PCR citogentica:

PCR viene de esta palabra que es reaccin en cadena de la polimerasa, y fue un descubrimiento
muy importante de Kary Mller, que le hizo ganar un premio nobel en 1993.
Esta tcnica en los laboratorios de todo el mundo es utilizada y nos permite amplificar pequeas
cantidades de DNA, en cientos y millones de veces. Esto es lo que nosotros logramos al hacer PCR;
amplificar un GEN.

Ventajas - desventajas
- El examen lo podemos obtener en el mismo da
- Tiene alta sensibilidad, que necesitamos una cantidad muy pequea de DNA (picogramos)
- En teora con PCR solo necesitamos una hebra de DNA para hacer PCR
- Tiene alta especificidad, solo vamos a apuntar al lugar especfico del genoma que
queremos desarrollar
- Es cualitativa, yo puedo tener presencia o ausencia del fragmento amplificado, pero no
puedo medirlo.

El PCR es bsicamente 3 pasos:

1. Denaturacin:
Todos sabemos que para que la polimerasa pueda replicar el DNA, es necesario separar las
hebras del DNA, y como en un tubo no podemos hacer eso, necesitamos hacerlo mediante
cambios de temperatura. Entonces para separar los puentes de hidrogeno que unen a las
hebras, nosotros necesitamos calor.
Entre 94 y 95C, por 30 segundos es suficiente para denaturar el DNA.

2. Alineamiento o hibridacin:
Ac nosotros bajamos la temperatura entre 45 a 65C que eso est dado por la secuencia
que tienen los partidores y es ac a e temperatura, son de los partidores van a ir a hibridar
por complementariedad de bases al lugar del genoma que nosotros queremos amplificar.
Las secuencias de partidores deben ser altamente especficos.
La temperatura ideal para el alineamiento es 5C menor que la de los partidores.

3. Extensin:
Ocurre a 72C porque la polimerasa necesita esta temperatura para activar la sntesis de
DNA, es decir, la incorporacin de los nucletidos en el extremo 3. Todos sabemos que la
sntesis de DNA y de mensajeros tambin, ocurre siempre en direccin 5 a 3, los
nucletidos van a ser incorporados en el extremo libre.
La TAQ para poder unirse y para saber dnde hacer sntesis necesita el DNA de doble
hebra, para que ella luego sintetice por complementariedad de bases la hebra
complementaria.

A todos estos pasos, se les llama un CICLO DE PCR, donde a partir de una molcula de
DNA, yo ya tengo dos copias de DNA.
Cuntos ciclos de DNA necesito, para poder trabajar con ellos? Entre 30 y 35 ciclos, y
con eso me aseguro de que voy a tener replicado, millones de veces el ADN.
 Qu reactivos necesito para hacer un PCR?

Nosotros para hacer una PCR necesitamos una mezcla de ciertos reactivos en un tubo:
- DNA molde; de frotis, mucosa oral, sangre, LCR, de DNA extrado de parafina, de biopsias,
de donde yo pueda obtener DNA, manteniendo la integridad del DNA.
- Partidores, Qu son los dNTPs? Son los nucletidos
- DNA polimerasa, que se active a los 72C
- Buffer que trae cada enzima y este buffer necesita de MAGNESIO, y eso es muy
importante porque el magnesio es un cofactor de la enzima, es decir, que la hace
activarse. Si no tiene magnesio, no se va a activar. El buffer le va a entregar las sales a la
enzima y al medio para que esta reaccin pueda ocurrir
- Agua, toda la reaccin necesita agua, para que en los cambios de temperatura este sea
amortiguado y no evaporado.

La TAQ necesita que agreguemos nucletidos artificiales para la sntesis del nuevo DNA y deben
estar en abundancia, los nucletidos se pueden encontrar como dNTPs o como
desoxirribonucletidos. Son 4 dNTPs y que incluyen a la adenina, guanina, citosina y timina.

Trabajamos a 10 Mm y hacemos una dilucin de 1:10, eso es suficiente para que la TAQ pueda
sintetizar nuevo DNA a partir de la adicin de dNTPs.

