Crecimiento folicular en ovarios

bovino y desarrollo correlacionado

con la expresion de acido
lipofosfatdico

Resumen.
La base de la una reproduccin exitosa es un crecimiento folicular apropiado. Adems de la
presencia de prostaglandinas y del factor de crecimiento endotelio vascular, se sugieren varios
factores nuevos como importantes reguladores del desarrollo y crecimiento folicular: PGES, TGF,
CD36, RABGAP1, DBI, y BTC.

Este estudio se enfoca en examinar esos factores en las clulas de la granulosa y de la teca que se
originan de diferentes tipos de folculos ovricos y su vnculo con la expresin de cido
lipofosfatdico (LPA), conocido regulador local de las funciones reproductivas en la vaca.

Los folculos ovricos fueron divididos en sanos, transicionales y atrsicos. Los niveles de expresin
del mRNA de la PGES, TFG, CD36, RABGAP1, DBI y BTC en las clulas de la granulosa y de la teca en
diferentes folculos ovricos fueron medidos mediante PCR en tiempo real. Las correlaciones entre
la expresin de enzimas sintetizadoras de LPA, receptores de LPA y factores examinados fueron
medidos. La inmunolocalizacin de PGES, TFG, CD36, RABGAP1, DBI Y BTC fueron examinados por
inmunohistoqumica.

Investigamos la expresin de mRNA dependiente de los factores potencialmente involucrados en

el desarrollo y crecimiento folicular ovrico, ambos en las clulas de la granulosa y de la teca en
folculos ovricos bovinos. Fuertes correlaciones entre los receptores de LPA, enzimas
sintetizadoras de LPA y los factores examinados en folculos transicionales y sanos fueron
observadas con una fuerte intercomunicacin con TFG, DBI y RABGAP1 en las clulas dela
granulosa y TFG en la clulas de la teca; mientras que en folculos atrsicos no fueron detectadas.
Un gran nmero de correlaciones fueron encontradas en las clulas de la teca en comparacin a
las clulas de la granulosa, as como en los folculos sanos y folculos transicionales fueron
observadas. Esta informacin indica el papel del LPA en el crecimiento, desarrollo y fisiologa del
folculo ovrico bovino.

1. introduccin
El folculo preovulatorio es considerado la unidad limitante del ovario en la reproduccin exitosa.
El papel principal del folculo preovulatorio es proveer al oocito de las condiciones apropiadas para
su desarrollo y crecimiento. Basado en la relacin Estradiol: Progesterona (E2:P4), los folculos
ovricos pueden dividirse en tres grupos: Sanos, transicionales y atrsicos. El folculo ovrico
incluye dos tipos principales de clulas, de la granulosa y de la teca, las cuales son responsables de
nutrir a los oocitos hasta la ovulacin y liberacin de oocitos maduros con la capacidad de producir
un embrin. La apropiada diferenciacin de las clulas de la teca y granulosa es requeridas para el
apropiado desarrollo de folicular y el proceso de ovulacin. Entre varios factores regulando estos
procesos en varias especies son las prostaglandinas, factor de crecimiento endotelio vascular, y un
nmero de factores con funciones conocidas que son importantes para el desarrollo folicular y
ovulacin: prostaglandina E sintasa (PGES) TRK-Fused gen TFG, receptor a trombospondina (CD36),
protena activadora de GTPasa en conejo 1(RABGAP1), molcula inhibidora a la unin a diazepam
y la betacelulina (BTC). La prostaglandina E sintasa en una de las enzimas que metabolizan el cido
araquidnico y es crucial en el proceso ovulatorio en ganado. El TRK-Fused gen fue originalmente
identificado como parte de los genes de fusin oncognica involucrados en la promocin de
tamao del CCO en ratn. El receptor a trombospondina es un factor de crecimiento autocrino
que puede regular el crecimiento celular, adhesin y angiognesis. La protena activadora de
GTPasa de conejo 1 es una nueva GTPasa que puede tener funcin en el ovario. Presente en el
ovario de rata, la DBI estimula la estereoideogenesis y la biosntesis de pregnenolona. La
betacelulina es uno de los miembros de la familia de factores de crecimiento similares a EGF, los
cuales son importantes mediadores de la actividad de la hormona luteinizante. La expresin de os
factores antes mencionados en diferentes tipos de folculos ovricos bovinos y su potencial rol en
la foliculognesis y ovulacin no ha sido estudiada anteriormente.

Entre los factores locales regulando la funcin reproductiva femenina est el cido lipofosfatdico.
El cido lipofosfatdico (LPA) es un fosfolpido que promueve las acciones biolgicas tales como
tales como la proliferacin celular y su diferenciacin e interacciones clula- clula. En mamferos,
el LPA induce su actividad por la bien conocida y bien estudiada va GPRC de tipo: LPAR1/EDG2,
LPAR2/EDG4, LPAR3/EDG7 y LPAR4/P2Y9. El LPA es producido por dos enzimas principales, la
fosfolipasa A2 (PLA2) y autotaxina (AX). El rol de la LPA en el sistema reproductor ha sido
estudiado en ratonas, cerdas, cabras y vacas. En el tracto reproductivo bovino, el LPA es
sintetizado en el endometrio, oviducto, cuerpo lteo y el embrin. Adems, estudios recientes han
demostrado la dependencia del tipo de folculo de LPA en componentes del folculo ovrico bovino
- clulas de teca y granulosa.

