias color azul verdoso (parecido
al color del medio), tambin, algunas colonias presentan un centro verde oscuro. Este tipo de
fenotipo se asocia con el de la Salmonella cuando crece en agar Hektoen.

Figura 3. Resultado de la siembra por agotamiento de estra realizada a partir de un caldo

con una muestra de pastel inoculado con Samonella.

En la Figura 4 se presenta el resultado obtenido de las pruebas bioqumicas realizadas a partir

de la siembra en agar Hektoen. Se pudo observar que para Citrato dio positivo, en MIO dio
positivo, LIA dio K/K (Descarboxilacin de la lisina), UREA dio negativo y en TSI se obtuvo
K/A + H2S (Fermentacin de glucosa y formacin de cido sulfhdrico).

A B C D E
 Figura 4. Resultado obtenido de las pruebas bioqumicas realizadas a partir de la siembra
en agar Hektoen. Donde, (A) Citrato positivo, (B) MIO positivo, (C) LIA K/K
(Descarboxilacin de la lisina), (D) UREA negativo y (E) TSI K/A + H2S (Fermentacin de
glucosa y formacin de cido sulfhdrico).

En la siguiente Tabla 3 se exponen los posibles resultados y porcentajes de las pruebas

bioqumicas para identificar la especie de Salmonella proporcionada por la docente
Tabla 3. Posibles resultados y porcentajes de las pruebas bioqumicas para identificar la
especie de Salmonella proporcionada por la docente (Perz Luna, Caicedo, & Rivera,
2014).
Genero Salmonella
Prueba/Especie typhi enteritidis choleraesuis Paratyphi A arizonae
K/A K/A K/A K/A A/A
TSI
100% 100% 100% 100% 85%
GAS 0% 98% 95% 100% 99%
H2 S 97% 88% 50% 10% 99%
CITRATO 0% 93% 25% 0% 99%
UREA 0% 0% 0% 0% 0%
MOVILIDAD 97% 95% 95% 100% 99%
K/K K/K K/K K/A K/K
LISINA
98% 95% 95% 100% 100%
K/A K/K K/K K/K K/K
ORNITINA
100% 97% 100% 95% 100%
INDOL 0% 1% 0% 0% 2%

A partir de la Tabla 3 se pudo establecer que la posible especie que se trabajo fue Salmonella
enteritidis. En la Tabla 4 se muestran los valores dados para la especie Salmonella enteritidis.

Tabla 4. Valores dados para la especie Salmonella enteritidis.

Salmonella enteritidis
Prueba/Especie
Resultado Valor
TSI 100% 1,00
GAS 98% 0,98
H2 S 88% 0,88
CITRATO 93% 0,93
UREA 0% 1,00
MOVILIDAD 95% 0,95
LISINA 95% 0,95
ORNITINA 97% 0,03
 INDOL 1% 0,99
Total 7.71
0,86

3. ANLISIS DE RESULTADOS.
En esta prctica de laboratorio se hizo una determinacin fenotpica para Salmonella en un
pastel casero. Como resultado, se pudo observar un crecimiento de las colonias color azul
verdoso (parecido al color del medio), tambin, algunas colonias presentan un centro verde
oscuro. Este tipo de fenotipo se asocia con el de la Salmonella cuando crece en agar Hektoen
(ver figura 3). Es importante saber que cualquier alimento con la posibilidad de contaminarse
con materia fecal humana o animal puede ser una potencial fuente de infeccin de
salmonelosis. Por otro lado, errores cometidos durante el manejo en la cadena alimentaria
transforman e incrementan el riesgo potencial de multiplicacin bacteriana.
Por otra parte, se utilizaron cinco pruebas bioqumicas para la identificacin de salmonella
(ver Figura 4), la primera prueba fue TSI (Triple Sugar Iron) el cual permite observar la
fermentacin y utilizacin de hidratos de carbono, adems de la produccin de H2S a partir
de glucosa, lactosa, sacarosa y rojo fenol, indicador de pH sulfato ferroso el cual vira a
amarillo por la formacin de cido a partir del carbohidrato (Pachn Cubillos, 2009). En este
medio se buscaba determinar la capacidad de la bacteria para degradar los azcares y la
formacin de gas y de H2S. La fermentacin aerbica se produce en el pico de tubo y la
anaerbica en el fondo del tubo. La degradacin de la lactosa ocurre en la parte superior, la
de la sacarosa en la parte intermedia y la de la glucosa en la parte profunda, producindose
un viraje del rojo al amarillo. El tiosulfato es reducido a H2S quien reacciona con el citrato
frrico amoniacal para dar formacin al sulfuro de fierro que es de color negro. La presencia
de gas se debe al CO2 producto de la fermentacin. Como resultado de este ensayo, se
evidenci una fermentacin de glucosa (K/A) es decir, que el pico de flauta alcalino y fondo
cido caracterstico de un fermentador de lactosa, adems con la formacin de H2S y
produccin de gas. La segunda prueba que se realiz fue LIA (Lisina descarboxilasa), donde
se evidencia que la descarboxilacin de lisina ocurre en ambiente anaerbico, es decir que en
el fondo del tubo se pone de manifiesto por la alcalinizacin del medio produciendo un viraje
del indicador prpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA
determina primero una reaccin de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de
color del medio a amarillo y el pH favorable para la reaccin de descarboxilacin que ocurre
despus, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo (lvarez Hidalgo,
2015). El resultado arrojado en esta prueba fue (K/K) lo que significa que hubo una
descarboxilacin de lisina produciendo cido cetocarbonico que al combinarse con la sal de
hierro y en presencia de oxgeno formaron un color violeta.
La tercera prueba fue citrato de Simmons, el cual consiste emplear el citrato como nica
fuente de carbono en ausencia de fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico.
Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la
coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene
tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como nica
fuente de carbono tambin es capaz de utilizar las sales de amonio como nica fuente de
nitrgeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH3-) con la consiguiente
alcalinidad del medio (Murcia Aranguren, 2006). El indicador de pH es el azul de bromotimol
el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul como es fue el resultado obtenido para
esta prueba.
Por otra parte, el cuarto ensayo de las pruebas bioqumicas fue por medio de urea de
Christensen, ya que determina la capacidad de un microorganismo de producir ureasa y
desdoblar la urea, formando dos molculas de amoniaco. El sustrato urea es una diamina del
cido carbnico, denominada carbamida. Todas las amidas (RCO-NH2) son rpidamente
hidrolizadas. La hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica que es la ureasa
es una enzima microbiana importante, relacionada con la descomposicin de los compuestos
orgnicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima
adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria solamente cuando se
encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una enzima constitutiva ya que la
sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea (Rodrguez, 2016).
El indicador de pH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando
una prueba positiva. Si el color es amarillo indica una prueba negativa como dio en este
resultado y confirmando que bacterias Gram-negativas como salmonella no degradan la urea.
Por ltimo, la prueba a realizar fue MIO (Movilidad indol ornitina), este medio como su
nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccin de indol y descarboxilacin
de la ornitina. La movilidad se detectar por la presencia de turbidez alrededor del punto de
inoculacin, como se pudo observar en este anlisis.
Por otro lado, al analizar mediante las pruebas bioqumicas, se utilizaron unas tablas para la
identificacin de salmonella; mostrando el gnero, especie y los valores porcentuales de las
pruebas bioqumicas (ver Tabla 4) arrojando que el valor promedio obtenido fue cercano a
1 para Salmonella enteritidis, se determina que la posible especie trabajada en esta prctica
de laboratorio fue esta.
http://www.elika.eus/datos/pdfs_agrupados/Documento82/1.Salmonella.pdf
http://www.scielo.cl/pdf/rci/v33n5/art10.pdf
http://www.ins.gov.co/lineas-de-
accion/investigacion/ueria/Publicaciones/PERFIL%20SALMONELLA%20SPP.pdf