Entonces, el primer reactivo que nosotros necesitamos incorporar a la mezcla de PCR son los
nucletidos.
Otra parte super importante son los partidores, primer o cebadores, todos esos quieren decir lo
mismo y son especficos para la secuencia que se quieren amplificar. Si no es especifico, no sirve
para hacer PCR, yo necesito que hibride un rea del genoma y estos se unen por
complementariedad de bases al extremo 3 libre de cada hebra.
El primer hibrida en el extremo 3 del DNA molde, se una por complementariedad de bases y de
este modo l le dice a la TAQ polimerasa lo que debe sintetizar, y si no existe el DNA de doble
hebra no hay sntesis.

El partidor debe tener ciertas caractersticas:

- Tamao de 20 a 25 nucletidos, este tamao nos asegura que solo va a hibridar esa rea
del genoma.
- Que su temperatura este entre los 50 a 65C, temperatura media entre lo que esta la
denaturacin y la extensin.
- Tengan un contenido de GC (guanina y citocina) alrededor del 40 a 60%. Si yo tengo
mucho ms que eso, y va a costar la denaturacin y si es menor, habra menos puentes de
hidrogeno y es ms rpida esta denaturacin.

La TM
La temperatura de fusin del cebador (Tm) por definicin es la temperatura a la que la mitad del
ADN dplex se disociar para convertirse en monocatenario e indica la estabilidad dplex. Los
cebadores con temperaturas de fusin en el rango de 52-58 C generalmente producen los
mejores resultados
De los 20 a 25 nucletidos, yo cuento cuantas adeninas y timinas hay y las multiplico por 2, luego
cuento cuantas CG hay y las multiplico por 4, de esa forma yo s cul es la temperatura optima de
los partidores.
Qu nos indica la TM?
Es la temperatura en la cual se desestabiliza el 50% de los hbridos (DNA molde unido a un
partidor).

Evidentemente sin TAQ polimerasa, no es mucho lo que podemos hacer. Esta TAQ fue extrada de
una bacteria Termus Aquaticus que es una enzima termoestable que nos permite utilizarla a
72c.
Si nosotros utilizramos la TAQ polimerasa humana, a Qu temperatura se usara? A 37C, pero
esa temperatura no nos sirve, porque si yo aumento la temperatura a 94C para denaturar el DNA,
se nos degradara. Entonces necesitbamos una enzima que fuera estable a temperaturas altas,
para eso utilizaron esta bacteria la cual vive en aguas calientes, como en los geiseres.
Y ella requiere para iniciar la sntesis un DNA bicatenario, y esto lo logramos hibridando la cadena
molde con los primers.

Y como les contaba, requieren de magnesio, porque el cloruro de magnesio acta como un
cofactor para la enzima, es echo se va a ir a unir al sitio cataltico de la enzima, permitiendo su
activacin. Entonces si no tenemos cloruro de magnesio, es probable que este PCR no sea
eficiente, puede que sea eficiente, pero no la cantidad que nosotros necesitamos.

De todos los componentes antes mencionados, la mayora se degrada, a excepcin del cloruro de
magnesio.

Entonces nosotros tenamos todos estos reactivos en un tubo, con primers, la TAQ, dNTPs, tampn
buffer, DNA molde con agua.
Qu hacemos con este tubo? Para obtener estos ciclos de en base a cambios de temperatura,
necesitamos un termociclador, y donde ponemos los tubitos.
Este equipo tiene una pantalla digital, y donde nosotros le podemos decir al termociclador que
temperaturas necesitamos para nuestros ciclos de PCR.

Entonces, Cmo podemos ver la calidad de este producto de PCR?

Para eso utilizamos la electroforesis en gel de agarosa, tambin se puede ocupar poliacrilamida,
pero . En cambio, de agarosa, hacemos un gel y en 20 minutos lo corremos por las bandas de
PCR.

Porque se ocupa agarosa?

