Puntos importantes:

El elemento que mejor la tcnica fue el descubrimiento de las ADN polimerasas

termoestables y termoactivas (que no pierden su actividad con temperaturas altas).
En 1976 se aisl la primer polimerasa termoestable conocida como Taq polimerasa, a
partir de la bacteria Thermus aquaticus que vive en ambientes acuticos con temperaturas
cercana a los 100 C. Esta nueva enzima permiti la simplificacin y automatizacin de la
PCR, sin necesidad de adicionar polimerasa en cada uno de los ciclos.
La Taq polimerasa es la enzima ms utilizada en la PCR, pero presenta la desventaja de
que no tiene actividad correctora (actividad nucleasa 3 5), solo presenta la actividad
nucleasa 5 3; por lo que existe la probabilidad de introducir errores durante el copiado
del ADN. Afortunadamente, se han encontrado ADN polimerasas termoestables,
termoactivas y de alta fidelidad (con actividad correctora) provenientes de bacterias del
dominio Archaea, como la ADN polimerasa Pfu de Pyrococcus furiosus que si tiene
actividad correctora (actividad nucleasa 3 5).
Este protocolo est diseado para la amplificacin de fragmentos estndar que no
sobrepasan las 2 kb (dos mil bases). Es necesario seleccionar previamente la o las regiones
a amplificar as como seleccionar o disear los iniciadores, de acuerdo con los objetivos de
la investigacin. Asimismo se deben establecer las condiciones de amplificacin de la PCR
y las concentraciones de los reactivos.
Pueden agregarse otros compuestos que ayudan a la estabilidad de la polimerasa.
La etapa de extensin se realiza a 72 C porque es la temperatura a la cual la Taq
polimerasa (enzima ms utilizada) alcanza su mayor actividad. El tiempo de extensin
depende de la longitud del fragmento a amplificar, la Taq polimerasa aade de 500 a 1000
nucle- tidos por minuto.
En cualquier PCR es muy importante utilizar siempre un control negativo, un tubo que
contenga todos los reactivos menos el ADN molde, para poder monitorear posibles
contaminaciones.
En qu consiste el control negativo en una PCR? Se trata de una muestra en la que se
incluyen todos los componentes de la reaccin, excepto el DNA.
Qu utilidad tiene el control negativo en una PCR? Los componentes de la PCR se
almacenan a -20C a una concentracin superior a la que luego se utilizan en la reaccin.
Del producto almacenado se utiliza una cantidad determinada cada vez que se prepara
una PCR, de manera que si un componente no se agota, el remanente se utiliza para otra
reaccin. En consecuencia, es posible que al tomar una alcuota del original se produzcan
contaminaciones con DNA procedente de alguna muestra. Tambin es posible que
durante el proceso de preparacin de la reaccin, por un error de manejo, se produzca
contaminacin cruzada entre muestras. El control negativo se utiliza para comprobar que
ninguno de los componentes de la reaccin est contaminado con DNA de otra
procedencia y que no se han producido errores de manejo que hayan provocado la
contaminacin cruzada entre muestras.
 Se detectar la contaminacin aunque haya sido producido por poco DNA? En principio,
con poca cantidad de DNA molde se obtendr producto de amplificacin, ya que la PCR es
muy sensible; dado que en cada ciclo se duplica la cantidad de DNA correspondiente al
fragmento a amplificar, aunque exista poco molde inicial se generar la cantidad suficiente
para ser visualizada.
Tambin es recomendable usar un control positivo, que consiste en una muestra que
sabemos amplifica sin problemas bajo las condiciones establecidas. Este control es muy
til para asegurarnos que los reactivos ocupados se encuentran en condiciones
apropiadas.
No es aconsejable realizar ms de 40 ciclos porque los productos inespecficos, no
deseables, se forman en mayor proporcin cuando el nmero de ciclos es mayor. Despus
de un nmero determinado de ciclos, la amplificacin deja de producirse de manera
exponencial y llega a una fase estacionaria.
La manera ms comn de evaluar si se logr una amplificacin exitosa es a travs de la
visualizacin del fragmento amplificado mediante electroforesis en geles de agarosa o
acrilamida se recomienda cargar el 50% del volumen del control negativo con el objetivo
de visualizar cualquier amplificacin que nos pueda dar indicio de una probable
contaminacin de los reactivos de PCR. En caso de que no haya producto amplificado o
que ste tenga un bajo rendimiento, se recomienda cambiar las condiciones de la PCR
(temperatura y concentraciones de los reactivos), as como supervisar el correcto
funcionamiento del termociclador.
Desoxinucletidos trifosfato (dNTPs). La concentracin del stock de dNTPs contiene 10mM
de cada unos de los cuatro dNTP a pH 7. La concentracin final en la reaccin puede ir de
20 a 200 M de cada uno de los dNTPs, dependiendo del fragmento a amplificar y la
concentracin de magnesio, la cual resulta en un ptimo balance en rendimiento,
especificidad y exactitud. Esta concentracin representa un exceso suficiente que permite
tener una concentracin adecuada durante toda la reaccin. Una alta concentracin de
dNTPs conlleva a un decrecimiento de la especificidad y fidelidad del PCR, por lo que es
importante que la concentracin de dNTPs usada est equilibrada, con el objetivo de
minimizar la incorporacin de errores. En general 200 M de cada uno de los dNTPs puede
usarse para la amplificacin de un fragmento de 2kb durante 30 ciclos.