El objetivo de este estudio fue investigar la expresin de factores que estn potencialmente
involucrados en el crecimiento y desarrollo del folculo ovrico y en la ovulacin en las clulas
tecales y de la granulosa que se originan en diferentes tipos de folculos ovricos. Tambin
examinamos el posible vnculo entre los factores antes mencionados, LPA sntesis y la expresin de
los receptores de LPA en tres diferentes tipos de folculos ovricos.

2. Material y mtodos
2.1. Coleccin ovrica
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comit Local de Cuidado y Uso
de Animales en Olsztyn, Polonia (Acuerdo No. 34 /2012 / N). Los ovarios, independientemente de
la etapa del ciclo estral, se recogieron de vacas maduras en un matadero local y se transportaron
al laboratorio en 40 minutos en solucin salina tamponada con fosfato estril (tampn PBS (NaCl
137 mM, KCl 2,7 mM, Na2KPO4 10 mM, 1,8) KH2PO4 mM, pH 7,4), complementado con
gentamicina al 0,4% (Sigma # G-1397)).

2.2. Coleccin del material experimental

En el lquido folicular aspirado de los folculos ovricos antrales (dimetro <5 mm), los niveles de
E2 y P4 se midieron mediante el mtodo RIA (el kit DIAsource E2eRIAeCT, KIP0629, DIAsource y el
kit DIAsource PROGeRIAeCT, KIP1458, DIAsource, respectivamente). Segn la relacin
intrafolicular E2: P4 (segn Irlanda e Irlanda 1994), los folculos ovricos se dividieron en tres
grupos: sano (E2: P4> 1), transicional (0,01 <E2: P4 <1) y atrsico (E2: P4). <0.01). Despus de la
recoleccin del lquido folicular, la cavidad antral de cada folculo se lav con PBS fro para
recuperar las clulas de la granulosa. La capa de teca se elimin con pinzas y se lav en PBS
hacindola pasar repetidas veces a travs de una jeringa de 1 ml. Las clulas de tecal y de la
granulosa obtenidas a partir de folculos individuales categorizados como sanos (n = 16),
transicionales (n = 16) o atrsicos (n = 16) se usaron para este estudio. Las muestras se recogieron
en RNAlater (Sigma, R-0901) y se almacenaron a -80C hasta la extraccin de RNA.

2.3. Extraccin total de ARN, transcripcin reversa (RT) y PCR en tiempo real
La capa de teca se homogeneiz antes de la extraccin de ARN. El ARN total se extrajo de acuerdo
con el protocolo del kit de aislamiento Total RNA Mini (A & A Biotechnology, # 031e100). Las
muestras de ARN se almacenaron a -80C. Antes del uso, el contenido y la calidad del ARN se
evaluaron mediante medicin espectrofotomtrica. La cantidad de 500 ng de cada muestra de
ARN total se transcribi de forma inversa (de acuerdo con el kit de sntesis de cDNA de First Strand
para el protocolo RT-qPCR, Thermo Scientific, n. K1642). La expresin de ARNm para las enzimas
responsables de la sntesis de LPA (fosfolipasa A2ePLA2 y autotaxineAX), los receptores para LPA
(LPAR1, LPAR2, LPAR3 y LPAR4) y los factores de importancia potencial para el proceso ovulatorio
y el desarrollo del folculo preovulatorio (PGES, DBI, CD36, TFG, RABGAP1 y BTC) se midieron
mediante PCR en tiempo real usando sondas TaqMan especficas.

La PCR en tiempo real se realiz con un sistema de deteccin de secuencias ABI Prism 7900
(Applied Biosystems, Life Technologies, EE. UU.) Usando la mezcla maestra de qPCR Maxima Probe
/ ROX (n K0231, Thermo Scientific, EE. UU.). Las reacciones de PCR se realizaron en placas de 384
pocillos. Los resultados de la transcripcin de ARNm se normalizaron a niveles de ARNm de beta-
actina (ACTB, un control interno) y se expresaron como unidades arbitrarias. El gen de limpieza fue
elegido utilizando el software NormFinder mediante la comparacin de los siguientes dos genes
candidatos: GAPDH y ACTB [32]. Los cebadores se disearon utilizando un paquete de software en
lnea (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Las secuencias de los cebadores y los tamaos
de los fragmentos amplificados de todos los transcritos se muestran en la Tabla 1. Para la
cuantificacin relativa de los niveles de ARNm, se us el software Miner
(http://miner.ewindup.info).
2.4. Inmunohistoqumica
Para inmunolocalizar los factores implicados en el proceso de ovulacin y el desarrollo folicular en
el folculo ovrico bovino, los ovarios con folculos antrales se fijaron en formaldehdo tamponado
al 4% para inmunohistoqumica (segn [33]). Las protenas de inters se tieron con el uso de
anticuerpos policlonales de cabra: anti-BTC, anti-DBI, anti-CD36 (dilucin para todos los
anticuerpos 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, # sc-5800, # sc-23474, #sc -5522, respectivamente),
anti-PGES (dilucin 1:50, Santa Cruz Biotechnology, # sc-32589), anti-TFG (dilucin 1: 150, Abcam,
# ab72126) y anti RABGAP1 (dilucin 1: 200, Abcam, # ab153992). Las secciones de control
negativo se incubaron con IgG irrelevante de cabra (concentracin 1: 100, Santa Cruz
Biotechnology, # sc-2028).

