R$ 5,00 ano III nmero 17 novembro/dezembro de 2000

BIOTECNOLOGIA/KL3

REPETE FOTOLITO

2 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

BIOTECNOLOGIA/KL3

REPETE FOTOLITO

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 3

 Expedio Humboldt 2000
Entrevista concedida a
ENTREVISTA Lucas Tadeu Ferreira
Fotos: Juan Pratginests

Pesquisa cientfica na Amaznia do Caribe ao Atlntico

Partindo da experincia
acumulada pelos viajantes naturalistas
que percorreram a grande floresta
Amaznica nos sculos XVIII e XIX,
39 cientistas da Universidade de
Braslia UnB, da Universidad Simon
Bolvar, da Venezuela, e de outras
instituies de pesquisas brasileiras
realizaram ampla coleta de material e
informaes para o desenvolvimento
de pesquisas de ponta, contribuindo
assim, para o avano do conhecimen-
to cientfico no sculo XXI.
Defendendo os direitos dos
povos indgenas e da floresta, e
combatendo a biopirataria, os cientis-
Professor Csar na tas que participaram dessa expedio
biblioteca do barco percorreram aproximadamente 10.000
km em busca de novos conhecimen-
tos a partir dos achados amaznicos.
Assim, espera-se que os resultados da expedio proporcionem contribui-
es importantes para vrias reas do conhecimento humano, uma forma
inteligente que a comunidade cientfica encontrou para se vincular aos
problemas amaznicos contemporneos e, principalmente, na busca de
solues.
Para falar um pouco dessa aventura Humboldt 2000, o professor de
microbiologia da Universidade de Braslia - UnB -, Csar Martins de S, que
foi um dos principais coordenadores da Expedio, concedeu esta entrevis-
ta a Lucas Tadeu Ferreira para a revista BIOTECNOLOGIA Cincia &
Desenvolvimento.
O professor Csar Martins graduado em biologia e mestre em
biologia molecular pela UnB. Fez doutorado em Paris, no Instituto Jacques
Monod da Universidade de Paris VII. Voltou ao Brasil em 1989; foi contra-
tado e professor do Departamento de Biologia Celular da UnB. Recente-
mente fez Ps-Doutoramento em San Diego, Califrnia, na rea de biologia
molecular de cncer.

4 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

BC&D - Quais foram os princi-
pais objetivos da Expedio Hum-
boldt -Amaznia 2000?
Csar Martins Primeiramente, gos-
taria de explicar um pouco o porqu
da escolha do nome Humboldt para
nossa Expedio. Alexander Von
Humboldt, de origem alem, foi um
dos maiores cientistas de sua poca.
Em meados de 1799, juntamente
com seu amigo botnico, o francs
Aim Bonpland, chegou Amrica
Latina, no delta do rio Orinoco, na
Venezuela. Os dois cientistas tinham
como objetivo estudar a Amaznia
atravs de seus rios. Acreditavam
que, subindo o rio Orinoco e pas-
sando pelo canal do Cassiquiare,
que liga a bacia do Orinoco bacia
do Rio Negro, poderiam chegar a
Belm, no Brasil. O problema que
Humboldt, quando chegou fron-
teira do Brasil, foi impedido de en-
trar no pas. Naquela poca, o Brasil
era colnia portuguesa e ele ficou
uns dois meses na fronteira aguar-
dando um visto de entrada. Acabou
sendo impedido, pois os portugue-
ses pensaram que ele era um espio
espanhol. Dessa forma, a Amaznia
Brasileira deixou de ser estudada
pelo grande sbio. Assim, a nossa
expedio, homenageando Humbol-
dt, faz um resgate histrico: - duzen-
tos anos depois, fizemos o mesmo
percurso que ele fez na Venezuela e,
principalmente, o percurso que ele
no fez, no Brasil, que era chegar a
Belm atravs dos rios. Tendo como
patrono Humboldt, a expedio
obrigatoriamente deveria ser uma
expedio cientfica multidisciplinar,
pois Humboldt era um cientista uni-
versal: gegrafo, astrnomo e com
grande conhecimento em muitas ou-
tras reas da cincia. Nossa expedi-
o teve como objetivo principal
contribuir para o desenvolvimento
de pesquisas voltadas para assegu-
rar o futuro da Amaznia.
BC&D - Qual foi o critrio de
escolha e quantos
pesquisadores bra-
sileiros e venezue-
lanos integraram a
expedio Hum-
boldt 2000 Ama-
znia?
Csar Martins A
escolha privilegiou
cientistas brasileiros.
Ns comeamos a Equipe trabalhando na
desenhar a expedio h dois anos biblioteca do barco
e como amos fazer um percurso
dentro da Venezuela, que a parte
do rio Orinoco, fizemos contato
com professores da Universidade
Simon Bolvar, em Caracas. Nessa
parte, a expedio ficou sendo bina-
cional. Participaram quatro profes-
sores venezuelanos, que foram es-
colhidos por eles mesmos. Essa equi-
...seguramente, tm achados
biolgicos que pela primeira vez
sero descritos e identificados.
Encontramos, por exemplo, um
microrganismo luminescente.
Bioluminescncia tem sido
muito utilizada em biologia,
medicina e agricultura como Flor de guaran
rastreadores moleculares
geraes que esto vindo conhece-
pe deixou a expedio na fronteira ram um pouco da Amaznia. Parti-
com o Brasil. Do nosso lado adota- ciparam 39 cientistas ao longo de
mos alguns critrios de seleo: pri- toda a expedio. Nem todos pude-
meiro, os cientistas deveriam ter ram ficar os 65 dias corridos. En-
disponibilidade de longos perodos quanto um grupo viajava, outros
de tempo, j que a expedio durou iam entrando e saindo em diferentes
65 dias. Segundo, esses pesquisado- percursos.
res deveriam ter um certo conheci-
mento do que era uma navegao e BC&D - Quais os principais tre-
convivncia dentro de um barco chos percorridos na Amaznia
com espao reduzido. Terceiro, o brasileira e venezuelana?
critrio cientifico, que a escolha de
especialistas em diferentes reas. Csar Martins O incio da expe-
Levamos muitos pesquisadores jo- dio foi no dia 1 de setembro de
vens, inclusive estudantes, porque 2000. Partimos de Braslia por avio
achamos muito importante para as at Manaus. Da, com destino a
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 5
 Ciudad Guayana no baixo
Orinoco Venezuelano. Esse
percurso foi feito por terra,
atravessando o estado de
Roraima, a serra de Pacara-
ima e as savanas venezuela-
nas. De Ciudad Guayana a
Puerto Ayacucho, a viagem
foi feita de barco. O segun-
do trecho foi feito de Puerto
Ayacucho s cidades de Es-
meralda e San Carlos del Rio
Negro no Cassiquiare, e
Cucu, j na fronteira com o Brasil.
Ns tivemos alguns problemas de
segurana na travessia desse trecho
por causa do recrudescimento da
guerrilha na fronteira com a Colm-
bia e assim tivemos que percorr-lo
em helicptero da fora area vene-
zuelana. O terceiro trecho compre-
endeu a descida, de barco, pelo rio
Negro at Manaus, com escala de 10
dias em So Gabriel da Cachoeira.
Naquela cidade as atividades foram
intensas graas ao apoio do Exrcito
Brasileiro. Parte da equipe subiu o
rio Uaups at Iauaret prximo
fronteira colombiana; outra foi ao
morro dos Seis Lagos, prximo do
parque do Pico da Neblina e outra
parte permaneceu pesquisando em
So Gabriel da Cachoeira. O quarto
trecho foi de Manaus a Santarm,
passando pela foz do rio Nhamund,
pelo Paran do Ramos, baixo Trom-
betas e subimos o Tapajs at For-
dlndia e outros. O quinto trecho da
expedio desceu o rio Amazonas,
passando pelo rio Xingu e pelas
cidades de Monte Alegre, Prainha,
Almerim, Laranjal do Jari, Santana e
chegou a Macap. No Amap, fomos
por terra at o rio Oiapoque, no
extremo norte do Brasil. De l, al-
guns pesquisadores seguiram ao
norte at a foz do rio Oiapoque para
pesquisa de microrganismos marti-
mos. A equipe de hidrlogos tam-
bm fez medies importantes de
vazo e sedimentos no Estreito de
bidos e na foz do Amazonas. De
Macap, fomos at Belm. Passamos
6 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Parte da equipe Humboldt e o
apoio dos militares do 5 Bis
por quatro estados brasileiros: Rora-
ima, Amazonas, Par e o Amap.
Nossa expedio percorreu quase
10.000 km na Amaznia.
BC&D - Quem coordenou, quan-
to custou e quais foram as insti-
tuies que financiaram a expe-
dio?
Csar Martins A expedio foi
organizada pelo Ncleo de Estudos restante da expedio era composta
Amaznicos da UnB e coordenada
por mim e pelo historiador profes-
sor Vtor Leonardi, especialista em
histria da Amaznia. Foi difcil le-
vantar todo o recurso necessrio e
tivemos de fazer muitos cortes. Ao
todo ficou em torno de R$ 180.000,00.
O principal financiador foi o Minis-
trio do Meio Ambiente, atra-
vs da Secretaria da Amaz-
nia; o Banco do Brasil, atra-
vs da BB-Tour, que nos for-
neceu as passagens areas.
O WWF, que financiou toda
a parte de fotografia e a Fun-
dao Universitria de Brasi-
lia-FUBRA . Contamos tam-
bm com o apoio do Exrci-
to Brasileiro atravs do 5
Batalho de Infantaria de Sel-
va, que nos alojou em So
Gabriel da Cachoeira e o Governo
do Amap, que forneceu veculo e o
alojamento em Oiapoque.
BC&D - Que reas do conheci-
mento humano foram explora-
das e investigadas na expedio?
Csar Martins A expedio con-
tou com quatro microbiologistas,
especialistas em ornitologia (pssa-
ros), botnicos, mastozoologia, sa-
de pblica, hidrologia, antroplo-
gos, indigenistas e historiadores.O
de uma equipe de cinegrafia, foto-
grafia e documentao; ao todo, a
expedio contemplou 14 reas es-
pecficas do conhecimento.
BC&D - Poderia descrever, sucin-
tamente, os principais achados
que, potencialmente, permitem
Equipe Humboldt
navegando pelo Rio Tapajs
aprofundar os conheci-
mentos sobre a floresta
Amaznica?
Csar Martins Na rea da
biologia, realizamos muitos le-
vantamentos e coletas ao lon-
go de nosso percurso. Todo
esse material ser agora pro-
cessado pelos pesquisadores
em suas respectivas unidades
de trabalho. Dizer atualmente
que vamos ter descobertas novas na
rea de biologia, em funo do que
foi coletado, ainda um pouco
prematuro. Precisamos de muitas
anlises de laboratrio e anos de
estudos para isso; mas, seguramen-
te, tm achados biolgicos que pela
primeira vez sero descritos e iden-
tificados. Encontramos, por exem-
plo, um microrganismo luminescen-
te que eu no sei ainda sua natureza.
Bioluminescncia tem sido muito
utilizada em biologia, medicina e
agricultura como rastreadores mole-
culares. Esse achado muito pro-
missor. Na parte de cincias huma-
nas e sade, os pesquisadores visita-
ram Instituies Pblicas de vrios
municpios, pesquisaram arquivos,
gravaram muitas entrevistas com ci-
entistas da regio, lideranas indge-
nas e de populaes ribeirinhas.
Certamente, o conhecimento exis-
tente sobre a Amaznia vai ser am-
pliado a partir dessa expedio. Um
fato interessante ocorrido
na regio do Paran do
Ramos, foi a descoberta pela
equipe de arquelogos do
Museu Amaznico de um
sitio arqueolgico, at ago-
ra desconhecido. Tudo in-
dica que aquele stio fora
habitado por uma socieda-
de estvel e bem estrutura-
da h, pelo menos, dois mil
anos. Trata-se de uma des-
coberta indita que ser co-
municada ao IPHAN.
BC&D O Senhor mencionou o
Extrao e transporte de madeira
na Amaznia
achado de um organismo lumi-
nescente. De que forma a carac-
terstica deste microrganismo
poder vir a ter, potencialmente,
alguma aplicao prtica?
Por que coletar recursos
biolgicos da Amaznia para
pesquisar no exterior? Por que
no fazer tudo isso aqui dentro
do nosso prprio pas ou com
as nossas universidades e
empresas, ou instalando labora-
trios, tal como se instalam
empresas multinacionais?
Csar Martins O nosso interesse
est na utilizao desses microrga-
nismos em biotecnologia. Dentro
Ruinas do velho Airo, cidade
do alto Rio Negro
desse contexto, eu vejo gran-
de chance de sucesso. Os mi-
crorganismos foram coletados
no solo amaznico, onde a
degradao da biomassa se d
de forma intensa e natural.
Assim, seguramente esses mi-
croorganismos podem tam-
bm ser utilizados na degra-
dao da biomassa originria,
por exemplo, do bagao da
cana-de-acar, do farelo de
arroz, entre muitos outros, cujos
produtos de hidrlise podem ser
utilizados na agroindstria. Por ou-
tro lado, a bioluminescncia encon-
trada de longe a mais fascinante.
Para se ter uma idia de sua impor-
tncia basta verificarmos, na literatu-
ra especializada, as revolucionrias
aplicaes, por exemplo, do sistema
luciferase isolado do vagalume e da
GFP (Green Fluorecent Protein) iso-
lada de jelyfish. preciso, contudo,
estudar muito bem esse potencial,
que muito expressivo.
BC&D - Quem sero os detento-
res do conhecimento e dos acha-
dos nessa expedio e como se
dar a distribuio do que foi
encontrado?
Csar Martins Assim que come-
armos a isolar e a classificar, todo o
material coletado estar disponvel
para quem quiser e, naturalmente,
solicitar. Os estudos e as
pesquisas sero realizadas
nas universidades brasilei-
ras, e assim que comear-
mos a conhecer o que co-
letamos, tudo ser disponi-
bilizado pelas medidas le-
gais. importante enfatizar
que no existe nenhum de-
tentor especfico dos acha-
dos e tudo ser amplamen-
te publicado.
BC&D - A Conveno da
Diversidade Biolgica es-
tabelece que a diversidade biol-
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 7

gica deve trazer benefcios para
a humanidade e reconhece ain-
da a soberania dos Estados no
uso e disponibilidade dos recur-
sos biolgicos encontrados em
seus territrios. Como conciliar
ento os interesses do Brasil com
o dos outros pases quanto ao
uso da sua biodiversidade?
Csar Martins Esse tema pouco
entendido, haja visto os vrios pro-
jetos de lei e medida provisria que
tramitam no Congresso. Eu tenho
uma viso bastante pragmtica a
respeito da autonomia da nossa bi-
odiversidade. Na minha opinio,
quem detm a autonomia da nossa
biodiversidade o Estado Brasileiro;
mas os conhecimentos dela gerados
e de seu uso pertencem humanida-
de. s aplicar a Conveno. Entre-
tanto, isto tem gerado muito mal-
entendido, principalmente com res-
peito biopirataria. Biopirataria
uma atividade ilcita praticada em
larga escala e, como tal, tem de ser
combatida. Mas como combat-la?
No se combate a biopirataria so-
mente com a criao de Leis, com as
foras armadas, a polcia federal e
outros instrumentos de fora. A me-
lhor forma de combat-la com
cincia. A biodiversidade brasileira
tem que ser preservada e estudada
ao mesmo tempo. Atravs do co-
nhecimento cientfico que vamos
8 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
8 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Equipe Humboldt
navegando pelo Rio Tapajs
exercer a nossa verdadeira autono-
mia.
BC&D - Como garantir a partici-
pao das comunidades locais e
dos povos indgenas nas deci-
ses que tenham por objetivo o
acesso e a explorao dos recur-
sos biolgicos das reas que ocu-
pam?
No se combate a biopirataria
somente com a criao de Leis,
com as foras armadas, a polcia
federal e outros instrumentos de
fora. A melhor forma de
combat-la com cincia
Csar Martins As terras indge-
nas, em alguns estados brasileiros,
como por exemplo, no Amap, es-
to praticamente todas demarcadas.
O processo de demarcao de terras
em outros estados tem evoludo
atravs de muitas lutas. Mas, o co-
nhecimento existente dos recursos
biolgicos , ainda no. Em alguns
casos, principalmente o uso fitoter-
pico de algumas plantas, , h mui-
tos anos, de pleno domnio dos
povos da floresta, mas pouco publi-
cado. Voc encontra alguns relatos
descritos por grandes viajantes ex-
pedicionrios e historiadores. Como
garantir, por exemplo a propriedade
intelectual deste conhecimento? Ago-
ra, com a demarcao de suas terras,
a explorao dos recursos biolgi-
cos das reas que ocupam fica muito
mais fcil. fazer parcerias e contra-
tos entre as partes. Estou convicto de
que no seremos bem sucedidos se
no fizermos parceria entre esses
povos e os pesquisadores e/ou Ins-
tituies envolvidas na explorao
dos recursos biolgicos.
BC&D - Recentemente, a impren-
sa denunciou um acordo fir-
mado entre a Organizao No-
Governamental Bioamaznia e a
multinacional NOVARTIS para a
explorao dos recursos biolgi-
cos da Amaznia. Qual a sua opi-
nio a respeito de eventos dessa
natureza?
Csar Martins Est a; esses mal
entendidos ocorrem. Na minha opi-
nio, esses acordos tm de ser clara-
mente definidos para preservar os
nossos interesses. Por que coletar
recursos biolgicos da Amaznia
para pesquisar no exterior? Por que
no fazer tudo isso aqui dentro do
nosso prprio pas ou com as nossas
universidades e empresas, ou insta-
lando laboratrios, tal como se ins-
talam empresas multinacionais? Des-
sa forma, criaramos empregos e
principalmente, garantiramos a for-
mao de recursos humanos qualifi-
cados, inclusive, para a prpria re-
gio. Depois, s dividir os lucros.
Para o amplo conhecimento da di-
versidade biolgica da Amaznia
preciso fazer parcerias e estimular os
envolvidos a investirem na forma-
o de recursos humanos. Que se
instalem indstrias e laboratrios den-
tro da Amaznia. Desta forma, sim,
pode vir todo mundo.
E-mail do Prof. Csar:
sasa@unb.br
 PORTAL
WWW.BIOTECNOLOGIA.COM.BR
(Repete fotolito)
Obs.: Saiu na pgina 9 da edio anterior (n16)

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 9

 Carta ao Leitor

Nessa edio entrevistamos o Professor Csar

Martins de S, da Universidade de Braslia, e um
dos principais coordenadores da Expedio
Humboldt 2000.

BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento Gostaria de destacar aqui a brilhante iniciativa

KL3 Publicaes desse projeto que, nos dias de hoje, da mais alta
importncia para Brasil, j que o objetivo princi-
Fundador
Henrique da Silva Castro pal a busca de novos achados que proporci-
Direo Geral e Edio onem novos conhecimentos, muito importante
Ana Lcia de Almeida para as mais diversas reas. Vrias expedies
Diretor de Arte como essa j poderiam e deveriam estar sendo
Henrique S. Castro F feitas por todo o Pas, por brasileiros, para asse-

Departamento Comercial, gurar a nossa autonomia sobre o patrimnio

Redao e Edio: gentico do Brasil, e com isso combatendo,
inclusive, a biopirataria.

SRTV/Sul - Quadra 701

Acreditamos que a partir de agora o governo
Ed. Palcio do Rdio II
Sala 215 - CEP 70340-902 federal dever, a exemplo dessa importante expe-
Braslia - DF dio, promover e incentivar outras expedies
Tel.: (061) 225-1512 (061) 225-0976
dessa envergadura, uma vez que, apoiando pro-
Fax: (061) 224-2830
jetos como esse, sem dvida nenhuma uma das
E-mail
kl3@biotecnologia.com.br melhores formas de proteger nosso patrimnio
gentico.
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Dr. Henrique da Silva Castro

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ISSN 1414-4522

10 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Conselho Cientfico Colaboraram nesta edio:
Dr. Aluzio Borm - Gentica e Melhoramento Vegetal
Dr. Henrique da Silva Castro - Sade; Adilson Leite
Dr. Maao Tadano - Agricultura; Alba Chiesse da Silva
Dr. Naftale Katz - Sade; Alosio da Silva Pinto
Dr. Pedro Juberg - Cincias;
Andra Almeida Carneiro
Dr. Srgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Gentica de Microorganismos;
Carlos Bloch Jnior
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Cludia Teixeira Guimres
Denise Silvina Piccini Quintas Horton
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi dila de Resende Von Pinho
Dr. Ivan Rud de Moraes - Toxicologia; Edilson Paiva
Dr. Lus Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Edson Luis Kemper
Eliane Namie Miyaji
Conselho Federal de Biologia
Eneida Abreu Parizotto
Dr. Joo de Deus Medeiros
Ivan Pereira Nascimento
Fundao Dalmo Catauli Giacometti Letcia Jungmann
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Gentica; Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Dr. Jos Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biolgico; Magda Aparecida de Lima
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genticos Maria das Graas Guimares Carvalho Vieira
Maria Laene Moreira de Carvalho
Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN Maura Vianna Prates
Dr. Jos Roberto Rogero
Newton Portilho Carneiro
Paulo Cezar De Lucca
Renato MAtos Lopes
Rogrio Pietro Mazzantini
Tnia Toledo de Oliveira
Tanus Jorge Nagem
Waldely Oliveira Dias

Entrevista
Csar Martins de S pg. 04

Pesquisa
Plantas como Biorreatores pg. 12
Flavonides pg. 18
Peptdeos Antimicrobianos pg. 30
Emisso de gases de efeito estufa pg. 38
Tcnicas moleculares em sementes pg. 44
Desvendando o cdigo gentico pg. 50

Sade
Vacinas de BCG Recombinante - DTP pg. 24

BioNotcias
pg. 48

Seo de Cartas pg. 59

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 11
 Plantas como
PESQUISA
Biorreatores
Utilizao de plantas transgnicas como reatores biolgicos para produo de protenas
Eneida Abreu Parizotto
Doutoranda em Gentica e Biologia
Molecular (UNICAMP)
eapariz@unicamp.br
Paulo Cezar De Lucca
Doutorando em Gentica e Biologia
Molecular (UNICAMP)
pdelucca@unicamp.br
Letcia Jungmann
Mestranda em Gentica e Biologia
Molecular (UNICAMP)
jungmann@unicamp.br
Edson Luis Kemper
Doutor em Gentica (UNICAMP)
Alba Chiesse da Silva
Doutora em Cincias Biolgicas
(UFSCar)
Ps-doc do Centro de Biologia
Molecular e Engenharia Gentica
(CBMEG, UNICAMP)
chiesse@unicamp.br
Adilson Leite
Doutor em Bioqumica
Pesquisador do Centro de Biologia
Molecular e Engenharia Gentica
(CBMEG, UNICAMP)
aleite@unicamp.br
12 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
desenvolvimento de plan-
tas transgnicas com no-
vas caractersticas consi-
derado uma das mais im-
portantes aplicaes da
tecnologia do DNA recombinante. Atra-
vs dessa tcnica, as plantas podem ser
geneticamente modificadas, basicamen-
te com duas finalidades: a) melhora-
mento de suas caractersticas agron-
micas e qualidades nutricionais; b) uso
das plantas como reatores biolgicos
para a produo de biomolculas.
Inicialmente, as plantas transgni-
cas visavam apenas ao melhoramento
agronmico por meio da introduo
de genes capazes de conferir resistn-
cia a herbicidas e a ataques de insetos
e microorganismos. Atualmente, as
plantas transgnicas esto sendo tam-
bm exploradas para o desenvolvi-
mento de alimentos que apresentem
contedo balanceado de aminocidos,
ou ainda que sejam enriquecidos em
leos insaturados e vitaminas (Gander
& Marcellino, 1997; Binsfeld, 2000;
Carneiro et al., 2000).
As plantas, assim como os animais
transgnicos, podem ser empregadas
como biorreatores para a produo de
protenas, carboidratos e lipdios em
larga escala. Adicionalmente, altera-
es genticas que determinam modi-
ficaes em vias metablicas das plan-
tas podem ser empregadas na produ-
o de polmeros ou compostos org-
nicos de baixo peso molecular. O
nmero de compostos produzidos por
meio dessas abordagens tem aumenta-
do consideravelmente, sendo que a
viabilidade do uso das plantas como
biorreatores j foi demonstrada para a
produo de carboidratos, cidos gra-
xos, polipeptdios utilizados como fr-
macos, enzimas de uso industrial e
plsticos biodegradveis (Goddijn &
Fotos cedidas pelos autores
Pen, 1995; Hood & Jilka, 1999).
Por que usar plantas
como biorreatores?
As plantas apresentam vantagens
em potencial em relao aos sistemas
baseados em fermentao microbiana,
clulas animais e animais transgnicos.
Protenas heterlogas expressas em
bactrias geralmente retm o resduo
de metionina, derivado do sistema de
traduo, na sua extremidade amino-
terminal. Nas protenas expressas em
eucariotos, entretanto, essa metionina
geralmente faz parte de sinais de ende-
reamento especficos, que so retira-
dos quando essas protenas so intro-
duzidas no compartimento celular para
o qual foram endereadas.
Alm disso, a fermentao bacteri-
ana freqentemente resulta na produ-
o de agregados insolveis, e so
necessrios gastos significativos para
solubilizar esses agregados e recuperar
a estrutura da protena nativa. Por
outro lado, o processo de fermentao
em si requer grandes investimentos de
capital.
Ao contrrio dos sistemas bacteria-
nos de expresso de protenas, os
sistemas eucariticos permitem o pro-
cessamento e a modificao dos pro-
dutos. O sistema de expresso eucari-
tico mais antigo e mais utilizado ba-
seia-se na utilizao de leveduras, sen-
do as espcies Saccharomyces cerevi-
sae e Pichia pastoris as mais utilizadas
(Torres & Moraes, 2000). Esses siste-
mas so to econmicos quanto os
bacterianos, mas as protenas sintetiza-
das so freqentemente hiperglicosila-
das e, quando produzidas em altos
nveis, so instveis e insolveis.
Outros sistemas eucariticos utili-
zados para a produo de protenas
heterlogas so as culturas de clulas
de insetos e de mamferos infectadas
por vrus recombinantes. Esses vrus
apresentam o gene que codifica a
protena de interesse controlado por
um potente promotor viral (Fraser,
1992). Esses sistemas so capazes de
secretar protenas corretamente eno-
veladas e podem promover modifica-
es ps-traducionais. Por outro lado,
tm como desvantagens o requerimen-
to de meios de cultura complexos, de
condies especiais para a manuten-
o das clulas, e de reatores sofistica-
dos, que encarecem bastante o proces-
so.
Animais transgnicos tambm po-
dem ser utilizados para a expresso de
protenas heterlogas em larga escala.
Um dos sistemas descritos baseia-se na
secreo de protenas heterlogas no
Figura 1: Representao esquemtica das diferentes estratgias
leite de caprinos, ovinos e bovinos.
utilizadas na produo de protenas heterlogas em plantas.
Nesse sistema, a expresso da protena
Do lado esquerdo, esto representadas as etapas envolvidas na
de interesse controlada por promoto-
res que atuam nas clulas de glndulas produo de protenas heterlogas em plantas pelo emprego de vrus
mamrias. Devido limitao da pro- carreadores. O gene que codifica a protena de interesse inserido em
duo em fmeas em fase de lactao, um vetor viral que utilizado na infeco de plantas. Aps o
mtodos alternativos tm sido propos- desenvolvimento das plantas, os tecidos infectados so utilizados como
tos, nos quais a protena heterloga fonte para extrao de vrus recombinantes. Os extratos virais podem
secretada na urina (Kerr et al., 1998) ou ser utilizados para a amplificao da produo, atravs da infeco de
no fluido seminal (Dyck et al., 1999) de novas plantas. Do lado direito, esto representadas as etapas envolvidas
animais transgnicos. Os sistemas ba- na produo de protenas heterlogas em plantas transgnicas e
seados em animais transgnicos so, transplastmicas. O gene que codifica a protena de interesse inserido
no entanto, mais caros que os sistemas em um vetor de transformao apropriado. Alm do gene de interesse,
baseados em plantas, e a aceitao do geralmente inserido tambm um gene seletivo, codificador de uma
produto por parte do pblico consumi- protena que confere resistncia a um antibitico ou a um herbicida. A
dor menor quando este tem origem integrao simultnea dos dois genes limitar o desenvolvimento de
animal. clulas no transformadas, durante a etapa de seleo. A partir do tecido
As plantas apresentam vias de mo- selecionado, so regeneradas plantas nas quais a integrao do gene de
dificao e processamento ps-tradu- interesse avaliada por meio da tcnica de PCR e de hibridao com
cionais, e os custos da produo de sondas especficas. A presena do produto de expresso do gene de
protenas heterlogas em plantas ge- interesse investigada atravs de testes bioqumicos e imunoensaios
ralmente so menores que os dos de- com anticorpos especficos. Essas anlises permitem a seleo das
mais sistemas. Por essas razes, o uso
linhagens que apresentam maior rendimento, que sero multiplicadas
de plantas como biorreatores para a
e utilizadas no desenvolvimento de mtodos de extrao e purificao,
produo de protenas heterlogas est-
e subseqente caracterizao estrutural e funcional da protena heter-
se tornando economicamente impor-
loga.
tante. A avidina, glicoprotena encon-
trada em ovos de aves, rpteis e anfbi-
os, e utilizada na produo de reagen- produo de protenas heterlogas em na heterloga. A expresso desse gene
tes para imunoensaios, constitui a pri- plantas. Uma delas baseia-se na utiliza- transitria, pois ele no integrado
meira protena heterloga produzida o de vrus contendo RNA simples ao genoma da planta. Esta, por sua vez,
em plantas j comercializada (Sigma) fita, que ocorrem naturalmente nas funciona como um veculo para a am-
(Hood et al., 1997). plantas. O gene que codifica a protena plificao das partculas virais (Fig. 1).
de interesse inserido no genoma do A protena recombinante recuperada
As diferentes estratgias utiliza- vrus, geralmente fusionado regio atravs do processamento da protena
das para a produo de protenas estrutural de um gene que codifica da capa viral, que purificada a partir
heterlogas em plantas uma protena da capa viral. Depois de de extratos dos tecidos infectados. Op-
infectar a planta, o vrus promove sua cionalmente, as partculas virais qui-
Basicamente, duas diferentes estra- replicao e a expresso de seus genes mricas purificadas podem ser utiliza-
tgias podem ser utilizadas para a incluindo o gene que codifica a prote- das diretamente na formulao de va