http://bvs.panalimentos.org/local/File/manual_salmonella_2008.pdf

4. CONCLUSIN.

El alimento contena Salmonella entediritis pero se desconoce la causa de la presencia de este

microorganismos.se puede deber a la contaminacin de los ingrediente y un mala
preparacin. Por lo que es un requerimiento seguir los estatutos establecidos por salud pblica
para evitar incidente que afecten

Las pruebas bioqumicas son una prueba fiable y rpida para la identificacin de
microorganismos dainos para la salud como la salmonella, pero en caso de querer tener
certeza del microorganismo o confirmar el resultado se recomienda pruebas genticas.

5. REFERENCIAS.

Barreto, M., Castillo Ruiz , M., & Retamal, P. (2016). Salmonella enterica: una revisin de
la triloga agente, hospedero y ambiente, y su trascendencia en Chile. Rev Chilena
Infectol , 33(5), 547-557. Obtenido de http://www.scielo.cl/pdf/rci/v33n5/art10.pdf
elika. (28 de Febrero de 2013). Salmonella. Obtenido de
http://www.elika.eus/datos/pdfs_agrupados/Documento82/1.Salmonella.pdf
Espinosa Garca, L. N. (2015). Evaluacin sanitaria del queso fresco artesanal en el Ejido
Chihuahua, La Trinitaria Chiapas. Tesis, Universidad Autnoma Agraria Antonio
Narro, Torren. Obtenido de
 http://repositorio.uaaan.mx:8080/xmlui/bitstream/handle/123456789/6894/EVALU
ACIONSANITARIAQUESOFRESCOARTESANAL.pdf?sequence=1&isAllowed=
y
Fernndez Olmos , A., Garca de la Fuente, C., Saz Nieto , J. A., & Valdezate Ramos, S.
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eimc. Obtenido de
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiol
ogia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
Ministerio de la Proteccin Social. (2011). Perfil de riesgo Salmonella spp. (no tifoideas)
en pollo entero y en piezas. Bogot: Imprenta Nacional de Colombia. Obtenido de
http://www.ins.gov.co/lineas-de-
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Parra, M., Durango, J., & Mttar, S. (2002). Microbiologa, patognesis, epidemiologa
clnica y diagnstico de las infecciones producidas por Salmonella. MVZ-
CRDOBA, 7(2), 187-200.
Perz Luna, V., Caicedo, L., & Rivera, S. P. (2014). Indentificacin bioqumica de
Enterobacterias. Guia de laboratorio. Cali, Colombia.
Pachn Cubillos, D. A. (2009). AISLAMIENTO, IDENTIFICIN Y SEROTIPICACIN EN
ENTEROBACTERIAS DEL GNERO SALMONELLA EN UNA POBLACIN
CROCODYLUS INTERMEDIUS. Bogot.

lvarez Hidalgo, E. B. (2015). Pruebas Bioqumicas y Medios de cultivo 2 Laboratorio de

Biodiversidad de los Microorganismos. Mxico.

Murcia Aranguren, M. (2006). IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS. Academia.

Rodrguez, A. (2016). DETERMINACIN BACTERIANA. Univ. Autnoma de

Chapingo.Mxico.