2.5. Anlisis estadstico

Los anlisis estadsticos se realizaron utilizando el software GraphPad PRISM v. 6.0 (GraphPad
Software, Inc.). Todos los datos experimentales se muestran como la media SEM, y las
diferencias se consideraron significativamente diferentes en el nivel de confianza del 95% (P
<0,05). Los anlisis se realizaron usando ANOVA de una va seguido de la prueba de comparacin
mltiple de Kruskal-Wallis (Figuras 1 y 2) o anlisis de correlacin seguidos por la prueba de
Pearson (Tabla 2, Figuras 4e7).

3. Resultados
3.1. La expresin de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG en las clulas de la
granulosa de los folculos ovricos sano, transicional y atrsico
La abundancia de ARNm de todos los factores examinados se detect en las clulas de la granulosa
de los folculos ovricos sano, transicional y atrsico (Fig. 1). Los mayores niveles de expresin de
ARNm se midieron para DBI y TFG. La abundancia de ARNm para DBI, RABGAP1 y TFG fue mayor
en los folculos sanos en comparacin con los folculos atrsicos (Fig. 1C, E, F, P <0.05). El nivel de
ARNm de PGES fue mayor en los folculos de transicin que en los otros tipos de folculos (Fig. 1A,
P <0.05). Se observaron niveles similares de expresin de ARNm de BTC y CD36 en tipos de
folculos sanos, transicionales y atrsicos (figura 1B, D, P> 0,05).

3.2. La expresin de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG en las clulas tecales de
folculos ovricos sanos, transicionales y atrsicos.
Se detectaron niveles de expresin de ARNm de todos los factores examinados en folculos
ovricos sanos, transitorios y atrsicos (Fig. 2).

Los mayores niveles de ARNm se revelaron para DBI y TFG. Las abundancias de ARNm de BTC y
CD36 fueron menores en los folculos sanos en comparacin con los atrsicos (Fig. 2B y D, P <0,05).
La abundancia de ARNm de TFG fue mayor en los folculos sanos que en los folculos atrsicos (Fig.
2F, P <0.05). Se observaron niveles similares de expresin de ARNm de PGES, DBI y RABGAP1 en
tipos de folculos sanos, transicionales y atrsicos (Fig. 2A, C, 2E, P> 0,05).
3.3. La localizacin inmunohistoqumica de PGES, BTC, DBI, CD36, RABGAP1 y TFG en
folculos ovricos bovinos
La inmunolocalizacin de los factores implicados en el crecimiento folicular, el desarrollo y la
ovulacin se examinaron en folculos ovricos bovinos. Las clulas granulosas y tecales de los
folculos ovricos se inmunotieron positivamente para todas las molculas analizadas (Fig. 3).

Se observ una inmunotincin fuerte para TFG (figura 5 A), DBI (figura 5B), RABGAP1 (figura 3D) y
PGES (figura 3E) en clulas granulosas y tecales. Se encontr inmunotincin plida para BTC (figura
5C) y CD36 (figura 5F). No se observ tincin positiva en la seccin desprovista de anticuerpos
primarios contra factores analizados o en secciones con anticuerpos inmateriales (control
negativo, Fig. 3GeL).

3.4. Las correlaciones entre los niveles de expresin de ARNm de PGES, BTC, DBI,
CD36, RABGAP1 y TFG y LPAR, PLA2 y AX en sano,
folculos ovricos transicionales y atrsicos Las correlaciones entre la abundancia de ARNm de los
factores potencialmente asociados con la foliculognesis y la ovulacin, LPAR y enzimas que
sintetizan LPA se investigaron en los diferentes tipos de folculos ovricos (Tabla 2). Todas las
correlaciones encontradas tanto en la granulosa como en las clulas tecales fueron positivas. La
intensidad de correlacin se determin por el valor de r (Tabla 2, Figuras 4e7). Las relaciones
caracterizadas por r <0,40 se describieron como estadsticamente no significativas (campos
blancos en la Tabla 2). Figs. 4e7 muestran correlaciones entre la abundancia de ARNm de los
receptores ms importantes para LPA (LPAR2, LPAR4), la enzima principal que sintetiza LPA (PLA2)
y factores elegidos que intervienen en la foliculognesis y la ovulacin. En las clulas de la
granulosa de los folculos sanos (Fig. 4) encontramos dos fuertes correlaciones (0,81 <r <1,00)
entre la abundancia de ARNm para la principal enzima que sintetiza LPA (PLA2) y los factores
examinados, RABGAP1 (Fig. 4A, r = 0,9908, P <0.05) y TFG (Fig. 4Br = 0,9381, P <0,05). Tambin
observamos las relaciones entre los niveles de expresin de ARNm de LPAR2 y BTC (Fig. 4C, r =
0.9719, P <0.05), PGES (Fig. 4D, r = 0.9559, P <0.05) y CD36 (Tabla 2, r = 0.8925, P <0.05). Adems,
detectamos correlaciones entre los niveles de ARNm de los factores examinados con otro receptor
importante para LPA en folculos ovricos bovinos, LPAR4, y las correlaciones son las siguientes:
LPAR4-RABGAP1 (Fig. 4E, r = 0.9431, P <0.05) y LPAR4-TFG (Fig. 4F, r = 0,8077, P <0,05).