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 13

 cinas orais e nasais que os corpsculos lipdi-
(Beachy et al., 1996). cos e as protenas associa-
A segunda estrat- das, devido sua baixa
gia consiste em intro- densidade, so facilmente
duzir o gene que codi- purificados por flotao
fica a protena de inte- aps centrifugao em
resse no genoma da baixa rotao.
planta por meio de tc- A secreo de prote-
nicas de transformao, nas heterlogas em exsu-
envolvendo, portanto, datos de razes, a rizose-
a obteno de plantas creo, constitui outro sis-
transgnicas. O desen- tema especial de endere-
volvimento de uma amento. Borisjuk et al.
srie de tcnicas de (1999) demonstraram a
transformao permi- eficincia desse sistema
tiu a obteno de plan- atravs da expresso de
tas transgnicas da mai- altos nveis da protena
oria das plantas culti- verde fluorescente de gua
vadas. Descries de- viva (GFP), da fosfatase
talhadas das tcnicas alcalina de placenta hu-
mais utilizadas podem mana, e de uma xilanase
ser encontradas em bacteriana. Os sistemas de
Brasileiro & Carneiro rizosecreo permitem o
(1998). A integrao desenvolvimento de pro-
estvel permite a ex- cessos de produo base-
presso permanente do ados em cultivo hidrop-
gene e sua transfern- Figura 2: Comparao da tecido-especificidade dos pro- nico e cultura in vitro de
cia prognie da plan- motores PCaMV e PGKaf. razes de plantas transg-
ta transformada (Fig. Para a realizao desse ensaio foram construdos plasmdios nicas. Culturas de razes
1). Enquanto a estrat- onde os promotores do gene que codifica o transcrito 35S do so especialmente teis
gia mediada por vrus vrus do mosaico da couve flor (PCaMV) e do gene que codifica para a obteno de produ-
determina geralmente a -kafirina (protena de reserva de sorgo) controlam a tos naturais cujas fontes
a expresso apenas em expresso do gene reprter codificador da -glicoronidase so plantas difceis de cul-
folhas, a integrao (GUS). Sementes de milho seccionadas longitudinalmente tivar ou que esto em pro-
permanente apresenta foram bombardeadas com os plasmdios e, aps 48 horas, a cesso de extino (Shanks
maior versatilidade, atividade enzimtica de GUS foi revelada com a adio do & Morgan, 1999). A fitor-
permitindo que a ex- substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glicorondio (Xgluc). remediao de solo e gua
presso seja direciona- Os pontos azuis, indicativos da atividade de GUS, aparecem representa outra importan-
da para os diversos te e promissora aplicao
nos diversos compartimentos da semente (EB, embrio; EN,
rgos, tecidos e com- para os sistemas de rizose-
endosperma; P, pericarpo) bombardeada pelo plasmdio que
partimentos das plan- creo.
apresenta o promotor P35SCaMV (imagem da esquerda),
tas. As protenas heterlo-
A orientao da enquanto que na semente bombardeada com a construo gas podem ainda ser pro-
expresso para os di- contendo o promotor PGKaf, os pontos azuis so observados duzidas em cloroplastos
versos compartimentos apenas na regio do endosperma (imagem da direita). O de plantas, transformadas
das plantas transgni- ensaio demonstra que, ao contrrio do promotor P35SCaMV, atravs da introduo dos
cas realizada atravs o promotor PGKaf apresenta tecido-especificidade, sendo genes codificadores das
da utilizao de pro- ativo apenas no endosperma. protenas de interesse no
motores tecido-espec- prprio DNA do cloroplas-
ficos e de sinais de to, por meio de tcnicas
direcionamento intracelulares. Essa ca- estratgia foi utilizada na produo de de biobalstica e posterior integrao
pacidade tem sido explorada no de- encefalina inserida na albumina 2S de por recombinao homloga (Fig. 1).
senvolvimento de sistemas de produ- Arabidopsis thaliana (Vandekerckho- Para diferenciar essas plantas das plan-
o capazes de simplificar o armazena- ve et al., 1989), e do anticoagulante tas transgnicas com modificaes no
mento do material colhido e os proces- hirudina inserido em oleosina (Par- DNA nuclear, as plantas assim obtidas
sos de extrao e purificao das pro- menter et al., 1995). Os sinais presentes so denominadas de transplastmicas.
tenas recombinantes. Alguns sistemas nas protenas 2S e oleosina endeream O grande nmero de cloroplastos pre-
baseiam-se na insero do polipept- a expresso das protenas recombinan- sentes nas clulas das folhas (aproxi-
dio em protenas carreadoras. O direci- tes para corpsculos proticos e lipdi- madamente 100 por clula) determina
onamento da protena sintetizada, nes- cos de sementes, respectivamente. A grande amplificao gnica, podendo
se caso, realizado pelo peptdio sinal grande vantagem do sistema baseado resultar em altos rendimentos na pro-
presente na protena carreadora. Essa no uso de oleosinas reside no fato de duo da protena recombinante. A
14 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
 Figura 3: Expresso de hGH em tabaco transgnico.
(A) Representao esquemtica do cassete utilizado na expresso do
hGH. O esquema mostra a regio que codifica o hGH, modificado atravs
da substituio do peptdio sinal natural por um peptdio equivalente
originrio de uma protena de reserva de planta. A expresso do gene
modificado regulada pelo promotor PGKaf e pelo sinal e stio de
poliadenilao do transcrito 35S do vrus do mosaico da couve flor
(335S). (B) Western blot de extratos proticos de diferentes tecidos de
tabaco transgnico. Amostras de extratos dos tecidos indicados, contendo
50 g de protena solvel, foram submetidas a eletroforese em gel de
poliacrilamida 14% na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS). Aps
a eletroforese, as protenas foram transferidas para a membrana, onde a
presena de hGH foi revelada pela utilizao de anticorpo especfico. Para
indicar a posio da migrao do hGH, foram utilizados 50 ng de Saizen,
hGH comercial da Serono. A presena de banda indicadora de hGH
apenas no extrato de semente confirma a tecido-especificidade nesse
sistema de produo do hormnio recombinante. (C) Western blot de
extrato protico obtido a partir de sementes de milho transgnico. O
rendimento na produo de hGH recombinante (0,6% da protena
solvel) foi estimado pela comparao das quantidades do hormnio
presentes em diferentes alquotas do extrato de semente com diferentes
quantidades do hGH padro (Saizen). O extrato foi preparado a partir de
100 mg de farinha de sementes maduras em 1,0 ml de tampo de extrao.

transformao de cloroplastos apresenta
ainda vantagem em relao conteno caros e que nem sempre so capazes
biolgica, posto que o genoma plastidial
raramente transmitido via plen. Re-
centemente, Staub et al. (2000) descreve-
ram a obteno de rendimentos superio-
res a 7% da protena total solvel para a
produo de hormnio de crescimento
humano (hGH) em cloroplastos de taba-
co. Entretanto, grande parte do hGH
recombinante produzido apresentou um
resduo do aminocido prolina na regio
N-terminal no lugar do resduo de fenila-
lanina presente na mesma regio do
hormnio natural. Esse resultado indica
que a estratgia utilizada no processa-
mento, catalisado pela protease especfi-
ca para ubiquitina, que produzida si-
multaneamente com a protena de fuso
ubiquitina-hGH, no apresentou a efici-
ncia desejada em cloroplastos. Portan-
to, apesar do alto rendimento de expres-
so descrito, esse sistema requer aperfei-
oamento adicional na etapa de proces-
samento ps-traducional das protenas
recombinantes.
Plantas transgnicas na produo
de peptdios e protenas de interes-
se farmacutico
A expresso de protenas usadas como
frmacos em plantas constitui uma alter-
nativa para processos, muitas vezes
dispensariam todos os recursos neces-
de suprir a demanda desses produtos.
Vandekerckhove et al. (1989) realiza-
ram um dos trabalhos pioneiros nesse
ramo, onde o neuropeptdio leu-ence-
falina (um analgsico opiide) foi pro-
duzido em Brassica napus (canola),
como parte de uma protena de reser-
va da semente, a albumina 2S. Outras
protenas usadas como frmacos j
foram sintetizadas em plantas, como o
fator de crescimento epidrmico, eri-
tropoietina, interferon, protena C hu-
mana, glucocerebrosidase, entre ou-
tras (Goddijn & Pen, 1995; Cramer et
al., 1996).
As plantas transgnicas tambm
esto sendo testadas para a produo
de antgenos vacinais. Enquanto os
sistemas baseados na amplificao de
vrus em plantas apresentam capacida-
de de expressar apenas pequenos do-
mnios antignicos fusionados s pro-
tenas da capa viral, plantas transgni-
cas podem expressar antgenos de
maior complexidade estrutural, sem
perda de suas propriedades imunog-
nicas originais. Diversas abordagens
tm sido usadas para obteno de
vacinas a partir de plantas, sendo as
vacinas comestveis as mais promis-
soras, pela reduo nos custos e faci-
lidade de administrao, uma vez que
srios para a produo e distribuio
das vacinas (Langridge, 2000). Buscan-
do demonstrar que protenas produzi-
das em plantas transgnicas so capa-
zes de induzir resposta imune nos
animais, Mason et al. (1992) introduzi-
ram, em tabaco, o gene codificador da
protena de superfcie do vrus da he-
patite B (HBV), ligado a um promotor
constitutivo. Imunoensaios revelaram
a presena da protena viral em extra-
tos das folhas transformadas, indican-
do a viabilidade da expresso de ant-
genos exgenos em plantas para uso
em vacinas. Posteriormente, Thanava-
la et al. (1995) demonstraram que a
protena viral obtida nos extratos das
folhas transformadas era capaz de in-
duzir resposta imune in vivo.
A mesma estratgia foi utilizada
tambm na produo dos antgenos
vacinais bacterianos toxina termolbil
(LT) de Escherichia coli enteropatog-
nica (Haq et al., 1995), e toxina colrica
(CT) de Vibrio cholerae (Arakawa et
al., 1998). Haq et al (1995) demonstra-
ram a formao espontnea de estrutu-
ras pentamricas LT-B idnticas s na-
turais, em batatas transgnicas. Os an-
tgenos recombinantes produzidos em
batatas foram capazes de produzir res-

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 15

 posta imune e proteo parcial em
camundongos (Mason et al., 1998) e no
homem (Tackett et al., 1998).
Anticorpos ou imunoglobulinas so
protenas multimricas complexas, que
requerem, para a sua produo, siste-
mas eucariticos de expresso. A pro-
duo de anticorpos em plantas pode
ter aplicaes in situ ou ex situ (White-
lam & Cockburn, 1996). As aplicaes
in situ compreendem aquelas em que o
anticorpo age como um reagente na
prpria clula, modulando a atividade
de um antgeno, ou ainda, promovendo
imunizao intracelular contra patge-
nos. Os anticorpos apresentam uma
grande variedade de aplicaes ex situ,
tais como controle de poluio ambien-
tal, produo de reagentes industriais,
sensores moleculares, reagentes para
diagnsticos, soros contra toxinas e
venenos, imunizao passiva contra
agentes infecciosos, contraceptivos, te-
rapias contra cncer, entre outras. A
maioria dessas aplicaes requer gran-
des quantidades de anticorpos, sendo
sua utilizao limitada pelo rendimento
dos sistemas de produo. As plantas
transgnicas, alm de apresentarem al-
tos rendimentos de produo, constitu-
em at o momento, o nico sistema de
expresso capaz de produzir anticorpos
completos funcionais. Esse fato foi efe-
tivamente comprovado atravs da pro-
duo de um anticorpo do tipo IgA em
tabaco (Ma et al., 1995). Com esse
objetivo, esses pesquisadores produzi-
ram quatro diferentes plantas de tabaco
transgnicas, cada uma expressando
uma das quatro cadeias polipeptdicas
que compem um anticorpo monoclo-
nal do tipo IgA. Atravs de cruzamentos
sucessivos entre essas plantas, obtive-
ram plantas capazes de expressar, si-
multaneamente, as quatro cadeias poli-
peptdicas e de produzir uma imuno-
globulina funcional. Devido capacida-
de de ligao do anticorpo original com
uma adesina da bactria Streptococcus
mutans, o anticorpo recombinante, pro-
duzido em larga escala em plantas,
dever ser utilizado na imunizao pas-
siva contra crie, pela sua adio em
dentifrcios.
Produo de hormnio do
crescimento humano em
sementes de plantas transgnicas
As protenas recombinantes, de ma-
neira geral, devem ser processadas ime-
diatamente aps a colheita, devido
16 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
alta atividade proteoltica da maioria diversos rgos do tabaco transforma-
dos tecidos vegetais. As sementes, por do com o cassete de expresso de-
sua vez, apresentam tecidos especiali- monstrou a produo do hormnio
zados que permitem o armazenamen- recombinante especificamente nas se-
to de protenas por longos perodos, mentes (Fig. 3B). O seqenciamento da
sem a ocorrncia de degradao. Alm regio amdica do hGH purificado a
disso, o emprego de promotores se- partir das sementes indicou a presena
mente-especficos impede que haja ex- de resduos idnticos aos encontrados
presso generalizada da protena na no hormnio natural. Esse resultado
planta, de modo que seus processos demonstra que o peptdio sinal adicio-
metablicos bsicos no so significa- nado, de maneira similar ao peptdio
tivamente afetados. sinal original, pde ser reconhecido
Com o objetivo de explorar as como um sinal de endereamento, ten-
vantagens da produo em sementes, do sido adequadamente processado.
foi desenvolvido, em nosso laborat- Posteriormente, ensaios de ligao a
rio um, cassete de expresso onde a receptores especficos mostraram que
expresso do gene codificador da pro- o hormnio produzido em sementes
tena de interesse controlada pelo de tabaco apresenta propriedades simi-
promotor de -kafirina. A -kafirina, lares s da protena nativa, dando uma
uma protena de reserva de sorgo, clara indicao de sua funcionalidade
acumula-se em grande quantidade na (Leite et al., 2000).
semente, onde constitui fonte de nitro- O nvel de expresso do hGH re-
gnio e enxofre durante a germinao combinante obtido em sementes de
(Leite et al., 1999). Conforme demons- tabaco resultou um rendimento de pro-
tram os experimentos de expresso duo de, aproximadamente, 0,16%
transiente mostrados na Figura 2, en- das protenas solveis da semente. O
quanto o promotor constitutivo deriva- baixo rendimento deve-se possivelmen-
do do transcrito 35S do vrus do mosai- te ao fato de um promotor originrio de
co da couve flor (P35ScaMV) dirige a uma planta monocotilednea ter sido
expresso do gene reprter gus para os usado no controle da expresso de
diversos compartimentos da semente genes em tabaco, uma planta dicotile-
de milho, o promotor de -kafirina dnea. Corroborando com essa hipte-
estimula essa expresso especificamen- se, resultados obtidos recentemente
te no tecido de reserva, o endosperma. por nosso grupo demonstram rendi-
O cassete de expresso baseado no mentos superiores (cerca de quatro
promotor de -kafirina foi inicialmente vezes) em sementes de milho transg-
testado na produo de hormnio do nico. Estimativas baseadas nesse rendi-
crescimento humano (hGH) em se- mento indicam a possibilidade de se
mentes de tabaco transgnico (Leite et produzir, aproximadamente, 250 g de
al., 2000). Com essa finalidade, a se- hGH a partir de uma tonelada de se-
qncia de cDNA codificadora do hGH mente de milho transgnico (Fig. 3C).
foi inserida na extremidade 3' da se- A baixa complexidade protica que
qncia promotora (Fig. 3A). Na hip- caracteriza o endosperma, aliada re-
fise, o hGH produzido na forma de duzida solubilidade em gua da maio-
um pr-hormnio que apresenta um ria de suas protenas, deve facilitar o
peptdio sinal em sua extremidade desenvolvimento de processos indus-
amdica. O peptdio sinal respons- triais de extrao e purificao do hGH
vel pelo endereamento da protena produzido em sementes de milho trans-
para o retculo endoplasmtico (RE) gnico. Com o objetivo de comparar o
determinando, dessa forma a secreo rendimento da produo de hGH re-
do hormnio. Apesar da existncia de combinante em sementes de diferentes
evidncias de que sinais de enderea- espcies de plantas, a mesma constru-
mento de animais so funcionais em o utilizada na transformao de taba-
plantas, no intuito de maximizar seu co e de milho est sendo testada em
processamento na semente o peptdio soja. Os experimentos com soja trans-
sinal original do hGH foi substitudo gnica esto sendo realizados em cola-
por um peptdio sinal equivalente ori- borao com os pesquisadores Dr. El-
ginrio de uma protena de reserva de bio L. Rech e Dr. Francisco J. L. Arago,
Coix lacryma-jobi, um cereal filogene- da EMBRAPA-Recursos Genticos e Bi-
ticamente relacionado ao milho (Leite otecnologia (Braslia, DF).
et al., 1999). Esse trabalho abriu perspectivas para
A anlise de extratos proticos dos a expresso de outros frmacos de
interesse econmico em sementes e,
utilizando o mesmo sistema de expres-
so, nosso grupo est trabalhando atu-
almente em projetos que visam ex-
presso de insulina humana e de um
anticorpo em sementes de tabaco trans-
gnicas.
Agradecimentos
Os autores agradecem o suporte
tcnico dado por Camilla Abbehausen,
Daniela Stancato e Eduardo Kiyota, e o
trabalho dos alunos de iniciao cien-
tfica Flvia Enara Furquin, Mrio del
Gidice Paniago e Sylvia Morais de
Sousa. Adilson Leite recebe bolsa de
Produtividade em Pesquisa do CNPq.
Eneida A. Parizotto recebe bolsa do
CNPq, Paulo C. De Lucca, Letcia Jung-
mann e Alba C. da Silva recebem bolsa
da FAPESP. Este trabalho recebe apoio
financeiro da FAPESP atravs do Proje-
to Temtico PTE: 99/02198-3.
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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 17
 PESQUISA
FLAVONIDES
Fotos/ilustraes cedidas pelos autores
Farmacologia de flavonides no controle hiperlipidmico em animais experimentais
Renato Matos Lopes
Mestrando do curso de Agroqumica
Departamento de Bioqumica e Biologia
Molecular
Universidade Federal de Viosa
renato@tdnet.com.br
Tnia Toledo de Oliveira
Doutora, Professora Adjunta do
Departamento de Bioqumica e Biologia
Molecular da Universidade Federal de
Viosa
ttoledo@mail.ufv.br
Tanus Jorge Nagem
PhD, Professor Adjunto do Departamento
de Qumica da Universidade Federal de
Ouro Preto
tjnagen.bh@zaz.com.br
Alosio da Silva Pinto
Mestre, Professor Assistente do Departa-
mento de Veterinria da Universidade
Federal de Viosa
aloisio@mail.ufv.br
18 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
INTRODUO
Desordens coronarianas so uns dos problemas causados pelo acmulo de
colesterol, e tm sido causa de alta taxa de mortalidade no Brasil, Japo, Inglaterra,
Estados Unidos e outros pases (Truswell, 1984).
A aterosclerose e, em particular, a cardiopatia coronria, relaciona vrios
fatores de risco, tais como: idade, sexo, obesidade, estresse emocional, baixos
nveis de colesterol -HDL, fumo, dietas ricas em gordura saturada e ainda
problemas genticos. A importncia de todos esses fatores de risco correlacio-
nada com o aumento dos nveis de colesterol no sangue, assim como as atividades
pr-oxidantes de radicais livres sobre as lipoprotenas de baixa densidade (LDL)
no nvel endotlio. O consumo de gorduras saturadas aumentam os valores do
colesterol na corrente sangnea, impedindo a atividade dos receptores de LDL e,
conseqentemente, dificultando a sua eliminao (Leite, 1994).
Nveis elevados de colesterol-HDL esto associados com a diminuio de risco
da cardiopatia coronariana; seu efeito oposto ao colesterol-LDL, uma vez que
este transporta o colesterol para os tecidos, enquanto o HDL atua no transporte
do colesterol em excesso para o fgado. O quociente colesterol LDL/colesterol-
HDL um indicativo confivel de risco aterognico. Nas populaes onde so altas
as concentraes tanto do LDL como do HDL, os indivduos com menores nveis
de HDL esto mais susceptveis a padecer de cardiopatia coronariana. Ainda que
os nveis de HDL possam estar condicionados geneticamente, a alimentao um
fator determinante (Feinleb, 1984).
As partculas de HDL facilitam o transporte de colesterol dos tecidos perifricos
ao fgado, para sua excreo. Os cidos saturados no reduzem os nveis de
colesterol-HDL, mas aumentam a concentrao de colesterol-LDL. A maioria das
investigaes epidemiolgicas mostram uma correlao positiva entre as concen-
traes sricas de triacialgliceris e a cardiopatia coronariana (Feinleb, 1984).
A reduo nas concentraes plasmticas de lipoprotenas LDL, VLDL podem
diminuir o risco do infarto do miocrdio (Lipid Research, 1984).
O esquema 1 apresenta a formao de uma placa aterosclertica. Partculas de
LDL e plaquetas penetram no endotlio e causam leses (1). Fatores de
crescimento liberados pelas plaquetas estimulam as clulas musculares abaixo do
endotlio, causando proliferao no stio da leso. Todo processo acompanhado
pela migrao de moncitos e outras partculas de LDL (2), conseqentemente,
ocorre a formao de clulas espumosas (3). Desenvolve-se, ento uma aglome-
rao na regio de fosfolipdios, colesterol e clcio e, gradualmente, ocorre o
endurecimento deste, formando salincias fibrosas e resistentes que so as placas
de ateroma.
Como preveno da doena arterial coronariana, comum o uso de frmacos
hipolipemiantes como adjuvantes da dietoterapia para pacientes com dislipopro-
teinemia. A busca de novos frmacos que possam atuar em uma reduo dos nveis
de colesterol tem sido motivo de novas pesquisas.
 FLAVONIDES
Os flavonides compem uma
ampla classe de substncias de ori-
gem natural, cuja sntese no ocor-
re na espcie humana. Entretanto,
tais compostos possuem uma srie
de propriedades farmacolgicas que
os fazem atuar sobre sistemas bio-
lgicos. Conseqentemente, mui-
tas dessas propriedades atuam de
forma benfica para a sade huma-
na. Atualmente, j foram
identificadas mais de quatro mil
substncias pertencentes ao grupo
dos flavonides (Peterson & Dwyer,
1998).
Estruturalmente, os flavonides
constituem substncias aromticas
com 15 tomos de carbono (C15) no
seu esqueleto bsico, sendo com-
postos fenlicos, que possuem nes-
sa estrutura anis aromticos C 6-C3-
C6. O esqueleto C15 dos flavonides
biogeneticamente derivado do
fenilpropano (C6-C3) e trs unida-
des de acetato (C 6). Portanto,
flavonides so derivados de ben-
zo-gama-pirona de origem vegetal
(Yokozawa et al, 1997), podendo
haver facilmente interconverso
entre eles (vide figura 1).
A explicao para a existncia
de uma grande diversidade estrutu-
ral dos flavonides explicada pelas
modificaes que tais compostos
podem sofrer, tais como:
hidroxilao, metilao, acilao, nando a ampla variedade das ativida-
glicosilao, entre outras (Koes et
al, 1994).
Consumidos em grandes pro-
pores dentro de uma dieta huma-
na regular, os flavonides so en-
contrados em vegetais, legumes,
frutas, chs de ervas, mel, entre
outros produtos de consumo coti-
diano.
Apesar do termo flavonide
derivar do latim flavus, que signifi-
ca amarelo, observa-se que os gru-
pos flavonis e flavonas so incolo-
res e que a classe das antocianinas
possuem substncias que variam
no seu espectro de colorao do
verde ao azul. A tabela 1 apresenta
algumas das principais classes de
flavonides, assim como alguns dos
seus principais representantes e
caractersticas.
Esquema 1: Formao da
placa aterosclertica
Propriedades farmacolgicas
dos flavonides
Diversos ensaios in vivo e in
vitro vm comprovando e determi-
dade Federal de Viosa, utilizando-se
des biolgicas dos compostos flavo-
nodicos. Segundo Ratty & Das (1998),
algumas dessas propriedades farma-
colgicas j foram observadas por
Szent-Gyorgi em 1936. Destacam-se,
dentre outros, os seguintes efeitos
dos flavonides sobre os sistemas
biolgicos: capacidade antioxidativa
(esta constitui a atividade mais eluci-
dada pelos estudos at agora desen-
volvidos); atividades antiinflamatria
e de efeito vasodilatador; ao antia-
lrgica; atividade contra o desenvol-
vimento de tumores, anti - hepatot-
xica, antiulcerognica; atuao anti-
plaquetria, bem como aes antimi-
crobianas e antivirais. Pesquisas re-
centes demonstraram que alguns fla-
vonides atuam na inibio da repli-
cao viral do agente causador da
Sndrome da Imunodeficincia Hu-
mana HIV (Lin et al. 1997).
Sabe-se que os flavonides po-
dem inibir vrios estgios dos proces-
sos que esto diretamente relaciona-
dos com o incio da aterosclerose,
como ativao de leuccitos, adeso,
agregao e secreo de plaquetas
(Hladovec, 1986b), alm de ativida-
des hipolipidmicas (Lin et al, 1986)
e aumento de atividades de recepto-
res de LDL (Kirk et al, 1998).
Segundo Anton & Beretz (1990),
as propriedades farmacolgicas dos
flavonides ainda no haviam sido
totalmente avaliadas. Aps uma d-
cada de avanos nessa linha de pes-
quisa, pode-se afirmar que novos
estudos toxicolgicos e farmacolgi-
cos devem ser realizados, uma vez
que a ampla diversidade estrutural
desses compostos - bem como a
capacidade de interao com outras
substncias - nos reporta a imaginar
que novas descobertas ainda podem
e devem ser realizadas.
Com o objetivo de se avaliar a
ao hipolipidmica de flavonides e
de corantes naturais em animais ex-
perimentais com hiperlipidemia in-
duzida, o laboratrio de Biofrmacos
da Universidade Federal de Viosa
vem desenvolvendo uma srie de
estudos para conhecer o potencial
farmacolgico desses compostos.
A seguir, so descritas algumas
metodologias empregadas pelo labo-
ratrio de Biofrmacos da Universi-
coelhos com hiperlipidemia induzi-
da a partir de uma dieta rica em cido
clico e colesterol ou aplicao de
Triton:
METODOLOGIA GERAL.
Considerando-se um nmero de-
terminado de coelhos machos, albi-
nos, adultos, da Raa Nova Zelndia
(com peso mdio de 2500 200g),
dispostos em gaiolas individuais com
temperatura local que varia entre 22
3 0 C, e taxa de umidade relativa do
ar situada na faixa de 70%. Esses
animais so submetidos a uma dieta
com rao comercial SOCIL, na pro-
poro de 130 g ao dia e gua potvel
ad libitum ( figura 2).
Aps o perodo de adaptao s
condies locais, os animais so or-
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 19
 denados em grupos, de acordo com
o tratamento a ser aplicado: a) Grupo
controle; b) Controle + substncias
indutoras de hipercolesterolemia; c)
Controle + substncias indutoras de
hipercolesterolemia + substncias
teste (flavonides ou medicamen-
tos). Os tratamentos so efetuados
durante perodos predeterminados
de tempo e, normalmente o trata-
mento dos animais realizado por
via oral atravs de cpsulas (figura 3).
Amostras de sangue so retiradas
antes, durante e aps o tratamento
desses animais para verificao e
acompanhamento dos efeitos dos tra-
tamentos sobre os constituintes lip-
dicos, o sangue retirado centrifuga-
do a 7100 G por 15, para obteno do
soro. As dosagens sorolgicas so
realizadas e os resultados do coleste-
rol, do colesterol-HDL e dos triacilgli-
ceris so obtidos por meio de Kits
Biolab no equipamento multipara-
mtrico Aliz (figura 4).
As substncias utilizadas como
indutores das hiperlipidemias so:
colesterol a 1% e cido clico 0,1%
misturados rao, assim como a Figura 1: Interconverso dos principais grupos de flavonides.
aplicao intraperitonial de Triton Adaptado de Domingues (1973)
WR 1339 na dose de 300mg/kg de
peso corporal do animal, utilizando O flavonide Naringina associado et al., 1999). Dessa forma, a associa-
como veculo NaCl 0,9%. antocianina e ao carmim (corantes es entre naringina/antocianina e
Triton tambm conhecido como naturais utilizados na indstria de naringina/carmim demonstraram alta
tyloxapol, um detergente no anini- alimentos) reduziram em at 70,21% eficincia na reduo dos nveis de
co de estrutura polimrica da Sigma, os triacilgliceris e em 63,01% os colesterol e triacilglicerol.
cuja utilizao vem sendo ampla- nveis de colesterol em ratos hiperli- Os flavonides quercetina, mori-
mente empregada para promover hi- na e o medicamento cido nicotnico,
perlipidemia em cobaias (Mathur et empregados de forma isolada e asso-
al., 1964; Sharma, 1979; Choi et al., ciada, apresentaram ao no metabo-
1991). lismo lipdico em ratos machos hiper-
lipidmicos (Santos et al. 1999a). Os
RESULTADOS OBTIDOS resultados mostraram uma reduo
de 83,77% de triacilgliceris e 76,89%
Nossos trabalhos demonstram que de colesterol, quando se empregou
naringenina e chitosan tm efeitos um tratamento conjunto de morina e
sobre lipdios no soro de coelhos cido nicotnico. Quercetina e cido
com hiperlipidemia induzida por Tri- FIGURA 2: Coelho da Raa Nova nicotnico promoveram uma varia-
ton. Certificou-se, inclusive, que a Zelndia confinado em gaiola o positiva em 21,96% para o coles-
associao entre naringenina e chis- individual durante o tratamento terol-HDL.
tosan foram mais eficazes no controle com a substncia-teste O cido nicotnico um medica-
do metabolismo lipdico. Os resulta- mento empregado de forma usual no
dos obtidos demonstram que, em um controle de nveis de lipdios no
efeito sinrgico das duas substncias- pidmicos, atravs de Triton. Narin- organismo. Aes hipolipidmicas
teste, promovem uma reduo de gina e antocianinas foram tambm as desse medicamento decorrem da ini-
71,42% de triacilgliceris, em compa- responsveis pelo acrscimo de bio da liplise do tecido adiposo,
rao com o grupo de animais que 15,27% de colesterol HDL, quando mobilizao dos cidos graxos, redu-
apresentaram hiperlipidemia induzi- comparado aos animais tratados ape- o da esterificao dos triacilglice-
da pelo Triton ( Lopes, 2000). nas com a rao e o indutor ( Nagem ris no fgado e aumento da lipase
20 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Tabela 1: Principais classes de flavonides e descrio de suas caractersticas bsicas
CLASSES COLORAO EXEMPLOS COMENTRIOS

