muestras biolgicas mediante una variedad
Comparacin entre un mtodo
espectrofotomtrico y un mtodo de
cromatografa lquida de alta presin
para determinar el triptfano en
productos alimenticios
Jonathan W. DeVries, * Catherine M. Koski,
David C. Egberg y Paul A. Larson
Se hace una comparacin entre un mtodo
espectrofotomtrico y una cromatografa
lquida de alta presin
(LC) mtodo para el contenido de
triptfano de una variedad de
alimentos. El mtodo
espectrofotomtrico tiene una RSD de
2.53%. El mtodo de LC tiene una
RSD de 2,03% con una recuperacin
de 95,5 f 2,4% para muestras
enriquecidas.
El contenido medio de triptfano de 18
muestras por el mtodo
espectrofotomtrico fue del 0,38%, y el
del mtodo LC fue del 0,35%.
Entre los principales desafos que enfrenta
el qumico de alimentos en la actualidad se
encuentra la necesidad de mtodos ms
precisos y rentables para el anlisis de
nutrientes. La espectrofotometra y / o la
cromatografa lquida de alta presin (LC)
cuando se combinan con la preparacin de
muestras y los procedimientos de tratamiento
adecuados cumplen estos criterios.
Uno de los aminocidos nutricionalmente
esenciales, el triptfano, ha sido analizado
por una variedad de mtodos en el
pasado. Estos mtodos han sido revisados
por Friedman y Finley (1971). Uno de estos
mtodos, estudiado a fondo por Spies
(1967), que utiliza la hidrlisis Pronasa, deriv-
atization con p- benzaldehdo
(dimetilamino), y medicin
espectrofotomtrica parece ser muy
adecuado para productos alimenticios. El
triptfano tambin se midi mediante LC en
de mtodos. Estos incluyen separacin en
empaques de copolmeros (Lefebvre et al.,
1977, 1978; Kroeff y Pitrzyk, 1978),
derivatizacin y deteccin colorimtrica y / o
fluoromtrica (LaPage et al., 1979; Hsu y
Currie, 1978; Margolies y Brauer, 1978).
Lammens y Verzele, 1978; Van Beeumen et
al., 1978; Jornvall et al., 1978; Furukawa et
al., 19771, deteccin fluoro-romntica directa
(Anderson y Purdy, 1977, 1979; Geeraerts et
al., 1978; Krstulovic y otros, 1977a, Meek y
Neckers, 1977; Graffeo y Karger, 19761, y
otros (Rustun, 1978; Hancock y otros, 1979;
Riley y otros, 1979; Krstulovic et al., 1978;
Molnar). y Horvath, 1978; Knudson et al.,
1978; Grushka et al., 1977). De estos
mtodos, la cromatografa de fase inversa
junto con la deteccin fluoromtrica directa
parece ser el mtodo ms viable para los
productos alimenticios.
Los aminocidos distintos del triptfano se
anailizan rutinariamente mediante
cromatografa de intercambio inico
despus de cido
hidrlisis (Wall y Gehrke, 1976). Bajo estas
condiciones, el triptfano es lbil y
generalmente debe analizarse
por separado. Esto generalmente se realiza
usando hidrlisis bsica o hidrlisis cida
mientras se protege el triptfano con un
antioxidante seguido de anlisis de
intercambio inico bsico en un analizador
de aminocidos, espectrofotometra
ultravioleta o fluorometra (Peters y Berridge,
1970; Berridge et al., 1971; Wapnir y
Stevenson, 1969;. Wilinson et al, 1976;
Eftnik y Ghiron, 1976; Hassan, 1975; Lewis
et al., 1976;
Medallion Laboratories, General Mills, Inc.,
Minneap-olis, Minnesota 55427.
Spackman et al., 1958). Lo que se buscaba,
por lo tanto, era un mtodo para
complementar el mtodo del ion-ex-change
del analizador de aminocidos y cuantificar
el triptfano de manera precisa y eficiente. El
mtodo espectrofotomtrico fue una
modificacin del de Spies (1967). El mtodo
LC desarrollado utiliza la hidrlisis
desarrollado por Spies y la separacin y
cuantificacin similares a los utilizados por
Krstulovic et al. (1977a) para muestras de
suero.
SECCION EXPERIMENTAL
Aparato. Espectrofotmetro: Absorbancia
lineal, Modelo 6120A (Coleman, Norwalk, CT
06856). Bomba: Modelo llOA, flujo constante
(Altex, Berkeley, CA 94710). Columna: F-
Bondapak CI8 (Waters Associates, Milford,
MA 01757) o Lichrosorb RP-18
(Altex). Inyector: Autosam-pler LC 420
equipado con un bucle de 20 pL (Perkin-
Elmer, Norwalk, CT 06856). Detector:
Espectrofluoromonitor LC650-10 (Perkin-
Elmer); excitacin a 295 nm con un ancho de
rendija de 12 nm y emisin a 320 nm con un
ancho de rendija de 12 nm.
Materiales. Tampn fosfato
(pH 7,5). Sodio phosphat dibsico
(Na2HP04) (4,40 g) y fosfato de potasio
monobsico (KH2P04) (4,40 g) se
disolvieron y se diluyeron a 1 l con agua. El
pH fue verificado y ajustado a 7.5 si es
necesario.
Pronasa Solution (4 rng / ml). Pronase
(Calbiochem) segundo grado, 45 X lo3PUK /
g; Calbiochem, La Jolla, CA 92037) (100 mg)
se coloc en un matraz volumtrico de 25 ml,
y el matraz se llev a volumen con tampn
de fosfato. La mezcla se prepar justo antes
de su uso. NOTA: Como la solucin
permanece turbia, se agit antes de
agregarla a cada muestra.cido
sulfrico (21,2 N). Concentrado H2SO4 (142
ml) se aadi en porciones de 25 ml a 85 ml
de agua destilada mientras se haca girar el
matraz bajo agua fra del grifo. La solucin se
enfri a temperatura ambiente antes de su
uso.
p- (Dirnethylarnino)
benzaldehdo (DAB). DAB (0.94 gramo) se
disolvi y se llev a un volumen de 250 ml
con cido sulfrico 21,2 N. La solucin se
prepar justo antes de su uso.
El nitrito de sodio (0.048%). El nitrito de
sodio (24 mg) era disuelto y llevado a un