Se encontr una correlacin entre los niveles de expresin de ARNm para LPAR3-CD36 (Tabla 2, r =
0.7327, P <0.05) y LPAR2-TFG (Tabla 2., r = 0.7045, P <0.05). Las correlaciones entre los niveles de
transcripcin de ARNm de los factores examinados y AX y LPAR1 no se observaron en las clulas de
la granulosa de los folculos sanos. En los folculos de transicin de las clulas de la granulosa (Fig.
5), encontramos dos asociaciones de abundancia de ARNm de PLA2 con TFG (Fig. 5A, r = 0.9578, P
<0.05) y RABGAP1 (Tabla 2, r = 0.8812, P <0.05) , LPAR2 con TFG (Fig. 5B, r = 0.9533, P <0.05) y
correlaciones entre la abundancia de ARNm de LPAR4 y RABGAP1 (Fig. 5C, r = 0.9862, P <0.05), DBI
(Fig. 5D, r = 0.7793, P < 0.05), PGES (Fig. 5E, r = 0.8828, P <0.05) y BTC (Fig. 5F, r = 0.9398, P
<0.05).LPAR2 con TFG (Fig. 5B, r = 0.9533, P <0.05) y correlaciones entre la abundancia de ARNm
de LPAR4 y RABGAP1 (Fig. 5C, r = 0.9862, P <0.05), DBI (Fig. 5D, r = 0.7793, P < 0.05), PGES (Fig. 5E,
r = 0.8828, P <0.05) y BTC (Fig. 5F, r = 0.9398, P <0.05).
De las correlaciones entre la abundancia de ARNm de los factores examinados y AX, la correlacin
con LPAR1 y LPAR3 no se observ en las clulas de la granulosa de los folculos de transicin. No se
detect ninguna relacin entre los niveles de transcripcin de LPAR, PLA2 y AX y los factores
investigados en las clulas de la granulosa de los folculos clasificados como atrsicos.

En las clulas tecales de los folculos sanos (Fig. 6), encontramos numerosas correlaciones muy
fuertes (0,81 <r <1,00) entre las abundancias de ARNm de LPAR2-4, PLA2 y todos los factores
examinados (Tabla 2). Se detectaron correlaciones fuertes (0,61 <r <0,80) entre LPAR1 y BTC,
CD36, RABGAP1 y TFG (Tabla 2). Adems, encontramos numerosas correlaciones dbiles (0,41 <r
<0,60) entre las transcripciones de LPAR1 y PGES, LPAR1 y DBI; entre LPAR3 y BTC; LPAR3 y PGES; y
entre AX y RABGAP1 y TFG (Tabla 2). Las relaciones entre los niveles de transcripcin de los
receptores principales para LPA en folculos ovricos bovinos (LPAR2, LPAR4), la principal enzima
que sintetiza LPA (PLA2) y los factores seleccionados, examinados (RABGAP1, TFG, DBI) en clulas
tecales de folculos sanos son se muestra en la Fig. 6. Todas las correlaciones entre RABGAP1 y
PLA2, LPAR2 y LPAR4 fueron muy fuertes (Fig. 6A, r = 0,9323; Fig. 6D, r = 0,9467; Fig. 6G, r =
0,9271, respectivamente; P <0,05), as como las asociaciones entre TFG y PLA2 y LPAR2 (Fig. 6B, r =
0,8992; Fig. 6E, r = 0,8370, respectivamente; P <0,05). La correlacin entre TFG y LPAR4 no fue
significativa (Fig. 6H, r = 0.4838, P> 0.05). Las correlaciones de los niveles de ARNm de DBI con
PLA2 y LPAR2 fueron muy fuertes (Fig. 6C, r = 0.8644; Fig. 6F r = 0.8835, respectivamente; P <0.05),
as como el vnculo entre DBI y LPAR4 (Fig. 6I, r 0.9083).

En las clulas tecales de los folculos transicionales (Tabla 2) encontramos correlaciones muy
fuertes (0,81 <r <1,00) entre los niveles de ARNm de PLA2 y DBI, CD36 y RABGAP1; AX y RABGAP1
y TFG; LPAR1 y RABGAP1 y TFG; LPAR2 y RABGAP1; LPAR4 y RABGAP1 y TFG. Tambin se
encontraron correlaciones fuertes (0,61 <r <0,80) entre LPAR1 y DBI y CD36; LPAR2 y DBI, y TFG;
LPAR3 y DBI; LPAR4 y CD36; y PLA2 y TFG. Se detectaron relaciones dbiles (0,41 <r <0,60) entre
las abundancias de transcripcin para LPAR2 y CD36; LPAR3 y PGES y CD36; y AX y CD36.