Antocianinas Azul, vermelha e Cianidina; Antocianinas esto predominantemente em frutas e flores

violeta Delfinidina; e provavelmente foram os primeiros flavonides a serem
Peonidina. isolados provenientes de pigmentos florais, conforme
indicam seus prprios nomes. So usadas como corantes.

Flavanas (mono, Incolor Catequina; Flavanas so encontradas em frutas e chs (verdes ou

bi e triflavans) Epicatequina pretos). Biflavanas so encontradas em frutas, lpulo,
Luteoforol; nozes e bebidas como chs e gua de coco. O sabor
Procianidina. peculiar de algumas bebidas, frutas, chs e vinhos
Theaflavina devido, principalmente, presena das biflavanas.

Flavanonas Incolor para um Hesperidina; Flavanonas so encontradas quase que exclusivamente em

amarelo plido. Naringenina. frutas ctricas.

Flavonas Amarelo plido Apigenina; Flavonas so encontradas quase que exclusivamente em

Luteolina; frutas ctricas. Mas tambm em cereais, frutas, ervas e
Diosmetina; vegetais. Conferem o pigmento amarelo em flores. Os
Tangeretina; compostos mais comuns so a apigenina e a luteolina.
Nobiletina
Flavonis Amarelo plido Quercetina; Os flavonis esto presentes em diversas fontes, sendo
Rutina; predominantes em vegetais e frutas. A quercetina o
Mircetina; principal representante da classe.
Kaempherol
Isoflavonides Incolor Daidzena; Isoflavonides so encontrados quase que exclusivamente
Genistena. em legumes, particularmente na soja.
Fonte: Adaptado de Peterson & Dwyer, 1998

Nagem et al, 1995; Santos et al,

1999c).

CONCLUSES

Os resultados obtidos demons-

FIGURA 3: Recipiente lacrado
e identificado contendo as
cpsulas com a substncia-teste
a ser utilizada durante o ensaio
biolgico
lipoprotica ( Goodman & Gilmans,
1996).
Diversos compostos flavonodi-
cos de diferentes plantas, que foram
extrados, isolados, identificados e
quantificados, foram transformados
quimicamente e empregados em en-
saios biolgicos para avaliaes dos
seus potenciais farmacolgicos sobre
lipdios em ratos (Santos et al, 1999b;
tram redues estatisticamente sig-
nificativas para os nveis de coles-
terol e de triacilgliceris, assim
como aumento dos valores de co-
lesterol-HDL, destacando-se, inclu-
sive, efeitos sinrgicos dos com-
postos flavonodicos testados.
Dessa forma, fundamental o de-
senvolvimento de novas pesqui-
sas sobre o potencial dos flavoni-
des no tratamento e na preveno
das hiperlipidemias, uma vez que
a obteno de novos resultados
serviro de instrumentos para a
utilizao desses produtos na pre-
veno de doenas cardiovascula-
res.
As interaes com outros n-
cleos de pesquisas para o desen-
volvimento de novas metodologi-
as de anlises permitiro aprofun-
dar os conhecimentos sobre os
FIGURA 4: Equipamento
Aliz (Analisador Automtico
de Bioqumica), capaz de
realizar anlises de concentra-
es de constituintes
sangneos, aproximadamen-
te 180 testes/hora
mecanismos de aes desses com-
postos naturais, assim como obter
novas avaliaes de suas proprieda-
des farmacolgicas.
Evidencia-se tambm a importn-
cia e a aplicabilidade de avaliaes
de toxicidade de flavonides sobre
sistemas biolgicos. Essa afirmao
reside no fato de que ensaios toxico-
lgicos permitiro o emprego de doses
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 21
 seguras dos flavonides como fr-
macos.
O laboratrio de biofrmacos da
Universidade Federal de Viosa pos-
sui interesse em interagir com ou-
tros ncleos de pesquisa, que, por-
ventura, tenha como objetivo estu-
dos farmacolgicos e toxicolgicos
de flavonides, corantes naturais ou
outros produtos de origem natural.
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22 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

 Anncio COBRAFI
Conselho Brasileiro de
Fitossanidade
(REPETE FOTOLITO)
Obs.: Saiu na pgina 37 da edio anterior n 16

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 23

 Vacinas de BCG Recombinante-DTP
Waldely Oliveira Dias
PhD pela Escola Paulista de Medicina
Pesquisadora do Instituto Butantan
Centro de Biotecnologia.
Eliane Namie Miyaji Denise Silvina Piccini Quintas
PhD pela Universidade de So Paulo, Ps- Horton
Doutoranda no Instituto Butantan PhD pela Escola Paulista de Medicina
Centro de Biotecnologia. Pesquisadora do Instituto Butantan

Rogrio Pietro Mazzantini Ivan Pereira Nascimento Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Centro de Biotecnologia - Instituto Doutorando do Departamento de PhD pela Universidade de So Paulo
Butantan Bioqumica - Instituto de Qumica USP. Pesquisadora do Instituto Butantan
SADE Mestrando do Curso Interunidades em Centro de Biotecnologia, Instituto lccleite@quim.iq.usp.br
Biotecnologia. Butantan.

Resposta imune e proteo induzida por vacinas de BCG recombinante-DTP

Fotos cedidas pelos autores

A imunoprofilaxia, ou vacinao, no ocorrer reverso para a viruln- monstrando a induo de respostas

a medida mais eficiente e menos one-
rosa na preveno de doenas infecci-
osas. A erradicao da varola e o
sucesso com a trplice (DTP - difteria,
ttano e pertussis, ou tosse comprida)
e com a Sabin so provas contunden-
tes da importncia desses programas
de vacinao. No entanto, fatores cul-
turais, sociais e econmicos dificul-
tam a realizao de diversas campa-
nhas de vacinao, especialmente em
pases em desenvolvimento, onde os
sistemas de sade so por vezes defi-
citrios. Essa conjuntura levou a co-
munidade cientfica a um esforo para
desenvolver vacinas multivalentes. Em
especial, procuram-se veculos vivos
de apresentao de antgenos, uma
vez que a expresso contnua do imu-
ngeno poderia eliminar a necessida-
de de vrias doses de reforo para se
alcanar uma proteo mxima, o que
o caso de vrias vacinas atualmente
em uso. Veculos que tm sido parti-
cularmente investigados so: Vacc-
nia, Salmonella atenuada, ou BCG
(Bacilo Calmette-Guerin, vacina con-
tra a tuberculose), com resultados em-
polgantes (1).
O Bacilo de
Calmette-Guerin, BCG
Albert Calmette e Camille Guerin,
trabalhando no Instituto Pasteur, de
Lille, no incio do sculo, atenuaram
uma cepa virulenta de Mycobacterium
bovis ao longo de 13 anos com 215
passagens sucessivas. A imunizao
com essa cepa foi ento testada em
diversas espcies de animais experi-
mentais para demonstrar que, alm de
24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
cia, tambm conferia resistncia a um
desafio subseqente com M.bovis vi-
rulento ou M.tuberculosis. Essa cepa,
hoje conhecida como Bacilo de Cal-
mette-Guerin, ou BCG, foi utilizada
oralmente, pela primeira vez, em 1921,
e sua aplicao generalizada foi reco-
mendada pela Liga das Naes, em
1927.
Hoje o BCG a vacina mais utiliza-
da no mundo, tendo j sido adminis-
trada a 3 bilhes de indivduos, com
uma freqncia baixssima de efeitos
adversos srios. Isso torna o BCG um
bom candidato a veculo para apre-
sentao de antgenos heterlogos,
tendo em vista a possvel validao de
uma vacina recombinante baseada em
BCG. Uma vacina multivalente, que
utilize BCG como veculo vivo, apre-
sentaria vrios outros fatores vantajo-
sos, como: I) o BCG a nica vacina
recomendada pela WHO (Organiza-
o Mundial da Sade) para ser admi-
nistrada ao nascimento; II) requer ape-
nas uma imunizao para conferir
imunidade celular duradoura, pois o
BCG pode permanecer no organismo
por anos (dependendo do indivduo)
- a apresentao contnua dos antge-
nos eliminaria a necessidade de pro-
gramas de vacinao seqenciais, que
o caso de diversas vacinas em uso
atualmente; III) seu processo de pro-
duo de baixo custo, sendo vendi-
da atualmente a apenas 55 centavos
de dlar; IV) o BCG um dos mais
efetivos adjuvantes conhecidos para
induo de imunidade celular em ani-
mais e humanos; e V) estudos recen-
tes tm reanalisado a possibilidade de
uma vacinao oral com BCG, de-
humorais e celulares, inclusive em
tecidos mucosos. Todas essas vanta-
gens favorecem o uso da cepa viva
atenuada de BCG como veculo mul-
tivacinal para a induo de imunidade
humoral e celular contra diversos pa-
tgenos (2, 3).
BCG recombinante
Micobactrias como M.tuberculosis
ou BCG infectam macrfagos e po-
dem sobreviver por longos perodos
no seu interior, estimulando continu-
amente o sistema imune. Vrios estu-
dos tm demonstrado que BCG re-
combinante expressando protenas
heterlogas pode induzir os 3 tipos de
resposta imune necessrios para pro-
teo contra vrios patgenos: I) pro-
duo de anticorpos IgG por clulas
B; II) proliferao de linfcitos T e
produo de linfocinas, inclusive in-
terferon-gama (IFN-); III) e produo
de linfcitos T-citotxicos, com restri-
o por classe I do complexo princi-
pal de histocompatibilidade (Figura
1). Antgenos de diversos patgenos
virais, bacterianos e de parasitas, como
HIV, Streptococcus pneumoniae, Clos-
tridium tetani, Borrelia burgdorferi,
Plasmodium falciparum, Schistosoma
mansoni, etc, foram expressos em
BCG recombinante, induzindo res-
postas humorais e/ou celulares e, em
alguns casos, levando proteo con-
tra um desafio com o patgeno (2,3).
A Vacina Trplice - DTP
A vacina trplice - DTP convencio-
nal mostrou-se extremamente eficien-
te no controle de infeces por difte-
ria, ttano e pertussis (tosse compri-
da), quando a vacinao completa
alcanada. Essa vacina constituda
de anatoxina diftrica e anatoxina te-
tnica (as respectivas toxinas detoxifi-
cadas por tratamento qumico) e por
clulas inteiras de Bordetella pertussis,
quimicamente inativadas. Um incon-
veniente na tecnologia utilizada na
produo da vacina trplice a neces-
sidade de manipulao de grandes
quantidades de material txico na pre-
parao de cada um dos componen-
tes. Embora essa vacina seja muito
eficiente, algumas vezes tem sido rela-
cionada a efeitos colaterais indesej-
veis. Alm disso, necessria a aplica-
o de diversas doses para se alcanar
a proteo mxima, o que pode levar
a uma cobertura reduzida, especial-
mente em pases em desenvolvimen-
to. Assim, a cobertura mundial para
vacinao com DTP, que estava esta-
cionada h anos em 80%, em 1998
caiu para 74%, sendo a baixa cobertu-
ra concentrada nos pases em desen-
volvimento. Isso significa que 1 em
cada 4 crianas no mundo no est
coberta contra esses patgenos, resul-
tando em uma mortalidade anual de
quase 1 milho de crianas (4). Por-
tanto, existe um esforo para a aplica-
o de novas tecnologias para o de-
senvolvimento de vacinas contra tta-
no, difteria e pertussis, buscando-se
alternativas para reduo do nmero
de doses necessrias. A utilizao de
vetores vivos de apresentao de an-
tgenos poderia ser, neste caso, extre-
mamente vantajoso.
BCG recombinante - DTP
O objetivo deste trabalho consiste
em desenvolver uma vacina multiva-
lente, utilizando BCG como veculo
vivo para apresentao de antgenos
de difteria, ttano e pertussis. Utiliza-
mos os seguintes antgenos: I) para a
frao diftrica, o CRM 197, toxina
diftrica, com uma mutao que elimi-
na sua atividade txica, mas mantm
a sua imunogenicidade (gentilmente
cedido pelo Dr. Rino Rappuoli, Bioci-
ne, Itlia); II) para a frao tetnica, o
fragmento C da toxina tetnica (FC),
que se tem mostrado atxico e imuno-
gnico (clonado pela Dra. Ana Lucia
T.O. Nascimento, Instituto Butantan);
e III) para a frao pertussis, o gene da
Subunidade 1 da toxina pertussis
(S1PT), com 2 mutaes que a tornam
atxica, porm mantendo sua imuno-
genicidade (PT-9K/129G) (fornecido
pelo Dr. Rino Rappuoli).
No desenvolvimento de uma vaci-
na de BCG recombinante, a expresso
da protena heterloga pode ser
conseguida atravs de um vetor de
expresso extracromossomal ou a par-
tir de um vetor integrativo, sendo que
o primeiro, em geral, leva a maiores
nveis de expresso e o segundo, a
expresso mais estvel. Os vetores de
expresso extracromossomais tm sido
mais utilizados, sendo vetores-ponte
com origem para replicao em mico-
Tabela 1: Sobrevivncia de
camundongos imunizados com
rBCG-S1PT contra desafio com B.
pertussis virulentaa
Grupo Sobrevivncia
Salina 1/10
rBCG-S1PT 8/10
DTP 9/10
a
Grupos de 10 camundongos
imunizados 2 semanas antes com
106 CFU/0,5 ml of rBCG-S1PT, ou
o controle negativo recebendo 0,5
ml de salina e o controle positivo
recebendo 0,4 ml de DPT, foram
submetidos a desafio intracerebral
com uma dose letal de cepa
virulenta de B. pertussis. A
sobrevivncia foi monitorada por
17 dias.
bactria e em Escherichia coli, onde
realizada toda a manipulao gentica
dos vetores. Os vetores de expresso
devem ter um marcador de seleo
para isolar os transformantes, onde se
usa em geral um gene de resistncia a
antibitico. O gene que tem sido mais
usado o gene Tn903, que confere
resistncia a kanamicina, uma vez que
as micobactrias so naturalmente re-
sistentes a antibiticos -lactmicos
(3).
O nvel de expresso e localizao
dos antgenos so fatores importantes
para o nvel de resposta imune indu-
zida. So os promotores que regem o
nvel de expresso. Os promotores
micobacterianos que tm sido mais
utilizados so os promotores das pro-
tenas de choque trmico, hsp60 e
hsp70. Mais recentemente, outros pro-
motores tm sido utilizados para a
expresso de protenas heterlogas,
como o promotor pAN, isolado de
M.paratuberculosis; os promotores dos
antgenos de 18kDa, 19kDa e 85A, de
M.tuberculosis, e o promotor mutado
da -lactamase de M.fortuitum, pBlaF*.
Outro fator importante na resposta
imune induzida a localizao do
antgeno heterlogo. A fuso com
seqncias sinais de exportao de
diferentes protenas de micobactria
pode levar exportao dos antge-
nos e, conseqentemente, alterao
na resposta imune induzida (2,3).
Ns utilizamos vetores de expres-
so que contm o promotor pBlaF*,
que levou a elevada expresso de
antgenos de outros patgenos, com
ou sem a seqncia sinal de exporta-
o da -lactamase (ssBlam) (gentil-
mente cedidos pela Dra. Brigitte Gic-
quel, Instituto Pasteur, Paris), que os
direcionaria exportao. Assim, o
vetor pJEM17 leva expresso do
gene nativo e o vetor pLA71 coloca o
gene em fuso com ssBlam (Figura 2).
Abordagem Experimental
A Figura 3 ilustra a abordagem
experimental utilizada. Os genes dos
antgenos heterlogos de ttano, dif-
teria e pertussis, respectivamente, FC,
CRM197 e S1PT, foram amplificados
por PCR a partir de plasmdeos con-
tendo os genes e clonados nos vetores
de expresso em micobactria con-
tendo o promotor pBlaF*, pJEM17 e
pLA71, sem fuso e com fuso com a
seqncia sinal da -lactamase, res-
pectivamente. BCG eletrocompeten-
tes foram transformados por eletropo-
rao e plaqueados em meio slido
para crescimento de micobactria con-
tendo kanamicina (o plasmdeo con-
tm o gene de resistncia a este anti-
bitico) para seleo dos transfor-
mantes.
Colnias de BCG recombinante
resistentes kanamicina, portanto con-
tendo os vetores, foram cultivadas em
meio lquido, tambm contendo ka-
namicina. Uma parte foi utilizada para
preparao de extratos proticos por
sonicao e extrao com detergente
SDS e outra parte foi utilizada para
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 25

Figura 1. Resposta imune induzida por BCG recombinante
preparaes vacinais congeladas em
glicerol a -80 C. Os extratos proticos
foram analisados por eletroforese em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e
por Western blot (reao com anticor-
pos especficos), para verificao da
expresso dos antgenos heterlogos.
Na revelao dos Western blots, foram
utilizados anticorpos especficos: I)
soro policlonal anti-anatoxina tetni-
ca e II) anti-anatoxina diftrica produ-
zido em cavalos no Instituto Butantan,
e III) anticorpos monoclonais anti-
toxina pertussis (cedidos pelo Dr. Yuji
Sato, NIH, do Japo). A localizao
dos antgenos foi verificada por extra-
o diferencial com detergente Triton
X-114, em que se separam as fraes
de citosol (aquosa), membrana celular
(detergente) e parede celular (insol-
vel) (5).
Preparaes vacinais de clones de
BCG recombinante que expressaram
os antgenos heterlogos foram, en-
to, administrados intraperitonealmen-
te em grupos de 5 a 10 camundongos
Balb/c, NIH, ou Swiss, a uma dose de
106 unidades formadoras de colnia
(CFUs) em 0,5 mL de salina apirogn-
cia (Figura 3). Foram tambm admi-
nistrados: salina, BCG e BCG conten-
do os vetores vazios, como grupos
controles negativos e DTP, como con-
trole positivo. Os camundongos fo-
ram sangrados por via retro-orbital a
cada 30 dias por at 6 meses. A indu-
o de resposta imune humoral foi
avaliada por ELISA, onde se verificou
a presena de anticorpos homlogos
especficos contra os antgenos nos
26 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
soros dos camundongos imuniza-
dos. Para as preparaes de BCG-
S1PT, avaliou-se tambm a induo
de resposta imune celular especfica
contra toxina pertussis (PT), dosan-
do-se a liberao de IL-4 e IFN- por
linfcitos esplnicos isolados dos ca-
mundongos imunizados, aps est-
mulo com toxina pertussis detoxifi-
cada (dPT).
Camundongos imunizados com
as diferentes vacinas de BCG recom-
binante expressando os antgenos
de difteria, ttano e pertussis, foram
ento submetidos a ensaios para ve-
rificao do nvel de proteo indu-
zida. A proteo contra ttano
verificada pela capacidade do soro
de camundongos vacinados em neu-
tralizar a toxina tetnica ativa. O
ensaio pode ser in vivo, onde a
toxina tetnica administrada aos
camundongos vacinados, ou in vitro
onde a toxina misturada com o
antissoro e o complexo administra-
do em camundongos no vacinados.
Verifica-se a sobrevivncia dos ani-
mais por 4 dias. A proteo contra
difteria avaliada pela capacidade
de soroneutralizao da toxina dift-
rica in vitro, verificando a toxicidade
da mistura toxina-antissoro aplicada
sobre culturas de clulas de mamfe-
ro (Clulas Vero). A sobrevivncia
das clulas avaliada aps 3 dias. A
proteo contra pertussis avaliada
pela sobrevivncia dos camundon-
gos imunizados aps desafio intrace-
rebral com cepa virulenta de Borde-
tella pertussis, seguida por 14 dias.
Resultados:
Expresso dos Antgenos
Heterlogos em rBCG
Os vetores de expresso de mico-
bactria contendo os antgenos de
ttano, difteria e pertussis foram ele-
troporados em BCG e as colnias
resistentes kanamicina, seleciona-
das e cultivadas para a preparao de
extratos proticos e lotes de vacinas.
Os extratos proticos foram analisa-
dos por Western blot.
Os extratos proticos de clones de
BCG recombinante (rBCG) transfor-
mados com os vetores contendo o
gene FC, sem ou com fuso com
ssBlam, respectivamente, rBCG-JFC e
rBCG-LAFC, mostraram expresso da
protena heterloga por Western blot
revelado com antissoro anti-anatoxi-
na tetnica, com os respectivos pesos
moleculares esperados: rBCG-JFC
apresentou uma banda de ~ 51 kDa e
rBCG-LAFC de ~ 55 kDa (incluindo
4kDa da ssBlam). No entanto, os ex-
perimentos de localizao do antge-
no heterlogo no BCG mostraram
que, em ambas as construes, o FC se
encontrava no citosol, indicando que,
nesse caso, a fuso com ssBlam no
resultou em exportao do antgeno.
Clones de rBCG transformados com
os vetores de expresso contendo o
antgeno de difteria CRM197 mostra-
ram expresso da protena em Wes-
tern blot quando revelado com antis-
soro anti-anatoxina diftrica (6). O
clone de rBCG-JCRM197 apresentou a
banda de peso molecular esperado a
~50 kDa. J o clone de rBCG-LA-
CRM197 apresentou uma banda de
mesmo peso molecular, indicando que
a fuso com ssBlam no foi estvel. O
interessante que, em ambas as cons-
trues, o antgeno se localizou na
frao de membrana, mesmo sem a
seqncia sinal de exportao, suge-
rindo uma afinidade prpria da prote-
na pela membrana celular.
No caso de rBCG-S1PT (contendo
a subunidade S1 da toxina pertussis
mutada), realizamos apenas a cons-
truo em fuso com ssBlam, pois
relatos da literatura haviam indicado
uma dificuldade de express-la sem
fuso em outros sistemas. O Western
blot revelado com anticorpo anti-PT
mostrou uma banda de ~30kDa, pou-
co acima da banda de S1 da toxina
pertussis (de 26,2 kDa). O S1PT re-
combinante localizou-se na frao de
parede celular (Figura 4, 2 e 3), indi-
cando ter havido uma tentativa de
exportao do antgeno que no che-
gou a se completar (7).
Resposta Imune e Proteo
induzida pelas vacinas de rBCG
em camundongos
Camundongos Balb/c ou NIH fo-
ram imunizados com as preparaes
vacinais de rBCG-JFC, rBCG-LAFC,
rBCG-JCRM197 ou rBCG-LACRM197,
ou diferentes combinaes desses. Um
reforo foi realizado nas mesmas con-
dies aps 2 meses e meio. A forma-
o de anticorpos anti-anatoxina tet-
nica ou diftrica foi avaliada mensal-
mente nos soros dos camundongos
vacinados, durante 6 meses, por ELI-
SA. Imunizao com rBCG expressan-
do FC em ambas as construes indu-
ziu a formao de anticorpos anti-
anatoxina tetnica, mostrando, ento,
uma elevao dos ttulos sricos aps zados com as preparaes vacinais de
o reforo. A expresso de FC, com e
sem fuso, com ssBlam mostrou-se
equivalente, porm a resposta humo-
ral foi mais elevada sem a fuso,
indicando ser a expresso do gene
nativo mais adequada. A imunizao
de camundongos com rBCG expres-
sando CRM197 tambm induziu for-
mao de anticorpos anti-anatoxina
diftrica, que foi aumentada aps o
reforo (6). Tambm, nesse caso, a
construo sem fuso com ssBlam
induziu a um nvel maior de anticor-
pos anti-anatoxina diftrica. Quando
os camundongos foram imunizados
com uma mistura de rBCG expressan-
do FC e rBCG expressando CRM197,
ambos sem fuso, a resposta imune
induzida contra cada um foi aumenta-
da, evidenciando um efeito adjuvante
de rBCG-FC sobre a resposta contra
difteria e a recproca, de rBCG-CRM197
contra o ttano. O soro obtido dos
camundongos imunizados com a mis-
tura de rBCG-FC e rBCG-CRM197 apre-
sentou um padro de istipos de imu-
noglobulina preponderantemente
IgG1, semelhante ao obtido com as
vacinas convencionais compostas pe-
las respectivas anatoxinas. Esse mes-
mo soro foi capaz de neutralizar a
atividade da toxina tetnica in vitro e
in vivo. O mesmo soro foi tambm
Figura 2. Vetores de expresso de antgenos heterlogos em
micobactria. Os vetores pJ-Ag e pLA-Ag contm origem de replicao
em E.coli (ori-E.coli) e origem de replicao em micobactria (ori-
mico), o gene de resistncia kanamicina (Km), e o promotor mutado
da -lactamase de M.fortuitum, pBlaF*. pJ-Ag expressa o gene do
antgeno nativo e pLA-Ag expressa os gene em fuso, com a seqncia
sinal da lactamase (ssBlam) (ss). Ag pode ser FC, CRM197 ou S1PT
capaz de neutralizar a atividade da dos evidenciaram um efeito adjuvante
toxina diftrica in vitro sobre clulas recproco de rBCG-FC e rBCG-
Vero. CRM197. A expresso de FC em rBCG
Camundongos Swiss foram imuni- j havia sido descrita utilizando outros
vetores, mas a proteo induzida foi
rBCG-S1PT, e a induo de resposta parcial. A expresso de CRM197 em
humoral especfica contra PT seguida veculos vivos de apresentao de
por ELISA do soro dos camundongos antgenos tem se mostrado difcil. Esta
imunizados por at 6 meses. A induo a primeira vez que se obtm a
de anticorpos anti-PT foi baixa. A res- expresso de CRM197 em BCG. A
posta celular foi avaliada por liberao imunizao de camundongos com
de IL-4 e IFN- de linfcitos esplnicos rBCG-S1PT induziu a uma elevada
de animais imunizados. Uma elevada resposta celular especfica contra PT,
liberao de INF- pelos linfcitos, aps que foi capaz de proteger os animais
estmulo com dPT, caracterizou uma contra um desafio intracerebral com
resposta celular tipo Th1 (7). Esses dose altamente virulenta B. pertussis.
camundongos foram submetidos a de- A expresso em BCG de S1PT em
safio intracerebral com dose letal de fuso com FC havia sido recentemen-
cepa virulenta de B.pertussis, apresen- te descrita, porm a resposta celular
tando uma elevada sobrevivncia, com- induzida foi baixa. Estamos investi-
parvel obtida com a vacina trplice gando, atualmente, a resposta imune
(Tabela I). induzida pela administrao conjunta
de rBCG-FC, rBCG-CRM197 e rBCG-
Discusso S1PT, com a expectativa de que pro-
priedades adjuvantes dos antgenos
A expresso dos antgenos de difte- combinados possam ainda aumentar
ria, ttano e pertussis em BCG atravs a resposta imune induzida contra cada
dos vetores de expresso em micobac- um dos patgenos.
tria contendo o promotor pBlaF* mos- Nossos estudos demonstraram
trou-se adequada, levando induo que rBCG expressando os antgenos
de elevados nveis de anticorpos anti- de DTP induzem resposta imune efici-
anatoxina tetnica e diftrica, e de uma ente e protetora contra ttano, difteria
resposta celular contra a toxina pertus- e pertussis. No entanto, uma vez que
sis. A resposta humoral obtida contra essas so vacinas vivas, podendo per-
ttano e difteria pela mistura de rBCG- manecer no organismo por longos
FC e rBCG-CRM197 foi capaz de neu- perodos, no seria aceitvel sua ad-
tralizar a atividade das respectivas toxi- ministrao em humanos, pela possi-
nas tetnica e diftrica. Nossos resulta- bilidade de disseminao do gene de
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 27

