UNFV - 2017 LABORATORIO DE CULTIO CELULAR Y TEJIDOS VEGETALES

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO

VILLARREAL
UNFV
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
Y MATEMATICA
FCCNM
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA

Conteo celular

INTEGRANTES: Garate del Carpio, Jorge

Rivera Castromonte, Marleni.
Rodriguez Carrascal, Hazel

AO: 5 ao.

ASIGNATURA: Cultivo celular y tejidos vegetales

DOCENTE: lvaro Marcelo

2017
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PRACTICA M 1: CONTEO CELULAR

1. INTRODUCCIN

Una de las dificultades para el recuento al microscopio es obtener una buena reproducibilidad,
por lo cual es importante saber seleccionar el tamao de la muestra, la dilucin, el tipo de
cmara de recuento, el objetivo del microscopio y la tcnica de llenado de la cmara. En algunos
casos, puede ser necesario corroborar el volumen de la cmara que se est utilizando. Para
realizar el recuento celular se han diseado diferentes cmaras que contienen un volumen
determinado de muestra entre una lmina y una laminilla rgida (cubreobjeto especial) colocada
sobre plataformas laterales a una altura establecida (Alfonso y Leal, 1998). La que se usa con
mayor frecuencia para cultivos es el hematocitmetro de 0.1 mm de profundidad con reglilla de
Neubauer, que se reproduce en la Figura 1.

En la Tabla 1 se dan las principales caractersticas de las cmaras ms comunes y posteriormente

se especifican los clculos para obtener la concentracin celular. En la mayora de los
laboratorios, la cmara de recuento que se utiliza es el hematocitmetro de 0.1 mm de
profundidad con reglilla de Neubauer, la cual consta de 9 cuadrados con lados de 1 mm (rea
total de recuento = 0.9 mm2 ), cada uno de los cuales corresponde a un volumen de 0.1 L. Los
cuatro extremos estn subdivididos en 16 cuadros pequeos. El cuadro central contiene 25
cuadros, cada uno con un rea de 0.04 mm2 (0.2 mm x 0.2 mm), a su vez divididos en 16 cuadros
ms pequeos (Fig. 1). Para clulas ms grandes de 6 m y con cultivos relativamente poco
concentrados, se aconseja que el recuento se haga en los cuatro cuadros marcados como A, B,
C y D, aunque en varios laboratorios se prefiere contar por lo menos un cuadro adicional,
seleccionado cada vez a azar. Cuando las clulas son pequeas y la concentracin de los cultivos
es muy alta, es preferible utilizar cinco cuadros menores del cuadro central marcado con X.

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1.2 Clculos de recuento celular

Si se contaron todas las clulas presentes en los 4 cuadros de 1 mm2 marcados como A, B, C y
D, la concentracin celular se calcula de acuerdo a la frmula:

C = N 104 dil

En donde:

C = cl/mL N = promedio de clulas presentes en 1 mm2 (0.1 L)

dil = factor de dilucin (cuando se consider necesario diluir la muestra.

Es importante aclarar que si se us 1 mL de muestra y 9 mL de agua sin clulas, el volumen total

es 10 mL y el factor de dilucin es = 10. Esta dilucin se define como uno en diez -1:10-. NOTA:
Esta aclaracin se debe a nuestra observacin que frecuentemente se agregan 10 mL de agua a
1 mL de muestra y se usa 10 como factor de dilucin lo que esto no es correcto).

10 4 = factor de conversin de 0.1 L a 1 mL

Si las clulas se contaron en el cuadro central (25 cuadros) considerando solo los 5 cuadros
menores del cuadro central marcado con X, la concentracin celular se calcula de acuerdo a la
siguiente frmula:

C = [ (N / 4) / 10-6 ] dil.

En donde:

C = cl/mL

N = promedio de clulas presentes en los 5 cuadros pequeos del cuadro central

4 x 10-6 = corresponde al volumen de la muestra expresado en cm3 (mL) sobre el rea de los
cuadros pequeos la cual equivale a 0.004 mm3 (0.004 L) (0.2 x 0.2 x 0.1)

dil = factor de dilucin

2. OBJETIVOS

o Conocer el mtodo de sales de tetrazolium de segunda generacin (XTT).

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o Calcular el nmero de clulas en cada cultivo.

o Conocer el manejo de las cmaras de Neubauer para conteo celular.