Las relaciones entre la abundancia de ARNm de receptores principales para LPA en el folculo
ovrico bovino (LPAR2, LPAR4), la principal enzima que sintetiza LPA (PLA2) y los factores
examinados (RABGAP1, TFG, DBI) en clulas tecales de folculos transicionales se muestran en Fig.
7. Las correlaciones entre los niveles de ARNm de RABGAP1 y PLA2, LPAR2 y LPAR4 fueron muy
fuertes (Fig. 7A r = 0.9584; Fig. 7D, r = 0.9204; Fig. 7G, r = 0.9647, respectivamente; P <0.05), as
como las relaciones entre los niveles de ARNm de TFG y PLA2 y LPAR2 (Fig. 7B, r = 0,8818; Fig. 7E, r
= 0,8593, respectivamente; P <0,05) y la asociacin entre la expresin de ARNm de TFG y LPAR4
(Fig. 7H, r = 0,9304, P <0,05). La relacin entre los niveles de ARNm de DBI y PLA2 (Fig. 7C, r =
0,9409) y la correlacin entre DBI y LPAR2 y LPAR4 tambin fueron muy fuertes (Fig. 7F, r = 0,8879;
Fig. 7I, r = 0,8826, respectivamente; P <0.05). No se detectaron relaciones entre los niveles de
expresin de ARNm de LPAR, PLA2, AX y los factores investigados en las clulas tecales de los
folculos clasificados como atrsicos.
4. Discusin
El crecimiento y desarrollo de los folculos ovricos requieren eventos coordinados que inducen
cambios morfolgicos y funcionales dentro del folculo y conducen a la diferenciacin celular y el
desarrollo de ovocitos. El desarrollo folicular opera de manera muy dinmica, comenzando con la
formacin de folculos primordiales a los 75 y 80 das del desarrollo fetal [34,35]. La iniciacin del
crecimiento folicular comienza con la conversin de las clulas aplanadas del folculo primordial en
una sola capa de clulas granulosas cuboidales en el folculo primario [36]. La proliferacin de
clulas de la granulosa comienza con un aumento de dos a seis capas de clulas alrededor del
ovocito en el folculo secundario a ms de seis capas de clulas y un antro lleno de lquido en el
folculo terciario o antral [36,37].

Estas clulas de la granulosa rodean el ovocito preovulatorio y acompaan al gameto femenino en

el momento de la ovulacin, lo que contribuye a la composicin de los fluidos en el lugar de la
fecundacin. Las clulas de la granulosa permanecen en estrecha cooperacin con otro
componente del folculo ovrico, la capa de teca, que se origina en las clulas del estroma. La
presencia de clulas tecales en el desarrollo folicular temprano da como resultado un mayor
crecimiento folicular y respuesta esteroidognica a las gonadotropinas [38], un mayor soporte
estructural y suministro de sangre que contiene reguladores ovricos para el folculo en desarrollo
[39] y una mayor produccin de andrgenos, que es necesaria para E2 biosntesis [40,41]. El tercer
componente de un folculo ovrico es el lquido folicular (FF), que est involucrado en el
metabolismo y la integridad de la membrana de las clulas foliculares.

El lquido folicular contiene muchos factores como la glucosa, la urea, el colesterol, los triglicridos
[42,43], la albmina, la protena total y las enzimas lisosmicas [44,45], y los principales productos
de la actividad de las clulas foliculares somticas: las hormonas progesterona y estradiol. Un
estudio reciente document la presencia de LPA en FF como el regulador local de los procesos
reproductivos en la vaca. Por otra parte, la presencia de receptores de LPA y las enzimas
responsables de su sntesis (PLA2 y AX) tambin se describieron en todos los componentes
foliculares ovricos [30, 31]. Estos datos sugieren el papel de LPA en la fisiologa folicular ovrica.
Este estudio es el primero en examinar el posible vnculo entre la sntesis y la accin del LPA y los
factores implicados en el crecimiento, el desarrollo y la ovulacin en el folculo ovrico bovino,
segn el tipo de folculo.

El papel principal del folculo ovrico es la ovulacin del ovocito, que se prepara para la
fertilizacin. El pico preovulatorio de LH es la seal endocrina, iniciando eventos clave que
acompaan al proceso ovulatorio [4,5,46], como cambios vasculares [47], degradacin proteoltica
de la pared del folculo [48,49] o maduracin nuclear de los ovocitos, adquisicin de la capacidad
de desarrollo por el ovocito y la expansin de las clulas del cumulus [13]. Adems de LH, estos
procesos en el ganado estn regulados por P4 y su receptor [50,51], PG [52,53], oxitocina (OT) [54]
y proteasas ADAMTS [55,56]. Sin embargo, la regulacin del desarrollo del folculo y el proceso de
la ovulacin por factores locales todava no se describe completamente.
Li et al. [8], basado en datos de microarrays y anotacin y anlisis de ontologa gnica,
demostraron una serie de nuevos factores potencialmente relacionados con el crecimiento
folicular, el desarrollo y el proceso ovulatorio, con regulacin positiva de la expresin de ARNm en
respuesta al estmulo ovulatorio (liberacin de gonadotropina inyeccin de hormona (GnRH)). El
aumento de la abundancia de ARNm despus de la induccin de LH en los folculos ovricos se
identific para DBI (> aumento de cinco veces), CD36 (~ aumento de tres veces) y TFG (~ aumento
de dos veces) 12 h despus de inyeccin de GnRH y RABGAP1 (~ dos multiplicado por tres veces)
20 h despus de la inyeccin de GnRH.

La presencia de transcritos para los factores mencionados anteriormente tambin se observ

especficamente en clulas granulosas y tecales, en las que la expresin de ARNm era elevada
despus de la inyeccin de GnRH. Li et al. [8] mostr expresin dependiente de clulas de los
nuevos factores que estn potencialmente involucrados en el crecimiento y desarrollo del folculo
ovrico y en el proceso de ovulacin. En nuestro estudio, investigamos si estos factores y otros
dos, PGES y BTC, que tambin estn potencialmente implicados en la ovulacin, tambin
dependen del tipo de folculo.