Figura 3. Construo e
teste de vacinas de BCG
recombinante
resistncia a antibitico para outras
bactrias. Recentemente foi descrito
um sistema de expresso em BCG,
utilizando cepas auxotrficas, desen-
volvidas para posterior complementa-
o com um vetor que expresse o gene
eliminado, conjuntamente com o ant-
geno recombinante. Dessa forma, evi-
ta-se a seleo com antibitico e, con-
seqentemente, o uso do gene de resis-
tncia, produzindo-se uma cepa de
rBCG adequada para administrao em
humanos. Estamos atualmente desen-
volvendo esse sistema no laboratrio,
para posterior verificao da resposta
imune induzida pelos antgenos de
DTP expressos dessa forma.
Em conjunto, este trabalho repre-
senta um fato indito na expresso dos
3 antgenos de DTP em um mesmo
sistema, com induo de resposta imu-
ne protetora contra cada um dos pat-
genos, condio necessria imple-
mentao de qualquer uma das vaci-
nas. Nossos resultados indicam que
rBCG-DTP poderia constituir uma vaci-
28 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
na de dose nica, eficiente e de baixo
custo, contra tuberculose, ttano, dif-
teria e pertussis, com claras vantagens
para pases em desenvolvimento.
Referncias:
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Vaccines and vaccination in a histori-
cal perspective, 1-12. . In M.M. Levine,
G.C. Woodrow, J.B. Kaper, G.S. Co-
bon (ed.), New generation vaccines,
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2) Gicquel, B. 1995 BCG as a
vector for the construction of multiva-
lent recombinant vaccines. Biologi-
cals 23, 113-8.
3) Fennelly, G.J., W.R. Jacobs Jr.,
and B.R. Bloom. 1997. The BCG as a
recombinant vaccine vector, p. 363-
385. In M.M. Levine, G.C. Woodrow,
J.B. Kaper, G.S. Cobon (ed.), New
generation vaccines, 2nd ed. Marcel tussis Toxin induces Protection against
Dekker, Inc. NY.
4) WHO/V&B/99.17 WHO Vacci-
ne Preventable Diseases Monitoring
Figura 4. Localizao da
subunidade S1 da toxina
pertussis em BCG
recombinante analisada por
Western blot. Lisado de
BCG recombinante foi
fracionado por
centrifugao e
particionado em detergente.
As amostras corresponden-
tes a cada frao ou locali-
zao foram aplicadas em
gel de SDS-PAGE,
transferidas para uma
membrana de nitrocelulose
e submetidas a um
imunoensaio utilizando um
soro policlonal contra a
toxina pertussis
System, 1999 Global Summary.
5) Parish, T., P.R. Wheeler. 1998.
Preparation of cell-free extracts from
mycobacteria, p. 77-89. In, T. Parish and
N.G Stoker (ed.), Methods in Molecular
Biology, Vol. 101: Mycobacteria Proto-
cols, Humana Press, Totowa, NJ.
6) Miyaji, E.N., Mazzantini, R.P., Dias,
W.O., Nascimento, A.L.T.O, Marcovistz,
R., Matos, D.S., Raw, I., Winter, N.,
Gicquel, B., Rappuoli, R. and Leite,
L.C.C. Induction of Neutralizing Anti-
bodies Against Diphtheria Toxin by Pri-
ming with Recombinant Mycobacterium
bovis BCG Expressing CRM197, a Mutant
Diphtheria Toxin, submetido (2000).
7) Nascimento, I.P., Dias, W.O., Ma-
zzantini, R.P., Miyaji, E.N., Gamberini,
M., Quintillo, W., Gebara, V.C., Cardo-
so, D.F., Ho, P.L., Raw, I. Winter, N.,
Gicquel, B., Rappuoli, R., Leite, L.C.C.
Recombinant BCG Expressing S1-Per-
an Intracerebral Challenge with Live
Bordetella pertussis in Mice, Infection
Immunity, 68 (9), 4877-4883 (2000).
 Anncio ANBIO

Associao Nacional de
Biossegurana

(FOTOLITO NOVO)
Obs.: Fotolito fornecido em anexo

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 29

 PEPTDEOS ANTIMICROBIANOS
Maura Vianna Prates Carlos Bloch Jnior
Aluna de doutorado do curso de Ps-graduao do Departamento de Professor adjunto do Instituto de Qumica da Universidade
Biologia Celular da Universidade de Braslia/UnB. de Braslia/UnB, Pesquisador do Cenargen/Embrapa.
mprates@unb.br cbloch@cenargen.embrapa.br

Uma alternativa no combate a microrganismos resistentes

Fotografias gentilmente cedidas pelo Prof. Antnio Sebben

s ameaas sade de pesquisa, assim como a indstria far- pacientes e funcionrios.

seres vivos causadas por
infeces de microrganis-
mos resistentes a antibi-
ticos e a vrios agentes
germicidas vm atingindo ndices ja-
mais registrados. Muitos microrganis-
mos tm desenvolvido resistncia tan-
to contra os j bem estabelecidos
antibiticos de uso convencional
quanto contra os antibiticos de lti-
ma gerao (Austin D. J., et al., 1999),
causando graves problemas de sade
pblica e vultosos prejuzos econ-
micos. O impacto da crescente resis-
tncia de microrganismos a medica-
mentos e a substncias especficas
tem movimentado vrios grupos de
30 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
macutica para desenvolvimento de
novas drogas que sejam capazes de
lidar efetivamente com as estratgias
de adaptao que esses organismos
elaboram, em face de todo o tipo de
situao adversa.
O surgimento da resistncia a an-
timicrobianos um exemplo clssico
de evoluo em resposta a uma forte
presso de seleo. Hospitais e ou-
tros estabelecimentos constituem uma
comunidade ecolgica particular, na
qual diversos tipos de micrbios cir-
culam e interagem entre si direta-
mente, por meio da reproduo e da
troca de plasmdeos, e/ou indireta-
mente, por meio de interaes entre
O corpo humano um conhecido
habitat de uma microflora muito di-
versificada, composta de populaes
benficas, populaes prejudiciais
sade e populaes que vivem co-
mensalmente, as quais exercem pou-
ca influncia sobre seu hospedeiro
em condies normais. A respeito
dos microrganismos patognicos, a
maior preocupao o surgimento
de cepas resistentes aos antimicrobi-
anos disponveis. Entretanto, os mi-
crorganismos comensais estabelecem
um tipo de problema diferente da-
quele imposto pelos microrganismos
patognicos. Sob condies normais,
eles vivem em locais como a pele ou
o trato respiratrio, causando pouco
ou nenhum problema. Porm, quan-
do transferidos para regies estreis,
como a corrente sangnea e os pul-
mes, eles podem ser malficos e
provocar srios distrbios na sade
do hospedeiro (Stewart F. M., et al.,
1998).
Uma vez que os antimicrobianos
so introduzidos para tratar os verda-
deiros patgenos e no os comen-
sais, vrios fatores de transferncia
de resistncia so assim dissemina-
dos e podem ser transmitidos a linha-
gens sensveis, por meio do contato
entre as clulas. Muitos fatores de
virulncia, como, por exemplo, os de
Staphylococcus aureus, so carrega-
dos por plasmdeos e podem ser
consignados entre diferentes linha-
gens. Sem dvida, esse o principal
mecanismo para o rpido espalha-
mento de linhagens com resistncia
mltipla (Brock, T. D., et al.,1994).
Alm disso, o problema da resistn-
cia introduz questes relacionadas
com a durao e com a intensidade
do tratamento, com as estratgias que
envolvem o uso de vrias drogas
concomitantemente e com o rigor
que deve ser obedecido por parte
dos pacientes.
PROBLEMTICA DA
RESISTNCIA A DROGAS
A infeco hospitalar vem desper-
tando interesse no somente para a
rea sanitria como tambm para a
econmica, devido, sobretudo, ver-
satilidade com que os microrganis-
mos causadores tm driblado a ao
de drogas. A infeco hospitalar atin-
ge dois milhes de norte-americanos
a cada ano e cerca de setenta mil
acabam morrendo. O S. aureus um
dos microrganismos mais comumen-
te encontrados em hospitais e um dos
principais agentes causadores da in-
feco hospitalar. A resistncia da
bactria S. aureus a antibiticos vem
crescendo assustadoramente, mesmo
em se tratando de drogas poderosas
e de amplo espectro como a metici-
lina. Em 1981, 5% da populao de S.
aureus eram resistentes a este antibi-
tico. Dez anos depois a porcenta-
gem aumentou para 38% e as estima-
tivas atuais so de cerca de 50% de
Figura 1a:
Phyllomedusa tarsius:
"Perereca da Floresta"
- espcie amaznica
resistncia meticilina (http://
www.bhj.org/journal/1997/3901_jan/
special_064.htm).
Infeces causadas por microrga-
nismos resistentes no atingem so-
mente a sade humana. Na pecuria,
grandes so os problemas enfrenta-
dos pelos criadores de gado leiteiro
susceptvel mastite, uma condio
inflamatria da glndula mamria cau-
sada por bactrias, (S.aureus, E. coli
e P. aeruginosa, principalmente) que
acarreta mudana das caractersticas
fsicas do bere e do leite, em vacas.
As perdas na indstria leiteira dos
Estados Unidos somam mais de dois
bilhes de dlares por ano. Os custos
incluem a diminuio da produo e
a perda da qualidade do leite, seja
provocada pela inflamao propria-
mente dita, seja causada pelo uso de
antibiticos para o tratamento e as
despesas com veterinrios, com labo-
ratrios e com a perda dos animais
(http://classes.aces.uiuc.edu/AnS-
ci308/mastitisintro.html).
O mesmo quadro pode ser verifi-
cado no que diz respeito aos fitopa-
tgenos. O surgimento de resistncia
de fungos fitopatognicos de impor-
tncia agronmica considerado um
fator limitante na eficcia e na vida
til das mais variadas estratgias de
controle de doenas (Heaney S., et
al., 1994). Muitos gneros tais como
Aspergillus, Botrytis, Venturia, Ustila-
go, Marnaporte, Colletotrichum, Al-
ternaria, Cercospora, Cladosporium
e Penicillium, tm desenvolvido es-
tratgias elegantes de resistncia con-
tra os fungicidas mais amplamente
empregados como os da classe dos
benzimidazis, das estrobilurinas, das
fenoxiquinolinas e das anilinopirimi-
dinas (Steffens, J. J., et al., 1996).
Nos ltimos anos, tem-se consta-
tado que mesmo fungicidas de amplo
espectro de ao como o Benomyl,
tornaram-se alvo de resistncia. O
emprego deste fungicida tem-se mos-
trado cada vez mais ineficiente para
combater a antracnose, doena pro-
vocada pelo gnero Colletotrichum
sp., em culturas de diversas fruteiras
susceptveis e, sobretudo, contra a
doena da flor preta em morango
(Tanaka, M. A. S., et al., 1997).
Conforme comentado anterior-
mente, o uso indiscriminado de dro-
gas o principal fator de induo
resistncia; contudo, a preveno
desse abuso no garantia de que a
susceptibilidade seja um fator rever-
svel, uma vez que os efeitos provo-
cados pelos antimicrobianos na fisio-
logia e ecologia dos microrganismos
impossibilitam, cada vez mais, o re-
torno ao estado de susceptibilidade
anterior. Dessa forma, o uso de novas
tecnologias para o desenvolvimento
de drogas mais eficazes constitui uma
estratgia promissora no campo da
biotecnologia, uma vez que possibi-
litar a iniciativa de prospeo de
novas classes de molculas naturais
e/ou sintticas, capazes de neutrali-
zar ou de danificar o patgeno-alvo
ao invs de inviabiliz-lo genetica-
mente, inibindo assim o desenvolvi-
mento da resistncia (Heinemann, J.
A., et al, 2000). Atualmente, peptde-
os antimicrobianos de origem animal
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 31
 gas como o LOCILEX, que um
creme de uso tpico com ao micro-
bicida e empregado no tratamento da
infeco de lceras diabticas. Alm
disso, derivados da magainina II tm
sido amplamente aplicados nas tera-
pias contra o cncer, no tratamento
de conjuntivites, de acne, de doenas
sexualmente transmissveis, de mico-
ses, alm de serem drogas promisso-
ras no tratamento da gripe (http://
www.magainin.com).

SUBSTNCIAS BIOATIVAS
DE ORIGEM NATURAL

Venenos e toxinas de origem na-

tural h muito representam uma fon-
te de fascnio para o homem, graas
aos seus extraordinrios efeitos far-
Figura 1b: Leptodactylus ocellatus: "R-Manteiga" - macolgicos. Sua utilizao cientfica
amplamente distribuda no Brasil tem contribudo com sucesso para a
elucidao de vrios mecanismos fi-
esto sendo utilizados como mode- diferenas significativas encontradas siolgicos, como demonstrado por
los para o desenho de novas drogas na sensibilidade entre os microrga- Claude Bernard em seus experimen-
com aplicao nas reas agrcola e de nismos e as clulas vegetais tm tos clssicos da dcada de 1850, com
sade. Para tanto, seqncias anfifli- mostrado que tais peptdeos podem o curare (Erspamer, V., 1994), as-
cas de peptdeos vm sendo dese- ser teis como modelos para o dese- sim como sua explorao industrial
nhadas, sintetizadas e testadas in vi- nho de genes de resistncia (Powell, para o uso teraputico, a exemplo de
tro, a fim de permitirem a obteno W. A., et al., 1995). vrias comunidades indgenas e na
de genes com potencial de resistn- O uso das magaininas na agricul- medicina popular (Daly et al. 1992).
cia a fitopatgenos, bem como com- tura no se restringe a cultivares Os vertebrados, mais precisamen-
postos ativos para a fabricao de frutferos ou alimentcios de um modo te os anfbios da ordem Anura, repre-
drogas de amplo espectro e de ml- geral, mas abrange tambm o ramo sentam um verdadeiro laboratrio de
tipla aplicabilidade. de plantas ornamentais geneticamente bioqumica, tendo em vista o arsenal
Um exemplo dessa abordagem modificadas, as quais expressam ge- de toxinas que fabricam. Nas clulas
so os anlogos sintticos da magai- nes de magaininas resistentes a fun- que revestem as paredes de glndu-
nina II, peptdeo proveniente da se- gos e outros patgenos causadores las granulares presentes na pele des-
creo da pele do anfbio africano de leses. Da mesma forma, a magai- ses animais produzida uma varieda-
Xenopus laevis (Zasloff, M., 1987) nina II j vem sendo utilizada como de de princpios ativos que compre-
que foram testados com sucesso na princpio ativo na fabricao de dro- endem molculas alifticas, aromti-
inibio da germina- cas e heterocclicas, alm
o de condios de de uma diversificada gama
Cryphonectria parasi- Figura 1c: de esterides, de alcali-
tica, Fusarium oxys- Dendrobates galactonotus: des, de aminas biogni-
porum f. sp. lycopersi- Espcie amaznica cas, de derivados guani-
ci, e Septoria musiva, dnicos, de protenas e de
e que no provoca- peptdeos, incluindo-se
ram nenhuma interfe- na produo desses dois
rncia detectvel na ltimos, seus precursores
germinao de plen e todo o sistema enzim-
dos organismos hos- tico envolvido na sua bi-
pedeiros, alm de se- ossntese. Essas molcu-
rem eficazes tambm las acumulam-se em gr-
contra as bactrias nulos, os quais compem
Agrobacterium tume- a luz de glndulas drmi-
faciens, Erwinia cas e so liberadas medi-
amylovora e Pseudo- ante estmulos apropria-
monas syringae. As dos. Seu papel muito
32 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
diversificado sobre as funes fi-
siolgicas da pele ou na defesa
contra predadores e microrganis-
mos. Grande nmero desses com-
postos j se encontra caracteriza-
do estrutural e funcionalmente
(Sebben, A. et al., 1993).
Entre todos os tipos de mol-
culas mencionados acima, os pep-
tdeos tm despertado bastante
interesse devido s suas ativida-
des como mediadores farmacol-
gicos e descoberta de molculas
homlogas ou anlogas em teci-
dos do trato gastrointestinal e
sistema nervoso de mamferos. O
exemplo mais freqente de molcu-
las encontradas em ambos os grupos
so as taquicininas, as cerulenas, o
hormnio liberador de tirotropina, as
bobesinas e os peptdeos opiides
(Erspamer, V. e Melchiorri, P., 1980).
O primeiro relato da ocorrncia
de peptdeos com atividade antibac-
teriana e hemoltica na pele de anf-
bio data de 1969, quando foi identi-
ficada a bombinina, um peptdeo de
24 resduos de aminocidos, prove-
niente da secreo cutnea do anuro
europeu Bombina variegata (Csor-
das, A. e Michl, H., 1970). No final da
dcada de 1980, foram isoladas as
magaininas de Xenopus laevis (Zaslo-
ff, M., 1987) e, somente a partir da,
outros peptdeos com atividade mi-
crobicida de origens diferentes co-
mearam a ser estudados mais deta-
lhadamente. Atualmente, as magaini-
nas representam uma das mais bem
estudadas classes de peptdeos anti-
biticos, os quais so considerados
efetores da imunidade inata, agindo
em uma primeira linha de defesa
contra infeces bacterianas e fngi-
cas nos organismos superiores (Zas-
loff, M., 1992; Boman, H. G., 1995;
Nicolas, P., 1995; Barra, D., et al.,
1998).
GLNDULAS DE VENENO
Especificamente nos anfbios h
pelo menos dois tipos de glndulas
drmicas denominadas mucosas e
granulares, alm das glndulas paro-
tides posteriores aos olhos da mai-
oria dos anuros. As mucosas encon-
tram-se distribudas no tegumento e
sua secreo umectante promove a
Figura 2:
Exemplar adulto de Physalaemus
fuscomaculatus. Notar o aspecto
granuloso da pele dorsal. Marca-
do pelo acmulo de glndulas
granulosas
hidratao da pele por onde ocorrem
cerca de 90% das trocas gasosas (Orr,
R. T., 1986).
As glndulas granulares, tambm
chamadas glndulas serosas ou de
veneno, podem estar distribudas ao
longo de todo o corpo ou concentra-
das em algumas reas, formando pro-
tuberncias, especialmente na regio
dorsal do animal (Duellman, E. W. e
Figura 3:
Corte histolgico da pele de anf-
bio mostrando a epiderme (E) e as
glndulas granulosas (G) e muco-
sas (M) localizadas na derme.
Aumento: 100 X
Colorao: Azul de toluidina
Trueb, L., 1986). Em muitas espcies,
essas glndulas, juntamente com as
glndulas parotides secretam subs-
tncias bioativas que constituem um
novo sistema de defesa coordena-
do pelo sistema nervoso, diferente
daquele constitudo pelas clu-
las T e B do sistema imune, e
detm a capacidade de promo-
ver a sntese de peptdeos de
baixa massa molecular com ati-
vidade antimicrobiana de am-
plo espectro, efetivos contra bac-
trias e fungos. Tal ocorrncia
poderia explicar a acentuada
resistncia desses grupos de an-
fbios a doenas (Nicolas, P e
Delfour, A., 1994).
O lume das glndulas sero-
sas e das parotides rico em
grnulos que armazenam secre-
es txicas. Em situaes de perigo,
um estmulo nervoso recebido pe-
las paredes glandulares provocando
a contrao da musculatura local e
causando uma descarga sincronizada
do seu contedo. Aps a liberao da
secreo, o sistema glandular inicia
seu processo de regenerao, que
pode variar de poucas horas a alguns
dias, dependendo da espcie de an-
fbio, at que o contedo do lume
glandular seja reconstitudo (Delfino,
G., et al., 1990).
PEPTDEOS ANTIMICROBIANOS
Mais de cinqenta peptdeos anti-
microbianos de anfbios j foram iso-
lados, tendo como principal caracte-
rstica a natureza catinica e a capa-
cidade de permeabilizar membranas
de microrganismos. Podem ser agru-
pados segundo sua estrutura prim-
ria e muitos so encontrados em
indivduos do mesmo gnero e at
mesmo em indivduos de gneros
distintos, pertencentes mesma subfa-
mlia ou no. Em 1970, a bombinina
foi descrita como um peptdeo anti-
bacteriano e hemoltico isolado da
secreo da pele do anfbio B. varie-
gata (Csordas, A. e Michl, H., 1970).
Pouco tempo depois, outras bombi-
ninas foram detectadas na secreo
do mesmo anfbio, as quais diferiram
entre si por poucos resduos de ami-
nocidos (Simmaco, M., et al., 1991).
Peptdeos do tipo bombinina tam-
bm foram isolados da espcie B.
orientalis e mostraram pouqussima
variao em relao aos encontrados
em B. variegata. As bombininas pos-
suem amplo espectro de ao contra
microrganismos em geral, porm apre-
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 33
 sentam toxicidade se- zante. As dermaseptinas
letiva contra clulas Peptdeos Anfbios so molculas catini-
sangneas, provocan- Magaininas Xenopus sp. cas de 24 a 34 resduos
do a lise das mesmas Bombininas Bombina sp. de aminocidos que for-
(Gibson, B. W., et al., Dermaseptinas Phyllomedusa sp. mam uma cadeia linear
1991). Brevininas Rana brevipoda com estrutura secund-
A secreo da pele Caerinas Litoria sp. ria aleatria em solven-
de Xenopus laevis tam- Gaegurinas Rana rugosa te aquoso, porm orde-
bm tem sido objeto Rugosinas Rana rugosa nada (-hlice) quan-
de intensa investigao. Buforina Bufo bufo do em meio apolar (Mor,
Nessa secreo, foram Ranalexinas Rana catesbeiana A., et al., 1991; Mor, A.
detectados o TRH (hor- Xenoxinas Xenopus sp. e Nicolas, P., 1994a; Mor,
mnio liberador de ti- Temporinas Rana temporaria A., et al., 1994; Mor, A.
rotropina), a xenopsi- Maculatinas Litoria genimaculata e Nicolas, P., 1994b).
na e a cerulena, com Esculentinas Rana esculenta Outras espcies, tais
potente atividade hipo- Pipininas Rana pipiens como P. rhodei e P.
tensora. Alm desses PGLa Xenopus laevis burmeisteri, tambm
peptdeos bioativos, Xenopsina (fragmento precursor) Xenopus laevis tm sido investigadas
foram encontrados ain- Levitdeo (fragmento precursor) Xenopus laevis como provveis produ-
da peptdeos homlo- Cerulena (fragmento precursor) Xenopus laevis toras de peptdeos anti-
gos s bombininas, de- Cerulena Litoria cerulea microbianos, da famlia
nominados magaini- Frenatina Litoria infrafrenata das dermaseptinas.
nas, que tambm so Alm disso, peptdeos
encontradas no estmago do anfbio, no que se refere ao contedo de relacionados com as dermaseptinas
porm sem funo definida nesse peptdeos antimicrobianos da pele. foram detectados em outros hildeos
rgo. Foram detectados peptdeos com ati- dessa subfamlia, nas espcies Pa-
Os peptdeos de defesa isolados vidade antimicrobiana nas espcies chymedusa dacnicolor e Agalychnis
da pele de Xenopus sp. esto agrupa- R. esculenta (Simmaco, M., et al., annae, ambas provenientes da Am-
dos em subfamlias de acordo com 1993, 1994), R. brevipoda (Morikawa, rica Central (Wechselberger, C., 1998)
sua origem biossinttica. A xenopsi- N., et al., 1992), R. catesbeiana (Cla- .
na e a cerulena so molculas de rk, D. P., et al., 1994) R. rugosa (Park, As dermaseptinas exercem ativi-
estrutura e atividades farmacolgicas J. M., et al., 1994; Suzuki, S., et al., dade ltica sobre bactrias gram-posi-
anlogas s da neurotensina e da 1995) e R. temporaria (Simmaco, M., tivas e gram-negativas, protozorios
gastrina/CCK (colecistocinina) dos et al., 1996) denominados esculenti- ciliados, leveduras e fungos filamen-
mamferos, respectivamente. Esses nas, brevininas, ranalexinas, rugosi- tosos em concentraes micromola-
peptdeos adotam a estrutura de h- nas e temporinas, respectivamente. A res (Fleury, Y., et al., 1998). Contudo,
lice anfiflica quando em ambiente particularidade encontrada nos pep- tais efeitos citolticos no foram ob-
hidrofbico, sendo ativos em doses tdeos desse gnero a sua estrutura- servados em clulas de mamferos,
micromolares contra uma variedade o secundria, a qual decisiva no devido, possivelmente, estrutura e
de bactrias gram-positivas, gram- modo de interao toxina/microrga- composio da membrana celular
negativas, fungos e leveduras (Be- nismo, distinta de todas as outras at desses animais. De fato, estudos de
vins, C. L. e Zasloff, M., 1990). As ento descritas (Simmaco M., et al., citlise usando lipossomas de dife-
magaininas I e II so peptdeos ho- 1998). rentes composies fosfolipdicas e
mlogos que possuem um amplo Na Amrica do Sul, os hildeos da crescente concentrao de colesterol
espectro de ao antimicrobiana. Em subfamlia Phyllomedusinae consti- (caracterstica de animais superiores)
doses micromolares, interrompem o tuem uma fonte muito rica de pept- mostraram maior resistncia dessas
crescimento e/ou induzem a lise os- deos antimicrobianos. Atualmente membranas artificiais ruptura (Ba-
mtica de diversos tipos de bactrias quatro espcies do gnero Phyllome- tista, C. V. F., 1999). A adenoregulina
gram-positivas e gram-negativas e de dusa vm sendo estudadas: P. bicolor de P. bicolor um peptdeo de estru-
protozorios. Elas so capazes de (Daly, J. W., et al., 1992; Mor, A., et al., tura similar s dermaseptinas, mas foi
induzir uma lise irreversvel das clu- 1994; Charpentier, S., et al., 1998), P. isolada primeiramente por sua fun-
las tumorais hematopoiticas e de sauvagei (Mor, A., et al., 1991; Mor, A. o farmacolgica neurotransmisso-
tumores slidos de diversas origens, e Nicolas, P., 1994a), P. distincta ra, que consiste na sua capacidade de
mas no provocam efeito sobre clu- (Batista, C., et al., 1999) e P. tarsius induzir a ligao de agonistas aos
las diferenciadas de eucariotos (Zas- (Prates, M. V., 1999). Nesse gnero receptores A1 de adenosina, prova-
loff, M., 1987). foram detectados potentes agentes velmente devido presena de D-
As espcies do gnero Rana de antimicrobianos denominados der- aminocidos em sua composio
diferentes reas geogrficas tm-se maseptinas, com amplo espectro de (Daly, J. W., et al., 1982). Posterior-
mostrado igualmente interessantes, atividade antimicrobiana e cicatri- mente, foi relatada sua atividade an-
34 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
timicrobiana, semelhante a das ou-
tras dermaseptinas.
Da mesma forma, muitas espcies
australianas de anfbios do gnero
Litoria tm sido estudadas por apre-
sentarem peptdeos antimicrobianos.
As espcies L. xanthomera e L. chloris
revelaram a presena de peptdeos
antimicrobianos denominados caeri-
nas (Stone, D. J. M., et al., 1992;
Steinborner, S. T., et al., 1997; Stein-
borner, S. T., et al., 1998), e as esp-
cies L. splendida e L. cerulea, o pep-
tdeo cerulena, todos ativos contra
bactrias gram-positivas (Stone, D. J.
M., et al., 1992; Waugh, R. J., et al.,
1993). J as espcies L. infrafrenata e
L. genimaculata apresentaram pept-
deos denominados frenatinas e ma-
culatinas (Raftery, M. J., et al., 1996;
Rosek, T., et al., 1998), sendo o
primeiro de amplo espectro e o se-
gundo, com atividade semelhante
das caerinas.
Na tabela, esto listados os princi-
pais peptdeos com atividade antimi-
crobiana encontrados nas secrees
da pele ou em outros rgos de
anfbios anuros.
CONCLUSO
O recente progresso da indstria
farmacutica relacionado com a des-
coberta e a produo de novos agen-
tes antimicrobianos no vem alcan-
ando o sucesso desejado na conten-
o da mutagnese de resistncia a
drogas desenvolvida pelos microrga-
nismos. Enquanto os mecanismos de
resistncia criados por muitos micr-
bios vm-se tornando cada dia mais
eficazes, as drogas conhecidas mos-
tram-se cada vez menos eficientes no
combate s patologias. A resistncia
microbiana a drogas um problema
complexo, uma vez que consiste no
produto de um processo natural e,
muito mais que isso, essencial, no
somente para a origem, como tam-
bm para a evoluo de todos os suem um mecanismo qumico de
seres vivos, o qual fundamenta-se na
mutao espontnea, na transfern- timicrobianos, anlogo ao encontra-
cia e recombinao de genes, crian-
do assim variabilidade gentica atu-
ante na seleo natural.
A bactria Pseudomonas aerugi-
nosa possu em seu genoma alguns
genes codificadores de protenas for-
madoras de bombas, as quais podem
ser a chave para a elucidao do
mecanismo de resistncia contra di-
versas classes de antibiticos (Stover,
C. K., 2000). A hiptese aceita atual-
mente sugere que bactrias gram-
negativas, grupo do qual a P. aerugi-
nosa faz parte, podem resistir ao
efeito letal de muitos antimicrobia-
nos, utilizando uma estratgia de
bombeamento dos agentes qumicos
para fora das clulas bacterianas mais
rapidamente do que seu acmulo no
interior destas. Dessa forma, tais pro-
tenas formadoras de bombas teriam
a capacidade de conferir a essas
bactrias a propriedade de resistn-
cia (Nikaido, H., 1998). Ainda no foi
esclarecido o procedimento da evo-
luo das bombas. Especula-se que
elas teriam surgido da necessidade
dos microrganismos em eliminar to-
xinas naturalmente presentes no seu
ambiente (Greenberg, E. P., 2000).
Sabendo disso, torna-se cada vez
mais importante a investigao e a
descoberta de drogas capazes de atu-
arem diretamente sobre a parede e a
membrana plasmtica, provocando
lise e morte celular, ao primeiro con-
tato. At onde se tem registro, sabe-
se que mesmo os mais sofisticados
mecanismos de defesa desenvolvi-
dos pelos microrganismos ainda no
so suficientes para neutralizar uma
ao do tipo detergente produzida
por peptdeos de carter catinico. o Universidade de Braslia.
O modo de defesa mediado pela
resposta humoral e celular confere
aos vertebrados uma proteo espe-
cfica e de longa durao contra os
microrganismos patognicos, porm
no de forma alguma adaptado
para responder rapidamente e de
maneira eficaz a uma invaso micro-
biana local, por ocasio de uma le-
so. Uma das descobertas mais inte-
ressantes a esse respeito revelou que,
alm da resposta imune celular alta-
mente especfica, os vertebrados pos-
PORTUGAL, T., POSSANI, L. D. e
defesa, composto por peptdeos an-
20:679-686.
do em invertebrados (Boman, H. G.
e Haltmark, D., 1987; Lehrer, R. I., et
al., 1991).
A maioria dos peptdeos antimi-
crobianos descritos at o momento
tem correspondentes de estrutura
idntica ou similar nos mamferos e
invertebrados. Sua presena nos ver-
tebrados, considerada como efetora
ancestral da imunidade, possui muito
mais que um significado vestigial.
No que diz respeito s vantagens,
no surpreendente o que esse
sistema de defesa qumica pode
conferir ao hospedeiro. De fato, um
repertrio fixo, porm extenso, de
pequenos peptdeos antimicrobia-
nos oferece aos animais superiores
um modo de controle particular-
mente rpido e eficaz contra a pro-
liferao microbiana (Nicolas, P. e
Delfour, A., 1994).
As possibilidades de aplicao
dos peptdeos antimicrobianos pela
agroindstria, assim como pela in-
dstria farmacutica, so inmeras.
Um trabalho sistemtico de prospe-
o dessas molculas, com identifi-
cao e sntese qumica em larga
escala, possibilitar, no somente
um grande avano na produo de
novas drogas, melhor conhecimen-
to biolgico das espcies doadoras,
reconhecimento do valor de cada
uma delas, como novas categorias
de recursos genticos e, por fim, a
necessidade de preservao desses
animais.
Agradecimentos: Os autores de-
sejam agradecer ao Professor Ant-
nio Sebben pelas fotos deste artigo,
EMBRAPA-CENARGEN e Funda-
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Anncio Novo
(O fotolito est sendo
enviado pelos Correios)