volumen de 50 ml con agua destilada.
Estndares de triptfano. Para una
solucin de stock (1 mg / mL), se disolvieron
100 mg de L (-) - triptfano y se llevaron a
un volumen de 100 mL con solucin tampn
de fosfato. Un
Determinacin de triptfano en productos
alimenticios
el bao ultransnico no calentado se us
para ayudar a la solucin.
Soluciones
estndar (200,100,50,25,20 y 5 pg / ml). Se
realizaron diversas diluciones de la solucin
madre usando pipetas apropiadas y
matraces volumtricos y diluyendo a
volumen con tampn de fosfato.
Fase mvil. Un gramo de acetato de sodio
se disolvi en aproximadamente 100 ml de
agua destilada. Se agregaron ochenta
mililitros de acetonitrilo y la solucin se llev
a 1000 ml con agua destilada. El pH se
ajust a 4,0 con cido actico.
Preparacin de la muestra . Las muestras
secas se molieron y / o pulverizaron para
pasar a travs de un tamiz de malla 40.
Procedimiento de hidrlisis. Una porcin
de muestra que contiene aproximadamente
25 mg de protena se pes en un matraz
aforado de 10 mL. Cuando se us el mtodo
espectrofotomtrico, se pipetearon 2,0 ml de
cada uno de los tres estndares (200, 100 y
20 pg / ml) en matraces aforados de 10 ml.
UN Se pipete una cantidad de 1,0 ml de
solucin de Pronasa en cada uno de los
matraces, as como un matraz vaco para
usar como pronasa Pronasa (Pronasa
misma libera triptfano durante la
hidrlisis). Los matraces se colocaron en un
bao ultrasnico hasta que se
humedecieron las muestras, y despus se
aadieron 2 gotas de tolueno y los matraces
se colocaron en un 40 f 1 "bao C durante 24
h. Despus de enfriar a temperatura
ambiente, la pieza en bruto, las muestras , y
los estndares se llevaron al volumen con
tampn de fosfato.
Mtodo espectrofotomtrico Una cantidad
de 8,0 ml de solucin de DAB cida se
pipetea en un tubo de ensayo grande (15 mm
DI x 150 mm). Una parte alcuota de 2,0 ml
del hidrolizado se pipete en tubo de ensayo
thie, y los contenidos se mezclaron en un
agitador de vrtice. Los tubos se taponaron y
se colocaron en la oscuridad durante al
menos 6 h (generalmente durante la
noche); Despus, se aadieron 0,1 ml de
solucin de nitrito de sodio al tubo de
ensayo, y el tubo se mezcl de nuevo en un
mezclador vortex y luego se apart durante
30 minutos para permitir el desarrollo del
color. Si es necesario, las soluciones se
filtraron a travs del papel Whatman GFA. El
espectrofotmetro se puso a cero utilizando
una solucin de 8,0 ml de 21,2 N H2SO4,2,0
ml de tampn fosfato y 0,1 ml de solucin de
nitrito sdico a 590 nm. La absorbancia de
las muestras, patrones y blanco se ley a
590 nm. En los casos en que se hidroliz el
hidrolizado, se prepar un blanco de muestra
mezclando 2,0 ml de hidrolizado con 8,0 ml
de H2SO4 21,2 N y se midi su absorbancia.
Clculos (1) La absorbancia del blanco de
muestra se rest de la absorbancia de la
muestra cuando corresponda.
(2) El espacio en blanco de Pronase se resta
de la absorbancia de las muestras y
patrones. (3) Las absorbancias corregidas de
los patrones se trazaron frente a la cantidad
de microgramos de triptfano presente en el
matraz volumtrico (Le., 400, 200 y 40
pg). (4) Las cantidades de microgramos de
triptfano en la muestra se determinaron a
partir de la grfica.(5) El porcentaje
triptfano = O.lT/S, dnde T = micro-gramos
de presente triptfano, S = Miligramos de
muestra, y 0,1 = 70 conversin veces factor
de conversin de microgramos a miligramos.
Mtodo LC. La separacin y la
cuantificacin fueron llevado a cabo con un
flujo de 1.5 ml / min. El triptfano se eluy a
los 2.5-4 min. Se inyectaron veinte
microlitros de cada uno de los estndares
(50, 25 y 5 pg / ml), al igual que 20 l del
blanco de Pronasa y cada uno de los
hidrolizados de muestra. El triptfano se
cuantific como
donde C = concentracin del estndar en
microgramos por
J. Agric. Comida Chem., Vol. 28, No. 5, 19
80 897
mililitro, W = Peso de la muestra en
miligramos, Px = altura del pico de la
muestra, PB = altura del pico de blanco,
y $ = Altura del pico de la norma.
RESULTADOS Y DISCUSIN
La tcnica de hidrlisis descrita
anteriormente fue muy directa y se llev a
cabo con una cantidad mnima de esfuerzo
manual. Una variedad de muestras fueron
analizadas por el mtodo
espectrofotomtrico por duplicado; los
resultados se muestran en la Tabla I. Como
puede verse, el mtodo es muy
reproducible. El coeficiente de variacin
agrupado fue del 2,53% relativo para las 10
muestras realizadas por duplicado. Esto
concuerda con los resultados de Spies
(1967).
Se realiz una comparacin entre el
mtodo espectrofotomtrico y el mtodo
LC; los resultados se muestran en la Tabla
11. Como se puede ver, los resultados
obtenidos de los dos mtodos estn en buen
acuerdo; es decir, la diferencia entre los
medios fue solo del 0.03%. Muestras no. 4 y
5 dieron hidrolizados que eran muy
altamente coloreados. Este color puede
haber afectado el valor final obtenido
espectrofotomtricamente, a pesar de que
un blanco de muestra fue subcontratado. Si
las muestras no. 4 y 5 se omiten del
conjunto de datos, la media por el mtodo
espectrofotomtrico es 0,28790 y que por el
mtodo LC es 0,283% o una diferencia de
0,004% con una correlacin de 0,988.