Los resultados obtenidos muestran la presencia de todos los genes examinados en los tres tipos de
folculos ovricos bovinos. Sin embargo, solo los niveles de expresin de ARNm de BTC y CD36
dependen del tipo de folculo en clulas tecales, PGES, DBI y RABGAP1 en clulas de la granulosa y
TFG en ambos tipos de clulas examinadas.

La betacelulina es uno de los ligandos funcionales del receptor del factor de crecimiento
epidrmico (EGFR) [57], que se ha demostrado que participa en los procesos de maduracin de los
ovocitos, la ovulacin [13,58e60], el desarrollo embrionario preimplantatorio [61] y la
implantacin [62e64]. ] En el tracto reproductivo femenino, BTC se identific por primera vez en el
tero de ratn exclusivamente en los sitios de aposicin de blastocisto en el momento de la
reaccin de unin (d 4) y durante la fase temprana de la implantacin (d 5) [62]. Adems, BTC
fue reconocido como el posible mediador ovrico de la actividad de la protena morfogentica
sea 15, un factor de crecimiento especfico de oocitos que desempea un papel importante en la
determinacin de la ovulacin en mamferos [65]. Finalmente, BTC se describi como un mediador
de la actividad del receptor LH [13, 58, 66,67], PG y P4 (PGR) [59] en el folculo ovulatorio.

De acuerdo con la importancia potencial de los factores analizados en la ovulacin, sospechamos

que la mayor abundancia de ARNm para los genes investigados se encuentra en los folculos
clasificados como sanos. Sin embargo, nuestro estudio mostr la tendencia opuesta: los mayores
niveles de ARNm para BTC y CD36 se detectaron en la capa de teca de folculos atrsicos, mientras
que los niveles de expresin ms bajos se encontraron en folculos sanos, que tambin contienen
el folculo dominante en ovulacin. Estos datos estn de acuerdo con Hsieh et al. [60], quien
demostr que la interrupcin gentica progresiva de la red EGFR en el folculo periovulatorio
previene la reentrada meitica y la ovulacin mediadas por LH. Curiosamente, Ana et al. [68]
document que la sobreexpresin de BTC en el tero y el ovario result en tasas de fertilizacin in
vivo e in vitro significativamente reducidas, retraso en la implantacin del embrin, reduccin del
tamao de la camada y una respuesta reducida de los ovarios a las gonadotropinas. El defecto de
fertilizacin se correlacion con una mayor actividad de MAPK3 / MAPK1, el rea de convergencia
para la sealizacin del receptor EGFR y LH (LHR).

Adems, parece posible que los folculos atrsicos sean menos sensibles a las gonadotropinas, lo
que podra ser el resultado de los altos niveles de ARNm de BTC. Adems, Li et al. [8] describieron
BTC en el folculo ovrico bovino como indetectable, mientras que nuestro estudio mostr la
expresin dependiente del tipo de folculo de este factor en clulas tecales, as como su presencia
en los folculos antrales en el anlisis IHC (tanto en clulas granulosas como tecales). Sin embargo,
los autores no han dividido los folculos en diferentes tipos. Teniendo en cuenta que menos del
20% de los folculos examinados [74] se clasificaron como "atrsicos", parece posible que en el
anlisis se usen principalmente folculos transitorios y sanos, en los que sera relativamente bajo el
nivel de ARNm de BTC. Detectado Las modificaciones posteriores a la traduccin tampoco se
pueden excluir. Curiosamente, nuestros datos muestran el vnculo entre la expresin de ARNm de
BTC y receptores para LPA, el regulador local de procesos reproductivos en la vaca. Encontramos
una fuerte correlacin positiva entre la abundancia de ARNm de BTC y LPAR2 en clulas de la
granulosa que se originaron en folculos sanos.

Este hallazgo fue relativamente impredecible, ya que documentamos el mayor nivel de expresin
de ARNm de BTC en los folculos atrsicos. Sin embargo, esta divergencia podra deberse al hecho
de que la sobreexpresin de BTC puede inhibir los procesos reproductivos, incluida la capacidad de
respuesta de los ovarios a las gonadotropinas [68], y que del grupo saludable de folculos, solo uno
se vuelve dominante y ovula. Por lo tanto, esta correlacin puede indicar el posible papel del LPA
como un regulador del desarrollo folicular mediante la prevencin de la ovulacin de ms de un
folculo. Tambin detectamos un vnculo entre la abundancia de ARNm de BTC y LPAR4 en las
clulas de la granulosa de los folculos de transicin. Como el papel de los folculos transicionales
en el ovario permanece desconocido, esta correlacin es difcil de explicar.

El receptor de trombospondina es un receptor de glicoprotena transmembrana multifuncional,