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 37

 Emisso de Gases de
PESQUISA
Efeito Estufa
Emisso de gases de efeito estufa provenientes de sistemas agrcolas no Brasil
Fotos cedidas pela autora
umentos recentes na
concentrao de gases
trao na atmosfera, de-
vido atividade antr-
pica, tm levado a um
impacto no balano de
entrada e sada de radiao solar do
planeta, tendendo ao aquecimento da
superfcie da terra. A mudana na
radiao lquida mdia no topo da
troposfera, decorrente de uma altera-
o na radiao solar ou infraverme-
lha, designada forante radiativa.
Os principais gases responsveis pelo
efeito estufa adicional so: o dixido
de carbono (CO2), o metano (CH4), o
xido nitroso (N2O), clorofluorcarbo-
nos (CFCs) e oznio (O3). Estima-se
que, se a taxa atual de aumento desses
gases no planeta continuar pelo prxi-
mo sculo, as temperaturas mdias
globais subiro 0,3oC por dcada, com
uma incerteza de 0,2 oC a 0,5 oC por
dcada (Cotton & Pielke, 1995), de
modo que, no ano 2100, o aquecimen-
to global estaria compreendido na
faixa de 1,0 a 3,5 oC (European Comis-
sion, 1997). A Figura 1 mostra a con-
tribuio relativa de gases para o au-
mento da forante radiativa global, e a
Tabela 1 mostra as atividades princi-
pais responsveis pelas emisses, tem-
po de permanncia e taxa atual de
acrscimo desses gases na atmosfera.
A agricultura uma atividade alta-
mente dependente de fatores climti-
cos, como temperatura, pluviosidade,
umidade do solo e radiao solar. Os
principais efeitos das alteraes des-
ses fatores na agricultura certamente
incidiriam na produtividade e no ma-
38 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
nejo das culturas, assim como nos
sistemas sociais, econmicos e de
polticas pblicas. A mudana climti-
ca pode afetar a produo agrcola de
vrias formas: pela mudana nos fato-
res climticos, includos a freqncia
e a severidade de eventos extremos;
Figura 1: Contribuio relativa
de gases provenientes de
atividades antrpicas ao efeito
estufa (baseado em Krupa,
1997)
pelo aumento da produo, devido ao
efeito fertilizador do carbono por cau-
sa da maior concentrao de CO2
atmosfrico; pela alterao da intensi-
dade da colheita, devido a uma mu-
dana no nmero de graus-dia de
crescimento, ou devido a modificao
da ocorrncia e a severidade de pra-
gas e doenas (Shaw, 1997), entre
outros efeitos. Estudos baseados em
modelos de circulao geral (GCM)
tm mostrado que a produtividade de
vrias culturas tende a diminuir em
algumas regies do globo e a aumen-
tar em outras, de tal modo que a
Magda Aparecida de Lima
Embrapa Meio Ambiente
Jaguarina, SP
magda@cnpma.embrapa.br
produo em reas tropicais e subtro-
picais, principalmente na frica sub-
Saara, devido s grandes reas de
clima rido e semi-rido e sua depen-
dncia de agricultura, tende a ser mais
afetada em relao s regies tempe-
radas (Jones et al., 1997, CGIAR, 1998).
Ao mesmo tempo em que constitui
uma atividade potencialmente influ-
encivel pela mudana do clima, a
agricultura tambm contribui para o
efeito estufa, com emisses de gases
como o metano (CH4), dixido de
carbono (CO2), monxido de carbono
(CO), xido nitroso (N2O) e xidos de
nitrognio (NOx). Estimam-se que 20%
do incremento anual da forante radi-
ativa global so devidos ao setor agr-
cola considerando-se o efeito dos ga-
ses metano, xido nitroso e gs carb-
nico (baseado em IPCC, 1996a), ex-
cluda a frao correspondente s
mudanas do uso da terra relaciona-
das com as atividades agrcolas (15%).
O metano e o xido nitroso so os
principais gases emitidos pelo setor
agropecurio, e contribuem com 15%
e 6%, respectivamente, para a forante
radiativa global (Cotton & Pielke, 1995).
As fontes agrcolas de gases de efeito
estufa so o cultivo de arroz irrigado
por inundao, a pecuria, dejetos
animais, o uso agrcola dos solos e a
queima de resduos agrcolas. O culti-
vo de arroz irrigado por inundao, a
pecuria domstica e seus dejetos,
assim como a queima de resduos
agrcolas promovem a liberao de
metano (CH4) na atmosfera. Estima-se
que cerca de 55% das emisses antr-
picas de metano provm da agricultu-
1
Tg = 1012 gramas
Tabela 1- Gases trao atmosfricos significantes para o aumento do efeito estufa (krupa, 1997)

Gs Carbnico Metano xido Clorofluor- Oznio Monxido Vapor dgua

(CO2) (CH4) Nitroso carbonetos (O3) de Carbono (H2O)
Principal Combustveis Cultivo de (N2O) (CFCs) Hidrocarbonetos (CO) Converso de
fonte fsseis, arroz Fertilizantes, Refrigeradores, (com NOx), Combustveis uso da terra,
antrpica desflorestam- inundado, converso aerossis, queima de fsseis, irrigao
ento pecuria, do uso da processos biomassa queima de
combustveis terra industriais biomassa
fsseis,
queima de
biomassa
Tempo de 50-200 anos 10 anos 150 anos 60-100 anos Semanas a meses dias
vida na meses
atmosfera
Taxa anual 0,5% 0,9% 0,3% 4% 0,5-2,0% 0,7-1,05 desconhecido
atual de
aumento
Contribuio 60% 15% 5% 12% 8% - desconhecido
relativa ao
efeito estufa
antrpico

ra e da pecuria juntas (IPCC,1995).
Os solos agrcolas, pelo uso de fertili-
zantes nitrogenados, fixao biolgi-
ca de nitrognio, adio de dejetos
animais, incorporao de resduos cul-
turais, entre outros fatores, so res-
ponsveis por significantes emisses
de xido nitroso (N2O). A queima de
resduos agrcolas nos campos libe-
ram, alm do metano (CH4), tambm
xido nitroso (N2O), xidos de nitro-
gnio (NOx) e monxido de carbono
(CO).
Criada em 1992, durante a Confe-
rncia das Naes Unidas sobre Meio
Ambiente e Desenvolvimento, com a
finalidade de proteger o sistema cli-
mtico global para as presentes e
futuras geraes, a Conveno Qua- contribuindo com 16% das emisses
dro de Mudana do Clima estabeleceu
compromissos para os pases signat-
rios, a fim de que estes se responsabi-
lizassem pela elaborao de inventri-
os peridicos das emisses antrpicas
de gases e pela formulao e imple-
mentao de programas nacionais vol-
tados para a mitigao da mudana do
clima, bem como pela promoo e
cooperao para o desenvolvimento,
aplicao e difuso de tecnologias,
prticas e processos de reduo ou
preveno das emisses de gases de
efeito estufa. A seguir, so identifica-
das algumas opes de reduo de tui o fator mais importante para a
gases trao potencialmente aplicveis
ao setor agropecurio brasileiro. Dado
que o metano constitui o principal gs
produzido por atividades agrcolas no
pas, uma ateno especial dada
neste artigo s opes para a sua
reduo.
Opes e medidas para a
reduo das emisses de
gases de efeito estufa
Campos inundados de arroz
O cultivo de arroz irrigado por
inundao (Foto 1) uma importante
fonte de emisso de metano (CH4),
antrpicas de metano (Figura 2). Es-
tima-se em 20 a 100 teragramas1 (m-
dia de 60 Tg) por ano a taxa de
emisso desse gs nos campos de
arroz irrigado (IPCC, 1995). O metano
produzido nos solos inundados,
durante a decomposio anaerbia de
substncias orgnicas, mediante a ao
de bactrias (metanognicas). A con-
dio mais importante para a sua
formao de anaerobiose (ausncia
de oxignio), que ocorre no solos sob
inundao. A matria orgnica rica em
carbono presente nesses solos consti-
produo de metano, tendo como
origem as razes mortas de plantas de
arroz, as algas e plantas aquticas na
gua de inundao, exudatos de ra-
zes (secrees) de plantas de arroz,
fertilizantes orgnicos adicionados e a
matria orgnica existente no solo. Os
materiais mais facilmente degradveis
(como exudatos de razes de plantas
de arroz, adubo verde) contribuem
para taxas mais elevadas de produo
de metano. Alm do tipo de substrato
orgnico, a composio, a textura e,
principalmente, a temperatura dos so-
los so fatores que influenciam a pro-
duo de metano nos campos de
arroz inundado. O metano produzido
nos campos de arroz liberado para a
atmosfera por vrias rotas, sendo a
principal delas por transporte difusivo
pelo aernquima (tecido vascular de
aerao). Segundo demonstrado por
Bont et al. (1978), a presena de
plantas de arroz facilita o escape de
metano para a atmosfera na ordem de
7 a 10 vezes mais que solos inundados
sem cultivo de arroz. A formao de
bolhas de gs na superfcie da gua e
sua difuso na gua do solo constitu-
em outras vias de escape de metano a
partir desses sistemas agrcolas.
Do total de metano gerado por
essa fonte, cerca de 90% so atribu-
dos ao continente asitico. No Brasil,