3. MATERIALES

o Cultivo de clulas de cerebro - 7 neonatos

o Solucin salina
o Cmara de Neubauer
o 10 tubos eppendorf
o Centrifuga
o Microscopio

4. METODOLOGA

1. Los cultivos celulares fueron tratados con XTT utilizando dos tcnicas; la primera con
clulas adheridas a la superficie y la segunda con clulas en el sobrenadante.
2. Agregar a cada pocillo de cultivo con clulas adheridas 200 ul de solucin salina.
3. Escoger 5 pocillos de cada tipo de cultivo y colocar en tubos eppendorf.
4. Centrifugar a 1700 rpm x 10 minutos.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender.
6. Coloca 20ul de la solucin en la cmara de Neubauer.
7. Observar a microscopio para el conteo celular.

5. RESULTADOS

El conteo celular se realiz en cuatro cuadrantes de 50 um de rea.

POCILLOS 1 CONTEO 2 CONTEO 3 CONTEO 4 CONTEO PROMEDIO

A3D 41 59 49 58 207
A4D 120
A5C 229 236 256 217 938
A6A 0 0 0 0 0
A7C 0 3 4 1 2
S3D 135
S4D 175
S5C 0 0 0 0 0
S6A 0 0 0 0 0
S7C 24

En los pocillos A6A, S5C y S6A no hay presencia de clulas, de los dems pocillos se calcul un
aproximado del nmero de clulas en el cultivo.

Para el conteo celular se utiliz un rea de 50 um x 200 um y de 0.1 mm de altura.

rea de trabajo (A)

A = 50um x 200um = 10 000 um2

Convertir um2 en mm2

10 000um2 = 10-2 mm2

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Volumen de trabajo (V)

h = altura = 0.1 mm

V = A x h = 10-2 mm2 x 0.1 mm = 10-3 mm3

POCILLO A3D

Aproximacin 1

207 103 3
= /
103 3 1

El total de sobrenadante fue de cada pocillo utilizado en el conteo fue de 50 ul.

1
50 = 50 103 =
103

Nmero de clulas en el pocillo A3D

5 102
207 106 = 2.07 106 5

= . .

CONTEO CELULAR POR POCILLO

POCILLO CONTEO EN 50 UL.

A3D 10.35 x 106 cel.

A4D 2.4 x 106 cel.
A5C 18.76 x 106 cel.
A6A 0 ce.
A7C 0.04 x 106 cel.
S3D 2.7 x 106 cel.
S4D 3.5 x 106 cel.
S5C 0 cel.
S6A 0 cel.
S7C 0.48 x 106 cel.
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6. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES

Realizar contos celulares mediante la cmara de neubauer es un mtodo de menor costo en

comparacin a utilizar la densidad ptica de las clulas segn las suspensiones para poder
realizar el conteo mediante un valor ya conocido, sin embargo este tambin muestra un margen
de error como las otras tcnicas que se usan para el recuento. Sin embargo en esta prctica el
mtodo empleado nos permiti poder realizar un conteo dndonos as que El mayor nmero
de clulas se obtuvo en el cultivo de clulas adheridas del pocillo A5C con 18.76 x 106 cel.
Siguiendo el pocillo A3D con 10.35 x 106 cel. y el nmero menor en el pocillo A7C.

De los 10 pocillos evaluados 3 no contaron con crecimiento celular, 1 del cultivo de clulas
adheridas y 2 del pocillo de sobrenadante.

En los pocillos que no se encontraron clulas tuvieron gran cantidad de bacterias,

probablemente consumieron los nutrientes del medio y no permitieron en crecimiento celular.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

ALFONSO, E. y Leal, S. (1998). Creacin y Mantenimiento de un Cepario de Microalgas.

Centro de Investigaciones Marinas, Universidad de La Habana. Habana, Cuba. 21 pgs.

GUILLARD, R.R.L. (1973). Division rates. En: Handbook of Phycological Methods. Stein,
J.R. (ed.). Cambridge University Press, Cambridge, 289-312 pp.

GUILLARD, R.R.L. y Sieracki, M.S. (2005). Counting cells in cultures with the light
microscope. En: Algal Culturing Techniques. Andersen, R.A.

SCHOEN, S. (1988). Cell counting. En: Experimental Phycology. A Laboratory Manual.

Lobban, C.S., Chapman, D.J. y Kremer B.P. (eds). Cambridge University Press. 16-22 pp