asociado con la adhesin celular, la presentacin del antgeno y la inhibicin de la angiognesis
[10]. Entre los muchos genes para CD36 se encuentran la trombospondina (TSP) -1 y -2, que
actan como factores de crecimiento autocrino y estn implicados en diversos eventos fisiolgicos
que incluyen crecimiento celular, adhesin y migracin, agregacin plaquetaria y regulacin de la
angiognesis [69]. En el ovario de rata, tanto TSP-1 como CD36 se localizaron principalmente en la
capa de clulas de la granulosa de folculos antrales, mientras que TSP-2 se expres ms tarde
durante la fase ovulatoria / ltea temprana [70]. En los folculos bovinos, TSP se coexpresaron con
CD36 en las clulas de la granulosa [6], aunque su expresin en las clulas tecales sigue siendo
desconocida. En este estudio, se detect la presencia de mRNA y protena CD36 en clulas
granulosas y tecales en el folculo ovrico bovino. Adems, la expresin de ARNm de CD36
tambin era dependiente del tipo de folculo en clulas tecales, con la mayor expresin de ARNm
en folculos atrsicos, y la ms baja en folculos sanos. Estos datos parecen ser consistentes con
una de las funciones CD36, que es la mediacin de la eliminacin de las clulas apoptticas [10].
En los mamferos, el gen TFG es un socio de fusin para el linfoma anaplsico quinasa en el linfoma
anaplsico de clulas grandes y se identifica principalmente como parte de un gen de fusin
oncognica (TRKeT3) [71]. Mientras que el papel de TFG en el control de la funcin celular normal
era previamente desconocido, Roccato et al. [72] document la posibilidad de que el TFG
interacte con el dominio citoplsmico de Src homology 2 que contiene protena-tirosina fosfatasa
(SHP-1) y controle su actividad.

Adems, TFG amplific el efecto del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), factor asociado al
receptor de TNF (TRAF) 2 y TRAF6 en la estimulacin de la actividad de NF-kappaB [73].
Curiosamente, PGE2 dependiente de la estimulacin de la expansin del cumulus en ratones fue
dependiente de NFkappaB [9], lo que sugiere un posible vnculo funcional entre la actividad de NF-
kappaB y los principales eventos dependientes de prostanoides durante el perodo preovulatorio.
Adems, la expresin del ARNm de TNFa en clulas de la granulosa de diferentes tipos de folculos
ovricos bovinos se describi previamente [74]. Los niveles de expresin del ARNm de TNFa y sus
receptores fueron estadsticamente mayores en los folculos atrsicos en comparacin con los
folculos sanos y de transicin.

Por lo tanto, parece posible el efecto potenciador de TGF sobre la expresin de TNFa en las clulas
de la granulosa bovina. Adems, en las clulas de la granulosa de folculos sanos, se detect una
relacin negativa entre la abundancia de ARNm de TNFa y LPAR2, sugiriendo un papel de ayuda de
LPA hacia la regulacin dependiente de TNFa de la apoptosis en las clulas de la granulosa de
folculo atrsico y transicional en lugar de folculos ovricos sanos [74]. Li et al. [8] observ el
aumento de la expresin de ARNm de TFG a las 12 h despus de la inyeccin de GnRH en los
folculos ovricos bovinos.

Adems, en las clulas tecales, la abundancia de ARNm de TFG se elev despus de 12 y 24 h

despus de la inyeccin de GnRH. Curiosamente, a diferencia de las clulas de la granulosa, la
transcripcin de TFG no era dependiente de prostanoides. En nuestro estudio, tambin
detectamos ARNm para TFG en granulosa y clulas tecales en todos los tipos examinados de
folculos ovricos bovinos. La mayor abundancia de la transcripcin del TFG se identific en los
folculos sanos, mientras que la abundancia ms baja se encontr en los folculos atrsicos tanto
en la granulosa como en las clulas tecales, lo que indica su papel potencial en el proceso de la
ovulacin.

La presencia de TFG en el nivel de protena tambin se confirm en folculos antrales por

inmunohistoqumica.

Adems, hemos encontrado fuertes correlaciones positivas entre los niveles de ARNm de TFG y la
enzima principal que sintetiza LPAePLA2, tanto en clulas granulosas como tecales en folculos
sanos y de transicin, pero no en atrsicos. Tambin se detect el vnculo positivo entre la
expresin de ARNm de TFG y los receptores para LPAeLPAR3 y LPAR4 en clulas granulosas y
tecales de folculos sanos y de transicin. Estos hallazgos pueden indicar que el LPA es un
regulador potencial de la actividad de TFG en los folculos ovricos de la vaca.
La expresin del inhibidor de unin al diazepam en los folculos preovulatorios bovinos puede
tener importancia funcional en los cambios de la capacidad esteroidognica. Como el ligando
endgeno para los receptores de benzodiacepina (BZD) (BZR), DBI puede desplazar a BZD de sus
receptores. DBI, a travs de la unin a BZR perifrica, tambin puede estimular la
estereoideogenesis in vivo, lo que lleva a la elevacin de la sntesis de pregnenolona [12].
Expresin de la DBI en el ovario de rata se ha informado anteriormente [11, 75]. En la vaca, la
expresin del ARNm de DBI se increment tanto en clulas granulosas como en clulas tecales de
los folculos preovulatorios en respuesta al estmulo ovulatorio [8]. Sin embargo, la expresin de
BZR en el ovario bovino no se ha informado an. En este estudio, se investig la abundancia de
ARNm para DBI en clulas tecales y granulosas en todos los tipos examinados de folculos ovricos
bovinos; sin embargo, la expresin de DBI dependiente del folculo de DBI se observ solo en las
clulas de la granulosa.