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 39

 estima-se uma con-
tribuio de 0,3 Tg
(Tg = 1012 gramas) de
metano proveniente
do cultivo de arroz
irrigado (Embrapa,
1998). Essa cultura re-
presenta cerca de
55% do total de arroz
produzido no pas,
embora este seja ain-
da um grande impor-
tador de arroz (mais de 1/4 da
produo nacional).
Desde que a produo de me-
tano ocorre em solos sob condi-
es de anaerobiose, regimes de
inundao intermitentes, condici-
onados s precipitaes pluvio-
mtricas, ou de mltipla aerao
devem promover reduo das
emisses de metano. Outras op-
es de reduo incluem:
a) melhoramento vegetal de-
senvolvimento de novas cultiva-
res, seleo e gerao de plantas
de arroz com baixas taxas de emis-
ses de metano. De acordo com
estudos de Minami & Neue (1994),
as variaes no coeficiente de di-
fuso na transio da raiz para o
aernquima parecem desempenhar
um importante papel na emisso
de metano entre as variedades de
arroz.
b) acelerao da decomposi-
o de metano atravs da oxida-
o por breves interrupes da
inundao. O aumento da drena-
gem de gua (troca da lmina
dgua) e a secagem intermitente
do solo ou no fim da esta-
o de crescimento resul-
ta na oxidao do metano
retido no solo. Sabe-se,
contudo, que ciclos alter-
nativos de anaerobiose e
aerobiose, que favorecem
a reduo das emisses de
metano, aumentam a emis-
so de N2O, quando com-
parado s condies de
anaerobiose ou aerobiose
permanentes.
c) modificao do ma-
nejo de fertilizao, de for-
ma que se opte pela adio de
material orgnico compostado,
onde a matria orgnica facilmen-
te mineralizvel encontra-se j de-
40 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Figura 2: Fontes globais de
emisso de metano proveni-
ente de atividades antrpicas
(baseado em IPCC, 1995)
composta e humificada, fornecendo
menos substrato para as bactrias me-
tanognicas.
Queima de biomassa na
agricultura
A combusto da biomassa de res-
duos de colheita e de culturas agrco-
las na pr-colheita (Foto 2), como
prtica agrcola, leva produo de colheita. Entre as medidas possveis
metano, xido nitroso (N2O), xidos
de nitrognio (NOx) e monxido de
carbono (CO), alm do dixido de
carbono (CO2). O fogo libera carbono
da biomassa durante a combusto e
acentua diretamente a liberao de
carbono do solo do qual a vegetao
foi queimada. No Brasil freqente a
queima de cana-de-acar na pr-
colheita (para auxiliar a colheita ma-
nual), e, em menor escala, a queima
Figura 3: Principais fontes
antrpicas de emisses de xido
nitroso (N2O) para a atmosfera
(baseado em IPCC, 1995)
dos resduos da cultura
do algodo, para contro-
le fitossanitrio. Embora
ocorra liberao de CO2
durante a queima da
cana-de-acar, as emis-
ses desse gs no so
consideradas como uma
emisso lquida ao longo
do tempo por esses siste-
mas, pois, no ciclo se-
guinte da cultura, o CO2
emitido reabsorvido (IPCC, 1996b).
No Brasil estima-se que a queima
de cana-de-acar e de resduos de
algodo herbceo, juntos, gerem emis-
ses de 2,8 Tg de CO, 0,1 Tg de CH4,
0,006 Tg de N2O e 0,2 Tg de NOx
(Embrapa, 1999a). As emisses de
gases provenientes da queima de cana-
de-acar correspondem a 97% des-
ses totais. A cultura do algodo herb-
ceo, alm de apresentar produes
bem menores (cerca de 1,3 milhes de
toneladas, em 1994, segundo IBGE
(1997)), proporcionalmente cana-
de-acar (292 milhes de toneladas),
tem empregado cada vez menos a
prtica de queima dos resduos aps a
para reduzir as emisses de gases
provenientes da queima de resduos
agrcolas no Brasil destacam-se: a)
corte mecnico da cana-de-acar e
aproveitamento energtico da biomas-
sa, com consequente diminuio de
desperdcios de matria vegetal e ener-
gia; b) a reduo de queimadas de
culturas e de seus resduos; c) uso de
prticas agrcolas de conservao dos
solos; d) aplicao e implantao de
legislao relacionada com
o controle de queimadas nas
unidades de federao.
Pecuria
Herbvoros ruminantes,
como bovinos, ovinos, bu-
balinos e caprinos produ-
zem metano atravs da fer-
mentao entrica, um pro-
cesso digestivo que ocorre
no rmen. As emisses glo-
bais desse gs geradas a
partir dos processos entri-
cos so estimadas em 80 milhes de
toneladas anuais, correspondendo a
cerca de 22% das emisses totais de
metano geradas por fontes antrpicas
(U.S.EPA, 2000) (Figura 2).
A produo de metano d-se tam-
bm a partir dos dejetos animais, prin-
cipalmente quando manipulados na
forma lquida, em condies de anae-
robiose. As emisses globais de meta-
no provenientes dessa fonte so esti-
madas em cerca de 25 milhes de
toneladas por ano (IPCC, 1995), cor-
respondendo a 7% das emisses totais
de metano.
No Brasil, 68% da pecuria repre-
sentada por bovinos (87% de corte e
13% de leite, aproximadamente), com
pouco mais de 163 milhes de animais
em 1998 (IBGE, 2000), sendo conside-
rado o maior rebanho bovino do
mundo com fins comerciais. Grande
parte desses animais do tipo zebu-
no, criados em sistemas predominan-
temente extensivos, de baixo investi-
mento de capital (Foto 3). O aumento
da produo animal tem sido devido,
em grande parte, ao elevado nmero
de animais e no tanto da produtivida-
de. A produtividade mdia anual de
leite no pas, como exemplo, de
pouco mais de 1.000 kg/vaca/ano,
para um total de 17 milhes de vacas
ordenhadas, segundo dados do Insti-
tuto Brasileiro de Geografia e Estats-
tica - IBGE), e, mesmo assim, a produ-
o nacional, em 1998, totalizou cerca
de 20 bilhes de litros.
Do total das emisses de metano
no Brasil, a pecuria, atravs da fer-
mentao entrica e dos dejetos, con-
tribui com cerca de 96% do total, com
emisses estimadas em 9,7 Tg de CH4,
em 1994 (Embrapa, 1999b). Desse
total, a pecuria bovina contribui com
96% das emisses, sendo que as ou-
tras categorias de animais (bubalinos,
muares, caprinos, asininos, eqinos,
sunos), juntas, so responsveis pe-
los 4% restantes das emisses de me-
tano. As emisses provenientes de
sunos so consideradas negligenci-
veis (1kg CH4/animal/ano).
Os fatores de emisso de metano,
que so obtidos a partir do consumo
de alimento e da taxa de sua conver-
so em metano, variam em funo do
sistema de produo e das caracters-
ticas dos animais. Para bovinos de
leite, por exemplo, os valores mdios
de fatores de emisso podem variar de
81 a 118 kg de metano/animal/ano na
Amrica do Norte e em pases do leste
europeu, respectivamente, enquanto,
em pases africanos e asiticos, esti-
mam-se emisses entre 36 a 56 kg de
metano/animal/ano (IPCC, 1995).
A intensidade da emisso de meta-
no depende do tipo de animal, da
quantidade e grau de digestibilidade
da massa digerida e do esforo ao qual
o animal submetido. Em bovinos, a
taxa de converso em metano esti-
mada, em mdia, em 6% da energia
bruta do alimento ingerido. Desde
que a produo de metano varia de
acordo com a quantidade e qualidade
do alimento digerido (U.S.EPA,
1990a,b), as vrias modalidades e con-
dies de sistemas de criao de ani-
mais domsticos implicam fatores di-
Foto 1: Cultivo de arroz irrigado
por inundao fonte antrpica
de emisso de metano para a
atmosfera
ferentes de emisso de metano.
As opes de reduo das emis- colocado no rmen do animal, de
ses de metano na atividade pecuria
esto associadas ao aumento da pro-
dutividade animal, com o objetivo de
se obterem maiores valores de produ-
o animal por quantidade de metano
emitido.
Ruminantes manejados extensiva-
mente podem ter suas emisses redu-
zidas por meio da melhoria da diges-
to fermentativa no rmen, adminis-
trando-se dietas a base de uria e de
protenas e fornecendo nutrientes vi-
tais. No Brasil, onde a maior parte das
emisses de metano provm de reas
extensivas de pastagem, a suplemen-
tao alimentar de gado em pasto com
protenas constitui um fator limitante
para significante parte das proprieda-
des rurais. Devem ser, pois, investiga-
das alternativas alimentares, em fun-
o dos recursos naturais, condies
climticas e estrutura scio-econmi-
ca especficas de cada regio. O au-
mento da produtividade animal por
meio de suplementao alimentar,
controle de zoonoses, melhoramento
gentico e de taxas de reproduo, e
outras melhorias, pode contribuir para
a estratgia de reduo das emisses
de metano por unidade de produto
(Embrapa, 1999d). Com esse intuito,
programas governamentais de apoio
produo animal, muitos deles atu-
almente em fase de implementao,
so fundamentais para o alcance deste
objetivo. A bioengenharia de alimen-
tos uma oportunidade a ser explora-
da no melhoramento da eficincia dos
processos microbianos com vistas
otimizao da digesto de fibras no
rmen e sntese microbiana. Outras
possibilidades incluem o desenvolvi-
mento de organismos que oxidam
metano ou outros sumidouros de hi-
drognio no rmen, usando engenha-
ria gentica (Embrapa, 1999b).
O desenvolvimento de modernas
tcnicas de medio e de monitora-
mento das emisses de gases trao
tm propiciado a avaliao das emis-
ses de metano em pequenos e gran-
des ruminantes, sob diferentes siste-
mas de produo. Para animais man-
tidos em regime de pastagens, desta-
ca-se a tcnica do traador (interno)
hexafluoreto de enxofre (SF6) (John-
son & Johnson (1995)). Nessa tcnica,
um dispositivo de permeao, que
libera o SF6 a uma taxa conhecida,
modo que amostras de metano so
coletadas nas proximidades da boca e
do nariz do animal (Foto 4- Foto do
Tom Wirth, USEPA). Assume-se nes-
se mtodo que o padro de emisso
de SF6 simule o padro de emisso de
CH4. As concentraes do metano e
do traador so ento determinadas
pela cromatografia gasosa ou outro
mtodo de quantificao. A partir da
taxa conhecida de liberao do traa-
dor no rmen e das concentraes de
metano e do traador nas amostras de
gs, calcula-se o metano produzido
pelo animal (U.S.EPA, 2000). Outros
mtodos de medio empregados so:
mtodo de cmara fechada, (para ani-
mais confinados), mtodo de traador
externo e mtodo micrometeorolgi-
co.
Por meio de estimativas acuradas
das taxas de emisso de metano deri-
vada de ruminantes, bem como do
seu monitoramento, com base no uso
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 41
 de tcnicas como as acima descritas,
possvel se estabelecerem diferentes
estratgias de manejo animal voltadas
para a reduo das emisses de meta-
no por unidade de produto (leite,
carne, etc.).
Solos Agrcolas
Os solos so um importante reser-
vatrio de carbono ativo, orgnico e
inorgnico, e desempenham um im-
portante papel no ciclo do carbono
global. A agricultura tem sido respon-
svel por significativas perdas de car-
bono pelo solo, atravs de prticas
agrcolas de baixa sustentabilidade
ambiental. Entre essas prticas, citam-
se a arao excessiva, gradeao e
desmatamentos, que expem os solos
a processos de eroso e compactao
e, por conseguinte, reduo dos
nveis de matria orgnica no solo.
Alm disso, fatores como a fertilizao
inadequada, a queima de restos cultu-
rais e o cultivo intensivo das terras,
contribuem para o aumento dessas
perdas. Em contraste, prticas agrco-
las que restauram a capacidade dos
solos como reservatrio de carbono
incluem: reflorestamento, cultivo de
culturas perenes (culturas extrativis-
tas, como seringueira, cacau, casta-
nhas, fruticultura, etc.), uso adequado
de fertilizantes qumicos e adubos
orgnicos, pastagens bem manejadas,
agrofloresta e prticas de conservao
do solo (Embrapa, 1999d).
Os reflorestamentos estocam car-
bono e, se mantidos intactos ou se
seus produtos florestais forem usados
em aplicaes durveis, essa estoca-
gem adicional pode ser significativa. A
produtividade de florestas de folho-
sas, como o eucalipto, no Brasil,
uma das mais elevadas do mundo
(30m3/ha/ano), contribuindo para a
fixao de carbono em cerca de 9 ton
C/ha/ano (Sociedade Brasileira de Sil-
vicultura, 1999), o que evidencia o
potencial do setor para fixar carbono
atmosfrico. Sistemas agroflorestais,
mediante a utilizao de prticas sus-
tentveis de manejo de florestas, po-
dem tambm ser uma importante con-
tribuio mitigao do efeito estufa,
medida que so evitadas emisses
por atividades mais predatrias (des-
matamento e queima de florestas),
ficando grande parte do carbono esto-
42 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
cado no sistema solo-vegetao.
A implantao de florestas (reflo-
restamentos) ou culturas permanen-
tes em reas degradadas por ativida-
des agrcolas, alm da recomposio
vegetal de reas ribeirinhas e de pro-
teo ambiental (como as de risco de
eroso, montantes de bacias de abas-
tecimento, etc.), so oportunidades
para capturar (ou sequestrar) carbono
atmosfrico, ao mesmo tempo que
restauram outras propriedades ambi-
entais e influi em indicadores econ-
micos. Programas de reflorestamento
e recuperao de reas de proteo (IPCC, 1995), sendo que os solos cul-
ambiental vm sendo implementadas
Foto 2: Queima de cana-de-
aucar prtica geradora de gases
de efeito estufa, como monxido
de carbono (CO), metano (CH4),
xido nitroso (N2O) e xidos de
nitrognio (NOx).
Foto: Humberto Rocha
mais recentemente, em decorrncia
do estabelecimento de consrcios de
bacias hidrogrficas e de outras inici-
ativas governamentais e no governa-
mentais para a restaurao de reas
florestais, em diversos estados brasi-
leiros.
Os solos agrcolas constituem tam-
bm uma das mais importantes fontes
de xido nitroso (N2O) para a atmos-
fera, o que se d por meio de adies
de fertilizantes nitrogenados sintti- estufa, destacam-se: a) recuperar re-
cos, da deposio de dejetos animais
ricos em nitrognio, da fixao biol-
gica de nitrognio aumentada, e do
cultivo de solos orgnicos e minerais
2
Desnitrificao : NO3- => NO2 => 2NO => N2O => N2
atravs da mineralizao da matria
orgnica. As emisses de N2O dos
solos ocorrem como conseqncia
dos processos microbiolgicos de
desnitrificao e nitrificao, a partir
de nitrognio mineral. A desnitrifica-
o2 , que o processo mais importan-
te nesse caso, consiste na reduo
microbiana do nitrato (NO3-) a formas
intermedirias de N, e ento a formas
gasosas (NO, N2O e N2) liberadas na
atmosfera (Embrapa, 1999c). As esti-
mativas globais de emisso de N2O
indicam uma mdia de 5,7 Tg N/ano
tivados e os dejetos da pecuria con-
tribuem com quase 70% do total das
fontes (Figura 3). No Brasil, os dejetos
animais depositados nos solos consti-
tuem uma das principais fontes de
emisso de xido nitroso (0,1 Tg N/
ano). Algumas das medidas de redu-
o das emisses de xido nitroso
so: o uso eficiente de fertilizantes
sintticos, o tratamento de dejetos
animais, manejo de nutrientes do solo,
uso de inibidores de nitrificao, inte-
grao da agricultura e pecuria.
O setor agropecurio pode contri-
buir para a mitigao da mudana do
clima pela aplicao de diferentes
prticas de reduo das emisses de
gases de efeito e pela proteo e
expanso de sumidouros e reservat-
rios de carbono. Os principais desafi-
os para o alcance desse objetivo resi-
dem: a) na identificao de sinergias
entre os objetivos de aumento de
produtividade e o equilbrio climtico
global; b) na produo de alimentos
limpos e seguros para o consumo
humano, com menor impacto ambi-
ental; c) na adoo de boas prticas
em sistemas agrcolas; d) no fomento
ao desenvolvimento de pesquisa bsi-
ca para compreender os processos,
prticas e tcnicas que influenciam as
emisses de gases nos diferentes agros-
sistemas, desde que uma produtivida-
de agrcola maior possa ser obtida
com o conhecimento e uso de melho-
res tcnicas.
Entre as aes e estratgias poss-
veis de ser empregadas como contri-
buio reduo de gases de efeito
as degradadas, com o objetivo adicio-
nal de fixar carbono atmosfrico; b)
adotar poltica agrcola orientada para
a converso de terras degradadas ou
abandonadas para uso florestal e re-
generao de florestas, assim como
para propiciar meios e recursos para a
adoo de boas prticas agropecuri-
as e tecnologias; c) incentivar ativida-
des agroflorestais sustentveis, como
alternativa de explorao de floresta
de forma no predatria e que, ao
mesmo tempo, favoream o estoque
de carbono nos solos e na vegetao;
d) desenvolver tecnologias que inte-
grem objetivos de produtividade e
reduo das emisses de gases; e)
fomentar o desenvolvimento de pes-
quisa para a compreenso dos proces-
sos que influenciam o fluxo de gases
entre sistemas agropecurios e a at-
mosfera; f) promover a melhoria de
informao tcnica, social e econmi-
ca, que subsidiem o delineamento das
caractersticas dos sistemas de produ-
o agrcola e animal geradores de
gases trao, permitindo aes de mo-
nitoramento.
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ses de Gases de Efeito Estufa proveni-
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sil: emisses de metano provenientes
de arroz irrigado por inundao (rela-
trio revisado). Relatrio tcnico apre-
sentado ao Ministrio da Cincia e
Tecnologia. Jaguarina: Embrapa Meio
Ambiente.
Embrapa. 1999a. Inventrio de
Emisses de Gases de Efeito Estufa
provenientes de atividades agrcolas
no Brasil: emisses de gases de efeito
estufa provenientes da queima de
resduos agrcolas. Relatrio tcnico
apresentado ao Ministrio da Cincia
e Tecnologia. Jaguarina: Embrapa
Meio Ambiente.
Embrapa. 1999b. Inventrio de
Emisses de Gases de Efeito Estufa
Foto 3: Gado de corte em
sistema de produo extensivo
provenientes de atividades agrcolas
no Brasil: emisses de metano prove-
nientes da pecuria. Relatrio tcnico
apresentado ao Ministrio da Cincia
e Tecnologia. Jaguarina: Embrapa
Meio Ambiente.
Embrapa. 1999c. Inventrio de
Emisses de Gases de Efeito Estufa
provenientes de atividades agrcolas
no Brasil: emisses de xido nitroso
provenientes de solos agrcolas. Rela-
trio tcnico apresentado ao Minist-
rio da Cincia e Tecnologia. Jaguari-
na: Embrapa Meio Ambiente.
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da agricultura brasileira mudana
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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 43
 Tcnicas Moleculares em
SEMENTES
PESQUISA
Fotos cedidas pelas autoras
termo qualidade das se-
mentes envolve aspec-
tos genticos, fsicos, fisi-
olgicos e sanitrios que,
avaliados de maneira in-
tegrada, propiciam o conheci-
mento do valor real e do poten-
cial de utilizao de um lote de
sementes.
A pesquisa na rea de
biologia molecular associada ao
controle de qualidade de se-
mentes tem evoludo rapidamen-
te e novas tcnicas tm-se mos-
trado teis na obteno de clas-
ses distintas de marcadores mo-
leculares que auxiliam na eluci-
dao dos fatores que afetam a
qualidade, na manipulao e
identificao do material genti-
co, assim como na preservao
desses materiais. Tais tcnicas permi-
tem o monitoramento durante todo o
processo produtivo, eliminando custos
e garantindo a qualidade.
Marcadores moleculares na
determinao da qualidade
gentica de sementes
O registro de diferentes cultivares e
os problemas que envolvem a comer-
cializao nacional e internacional de
sementes fazem com que a habilidade
de distinguir e de identificar cultivares
se torne um ponto crucial para o mo-
nitoramento e controle desse comr-
cio.
No Brasil, pela lei de no 9.456, de
1997, foi instituda a proteo de culti-
vares, que reconhece a propriedade
intelectual e os direitos ao titular de
materiais genticos protegidos. Nessa
lei, a caracterizao de forma precisa
da cultivar um dos pontos essenciais
44 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Aplicao de tcnicas moleculares no controle de qualidade das sementes
para garantir o direito de propriedade
intelectual. Para ser submetida prote-
o, a nova cultivar, ou a cultivar
essencialmente derivada, deve se apre-
sentar distinta de outra, utilizando-se
FIGURA 1. Diferenciao de
cultivares de cafeeiro por
RAPD, utilizando o primer OP-
I20. UFLA- Lavras, MG. 2000.
Acima de cada linha encontra-
se a denominao das cultiva-
res. (Gentilmente cedido por
Padilha, L., aluna do curso de
Doutorado em Fitotecnia/
Sementes da UFLA)
para isto descritores homogneos quan-
to s suas caractersticas em cada est-
dio de desenvolvimento e estveis
quanto repetio dessas caractersti-
cas ao longo de geraes sucessivas.
Atualmente, para submeter uma culti-
var proteo, so usados marcadores
morfolgicos, que apresentam uma
srie de inconvenientes, como a neces-
sidade de um grande nmero desses
descritores, que, na sua maioria, sero
Maria Laene Moreira de Carvalho
PhD, Prof. Adjunta IV do Depto. de Agricultura-UFLA
Maria das Graas Guimares Carvalho Vieira
Prof. Titular do Depto. de Agricultura-UFLA
dila de Resende Von Pinho
Prof. Adjunto do Depto de Agricultura-UFLA
Universidade Federal de Lavras /UFLA/DAG
email: sementes@ufla.br
identificados em nvel de planta inteira
ou adulta; como a necessidade de
amplo espao fsico para a avaliao
do material; alm de possveis influn-
cias do ambiente no qual esto inseri-
dos. Comparados aos morfol-
gicos, os marcadores molecula-
res se mostram mais versteis,
rpidos e seguros. Os princi-
pais marcadores moleculares
utilizados para a identificao
de cultivares e da pureza gen-
tica envolvem a anlise de pro-
tenas e de DNA.
A utilizao da eletroforese
de protenas em identificao
de cultivares se baseia no fato
de estas serem produtos dos
genes e, portanto, poderem ser
consideradas como marcado-
res para os genes que as codi-
ficam. Na maioria das espcies, prote-
nas de armazenamento de sementes
exibem considervel polimorfismo com
relao carga, tamanho, ou ambos os
parmetros. Alm do mais, elas so
codificadas em vrios lcus, esto pre-
sentes comparativamente em grandes
quantidades e so prontamente extra-
veis. No caso de espcies autgamas,
pode ocorrer uma base gentica estrei-
ta, dificultando a certificao da pureza
gentica pelo uso dessa tcnica. Nas
espcies algamas, as populaes de
indivduos expressam uma ampla vari-
edade de caracteres fenotpicos. Estes
indivduos podem ser geneticamente
distintos, contendo diferentes combi-
naes de lcus em homozigose e
heterozigose, includos aqueles que
codificam para protenas de armazena-
mento e isoenzimas. Neste caso,
indicada a anlise em bulk, para que
se tenha todo o genoma da populao
representado.
 As isoenzimas, por sua vez, devem
ser usadas com muito critrio para este
fim, pois determinados sistemas enzi-
mticos podem apresentar variaes
em funo do estdio de deteriorao
em que as sementes se encontram ou
quando esto presentes microrganis-
mos em associao com as sementes.
Existem diversas tecnologias base-
adas no polimorfismo do DNA utiliza-
das para identificao de cultivares e
determinao da pureza gentica em
lotes de sementes. A principal vanta-
gem do uso de DNA que eles no so
afetados pelo ambiente, permitindo
uma anlise mais objetiva e precisa.
Entre as tcnicas utilizadas, destacam-
se: RFLP (fragmentos de restrio de
segmentos polimrficos) RAPD (poli-
morfismo do DNA amplificado ao aca-
so); os microsatlites ou SSRs (sequn-
cia simples repetida) e o AFLP (frag-
mentos de comprimento polimrfico
amplificado).
A tcnica de RFLP propicia alto
nvel de discriminao entre indivdu-
os, alta reprodutibilidade e tem apre-
sentado resultados positivos quando
utilizado na identificao de cultivares
de milho e soja. No entanto, para
espcies como tomate e trigo, alguns
autores tm revelado que essa tcnica
no detecta muita variao, o que pode
inviabilizar sua utilizao na identifica-
o e certificao da pureza gentica
dessas espcies. A des-
peito dessas vantagens, a
anlise de RFLP lenta,
requer grande quantida-
de de material da planta,
exige trabalho intensivo,
muito espao em labora-
trio e apresenta custo
elevado, o que restringe
seu uso em programas de
controle de qualidade para
certificao da pureza
gentica.
Mtodos baseados em PCR (reao
em cadeia da polimerase) tais como
RAPD, AFLP e SSR ou microsatlites
tm sido preferencialmente utilizados
para anlise da pureza gentica e uma
vez que pequenas quantidades de DNA
so requeridas, os perfis podem ser
obtidos mais rapidamente do que com
RFLPs. Desses mtodos, o RAPD o
menos aceito, devido ao baixo grau
relativo de complementaridade entre o
primer e a seqncia de DNA alvo, o
que torna o teste de difcil padroniza-
esses marcadores ao acaso para regi-
FIGURA 2. Diferenciao de
cultivares de algodoeiro por
AFLP. UFLA Lavras/MG, 2000.
As setas indicam distino das
cultivares colorida e precoce,
das demais.(Gentilmente cedida
por Mann,R.S., aluna do curso
de Doutorado Fitotecnia /
Sementes / UFLA)
o. O baixo anelamento relativo do
primer tambm resulta em falhas na
amplificao de algumas bandas pa-
rentais do hbrido em F1. Sobretudo
falhas na reprodutibilidade de resulta-
dos comprometem grandemente a pre-
ciso e a praticidade do uso de RAPDs
para anlise de pureza gentica, fazen-
FIGURA 3. Padres de
microssatlites de linhagens e
hbrido de milho pelo primer
bnlg2291 em folhas e sementes
(5 repeties). UFLA, Lavras,
MG. 2000. (Gentilmente cedida
por Salgado, K.C.C., aluna do
curso de mestrado em
Fitotecnia/Sementes/UFLA.)
do com que este mtodo seja utilizado
com grande cuidado. No entanto, o
RAPD tem sido bastante usado em
etapas iniciais de diferenciao (Fig1);
aps a deteco de polimorfismo, os
produtos RAPD so clonados e se-
qenciados, redesenhando primers
PCR, mais longos e ento convertendo
es amplificadas caracterizadas por se-
qncia (marcadores SCARs). Nesse
caso, a amplificao da seqncia es-
pecfica do DNA ocorre em temperatu-
ras de pareamento mais elevadas, o
que torna o processo mais reproduz-
vel.
A tecnologia AFLP combina, em
parte, as tcnicas RFLP e RAPD. Nesta
tcnica, o DNA clivado com enzimas
de restrio, e os fragmentos obtidos
so amplificados por PCR a partir de
primers complementares aos adapta-
dores que foram previamente ligados
s extremidades dos fragmentos. Des-
sa forma, a maioria das dificuldades
apresentadas em RAPD resolvida,
pelo uso de condies de alta adstrin-
gncia para o anelamento do primer
PCR. Ressalta-se no entanto, que tanto
RAPD quanto AFLP so marcadores
dominantes, o que torna sua utilizao
um problema prtico para anlise de
pureza gentica, uma vez que os hete-
rozigotos podem no ser detectveis.
Um exemplo de utilizao da tcnica
de AFLP para diferenciao de cultiva-
res de algodoeiro pode ser visualizado
na Fig. 2.
Simples Seqncias Repetidas (SSRs)
ou microsatlites consis-
tem de pequenas seqn-
cias , com 1 a 4 nucleo-
tdeos de comprimento,
repetidas ao longo do
genoma, podendo ocor-
rer tanto em regies co-
dificadoras quanto em re-
gies no codificadoras.
Devido a erros (inser-
es/delees) durante
o processo de replicao
do DNA, que normalmente ocorrem
com mais freqencia nessas regies
repetidas do genoma, os microsatlites
so normalmente polimorfos. As regi-
es com seqncias simples repetidas
so amplificadas individualmente atra-
vs de PCR, pela utilizao de um par
de primers especficos que so com-
plementares s sequncias nicas que
flanqueiam os microsatlites. Essas re-
gies do genoma que contm a se-
qncia repetida devem ser inicial-
mente identificadas, isoladas e seqen-
ciadas, o que demanda tempo e eleva
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 45
 o custo operacional. Ao contrrio do
RAPD e AFLP, lcus SSR so codomi-
nantes, multiallicos, ou seja, todos os
alelos de um determinado lcus po-
dem ser detectados e discrimina-
dos, alm de serem somaticamen-
te estveis. Apesar da tecnologia
SSR ser onerosa em sua implemen-
tao, h de se ressaltar que, no
caso de plantas, esto disposi-
o, no mercado, pares de pri-
mers para diversas espcies de
interesse econmico, o que viabi-
liza o seu uso na identificao e
anlise de pureza gentica. Marca-
dores SSRs tambm tm sido utili-
zados para detectar a contamina-
o gentica em campos de produo
de sementes (Fig 3).
Apesar da recomendao do uso de
marcadores bioqumicos pela Interna-
tional Seed Testing Association (ISTA)
e pela Assocation of Official Seed
Analysts (AOSA) e da gama de tcnicas
disponveis, a escolha do mtodo mo-
lecular a ser utilizado vai depender da
estrutura gentica de cada espcie, do
seu modo de reproduo, do tamanho
do seu genoma e, sem dvida, da
relao custo/benefcio. H de se res-
saltar ainda a necessidade de investi-
mentos nestas tecnologias, de forma
que sejam adaptadas e postas dispo-
sio para uso em anlises rotineiras de
laboratrio.
Marcadores moleculares na
determinao da qualidade
fisiolgica de sementes
Tm sido desenvolvidas pesqui-
sas para detectar as diversas reaes
metablicas que envolvem sntese
e degradao de molculas durante
o desenvolvimento, a germinao e
a deteriorao de sementes. No
processo de morfognese tem sido
utilizado marcadores moleculares,
como a -tubulina, com a finalidade de
acompanhar as seqncias de proces-
sos que ocorrem durante a diviso
celular. A atividade da -tubulina pode
ser detectada pelas tcnicas de imuno-
deteco ( Fig 4). Esse tipo de anlise
tem grande aplicao em pesquisas
relacionadas com envigoramento de
sementes e em estudos de tolerncia a
dessecao.
Durante a fase de maturao das
sementes, a anlise do acmulo de
materiais de reserva por meio de mar-
cadores moleculares pode fornecer in-
46 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
dcios da qualidade das sementes. Pro-
tenas termoestveis como as LEA pro-
teinas (Late Embriogenise Abundant)
tm sido utilizadas como um dos indi-
FIGURA 4. Acumulao de das reservas ou com a biossntese de
tubulina em embries de
sementes de tomate durante a
germinao. (Gentilmente
cedido por Delmondez, R.,
bolsista recm-Doutor em
Fitotecnia/ Sementes da UFLA)
cativos de tolerncia dessecao, e a riorao das sementes. As enzimas mais
atividade da enzima -amilase, como
marcador relacionado com a tolerncia que atuam no processo de respirao, a
secagem de sementes de milho.
Isoenzimas tambm podem ser utili-
zadas como marcadores de dormncia,
germinao e deteriorao. A enzima tal no processo de germinao de se-
Figura 5. Perfis eletroforticos de
atividade enzimtica da -amilase,
em sementes de arroz recm-
germinadas, antes e aps o
armazenamento. UFLA, Lavras-
MG, 2000. (Gentilmente cedido
por Vieira, A.R. Doutor em
Fitotecnia/ Sementes da UFLA)
-amilase tem se apresentado eficiente
para monitorar a intensidade de dor-
mncia de sementes de arroz ao longo
do armazenamento (Fig 5), e a endo--
mananase, como marcador no proces-
so de germinao.
A perda da viabilidade das sementes
no processo de deteriorao precedi-
da por reduo na capacidade de sinte-
tizar protenas, devido ao declnio
de componentes como ribossomos,
RNA mensageiro e alteraes em
nvel de transcrio e traduo, com
o envelhecimento das sementes.
A integridade e o metabolismo celu-
lar dependem da grande variedade
de enzimas e protenas estruturais de
cada espcie. Desta forma, os testes
mais sensveis para determinar o
estdio de deteriorao so aqueles
que medem a atividade de certas
enzimas associadas com a quebra
tecidos novos. As protenas de armaze-
namento tambm podem sofrer mudan-
as resultantes de quebras parciais ou de
degradao para subunidades.
A atividade especfica de enzimas e
a integridade das protenas de armaze-
namento tm sido determinada por meio
de tcnicas de eletroforese e usadas
como marcadores do processo de dete-
pesquisadas nesse sentido so aquelas
exemplo da malato desidrogenase, ou
aquelas envolvidas no metabolismo de
ligao nitrognio-carbono, (fundamen-
mentes), como a glutamato desidro-
genase ou ainda aquelas que possu-
em funes especficas no metabolis-
mo dos lipdeos, como o caso das
esterases. Ainda tem sido considera-
do o estudo da atividade de enzimas
removedoras de perxidos como as
peroxidases, catalases, peroxido dis-
mutase, entre outras, e enzimas liga-
das destruturao do sistema de
membranas, a exemplo da esterase,
fosfatase cida e alcalina (Fig 6). J as
protenas de armazenamento tm sido
utilizadas para deteco de estgios mais
avanados de deteriorao.
No intuito de melhorar o desempe-
nho de sementes com determinados
nveis de deteriorao, tem-se trabalha-
do por meio da restrio hdrica (pri-
ming). Para o monitoramento desta tc-
nica, a eletroforese de isoenzimas espe-
cficas (Fig 7) vem sendo recomendada.
Muitas vezes podem ocorrer manifesta-
es bioqumicas indesejveis em fun-
o do mtodo de condicionamento
empregado, o que pode ser detectado
pelos perfis eletroforticos de enzimas
envolvidas na rota anaerbica, a exem-
plo da lcool desidrogena-
se.
Em ltima anlise, fica
evidenciado que o uso de
marcadores moleculares
para avaliao da qualida-
de fisiolgica das semen-
tes, apesar de j ter tido um
avano expressivo, ainda
requer muitas pesquisas,
antes de que seja estabelecido como
ferramenta decisiva em programas de
controle de qualidade.
Marcadores moleculares
na determinao da
qualidade sanitria
Os mtodos tradicionais para iden-
tificao de fungos envolvem estudos
de sua morfologia na planta infectada
e nos meios de cultura. Esses mtodos
so geralmente demorados e podem
ser pouco conclusivos ou levar a erros
de interpretao.
Tcnicas moleculares, baseadas na
imunologia e anlises de cidos nucli-
cos tm sido aplicadas em diversas
reas da micologia, o que tem gerado
grandes perspectivas para o desenvol-
vimento de mtodos rpidos, sensveis
e especficos no diagnstico de pat-
genos de plantas, comumente transmi-
tidos por sementes. Por um grande
perodo de tempo, as isoenzimas e
protenas foram os marcadores mole-
culares mais escolhidos. Recentemen-
te, com o advento cada vez mais rpido
do conhecimento em cincias, outras
tcnicas baseadas em molculas de
DNA e RNA foram disponibilizadas.
RFLP foi a principal tcnica mole-
cular utilizada para identificao de
isolados fngicos antes da reao de
polimerase em cadeia, no entanto,
apresenta algumas desvantagens, como
requerer grande quantidade de DNA
para visualizao em autoradiografia,
DNA de alta qualidade, intacto e sem
inibidores de enzimas de restrio.
Marcadores moleculares baseados
em microssatlites podem ser obtidos
para a discriminao de txons. Este
mtodo j foi testado em fungos, de-
tectando polimorfismo inter e intraes-
pecficos nos patgenos. Apesar da
utilizao desta tcnica ter auxiliado na
identificao e caracterizao de fun-
gos, ela apresenta a desvantagem de
necessitar do conhecimento prvio das
seqncias do organismo a ser estuda-
FIGURA 6. Padres enzimticos
da fosfatase cida de Aspergillus
glaucus, Aspergillus flavus e de
sementes de algodoeiro inocula-
das e no inoculadas com
ambos os fungos separadamente
e submetidos a envelhecimento
artificial. UFLA Lavras MG,
1995
do, para a construo dos primers.
O RAPD tem-se apresentado
como um mtodo vivel, e tem detec-
tado variaes em muitos organismos
(Fig 8). Apesar de seu problema de
repetio, existe a possibilidade de,
aliado a este, usar-se SCARs, onde
FIGURA 7. Padres isoenzimti-
cos de sementes de cafeeiro
submetidas a diferentes potenci-
ais hdricos nos tempos de 3 e 6
dias, reveladas para lcool
desidrogenase (ADH). UFLA,
Lavras - MG, 1998. (Gentilmente
cedido por Camargo, R., aluno de
doutorado em Fitotecnia/ Semen-
tes da UFLA)
fragmentos so seqenciados e pri-
mers maiores construdos. Esses pri-
mers so mais longos e especficos
para um lcus, o que possibilita a sua
utilizao por diferentes laboratrios.
Outro mtodo que pode ser utiliza-
do e que tem algumas vantagens sobre
o RAPD, o AFLP. Uma vantagem
significante do AFLP sobre o RAPD
que muitos fragmentos so gerados e,
conseqentemente, mais ban-
das podem ser detectadas com
uma simples amplificao.
Para algumas espcies de
fungos, tem-se ainda utilizado
outros recursos, como a anlise
de DNA mitocondrial o que
tem permitido a identificao
entre isolados, apesar de em
alguns casos apenas possibili-
tar diferenciao entre espcies.
A anlise da regio ITS (Internal
Transcribed Spacers) indicada para a
identificao de espcies de microrga-
nismos, inclusive nos casos em que a
taxonomia controvertida, pois esta
regio pouco varivel em estudos
intra-especficos, e apresenta variabili-
dade em torno de 0-2%.
A escolha das melhores tcnicas
para avaliao da qualidade gentica,
fisiolgica ou sanitria de lotes de se-
FIGURA 8. Padres de ampli-
ficaes obtidos com DNA
extrado de 3 isolados de C.
gossypii e 1 isolado de C.
gossypii var. cephalosporioides.
Nas linhas, a seqncia dos
isolados 1, 2 e 3 (C. gossypii) e
do isolado 4 (C. gossypii var.
cephalosporioides), 1o grupo
de 4 foram amplificados pelo
primer A4 e o 2o grupo, pelo
primer A7. UFLA MG 1998
mentes, depende de vrios fatores, in-
cludas a finalidade da anlise, as carac-
tersticas das espcies e a relao custo/
benefcio. O desenvolvimento de tcni-
cas moleculares tem evoludo de modo
extremamente rpido, possibilitando
maior segurana e confiabilidade dos
resultados na avaliao e no controle da
qualidade de sementes.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 47
 O Centro de Pesquisas em Tu-
berculose (CPT) da Faculdade de
Medicina de Ribeiro Preto USP
anuncia a sua disponibilidade de
realizar ensaios pr-clnicos de no-
vos medicamentos contra o bacilo
da tuberculose (TB). Todos os con-
tatos devem ser feitos com a Dra.
Ana Olvia de Souza (e-mail:
olivia@rpm.fmrp.usp.br) ou com o
Dr. Clio Lopes Silva (e-mail
clsilva@fmrp.usp.br)
Desde que o alemo Robert Koch
anunciou a descoberta do bacilo da
TB, em 1882, a preveno e o trata-
mento da doena desafiam cientis-
tas em todo o mundo. E pela dimen-
so que essa doena infecto-conta-
giosa tem alcanado na atualidade -
2 bilhes de pessoas infectadas e 3
milhes de mortes anuais - tornou
particularmente importante o de-
senvolvimento de um novo medica-
mento para o tratamento dessa en-
fermidade, por uma equipe de pes-
quisadores do CPT - USP, coordena-
da pelo professor Clio Lopes Silva
e pela Dra. Ana Olvia de Souza.
Segundo a Organizao Mundial de
Sade, a TB um flagelo milenar. No
passado, a doena foi disseminada
pelos fluxos migratrios e em decor-
rncia das guerras e da colonizao
das novas terras descobertas a partir
do sculo XV. Antes dos antibiti-
cos, o tratamento da TB era precrio,
com elevada taxa de mortes dos
indivduos afetados. O advento da
quimioterapia, baseada nos antibi-
ticos, com ndice esperado de cura
de at 95% dos casos, deu origem
euforia pela possvel erradicao de-
finitiva da peste branca. No entan-
48 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
48 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
to, fatores relacionados com a disse-
minao da doena, freqentemen-
te associados pobreza, mudaram o
quadro de euforia para um cenrio
de recrudescimento do flagelo. Tal
situao agrava-se com o apareci-
mento de bacilos resistentes s dro-
gas habituais, fruto, na maioria das
vezes, de tratamentos irregulares,
com grandes percentuais de aban-
dono. O problema pode ser revers-
vel desde que sejam tomadas medi-
das urgentes e inovadoras em vrias
frentes. O CPT, dando sua parcela
de contribuio para a soluo des-
ses problemas, desenvolveu tecno-
logias avanadas para testes pr-
clnicos de novos medicamentos an-
timicobacterianos e coloca dispo-
sio das Universidades, Institutos
de Pesquisas e Empresas Farmacu-
ticas a possibilidade de testar produ-
tos obtidos por cada uma dessas
Instituies.
A TB um problema secular s
portas do terceiro milnio
Na sua marcha desafiadora a TB
atingiu em mbito mundial, e nos
tempos atuais, 10 milhes de casos
novos, com 3 milhes de mortes por
ano, representando 18,5% de todas
as mortes em adultos entre 15-59
anos - a fase mais produtiva da
populao mundial. Cerca de meta-
de dos doentes nunca tiveram trata-
mento. Segundo a OMS, 32% da
populao mundial est infectada
com o bacilo da TB e, portanto, com
maior risco de adoecer por reativa-
o e, tambm, por infeco exge- mentos, e os que esto atualmente
na. Entre 1850 e 1950, um bilho de
pessoas morreram de TB. Na dcada
passada, 300 milhes de pessoas
foram infectadas, 90 milhes de no-
vos casos da doena apareceram e
30 milhes de pessoas morreram.
Morreram mais pessoas de TB em
1996 do que em qualquer ano da
histria. As perspectivas para elimi-
nar o bacilo da tuberculose do gran-
de nmero de indivduos infectados
um tero da populao mundial,
so baixas. O bacilo se aloja com
maior freqncia no pulmo, por
tempo indefinido, mas pode infectar
outros rgos, permanecendo con-
tido pelas clulas de defesa do orga-
nismo. Em decorrncia da diminui-
o da resistncia orgnica (desnu-
trio, subnutrio, estresse ou asso-
ciao de outras doenas), o bacilo
tende a se reproduzir intensamente
e pode levar o indivduo morte,
caso no seja tratado devidamente.
A primeira droga contra a TB, a
estreptomicina, foi descoberta em
1946. Na dcada de 50, outras dro-
gas foram pesquisadas e surgiram as
primeiras associaes medicamen-
tosas. Naquela poca, acreditava-se
que a erradicao da doena estaria
prxima. Contudo, uma srie de
fatores est contribuindo para a dis-
seminao da TB, entre os quais
podemos destacar: a pobreza, o uso
incorreto da teraputica; o abando-
no do tratamento; a alta capacidade
infectante desses agentes; as via-
gens migratrias constantes; a ocor-
rncia de grandes aglomerados po-
pulacionais e a co-infeco pelo
HIV. Como o tratamento da doena
feito exclusivamente por medica-
em uso, alm de causarem graves
efeitos colaterais, esto sendo inefi-
cientes contra cepas resis-
tentes, indispensvel que
se desenvolvam novos me-
dicamentos, novos frma-
cos ou novas formulaes
farmacuticas para o
combate TB.
Informaes sobre as
atividades do CPT
Alm do desenvolvimen-
to da terapia gnica, que
usada, tanto para a pre-
veno como para o trata-
mento da TB j instalada,
o CPT est envolvido com
a realizao de ensaios de
susceptibilidade de mico-
bactrias a produtos sint-
ticos e a extratos e/ou
fraes purificadas de
plantas, fungos, bactrias
do solo etc., abrangendo todas as
etapas na fase pr-clnica da tria-
gem de uma droga candidata a
medicamento anti-TB. As tcnicas
aplicadas nos ensaios seguem os
padres adotados internacional-
mente assim como os padres do
Centro de Controle e Preveno de
Doenas (CDC/EUA). A triagem
pr-clnica constituda de 4 eta-
pas. Na primeira etapa determina-
se a concentrao inibitria mni-
ma contra o bacilo utilizando o
sistema automatizado MB/Bact ou
a microdiluio em placa. Nesses
testes, cepas de Mycobacterium sp
so submetidas diretamente em
contato com a ao da droga em
teste. As drogas que atingem 90%
de inibio do crescimento mico-
bacteriano passam para a segunda
etapa dos testes. Na segunda eta-
pa, os ensaios so repetidos para
confirmar a concentrao que ini-
be 99% do crescimento micobacte-
riano. Outro fator de extrema im-
portncia e tambm considerado
em nossos ensaios a determina-
o da toxicidade de um compos-
to. Para essa finalidade, vrias li-
nhagens de clulas so utilizadas
nos ensaios para determinao con-
centrao da droga que inibe 50% da
proliferao celular e verificadas tam-
bm a ao das drogas sobre orga-
nelas celulares como lisossomas e
mitocndrias. Com os resultados ob-
tidos nessa etapa, calcula-se o ndice
de seletividade da droga utilizando-
se os parmetros acima avaliados.
Como requisito para a droga ser
submetida aos testes da terceira eta-
pa, esse ndice deve ser igual ou
superior a 10. As drogas seleciona-
das para a terceira etapa so avalia-
das sobre as micobactrias localiza-
das dentro dos macrfagos as
clulas que albergam o bacilo da TB
na infeco e na doena. Essa etapa
crtica e de grande importncia,
uma vez que, para a droga ser
efetiva, ela deve permear a membra-
na celular e atingir o interior do
macrfago onde a micobactria est
presente. A droga ainda deve resistir
s condies do meio intracelular
para combater os bacilos. Muitas
drogas so inefetivas porque no
atingem o interior do macrfago ou
porque, de alguma forma, so de-
gradadas no citoplasma celular. Aps
15 dias do incio dos testes, determi-
na-se o nmero de bactrias que
sobreviveram, a concentrao bac-
tericida mnima, a capacidade da
droga em retardar o incio do cresci-
mento micobacteriano aps a remo-
o da droga, e a dose efetiva para
a reduo de 50% do crescimento
micobacteriano intracelular. As dro-
gas com atividade dentro dos pa-
dres estabelecidos pelo CPT, avali-
adas frente a vrias cepas isoladas de
pacientes portadores de TB, e resis-
tentes a uma das drogas utilizadas na
quimioterapia da TB, passaro para
a quarta etapa. Na quarta etapa, os
testes so realizados em animais de
experimentao como camundon-
gos, cobaias e macacos. Eles so
experimentalmente infectados com
bacilos da TB e tratados com as
drogas em teste. Durante o trata-
mento, monitora-se o nmero de
bacilos presentes em rgos como o
bao e o pulmo. Os dados obtidos
na quarta etapa indicam se uma
droga apresenta potencial teraputi-
co para a quimioterapia da TB e a
viabilidade de continuidade dos
ensaios na fase clnica.
Dr. Clio Lopes Silva
clsilva@fmrp.usp.br
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 49
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 49
 Desvendando o
PESQUISA
Cdigo Gentico
Um quebra-cabea que comea a ser montado