La agarosa es extrada del AGAR de las algas y tiene la cualidad de gelificar, es igual que hacer
jalea.
Este gel es sumamente poroso y que va a estar dado por la concentracin de este gel de agarosa,
donde estos poros van a tener diferentes tamaos, y separa el DNA que viene del PCR por tamao,
por un campo elctrico.
Recordemos que el DNA tiene carga negativa, por los grupos fosfatos, y eso al migrar por un
campo elctrico, el DNA migra desde el polo negativo al positivo, en ese paso yo lo puedo separar
por tamao. Entonces los DNA de mayor tamao van migrar mucho menos, que los que tienen
menos tamao.

Qu quiere decir que mi gel de agarosa este al 2%?

Que yo agrego 2 gramos de agarosa en 100 ml de buffer que se compran.
Yo caliento esto al microondas, fundo la agarosa, permito que se homogenice y listo.
El gel de agarosa esta siempre a ese %?
Eso depende, si yo tengo un DNA muy grande, necesito que los poros sean ms grandes, y para
lograr eso, le agrego menos agarosa al buffer.

Si yo tengo 200 pb, los poros deben ser ms pequeos, entonces hago una agarosa del 2.5% al 3%
de concentracin y nos van a permitir los fragmentos.

Estos agares de compran, y ellos nos aseguran ciertos tamaos de pares de bases, por el cual yo
puedo extrapolar mi producto de PCR. Entonces es importante el uso de agares, porque uno
puede estimar, la concentracin ms o menos a la cual tengo mi muestra.

Como sabemos, hay mltiples usos de la PCR en el laboratorio donde uno

trabaja.

Principalmente los que yo les hablare, el primero es la EXPRESION GENICA, del que yo puedo ver
cuntos mensajeros ms se producen por ejemplo y la deteccin de deleciones puntuales/
polimorfismos.

Qu son los polimorfismos?

Los SNPs, es el cambio de una base del genoma por una frecuencia allica mayor al 1%, si es
menor al 1% es una mutacin ese cambio de base.

Tenemos varias variantes:

Alguien seco en PCR, puede hacer PCR mltiple, porque es una PCR donde uso hasta 8 primers, es
decir, que debo estar pendiente de que todos esos partidores tengan las mismas temperaturas.
Esto puede servir para un GEN con MULTIPLES bandas.
Obtener estos PCR, les aseguro que es un trabajo por ejemplo, se puede amplificar varias
regiones, para diferentes bacterias.
Entonces si yo tengo un cultivo de un paciente, que tiene por ejemplo neumona, hago distintos
partidores para bacterias que pudiesen producir neumona, y de esa forma yo s que bacteria
afecta al paciente y cual no. Podemos ver que gen esta deletado y cual no est deletado, y esas
cosas podemos verlas con PCR MULTIPLE.

Nested- PCR o PCR anidada:

Muchas veces nos pasa en el laboratorio, que los partidores que yo tengo no son especficos. Y
como el ADN tambin tiene estructuras secundarias, no permite una buena hibridacin del
partidor, entonces para eso nosotros necesitamos de dos partidores, entonces hago un PCR con
un partidor, y luego con este producto de PCR hago otro PCR con el segundo partidor.

Entonces en el segundo PCR, agrego el producto de PCR anterior, no ADN solo. Hago dos PCR
consecutivos, pero en el segundo PCR en vez de agregar DNA, mi molde va a ser un producto de
PCR.
RT-PCR o la transcriptasa reversa:
La transcriptasa reversa es la enzima que nosotros vamos a utilizar, esta sintetiza DNA de doble
hebra a partir de RNA monocatenario.
Entonces por ejemplo si estoy trabajando con lneas celulares, en vez de usar DNA, uso RNA y
utilizo esta retrotranscriptasa.
Con esta tcnica puedo hacer un PCR cuantitativo y saber cuntos ms tengo expresin de un gen,
comparando una clula con otra.