Iniciadores. La concentracin ptima de los iniciadores debe ser de 0.1- 0.5 M en una
reaccin estndar, una concentracin superior a 0.5 M puede causar la acumulacin de
productos no especficos debido a uniones inespecficas en el ADN molde y una
concentracin menor a 0.1 M puede generar que se terminen los iniciadores antes
finalizar los ciclos de la PCR, lo que generara un bajo rendimiento de amplificacin. De
manera general, 5 pmol de cada iniciador es adecuado para 25 L de reaccin. Para la
eleccin de los iniciadores, existen una serie de normas que se deben seguir,
afortunadamente existen programas computacionales que nos facilitan esta tarea.
Polimerasa. La concentracin recomendada de enzima ADN polimerasa en PCR es de 1-2.5
unidades por 100 L de volumen de reaccin (generalmente la enzima se comercializa a
una concentracin de 5U/L). Esto representa en equivalencia molar, un valor bajo en
 comparacin a los otros componentes de la reaccin. Una baja concentracin de enzima
garantiza la fidelidad de la amplificacin del ADN, una alta concentracin de enzima
resulta en la amplificacin de productos inespecficos. Otros factores que pueden
modificar la fidelidad de la enzima ADN polimerasa son la presencia de actividad
exonucleasa 3-5, la tendencia natural de la enzima para insertar errores, la facilidad con
que los errores pueden ser retirados, la concentracin de sales, especficamente la
concentracin de magnesio.
Aditivos. En algunas ocasiones, para optimizar la PCR es recomendable la adicin de
sustancias adyuvantes que incrementan la especificidad y fidelidad (Landre et al. 1995),
entre las ms usadas estn:
DMSO (dimetilsulfxido): en una concentracin entre 2 y 10%
disminuye la estructura secundaria del ADN.
Glicerol: en una concentracin entre 15 y 20% mejora la
amplificacin de fragmentos con alta proporcin de G+C e
incrementa la estabilidad trmica de la enzima.
Detergentes no inicos: Tritn X-100, Tween 20 o Nonident P-
40. Estabilizan a la Taq polimerasa e inhiben la formacin
estructuras secundarias en el ADN. Se utilizan en
concentraciones entre 0.1 y 1%. Concentraciones mayores
pueden generar amplificaciones no especficas.
BSA (Albmina de suero bovino): En una concentracin final de
0.1 a 0.8 g/L es particularmente til para amplificar ADN
antiguo o muestras de ADN con inhibidores de PCR como la
melanina.
Betaina: A una concentracin final de 1 a 1.7 M, mejora la
amplificacin de los fragmentos.
Aditivos comerciales: hay adyuvantes comerciales disponibles
que optimizan la reaccin de PCR. Sin embargo, no revelan su
composicin qumica.
Sugerencias para mejorar la amplificacin por PCR:
Para mejorar:
a) Fidelidad y especificidad:
Seleccionar una enzima con actividad 3-5 exonucleasa.
Utilizar iniciadores con ms de 15 nucletidos.
Incrementar la temperatura de alineamiento.
Reducir el tiempo de desnaturalizacin y alineamiento en el
ciclo.
Reducir la concentracin de iniciadores.
Reducir el nmero de ciclos.
Reducir la concentracin de Mg2+.
Revisar que el termociclador funcione adecuadamente.
b) Eficiencia de amplificacin:
 Incrementar la concentracin de dNTPs y enzimas.
Usar en concentracin baja algn aditivo.
Reducir el tamao del fragmento que se desea amplificar
(amplicn).
Probar con Pfu polimerasa.
Confirmar que los iniciadores no forman dmeros.
Habitualmente, los resultados de una reaccin de PCR se visualizan (se hacen visibles) al
usar electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una tcnica en la que una corriente
elctrica impulsa fragmentos de ADN a travs de una matriz de gel y los fragmentos de
ADN se separan segn su tamao. Tpicamente se incluye un estndar, o marcador de
peso molecular, para que pueda determinarse el tamao de los fragmentos en la muestra
de PCR. Esta separacin se hace bajo un buffer o tampn que puede ser TAE o TBE.
Otro ingrediente que se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio,
una molcula intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado
con luz UV emite una seal que permite la visualizacin de los amplicones en forma de
bandas. Es importante manipular con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que
es mutagnico y teratgeno. Cuando los amplicones son corridos en el gel, stos deben
ser cargados junto con un marcador molecular que contenga un nmero determinado de
segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la identifi cacin de los amplicones y si su
tamao corresponde con el esperado. El tamao est dado por el nmero de pares de
pases del amplicn. El marcador de peso molecular es fcilmente adquirido en el mercado,
ya que se ofrece una gama de marcadores con distintos pesos moleculares para elegir el
de nuestro inters.
Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles de
millones de veces y producir suficientes copias de ADN para que se analicen mediante
otras tcnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar por electroforesis en gel, enviar a
secuenciar o digerir con enzimas de restriccin y clonar en un plsmido.
La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigacin, y tambin tiene aplicaciones
prcticas en medicina forense, pruebas genticas y diagnsticas. Por ejemplo, la PCR se
utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genticos a partir del ADN de los
pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR tambin puede
utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si el
patgeno est presente, es posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de
sangre o tejido.