Un nmero de muestras
eran adems analizado por duplicado
por LC. Los resultados se muestran en la
Tabla 111. Tambin se muestran en la Tabla
I11 los resultados de un estudio de
recuperacin. Una cantidad de triptfano de
la misma magnitud que la encontrada en el
898 J. Agric. Food Chem., Vol. 28, No. 5,
1980

Tabla 111. Reproducibilidad y

recuperacin obtenidos para
el anlisis de triptfano por un medio de
anlisis por duplicado.

Figura 1. Cromatogramas de (a) estndar

de triptfano 50 pg / ml, (b) Pronasa en
blanco, y (c) levadura hidrolizada.

la muestra se aadi a la muestra antes de

la etapa de hidrlisis de Pronasa. Como
puede verse, la reproducibilidad del mtodo
es muy buena, dando un COV combinado
de = k2.03% relativo. Los resultados de
recuperacin tambin fueron buenos, es
decir, 95,5 f 2,4% para los productos
analizados.

Los resultados del estudio indican que el

mtodo LC se compara favorablemente con
el mtodo colorimtrico publicado. El mtodo
LC es considerablemente ms fcil y lleva
menos tiempo. La cuantificacin es sencilla,
ya que los cromatogramas generalmente
contienen solo otro pico adems del pico de
triptfano (ver Figura 1).