****** En el VIH, Entonces de esta forma un RNA es pasado a DNA el cual ingresa al ncleo e
infecta a la clula.

PCR en tiempo real:

Quiere decir, que yo en cada ciclo de amplificacin puedo tener una lectura, no es como el PCR
convencional tengo que hacer los 30 a 35 ciclos, en cambio en tiempo real NO. El termociclador de
tiempo real es diferente, porque en cada ciclo de amplificacin va a tener una lectura, esta lectura
se da con un fluoroforo, y este al mezclarlo con un lser da una seal de fluorescencia, la cual es
captada por este equipo.
Entonces este termociclador lee el termino de cada ciclo de PCR, entonces mientras ms copias de
DNA HAY, mas fluorescencia va a haber.
Y con esto puedo ver la expresin gnica del mensajero, y poder comparar. Entonces esta tcnica
no la vamos a ver en un gel, sino que en el mismo computador.

Ac lo que yo extraigo no es c-DNA, sino que extraigo los mensajeros de mi clula y a partir de los
mensajeros de la clula yo sintetizo c-DNA, y ah puedo hacer PCR en tiempo real, entonces yo
tengo todos los RNAs que estaban en las clulas, por ejemplo, dos lneas celulares diferentes y ah
yo comparo que clulas presenta ms mensajeros que otra.

Cmo puedo ver que una clula exprese ms mensajeros que otra? Al ir a ver estas curvas, si la
curva aparece tempranamente quiere decir que el nmero de copias es mucho mayor que la de la
otra lnea celular.

Ac como estamos trabajando con fluorescencia, el equipo mide as necesitamos tener algo que
muestre esa fluorescencia, las principales son:
- SYBR GREEN: que es un agente intercalante de doble hebra
- Sondas taqman

El SYBR GREEN son molculas que se intercalan con el DNA de doble hebra y este SYBR GREEN yo
lo agrego a mis mezcla de PCR que tena anteriormente , este no emite fluorescencia cuando hay
DNA monocatenario, pero cuando la TAQ comienza a sintetizar este se intercala entre los puentes
de hidrgenos, entonces cuando la TAQ amplifico el segmento este equipo en el ciclo va a dar
laser a cada tubo, y mide la cantidad de fluorescencia; es decir, cuanto se incrementa esta
fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de DNA.
La desventaja que tiene este reactivo es que se une a todo tipo de DNA de doble hebra, hay dos
formas de que los partidores sean ineficientes:
- Los partidores son dos secuencias de DNA diferentes
- O que a uno de los partidores se le haga horquilla y no se le pueda unir el DNA.
Entonces podramos sobreestimar lo que quisimos medir.

Sondas Taqman:
Esta tcnica permite genotipar distintas muestras y tener una discriminacin allica, es decir, yo
puedo saber en qu parte del genoma tengo el alelo A y en que parte del genoma tengo el alelo B.
Y as yo puedo detectar SNPs o mutaciones.

Ac nosotros tenemos 2 partidores, un FORWARD y un REVERSE, igual que en pcr convencional, un

DNA molde igual que en PCR convencional, tenemos TAQ y dNTPs igual a PCR normal. Lo que
cambia son las sondas, ac hibridan los partidores y aparte hibridan a las sondas que tienen la
particularidad de tener estar dos molculas que vemos ac.

La R es un reportero, que emite fluorescencia y un Quencher cuando esta sonda esta integra,
no emite fluorescencia, pero cuando hay sntesis de DNA y al partidor se le uni la TAQ,
tiene actividad exonucleasa 5 a 3, es decir, se uni la TAQ y empez a sintetizar y
cuando se encuentra con la sonda que esta hibridada la degrada, la actividad exonucleasa, quiere
decir la degradacin de RNA O DNA, entonces la TAQ se posiciona ac y cuando se encuentra con
este DNA de doble hebra lo degrada.
Al degradarse, el fluoroforo se libera del Quencher, de este modo, el fluoroforo empieza a emitir
fluorescencia cuando lo estimula el lser, entonces en cada ciclo hay un clivaje corte de la sonda
por la liberacin del fluoroforo y obtendremos estar curvas.

Donde por ejemplo estas curvas, pueden ser para genotipar, por ejemplo, el ALELO T Y ALELO C.
entonces yo s, que mi paciente solo tiene alelo C, porque solo sube esta sonda.