Newton Portilho Carneiro Seqenciamento de Genes tro lado, o genoma funcional base-
Ph.D. Biologia Molecular
newtonc@cnpms.embrapa.br
Projetos Genomas ado apenas no seqenciamento dos
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG genes expressos e tem a vantagem de
Existem basicamente dois tipos de poder caracterizar a expresso tem-
Andra Almeida Carneiro
Ph.D. Biologia Molecular projetos genoma. Um chamado estru- poral e local dos genes. O seqencia-
andreac@cnpms.embrapa.br tural que o seqenciamento total do mento no genoma funcional feito
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG genoma, e outro funcional, que se em cerca de 800 pares de bases (bp)
Cludia Teixeira Guimares baseia no seqencimento apenas dos de apenas uma das fitas de cDNA.
D.S. Biologia Molecular genes expressos. A estratgia mais Considerando que as bibliotecas de
claudia@cnpms.embrapa.br
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG
utilizada para genomas estruturais a cDNA so montadas direcionalmente,
chamada shotgun, que uma se- a maior parte do seqenciamento
Edilson Paiva qncia em grande escala de subclo- feito a partir da extremidade 5 do
Ph.D. Biologia Molecular
edilson@cnpms.embrapa.br
nes de fragmentos de DNA j mapea- cDNA, devido ser a mais informativa e
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG dos. Estudos estruturais de genomas conservada. Embora possa haver er-
estruturais tm a principal vantagem ros de leitura nas seqncias geradas,
estes no comprometem, na maio-
ria dos casos, a identificao dos
correspondentes genes. Desta for-
Os genes so as unidades biolgicas responsveis em determi- ma, milhares de seqncias podem
nar as caractersticas de um organismo. Apesar de atualmente conhecer- ser determinadas com um limitado
mos como as informaes contidas nos genes so codificadas em investimento. A terminologia do in-
protenas, muitas dessas protenas / genes no possuem uma funo gls para etiqueta dos genes cha-
conhecida. Como descobrir a(s) funo(es) de uma protena codificada mada de Express Sequence Tags
por um determinado gene? Protenas podem ter funes enzimticas, (ESTs).
estruturais ou de reserva, a que iremos nos referir nesta discusso, como O banco de dados de ESTs tem
funes bioqumicas. Contudo, funes bioqumicas esto encaixadas mostrado ser uma grande fonte de
em um contexto mais amplo, como por exemplo: protenas participam identificao, principalmente da fun-
de processos de regulao celular, de defesa, de tolerncia a estresses, o bioqumica de muitos genes e
etc, os quais sero referidos neste texto como funo biolgica de uma de funes biolgicas que podem
protena. Este artigo tem por objetivo descrever alguns dos mecanismos ser inferidas com base na freqn-
utilizados para o estudo da funo bioqumica e biolgica de protenas cia de certos genes, que so identi-
codificadas por um gene ou em grande escala, por grupos de genes. ficados em bibliotecas de cDNAs
construdas sob diferentes condi-
es. Exemplificando: uma prote-
na X pode ser identificada como
de combinarem o seqenciamento e o uma quinase (funo bioqumica) atra-
mapeamento fsico dos genes, mas a vs do seqenciamento do gene que
desvantagem de um elevado custo. a codifica e da comparao com o
Considerando esse aspecto, est sen- banco de dados. Se essa mesma pro-
do feito o seqenciamento total do tena for identificada apenas em teci-
genoma, apenas de organismos com dos ou orgos que sofreram o ataque
genomas pequenos ou daqueles que de um patgeno Y , esse fato pode
j tm grande financiamento. Por ou- levantar a suspeita de que a protena

50 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

X esteja relacionada com os
processos de defesa contra o
organismo Y (funo biolgi-
ca).
Atualmente (Outubro/
2000), mais de 5 milhes de
seqncias, correspondendo
a genes de vrios organismos
esto disponveis em bancos
de dados pblicos. Os proje-
tos genomas, no incio dos
anos 90, comearam seqen-
ciando principalmente genes
abundantes e indicavam que
cerca de 60% das seqncias
eram desconhecidos. Como
j era de se esperar, pesquisa-
dores das mais diversas reas foram
depositando informaes de seqn-
cias e suas funes no banco de da-
dos. Para muitos desses genes, as
funes foram determinadas pela uti-
lizao da combinao de uma srie
de estudos que envolveu caracteriza-
o de mutantes, nveis e localizaes
da expresso gnica, modificaes de
substratos especficos, hibridao in
situ, mapeamento, interao protena-
protena in vitro e in vivo entre outros.
Essas seqncias gnicas, cujas fun-
es j esto determinadas, servem de
suporte para a identificao da funo
gnica de novas seqncias deposita-
das em bancos de dados. Quantos
genes so desconhecidos hoje, com-
parando-se com o incio dos
anos 90? A comparao de
seqncias pode ser feita a
nvel de nucleotdeos, amino-
cidos ou de domnios funci-
onais. As anlises de compa-
rao so feitas enviando-se a
seqncia editada para o ban-
co de dados e os resultados
so devolvidos em uma forma
chamada de e value. Quanto
menor esse valor, maior a si-
milaridade da seqncia com
aquela presente no banco de
dados. Cabe ao pesquisador
responsvel determinar qual
o limite mnimo para conside-
rar que uma seqncia est qualitativa
ou quantitativamente representada no
banco de dados pblicos. Apesar do
sistema de bioinformtica estar bas-
tante sofisticado nesses projetos,
difcil para um computador indicar o
que pode ser considerado um novo
gene, um membro de uma famlia
Figura 1 - Mutao por
antisenso. A Clula no
mutante contendo o gene X;
B Construo contendo o
gene X na orientao
antisenso; C - Clula A trans-
formada com construo B. ter toda a regio codante do gene
Clula da Planta Mutante na
Proteina X
gnica ou variaes de um alelo. Hoje,
projetos genomas descrevem que para
um e value de 10-25 existem cerca de
35% de genes desconhecidos.
Existe um grande nmero de pro-
jetos genomas sendo desenvolvidos
no mundo. Um resumo dos ESTs
depositados em banco de dados p-
Figura 2 - Co-supresso de
promotor. O experimento de
SDS-PAGE demonstra
que a protena X no existe
mais na planta transgnica
contendo a construo gnica
blicos pode ser acessado no
endereo internet http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/
dbEST/dbEST_summary.html.
No Brasil, projetos genoma tm
sido principalmente realizados
no Estado de So Paulo, com o
auxlio da Fapesp (Fundao
de Apoio Pesquisa, do Estado
de So Paulo).
Como um seqenciamento
per si pode ser til na determi-
nao da biologia de um gene?
Dependendo do nmero de
clones seqenciados e das va-
riedades das bibliotecas de
cDNAs construdas, possvel
tirar concluses relacionadas abun-
dncia, expresso temporal e espacial
de muitos genes. Apesar de muitos
desses seqenciamentos serem feitos
a partir do final 5 do gene, possvel
devido presena de clones de cD-
NAs derivados de mRNA de diferentes
tamanhos. A bioinformtica pode re-
conhecer um bom seqenciamento,
retirar regies dos vetores, submeter
automaticamente a anlise do Blast
e montar contigs ou grupos de se-
qncias que tenham overlaps e,
com isso, caracterizar membros de
uma famlia, alelos, single nucleoti-
deo polymorphism (SNPs) etc.
Nem sempre os projetos genomas
pblicos descrevem as seqn-
cias desconhecidas. A vanta-
gem de um banco de dados
disponibilizar as seqncias
desconhecidas a oportuni-
dade que um pesquisador
poder comparar as expres-
ses de um gene em outros
organismos e de sugerir pro-
vveis funes. As sees a
seguir descrevem processos
usados para auxiliar a melhor
descrio da(s) funo(es)
gnica(s).
Gentica Direta e Reversa
Gentica direta um processo que
envolve, inicialmente, a anlise do
fentipo e depois o isolamento e a
identificao do gene responsvel pela
caracterstica. Genes tm sido isolados
por clonagem posicional, mutagnese
com insero de transposons ou de T-
DNA, por escrutnio de bibliotecas de
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 51
 DNA expresso e por tcnicas
de expresso diferencial (diffe-
rental display).
Com o aumento da capaci-
dade de clonar, modificar e
examinar as atividades biolgi-
cas de segmentos de DNA, a
caracterizao de um gene pode
tambm ser realizada pela uti-
lizao de uma rota inversa,
denominada de gentica rever-
sa. Esse novo processo parte
de um gene cuja estrutura mo-
lecular conhecida e procede
por explorar a contribuio do
gene para um determinado fe-
ntipo. Assim sendo, um cami-
nho experimental parte do gene
como uma seqncia de nucle-
otdeos para a sua funo cor-
respondente. Sendo a seqncia do
gene conhecida, sua funo pode ser
desvendada pela sua inativao por
meio da recombinao homloga com
uma seqncia defeituosa, ou pela
diminuio da sua expresso por tc-
nicas de antisenso ou de co-supres-
so.
Tcnicas de Gentica Reversa
Usadas para Manipular Genes e
para Produzir Organismos
Mutantes
Mutao por Perda da
Funo Gnica
Nesse prximo seguimento de-
monstraremos como tcnicas de re-
combinao homloga, antisenso e
co-supresso podem ser empregadas
para mutar um gene conhecido, fa-
zendo com que ele se torne no fun-
cional e a importncia das plantas
transgncias como importantes ferra-
mentas cientifcas para auxiliar na iden-
tificao da funo gnica.
Recombinao Homloga
A recombinao homloga a
alterao de uma pequena parte da
seqncia de um gene de interesse
que geralmente feita com a incorpo-
rao de um gene marcador e a rein-
troduo desse gene mutado no orga-
nismo de origem. Uma vez dentro do
organismo de interesse, o gene muta-
do tem a capacidade de substituir o
gene nativo pela recombinao ho-
52 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Figura 3 - Identificao de um
gene utilizando transposon por
meio de gentica direta. A
grande maioria dos indivduos
F1 do cruzamento entre um
indivduo A contendo um
transposon ativo com o indiv-
duo mutante de interesse B
sero normais devido comple-
mentao do alelo normal da
linhagem A, contudo, em uma
freqncia baixa na populao
F1, o transposon estar inserido
no locus do indivduo A
corresponde ao gene mutado do
indivduo B. Nesse caso, o
indivduo F1 ser semelhante ao
indivduo B. Dessa forma o
alelo mutado do indivduo B
pode ser substitudo pelo
transposon, um marcador
conhecido, atravs de cruzamen-
tos, e o gene de interesse
identificado atravs da constru-
o de uma biblioteca genmica
mloga, criando um organismo mu-
tante. Um gene marcador pode ser o
gene bar de seleo para o herbicida
fosfinotricine (PPT). As plantas con-
tendo o gene modificado com o mar-
cador so selecionadas na presena
do herbicida e, aps ficar demonstra-
do a incorporao do gene modifica-
do no genoma da planta transforma-
da, essa autofecundada e, por estu-
dos moleculares, possvel identificar
a planta que tenha apenas o alelo
modificado (homozigose). A
planta homozigota para o gene
modificado de interesse pode
apresentar ou no um fentipo
aparente, mas as plantas com
os fentipos mutantes eviden-
tes podem proporcionar uma
forma rpida de correlacionar
o fentipo com o gene modifi-
cado. Mtodos de distrbio da
funo gnica, via recombina-
o homloga tm sido descri-
tos para leveduras e ratos, sen-
do poucos os casos descritos
em plantas. Uma aplicao com
sucesso da recombinao ho-
mloga, em plantas foi a de-
monstrada para o gene AGL
MADS-box, em Arabidopsis.
Antisenso
A metodologia do antisenso envol-
ve a introduo, na clula, de molcu-
las de RNA ou de DNA, construdas
artificialmente, que sejam complemen-
tares (antisenso) ao RNA mensageiro
(mRNA) do gene de interesse. Uma
das hipteses para explicar o motivo
pelo qual o RNA antisenso pode cau-
sar mutaes no organismo transfor-
mado o fato de que estas molculas
de RNA ou de DNA artificiais se ligam
ao mRNA celular, inativando-o (Fig.
1). Usando essa tecnologia, o antisen-
so do gene da chalcone sintase (chs),
responsvel pela pigmentao das flo-
res, foi introduzido em plantas de
petnia e de tabaco, resultando em
plantas com alterao na pigmenta-
o das suas flores (fentipo mutan-
te). Sheehy et al. (1988) tambm usa-
ram a tecnologia do antisenso para
inibir a produo de enzimas respon-
sveis pelo desenvolvimento do fruto
do tomate, produzindo, assim, um
tomate mutante com o amadureci-
mento retardado.
Co-supresso
Na tcnica de co-supresso, um
gene de interesse engenheirado por
meio de tcnicas de biologia molecu-
lar, para superexpressar uma protena
de interesse. Uma vez que a clula
possui uma maquinaria minuciosa-
mente ajustada, qualquer alterao
nos nveis de expresso de uma pro-
tena produz uma grande confuso