Encontramos una mayor abundancia de ARNm de DBI en las clulas de la granulosa de los folculos
sanos que en los folculos atrsicos. Esta observacin puede deberse a la menor capacidad
esteroidognica de las clulas de la granulosa, lo que conduce a una menor produccin de E2 en
los folculos atrsicos. En nuestro estudio, detectamos una correlacin entre los niveles de ARNm
de DBI y LPAR4 en las clulas de la granulosa de los folculos de transicin. Sin embargo, una
explicacin de esa correlacin parece no estar clara, y todava hay papeles no descubiertos de los
folculos de transicin. Tambin detectamos fuertes correlaciones entre la expresin de ARNm de
PLA2, LPAR2, LPAR4 y DBI en clulas tecales de folculos sanos y de transicin. Estas correlaciones
explican la participacin del LPA en la actividad de DBI en las clulas tecales y pueden explicar los
cambios en la capacidad esteroidognica de estas clulas, independientemente del tipo de
folculo.

La prostaglandina E sintasa es la enzima que convierte PGH2 en PGE2. Esta molcula ha sido
identificada en clulas de la granulosa bovina [76], de rata [77] y de primate [78]. Adems, se
detect PGES en las clulas tecales bovinas obtenidas despus de la estimulacin ovrica, pero no
durante ciclos estral espontneos [76]. Adems, los estudios in vitro han demostrado que las
clulas tecales de los folculos periovulatorios obtenidos de ovarios humanos [79], rata [80],
porcino [81] y mono [78] tambin producen PGE2, lo que sugiere que estas clulas expresan todas
las enzimas necesarias para la sntesis de PGE2. En este estudio, tambin se analiz la expresin
del ARNm de PGES en los diferentes tipos de folculos bovinos, sin embargo, no se han identificado
diferencias entre los grupos en cualquiera de los componentes examinados del folculo. Se
detectaron correlaciones positivas entre la abundancia de ARNm de PGES y LPAR2 / LPAR4 en las
clulas de la granulosa en los folculos sanos y de transicin. Como en el caso de DBI, no se puede
excluir la participacin de LPA en la actividad de PGES en clulas de la granulosa,
independientemente del tipo de folculo.

Las protenas activadoras de Rab GTPasa estn definidas por el dominio conservado de TBC (Tre2 /
Bub2 / Cdc16) que contiene residuos conservados requeridos para catalizar la hidrlisis de GTP.
Estudios previos sugieren que uno de ellos, RABGAP1, es una GTPasa que puede tener nuevas
funciones en el ovario [8]. Sin embargo, an se desconoce el papel funcional potencial de este
factor en los folculos preovulatorios bovinos. Detectamos la expresin de ARNm para RABGAP1
en los tres tipos de folculos ovricos bovinos.

Adems, se observ la expresin del ARNm dependiente del tipo de folculo de RABGAP1 en las
clulas de la granulosa pero no en las clulas tecales.

Se ha reconocido la importancia de las redes de sealizacin interconectadas entre distintas

GTPasas y sus reguladores. La presencia de RABGAP1 en clulas granulares y tecales que cooperan
estrechamente puede sugerir su papel en la mediacin de la sealizacin granular-local.
Yoshimura et al. [82] mostr los roles de varios RABGAP en la formacin de cilios primarios
mediante la regulacin de membranas de membranas y membranas de interacciones entre
esqueleto. En este estudio, detectamos el mayor nivel de ARNm de RABGAP1 en las clulas de la
granulosa de los folculos sanos, uno de los cuales se volver dominante y se someter a la
ovulacin.

Durante la ovulacin, los ovocitos rodeados por clulas de la granulosa, se trasladan del ovario al
oviducto, donde permanece en el complejo cmulo-ovocito hasta la fecundacin. Tomados en
conjunto, estos hallazgos sugieren que RABGAP1 puede estar involucrado en la formacin de cilios
en el oviducto; Sin embargo, se requiere ms investigacin. En este estudio, tambin hemos
encontrado correlaciones muy fuertes entre las abundancias de ARNm de PLA2 y RABGAP1 y entre
LPAR4 y RABGAP1 en las clulas de la granulosa de los folculos sanos y entre LPAR4 y RABGAP1 en
las clulas de la granulosa de los folculos de transicin. Adems, se encontraron varias
correlaciones fuertes entre la expresin de ARNm de RABGAP1 y enzimas que producen LPA y sus
receptores en las clulas tecales de folculos ovricos sanos y transicionales, lo que puede sugerir
el papel modulador de LPA en la accin RABGAP1 en el folculo ovrico preovulatorio bovino.

5. Conclusiones
En resumen, en nuestro estudio, investigamos la expresin de ARNm dependiente del tipo de
folculo de factores potencialmente implicados en el crecimiento y desarrollo folicular ovrico y el
proceso de ovulacin en clulas granulosas y tecales del folculo ovrico bovino. Encontramos los
niveles de expresin de ARNm de TFG, BTC, DBI, PGES, RABGAP1 y CD36 y confirmamos su
expresin proteica en folculos antrales por inmunohistoqumica. Adems, se observaron fuertes
asociaciones entre los niveles de transcripcin de LPAR, las enzimas que sintetizan LPA y los
factores antes mencionados en los folculos sanos y de transicin, mientras que no se detectaron
correlaciones en los folculos atrsicos. El mayor nmero de correlaciones fue tpico para el tecal
en comparacin con las clulas de la granulosa, y en el sano en comparacin con los folculos de
transicin. Estos datos sugieren la posible participacin de LPA en el desarrollo folicular, con sus
mayores influencias en TFG, DBI y RABGAP1 en clulas de la granulosa y TFG en clulas tecales.
Estos resultados indican el papel de LPA en el crecimiento, desarrollo y fisiologa del folculo
ovrico bovino.