Figura 4 TUSC (Trait Utility
System in Corn). Plantas conten-
do transposons ativos so multi-
plicadas para a montagem de
uma biblioteca de mutantes.
Conhecendo a freqncia com
que o transposon se multiplica e
se insere em regies codantes,
pode-se calcular teoricamente o
nmero de plantas necessrias
para se ter um transposon em
cada gene. Cada planta mutante
autofecundada e as sementes
estocadas. Uma reao de PCR
feita com DNA extrado de folhas
de grupos de plantas dessa
biblioteca de mutantes, usando-
se um primer do transposon e
um primer do gene (a seqncia
de ambos conhecida). A
hibridao feita para auxiliar
no escrutnio de um grande
nmero de plantas. Os grupos de
plantas cujo sinal foram positivos
so subdivididos at que seja
encontrada a planta que conte-
nha o transposon inserido no
gene. Para aumentar a chance de
encontrar a planta mutante, testa-
se uma srie de primers de um
nico gene simultaneamente
nos mecanismos de regulao celular.
Como conseqncia, na maioria das
vezes, a superexpresso de uma pro-
tena na clula faz com que a produ-
o dessa protena seja desligada e, ao
contrrio do que seria espera-
do, forma-se, ento, um orga-
nismo mutante, que no pro-
duz a protena de interesse.
Isso pode acontecer a nvel de
gene ou a nvel de promotor.
Um exemplo de co-supresso
a nvel de promotor demons-
trado na Figura 2 onde um
mutante foi produzido no na
protena que estava sendo su-
perexpressa, mas na protena
de onde foi retirado o promo-
tor. Embora seja difcil compre-
ender como a superexpresso
de um gene possa ocasionar a
diminuio da sntese de sua
protena, vrios experimentos
tm sido realizados demons-
trando a ocorrncia desse fato.
O primeiro resultado de co-
supresso foi obtido por meio de um
estudo envolvendo a variao da co-
lorao de flores de petnia pela
introduo do gene da chs sob o
controle do promotor 35S.
Mutao por Insero de
Transposon ou T-DNA
Transposons
Transposons so elementos de
DNA que tm a capacidade de sair de
uma regio do genoma e se incorpo-
rar em outra. Sendo o movimento do
transposon um processo aleatrio,
quando estes elementos pulam em
um genoma, podem se inserir no
meio de um gene, tornando-o inativo.
Em plantas, uma srie de transposons
tm sido usados como ferramenta,
tanto na gentica direta quanto na
reversa, para isolamento e caracteri-
zao de vrios genes ou fentipos. O
princpio da tcnica est descrito na sivo GA, que inclui uma altura redu-
Figura 3. O primeiro gene de planta
clonado por transposon, via gentica
direta, foi o gene bronze, de milho,
que codifica UDP-glucose:flavonide
3-O-glucosiltransferase, uma enzima
da via metablica das antocianinas
(Fedoroff et al., 1984).
A gentica reversa usando mutan-
tes por insero de transposons foi
descrita, inicialmente, em Drosophila
melanogaster. Essa metodologia ba-
seada em uma reao em cadeia da
polimerase (PCR Polymerase Chain
Reaction), que utiliza um primer com-
plementar ao final do transposon e
outro complementar ao final do gene.
Dessa forma, os produtos de Polime-
rase Chain Reaction (PCR) s sero
obtidos se um transposon estiver inse-
rido no gene de interesse. Genes que
tiveram sua expresso alterada pela
insero do transposon so recupera-
dos por meio da amplificao por PCR
do DNA extrado do indivduo com
fentipo mutante. Esse processo tem
sido utilizado na identificao de ge-
nes em Caenorhabditis elegans e mi-
lho.
A famlia dos transposons Mutator
(Mu) em plantas apresenta altas taxas
de mutaes e tem alto grau de con-
servao nas extremidades das se-
qncias invertidas. Essas duas carac-
tersticas so bastante interessantes,
pois ajudam a selecionar alelos que
contenham os elementos Mu cuja se-
qncia previamente conhecida. In-
seres dos elementos Mu podem ser
identificadas pela amplificao por
PCR. O gene mutado pode, ento, ser
recuperado e propagado em semen-
tes F2. Outros aspectos importantes
desse processo, e essenciais para a
anlise de um menor nmero de plan-
tas, so o nmero de transposio e o
nmero de cpias do transposon Mu
na planta. A tecnologia de caracteriza-
o de funes gnicas atravs do Mu
foi utilizada pela primeira vez em
milho pela Pioneer Hi-Bred Co., sen-
do denominada Trait Utility System
(TUSC) (Fig. 4). Bensen et al. (1995)
utilizaram a tcnica do TUSC para
caracterizar o mutante Anther ear1
(An1), cujo produto gnico est en-
volvido na sntese do primeiro inter-
medirio tetracclico na via da biossn-
tese de giberelina (GA). A mutao
An1 resultou em um fentipo respon-
zida de planta, atraso na maturidade e
desenvolvimento de flores perfeitas
em espigas normalmente pestiladas.
Um projeto financiado pela Natio-
nal Science Foundation (NSF) coor-
denado pela Dra. Virginia Walbot (Uni-
versidade de Stanford, EUA) tem por
objetivo demonstrar a funcionalidade
de genes de milho usando dois mto-
dos complementares: o seqencia-
mento de DNA genmico flanquean-
do as inseres do transposon Mu e a
identificao e caracterizao dos in-
divduos mutantes contendo esses
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 53
 transposons. Um banco de mu-
tantes est sendo criado usando
plantas transformadas com os
elementos Mu contendo o plas-
mdeo Bluescript (Fig. 5). A nova
insero contendo o transposon
poder ser seletivamente clona-
da direto em E. coli, gerando
uma biblioteca de mutao in-
sercional para anlise de DNA.
Cada planta F2 ser autofecunda-
da e as sementes sero estocadas
no Maize Genetics Cooperative
Stock Center, um rgo especi-
almente criado para armazenar
os estoques de sementes muta-
das. Os usurios podero utilizar
a tcnica de PCR para seleo de uma
coleo de plasmdeos que foram in-
seridos em genes de interesse. Cerca
de 50.000 ESTs, flanqueadas pelo trans-
poson Mu, j foram completamente
seqenciados durante o primeiro ano
do projeto. O objetivo final seqen-
ciar cerca de 150.000 segmentos de
DNA genmico contendo inseres
do transposon Mu.
T-DNA
O T-DNA um segmento de DNA
presente no plasmdeo Ti (DNA no
cromossmico) de Agrobacterium tu-
mefaciens, uma bactria de solo que
causa tumores quando infecta plan-
tas. O tumor causado pela capacida-
de da bactria de transferir seu T-DNA
para as clulas vegetais. O T-DNA
contm genes que codificam horm-
nios e aminocidos necessrios so-
brevivncia da Agrobactria dentro da
planta. Cientistas descobriram que
podiam alterar este fragmento de DNA
substituindo os genes nativos por
qualquer gene de interesse e, que
esses novos genes continuariam sen-
do transferidos para as plantas pelo
sistema mediado pela bactria. A par-
tir dessa descoberta, o T-DNA passou
a ser usado como uma ferramenta na
gentica direta e reversa de maneira
semelhante aos transposons. O T-
DNA se insere aleatoriamente no meio
de genes tornando-os no funcionais
e produzindo um organismo mutante.
A funo do gene Agamous de Arabi-
dopsis foi caracterizada como sendo
um regulador transcricional necess-
rio para o desenvolvimento floral uti-
lizando essa metodologia (Yanofsky
54 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Figura 5 Projeto NSF coorde-
nado pela Dr. Virginia Walbot
(University of Stanford). O
transposon contendo uma marca
de seleo para resistncia
ampicilina em bactria transfe-
rido para o milho por transfor-
mao. As plantas so multiplica-
das e so feitas bibliotecas
genmicas a partir de colunas e
fileiras de plantas contendo esses
transposons engenheirados,
inseridos aleatoriamente no
genoma. Os plasmdeos origina-
dos da biblioteca genmica
contendo esse cassetes so
seqenciados e as plantas que
contm os transposons inseridos
nos genes de interesse so
identificadas
et al., 1990).
Gentica reversa em Arabidopsis
usando grandes populaes de plan-
tas mutadas, com um elemento de
insero, taes como o T-DNA de A.
tumenfaciens. Grandes populaes
de plantas mutantes foram geradas
para constituir uma biblioteca de in-
sero. Em Arabidopsis, uma unidade
de transcrio tem em mdia 2.5 kb
(intron e exon), o que significa que
um genoma de 100 Mb pode ser
dividido em cerca de 40.000 genes.
Para ter 95% de chance de acertar um
dos genes, so necessrias 120.000
inseres aleatrias independentes. O
DNA extrado de plantas mutageni-
zadas e agrupadas em grupos maio-
res. Inseres simples podem ser de-
tectadas por PCR em grupos de cerca
de milhares de indivduos. Depen-
dendo da natureza da populao usa-
da, grupos ou supergrupos po-
dem ser organizados em matri-
zes de duas ou trs dimenses
para facilitar a determinao fi-
nal do indivduo carregando a
insero desejada. As reaes
de PCR so realizadas em su-
pergrupos de DNA usando-se
combinaes de oligonucleot-
deos do gene e do elemento de
insero. Os produtos de PCR
so carregados em um gel de
agarose, transferidos para mem-
brana e hibridizados com son-
das produzidas a partir do gene
de interesse e do elemento de
insero. Apesar do PCR ape-
nas permitir a amplificao do gene
mutado pelo elemento de insero,
backgrounds podem ocorrer. Desta
forma, apenas as bandas que hibridi-
zarem com ambas sondas sero leva-
das adiante. Uma vez que o produto
de PCR tenha sido confirmado e se-
qenciado, o supergrupo pode ser
subdividido em grupos cada vez me-
nores. A determinao final da linha
mutante pode ser obtida em menor
tempo, dependendo do esquema de
agrupamento dos DNAs.
Uso de Microarrays de DNA
para Estudar a Expresso de
Genes em Todo o Genoma
de Um Organismo
O microarray uma metodologia
utilizada para comparar a expresso
de um grande nmero de genes, si-
multaneamente. Essa tcnica empre-
ga arranjos (arrays), que contm um
grande nmero de genes robotica-
mente distribudos de forma ordenada
sobre placas de vidro. A quantificao
dos nveis de expresso na tecnologia
de microarray baseada em experi-
mentos onde os milhares de clones de
cDNA so hibridizados com duas son-
das marcadas com diferentes fluores-
cncias (geralmente uma que emite
cor vermelha e outra, verde). As son-
das podem ser conjuntos de cDNAs
gerados a partir de clulas ou de
tecidos em duas situaes diferentes
que se deseje comparar (por exem-
plo: resistncia e suscetibilidade ao
alumnio). Os resultados so produzi-
dos sob forma de diferentes intensida-
des de fluorescncia, que so capta-
das por microscopia de fluorescncia
a laser, em funo dos diferentes
nveis de expresso de cada gene.
A imagem dos pontos fluores-
centes processada por compu-
tadores e programas especficos,
sendo gerada simultaneamente
uma grande quantidade de in-
formao (Fig. 6).
A tecnologia de microarrays
no fornece apenas informaes
sobre a funo de genes anni-
mos, o que favorecer bastante
os processos de gentica rever-
sa, mas tambm constitui uma
ferramenta indispensvel para
estudos globais de expresso
gnica, com grandes aplicaes
nos estudos de biologia molecu-
lar e fisiologia vegetal. Apesar do
microarray ser um dot blot de
RNA, grande nmero de concluses
podem ser tiradas com o uso desse
processo.
Uma importante aplicao da tec-
nologia de microarray o fato que
muitos arrays podem ser produzidos
para servir como uma plataforma co-
mum entre vrios pesquisadores. Se
aclopado para o desenvolvimento de
um banco de dados centralizado, os
pesquisadores sero capazes de pes-
quisar em multiplos grupos de dados
diferentes padres de expresso de
interesse. Com essa tecnologia, ser
possvel acessar o impacto de especfi-
co tratamento, fatores ambientais, est-
gios de desenvolvimento e efeitos na
expresso global de todos os genes em
um transgnico, estudos envolvendo
heterosis e produtividade, anlise com-
parativa de organismos de genomas
menores, como vrus, melhoramento
assistido por marcadores, fingerprin-
ting e escrutnio de germoplasma para
identificar genes envolvidos em pro-
cessos especficos, entre outros. Devi-
do a informao gerada por estudos de
microarrays ser quantitativa, mudan-
as sbitas na expresso de um gene
podem ser detectadas e podem substi-
tuir metodologias de subtrao e diffe-
rential display.
Apesar da obteno de cDNAs de que calcula intensidade de sinal
organismos procariotas ser difcil devi-
do principalmente falta do poli A+ e
alta instabilidade dos mRNAs, esses
organismos ainda so um excelente
sistema para anlise de microarray
devido principalmente ao seu genoma
pequeno (em torno de 3 Mb) e a grande
Figura 6 - Anlise de expresso
gnica usando microarray. O
mRNA total de cada situao
usado para preparar sondas de
cDNA usando a transcriptase
reversa na presena de um
nucleotdeo marcado com fluo-
rescncia. Um dos grupos de
mRNA marcado com um
nucleotdeo com fluorescncia
verde e o outro, com fluorescn-
cia vermelha. As duas sondas so
misturadas e hibridizadas com o
DNA no microarray. Assim, a
relativa abundncia de cada
mRNA comparada por um
analisador de imagem atravs do
sinal gerado pelas duas sondas. O
objetivo do processo identificar
genes cujos sinais gerados foram
mais voltados para o verde ou
para o vermelho. Aqueles clones,
cujo mRNA no so diferencial-
mente expressos entre as duas
populaes de mRNA, tero uma
cor intermediaria entre verde e
vermelho, aqui representada pela
cor amarela. Os clones represen-
tados pela cor cinza representam
aqueles que esto representados
em pequenas quantidades nas
sondas. Toda a anlise de ima-
gem feita em um computador
gerado na hibridao
variabilidade de mutantes disponveis.
Estudos de microarrays podem ser
usados para comparar o organismo
selvagem com mutantes, em uma s-
rie de fatores especficos.
A anlise de expresso gni-
ca em grande escala oferece
grandes vantagens, porm esse
processo possui limitaes. Uma
clara limitao na aplicao des-
sa tecnologia a grande quan-
tidade de RNA necessria du-
rante a etapa de hibridao. A
quantidade de RNA total para
uma hibridao de 50 a 200 g
(2 a 5 g para mRNAs). Certa-
mente, os resultados gerados
por esse processo no determi-
nam a funo de um gene, mas
fornecem uma forte ferramenta
para a sua compreenso. Os
resultados fornecidos por esse
processo servem para indicar
genes candidatos interessantes
para estudos mais detalhados. Estu-
dos adicionais tero de ser feitos para
verificar se os nveis de transcrio
alterados refletem mudanas na snte-
se ou turnover. Alm disso, uma
resposta diferente pode estar relacio-
nada com processos ps-transcricio-
nais como fosforilao, metilao, gli-
colisao, etc.
Devido a essa grande capacidade
de anlise de transcritos ao mesmo
tempo, a tecnologia de microarray
pode, muitas vezes, antecipar os pro-
jetos genomas de seqenciamento es-
trutural e funcional. Os microarrays
hoje so construdos a partir de clones
conhecidos. Essa etapa envolve se-
qenciamento de genes, identificao
de clones em placas de estoque, ma-
nipulaes desses clones para novas
placas de estoque, reaes de PCR e
eletroforese em gel de agarose para
confirmar a eficincia do processo,
etc. Uma nova idia que tem surgido
o uso de microarrays sem o seqen-
ciamento prvio. Clones de bibliote-
cas normalizadas so submetidos a
amplificao do inserto por PCR e
automaticamente transferidos para o
microarray. Assumindo que a quanti-
dade de clones raros tenha aumenta-
do em relao aos abundantes na
normalizao da biblioteca, e que, em
cada lmina de vidro, podem ser orga-
nizados pelo menos 10.000 clones, o
processo pode tornar-se bem mais
simples e interessante. Clones relacio-
nados com o estresse poderiam ser
isolados com base na confeco de
uma biblioteca de cDNA de raiz de
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 55
 uma planta tolerante ao es-
tresse, e sondas de cDNAs
da planta tolerante e da
planta susceptvel ao mes-
mo estresse marcados com
duas fluorescncias dife-
rentes. Um rob de micro-
array capaz de colocar
16 amostras em 48 placas
de vidro, lavar e secar a
sonda para o prximo gru-
po de cDNA em 70 segun-
dos. Assim, cerca de 10.000
amostras podem ser im-
pressas em, aproximada-
mente, 12 horas. Vrios sis-
temas robotizados mais rpidos e efi-
cientes para a impresso e processa-
mento dos cDNA nas placas de vidro,
alm de metodologias cada vez mais
sensveis e precisas para deteco e
anlise dos resultados tm sido desen-
volvidos e disponibilizados. No exem-
plo anterior, apenas clones expressos
diferencialmente seriam seqenciados.
Portanto, mesmo que tenhamos clo-
nes repetidos, estaremos com um n-
mero de clones para seqenciamento
bastante reduzido em relao a um
seqenciamento aleatrio. Se na pr-
tica de microarrays pode, ou poder
em um futuro prximo, ser usado sem
auxlio de classificao prvia dos que sero utilizados em uma
clones, grupos que tenham, ou este-
jam desenvolvendo, organismos con-
trastantes para diversas caratersticas
de interesse, estaro com excelentes
ferramentas para ajudar a identificar
os genes envolvidos em vrios pro-
cessos fisiolgicos. Linhas recombi-
nantes provinientes de cruzamentos
de indivduos contrastantes e mutan-
tes so as melhores opes, atualmen-
te, para as anlises de microarrays.
Vantagens e desvantagens do
microarray baseado em
fragmentos de DNA
Existem basicamente dois proces-
sos em que os microarrays podem ser
confeccinados. Um a impresso de
oligos e o outro, os de framentos de
DNA previamente isolados na lmina
de vidro. O microarray baseado em
oligos, em particular aqueles produzi-
dos por mtodo de fotolitografia, tem
alta densidade (250.000 olinucleotide-
os/cm2) e so mais consistentes nos
arrays comparados com os microar-
56 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Figura 7 - Identificao de
interao protena-protena (in
vitro).
A) A protena de interesse
clonada em um vetor de expres-
so em bactria que permite a
sua purificao em uma coluna
de afinidade. Um extrato de
protenas produzido nas clulas
vegetais tambm submetido
coluna que j contm fixada a
protena de interesse. A coluna
lavada e as protenas que intera-
girem com a protena de interes-
se podem ser seqenciadas ou
usadas para produzir anticorpos
rer, ocasionando uma anlise confusa
biblioteca de expresso de
cDNA.
B) Protenas X e Y produzi-
das em E. coli so misturadas e
passadas atravs de uma coluna
de nquel. Se a protena Y
interagir com a X, ambas
ficaro retidas na coluna. O
processo pode ser visualizado
por anticorpos ou raio-X, caso a
proteina Y esteja marcada com
radioatividade
rays baseados em fragmentos de DNA.
O potencial de colocar clones em
locais errados pode ser evitado no
mtodo do oligo porque so sintetiza-
dos in situ, baseado na seqncia do
gene obtido diretamente do banco de
dados. Alm disso, devido seqn-
cia que os hibridiza no microarray
baseado em oligo ser muito curta (20
a 25 nucleotdeos), as reaes de
hibridao so muito sensveis na tro-
ca de um simples nucleotdeo, ao
contrrio do mtodo baseado no frag-
mento de DNA. Isso faz
microarrays baseado em
oligonucleotideos parti-
cularmente apropriados
para genotipagem e apli-
caes de seqencia-
mento. A maior desvan-
tagem do microarray
baseado em oligos que
sua construo depende
da disponibilidade de um
banco de dados seguro.
Ao contrrio de micro-
arrays baseados em frag-
mentos de DNA, infor-
maes de seqncias
no so necessrias para a constru-
o. Em comparao dot blots de
clones arranjados em membranas de
filtro, microarrays so mais sensveis,
exibindo uma dinmica mais ampla e
permitindo uma anlise simultnea de
duas sondas complexas. Assim, ape-
sar dos dot blots poderem ser apropri-
ados para pequena escala, apenas
microarrays baseados em fragemen-
tos de DNA podem fornecer anlises
em escala genmica. Uma desvanta-
gem do processo, similar em qualquer
outro mtodo de hibridao, o fato
de que hibridao cruzada entre mem-
bros de uma famlia gnica pode ocor-
de expresso gnica de membros de
uma mesma famlia.
SAGE (Serial Analysis
of Gene Expression)
SAGE a extenso lgica do se-
qenciamento de EST. Um inventrio
de mRNAs feito com base no se-
qenciamento de cDNAs curtos, clo-
nados em tandem. O tamanho desses
cDNAs o suficiente para identificar
genes correspondentes no banco de
dados. O padro de restrio desses
genes diferentes est relacionado com
a abundncia relativa de cada cDNA.
Os padres gerados pelo SAGE
tm sido estudados em humanos e em
levedura, contudo tm sido pouco
utilizados em plantas. Um pr-requisi-
to para a identificao dos ESTs a
disponibilidade de um banco de da-
dos grande para a espcie estudada.
Essa tcnica poderosa, mas no
conveniente para a comparao de
muitas amostras diferentes e para o
estudo de transcritos raros.
Proteomics Estudo do Perfil
Protico de Um Organismo
Cientistas tm utilizado o ter-
mo proteomics para descrever
as anlises do perfil protico de
um organismo. O comportamen-
to de muitas protenas em um
proteoma pode ser monitorado
por meio de gis de eletroforese
em duas dimenses. Nesse pro-
cesso, protenas provenientes de
clulas ou de tecidos em duas condi-
es fisiolgicas diferentes (por exem-
plo, plantas resistentes e sensveis a
uma determinada doena ou condi-
o de estresse) so extradas, aplica-
das em gis e comparadas qualitativa
e quantitativamente. As protenas pre-
sentes em apenas um dos gis ou que
tenham a sua quantidade alterada so
fortes candidatadas para atuarem no
controle do processo em estudo. A
partir da identificao das protenas
de interesse, pode-se, utilizando-se as
tcnicas de biologia molecular, isolar
sua seqncia gnica e caracteriz-la.
Localizao Celular de um
mRNA ou Protena para
Inferir sobre sua Funo
Os genes so transcritos em mol-
culas de RNAs mensageiros (mRNA),
que so traduzidos em protenas. Es-
sas so transportadas para locais espe-
cficos dentro da clula de um deter-
minado tecido ou organismo. Enquan-
to alguns genes codificam para prote-
nas que so expressas em todas as
clulas de um indivduo durante toda
a sua vida (genes constitutivos), ou-
tros codificam para protenas que so
expressas apenas em algumas clulas,
ou em um determinado perodo de
desenvolvimento, ou em resposta a
algum estmulo externo (genes teci-
do-especficos). A localizao de uma
protena ou de seu mRNA nas clulas
ou tecidos onde so produzidos
uma importante fonte de informao,
que pode auxiliar na determinao da
funo de um gene ou protena. Um
dos princpios dessa metodologia a
identificao do mRNA ou da protena
de interesse por meio de sondas espe-
cficas. As sondas aps se ligarem
protena ou ao mRNA em estudo so
detectadas com o auxlio de tcnicas
de microscopia. Uma vez conhecida a
Figura 8 - Interao protena-
protena in vivo. A- O ativador de
transcrio GAL4 possui dois
domnios: um que se liga ao DNA
e outro que ativa a transcrio; B
e C - Os dois domnios foram
separados: o primeiro pode ser
fundido protena de interesse
(B) e o segundo, protena
desconhecida (C); D - As colnias
de levedura contendo os dois
plasmdeos cujas protenas intera-
gem sero azuis em meio conten-
do X-GAL (substrato para a
enzima), devido resconstituio
do fator de transcrio GAL4 e
ativao do gene da beta-galacto-
sidase (lac Z)
localizao da molcula dentro de um
organismo podem ser programados
experimentos mais refinados para a
definio de sua funo. Tcnicas de
hibridizaes in situ tm sido ampla-
mente utilizadas para localizar genes e
os seus produtos em cromossomos,
tecidos e clulas de diversos organis-
mos.
Interao Protena-Protena
A caracterizao da funo gnica
pode ser auxiliada por meio de estu-
dos de interao protena-protena in
vitro e in vivo. A observao de que
uma protena, cuja funo desco-
nhecida, interage com uma que
conhecida pode sugerir que as duas
protenas fazem parte do mesmo pro-
cesso ou que podem estar localizadas
no mesmo compartimento celular. Os
dois tipos de testes (in vitro e in vivo)
podem ser usados para verificar a
existncia de interao entre duas
protenas conhecidas, identificar no-
vas protenas que interagem com uma
protena em estudo e identificar
regies dentro de uma protena
que so importantes no processo
de reconhecimento e da interao.
Existe um grande nmero de alter-
nativas e variaes para estudar as
interaes entre protenas (Fig. 7).
Apesar de bastante informativas,
as reaes in vitro podem masca-
rar os resultados reais devido
impossibilidade de se reproduzir
in vitro todas as condies exis-
tentes nas clulas in vivo. Por esse
motivo, foram desenvolvidos proto-
colos que estudam a interao entre
protenas in vivo.
Uma maneira eficiente para detec-
o de interao in vivo utilizar o
sistema hbrido duplo de levedura.
Esse processo constitui a construo
de duas protenas de fuso, por enge-
nharia gentica. Uma delas gera um
hbrido entre seqncias para um do-
mnio que se liga ao DNA do fator de
transcrio Gal4 (aminocidos 1-147)
e a protena de interesse. Um segundo
plasmdeo de expresso contm uma
seqncia que ativa o fator de transcri-
o Gal4 (aminocidos 768-881) fun-
dida com cDNAs (Fig. 8). Os cDNAs
so provenientes de bibliotecas de
onde existem genes candidatos. Des-
sa forma, se as duas protenas expres-
sas na levedura so capazes de intera-
gir, o complexo resultante ativar a
transcrio dos promotores contendo
stios de ligao para o Gal4, gerando
uma colnia azul em meio contendo
um substrato apropriado (X-GAL). O
sucesso dessa metodologia foi primei-
ramente demonstrado pela interao
Gal4-Gal80 (Fig. 8).
Concluso
Desde a redescoberta das leis de
Gregor Mendel, cientistas comearam
a questionar a natureza do gene. Que
tipo de molcula seria o gene? Como
a informao contida em uma mol-
cula poderia ser transmitida para as
prximas geraes? Por que e como
apareceriam indivduos mutantes?
Apenas em meados do sculo XX,
com a descoberta da estrutura do
DNA por Watson e Crick, essas e
muitas outras questes comearam a
ser respondidas. Nas primeiras trs
dcadas aps a compreenso da es-
trutura do DNA, o conhecimento a
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 57

Figura 9 - Esquema dos plasm-
dios usados no sistema de
levedura de hbrido duplo. Os
plasmidios pAS2 e pACT2
contm as protenas de fuso de
ligao no DNA (DBD) e ativa-
o de transcrio (DAD),
respectivamente. Os genes Trp e
Leu permitem que a levedura
cresa em meio sem triptofano e
leucina. O gene Ap seleciona os
plasmdios em Escherichia coli.
HA a protena hemoaglutinina
e pode ser usada como protena
reprter de leveduras transfor-
madas
respeito de sua biologia cresceu fan-
tasticamente. Dentro desse perodo,
ficou conhecida a natureza qumica
dos genes, como a informao gen-
tica era armazenada, como as clulas
respondiam a essa informao e como
ela era transmitida de uma gerao
para outra.
A partir dos anos 70, cientistas
aprenderam a manipular a molcula
de DNA utilizando as tcnicas de bio-
logia molecular. Inaugurou-se a era da
tecnologia do DNA recombinante, tam-
bm denominada engenharia genti-
ca. Desde ento, a biologia molecular
tem experimentado grandes avanos
tecnolgicos que tm culminado em
importantes fontes de conhecimento
sobre a funo, expresso e regulao
de genes em diferentes organismos.
Trabalhos de isolamento, seqencia-
mento e caracterizao de um ou
poucos genes eram comumente pu-
blicados at a dcada de 90. Atual-
58 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
mente, um nico laborat-
rio pode seqenciar 1000
(ou mais) genes por dia.
Um pesquisador pode utili-
zar os dados gerados e che-
gar a concluses muito mais
precisas sobre a funo de
um gene em poucas sema-
nas de trabalho, do que
outro, em muitos meses de
trabalho, h alguns anos
atrs. Hipteses podem ser
testadas muito mais rpida
e precisamente. Est haven-
do um redirecionamento na
maneira como os grupos
conduzem seus projetos de
pesquisas na rea da biolo-
gia molecular. A primeira
fase dos chamados projetos
genoma, seqenciamento
de genes, est gerando uma
grande quantidade de informaes, as Figura 10 - Processo de seleo
quais sero provavelmente, multipli-
de leveduras contendo os
cadas com a implementao da se-
plasmdios pAS2 e pACT2 e
gunda fase, ou seja, com a anlise
seleo das leveduras contendo
funcional do material seqenciado.
interao entre as protenas X
Neste texto foram mencionadas meto-
e Y
dologias que tm por objetivo auxiliar
na identificao da funo gnica tan-
to em mbito bioqumico como biol-
gico. Entre elas, os microarrays tm aumento da qualidade nutricional,
revolucionado a anlise funcional de entre outras caractersticas de interes-
seqncias gnicas em grande escala, se econmico.
uma vez que diferenas nos nveis de
expresso de milhares de genes po- Referncias
dem ser detectados simultaneamente.
Desta forma, vrios genes ainda des- BENSEN, R.J.; JOHAL, G.S.; CRA-
conhecidos podero ter suas funes NE, V.C.; TOSSBERG, J.T.; SCHNA-
biolgicas desvendadas utilizando esse BLE, P.S.; MEELEY, R.B.; BRIGGS, S.P.
processo. Em um futuro no muito (1995). Cloning and characterization
distante, ao invs de se comprarem of the maize An1 gene. Plant Cell 7:
kits para construo de bibliotecas, 75-84.
sero compradas bibliotecas j arran- FEDEROFF, N.V.; FURTEK, D.B.;
jadas em matrizes, e o pesquisador NELSON, O.E. (1984). Cloning of the
testar sondas diferentes. Os resulta- bronze locus in maize by a simple and
dos sero organizados no mais em generalized procedure using the trans-
ESTs, mas em nveis de expresso posable element Activator (Ac). Proc.
desses genes sob diferentes condi- Natl. Acad. Sci. USA 81: 3825-3829
es. As metodologias de anlise g- SHEEHY, E.R.; KRAMER, M.; HI-
nica, tanto individuais quanto em lar- ATT, W.R. (1988). Reduction of poly-
ga escala, fornecero um acesso a galacturonase activity in tomato fruit
informaes sem precedentes para by antisense RNA. Proc. Natl. Acad.
todas as reas da biologia. Entre elas, Sci. USA 85: 8805-8809.
a agropecuria ser amplamente be- YANOFSKY, M.F.; MA, H.; BOW-
neficiada, uma vez que existe grande MAN, J.L.; DREWS, G.N.; FELDMANN,
necessidade de identificar e de estu- K.A.; MEYEROWITZ, E.M. (1990). The
dar genes que sejam responsveis por protein encoded by the Arabidopsis ho-
conferir resistncia a doenas, tole- meotic gene agamous resembles trans-
rncia a estresses biticos e abiticos, cription factors. Nature 346: 35-39.
 SEO DE CARTAS
Para entrar em contato com Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento voc pode enviar sua
correspondncia via Internet, fax ou carta para esta seo. A critrio do editor, as mensagens pode-
ro ser publicadas resumidamente. Nossos endereos so:
Redao de Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento: SRTV/Sul Quadra 701 Ed. Palcio do
Rdio II, sala 215 Cep 70340-902 Braslia DF Tel: (061) 225-1512 Fax: (061)224-2830
CARTAS Home-page: www.biotecnologia.com.br Email: kl3@biotecnologia.com.br

Prezados Senhores,
O motivo dessa mensagem solicitar
informaes. Fui escalado para uma
discusso sobre a MP2052 durante o
prximo EVINCI (Curitiba/PR - UFPR),
em uma mesa-redonda, na qual esta-
ro presentes representantes do IBA-
MA. Tenho acompanhado algumas
listas de discusso e percebo que o
desconhecimento sobre o assunto
geral, indo desde os alunos da gradu-
ao at o MCT e CNPq, que suspen-
deram os processos de projetos com
cooperao internacional at que os
advogados do IBAMA possam enten-
der a lei. Preciso de sugestes sobre
temas que podem ser discutidos. J
estou preparando uma pequena pau-
ta para meu discurso mas queria mais
sugestes. Aproveito o ensejo para
informar que produzo um boletim
enviado por e-mail para cerca de uma
centena de estudiosos da rea de
Ornitologia em todo o Brasil e vrios
pases da Amrica do Sul.
FERNANDO COSTA STRAUBE
Mlleriana: Sociedade Fritz Mller de
Cincias Naturais
E-mail: juruva@milenio.com.br
Prezado Sr.Fernando, Estamos dispo-
nibilizando um espao no nosso site,
denominado BIOCORREIO, para tro-
ca de informaes entre pesquisado-
res, portanto poder deixar essa sua
mensagem para que algum eventual
pesquisador entre em contato com
voc. Basta enviar novamente sua
mensagem A/C de Biocorreio do por-
tal www.biotecnologia.com.br.
Prezado Senhores,
Sou fruticultor de Mamo, Maracuj,
Banana, e algumas Cucurbitceas
como Abbora e Melancia. H algum
tempo j utilizo produtos como Meta-
rhizium anisopliae e Beauveria bassi-
ana, e tenho obtido excelentes resul-
tados. Vejo no processo de controle
biolgico uma sada saudvel para a
produo de alimentos e outros pro-
blemas sanitrios. Sou assinante da
revista biotecnologia e gostaria de dar
a minha participao, parabenizando
primeiramente, por este excelente tra-
balho. Como produtor, sinto que a
maioria dos colegas produtores no
conhecem nenhuma tecnologia de
controle fitossanitrio biolgico, e esto
extremamente bitolados com o uso de
controles convencionais qumicos.
Vejo a necessidade de mudar isso
mediante disponibilidade de informa-
es, o que procuro fazer um pouco
aqui em minha regio. Sinto que h
poucos produtos no mercado para
que possamos utilizar e no so bem
divulgados, sendo difcil para o pro-
dutor encontrar tais informaes. Os
produtos que, eventualmente, neces-
site manipular na prpria propriedade
para aplicao so muito rejeitados
pelo produtor por entenderem que
no h tempo e pessoal treinado para
isso. Assim, a minha opinio seria no
sentido de criarem uma coluna dentro
da revista onde disponibilizassem in-
formaes dos produtos existentes,
suas finalidades e formas de utiliza-
o.
Sem mais, subscrevo-me.
Atenciosamente
Hugo Yamada
Prezado Sr.Hugo,
Acusamos e agradecemos seu e mail,
assim como informamos que sua su-
gesto foi encaminhada.
Meu nome Ricardo Alexandre Gue-
des da Silva e sou universitrio. Curso
biologia, estou no 6 perodo, na UPE
e tenho conhecimento de informti-
ca/internet. Estou procurando vagas
de pesquisador (laboratrio) e quero
informaes sobre a rea.
Ricardo A.G da Silva
e-mail: fouly@uol.com.br
Prezado Ricardo,
No momento estamos disponibili-
zando um espao em nosso site na
Internet, por meio do Portal Biotec-
nologia chamado Biocurriculum,
espao no qual o senhor poder
disponibilizar o seu curriculum.
Caso tenha interesse, envie o seu
curriculum A/C da sesso Biocurri-
culum.
Prezado Sr.
Voc poderia me enviar o intervalo
de pginas do artigo Extraction of
DNA from Plants SOLUTIONS FOR
COMMONLY FOUND PROBLEMS
publicado na revista Biotecnologia
(volume 9, ano 1999)? Desde j, lhe
agradeo muito pela ateno!
Flavio Ayres
Prezado Sr. Flvio,
O artigo Extrao de DNA de plan-
tas - solues para problemas comu-
mente encontrados esto na edio
n 9 da Revista Biotecnologia. Pgs.
40, 41, 42, 43.
Vocs poderiam me informar sobre
o Dermanyssus, pois estou desen-
volvendo um trabalho universitrio
e no estou encontrando nada so-
bre esse assunto.
Desde j agradeo,
Fleury
fleuri@osite.com.br
Caro Sr. Fleury, todo o material que
dispomos encontra-se em nosso site.
Pedimos por gentileza que faa uma
pesquisa no nosso sistema de busca,
a fim de encontrar o assunto deseja-
do.

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 59

 FUNDAO GIACOMETTI
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na Pg. 31 da edio anterior (n16)

60 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

 MONSANTO
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na pgina 49 da edio anterior (n16)

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 61

 EMBRAPA
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na 3 Capa da edio anterior (n16)