Hidrlisis enzimtica de protenas 1

Objetivo
Determinar el efecto de las condiciones de reaccin (pH del medio de reaccin,
concentracin de sustrato y enzima) sobre la actividad proteoltica de la pepsina,
utilizando como sustrato la albmina de huevo.

Resultados
Experimento N1

TABLA N1 Efecto de la concentracin del sustrato sobre la actividad enzimtica de la pepsina

Reactivo 1 2 3 4 5
H2O (ml) 3,0 2,0 1,5 1,0 --
Solucin HCl 0,5 0,5 0,5 0,5 --
0,5 N (ml)
Solucin de 1,0 2,0 2,5 3,0 --
albmina (ml)

Solucin de -- -- -- -- 3,0
pepsina 1%
(ml)
Colocar los tubos de ensayo en un bao de hielo
Solucin de 0,5 0,5 0,5 0,5 --
pepsina 1%
(ml)
Mezclar bien
Leer rpidamente la absorbancia de los tubos a 450 nm utilizando como blanco agua
destilada. Anotar la absorbancia inicial (t=0)
Incubar a 37C por 20 minutos
Detener la reaccin colocando los tubos en el bao con hielo y leer la absorbancia a 450 nm.
Anotar la absorbancia final (t=20)

TABLA N2 Resultados de lectura de absorbancia a 450 nm en el t=0 y t=20

Tubos
Tiempo 1 2 3 4 5
Absorbancia T=0 0,225 0,280 0,527 0,800
T=20 0,238 0,336 0,195 0,061 0,045
 Hidrlisis enzimtica de protenas 2

Clculos

Actividad enzimtica del tubo x = Absorbancia t=0 Absorbancia t=20

Actividad enzimtica del tubo x = D.O t=0 D.O t=20

Tubo 1:

Actividad enzimtica = 0,225 0,238 = - 0,013

Tubo 2:

Actividad enzimtica = 0,280 0,336 = - 0.056

Tubo 3:

Actividad enzimtica = 0,527 0,195 = 0,332

Tubo 4:

Actividad enzimtica = 0,800 0,061 = 0,739

 Hidrlisis enzimtica de protenas 3

Experimento N2

TABLA N3 Efecto de la concentracin de la enzima sobre la actividad de la pepsina

Reactivo 1 2 3 4 5
H2O (ml) 2,0 1,5 1,0 0,5 --
Solucin HCl 0,5 0,5 0,5 0,5 --
0,5 N (ml)
Solucin de 2,0 2,0 2,0 2,0 --
albmina (ml)

Solucin de -- -- -- -- 6,0
pepsina 1%
(ml)
Colocar los tubos de ensayo en un bao de hielo
Solucin de 0,5 1,0 1,5 2,0 --
pepsina 1%
(ml)
Mezclar bien
Leer rpidamente la absorbancia de los tubos a 450 nm utilizando como blanco agua
destilada. Anotar la absorbancia inicial (t=0)
Incubar a 37C por 20 minutos
Detener la reaccin colocando los tubos en el bao con hielo y leer la absorbancia a 450 nm.
Anotar la absorbancia final (t=20)

TABLA N4 Resultados de lectura de absorbancia en el t=0 y t=20

Tubos
Tiempo 1 2 3 4 5
Absorbancia T=0 0,769 0,590 0,809 0,808 0,065
T=20 0,439 0,461 0,473 0,516 0,040
 Hidrlisis enzimtica de protenas 4

Clculos

Actividad enzimtica del tubo x = Absorbancia t=0 Absorbancia t=20

Actividad enzimtica del tubo x = D.O t=0 D.O t=20

Tubo 1:

Actividad enzimtica = 0,769 0,439 = 0,33

Tubo 2:

Actividad enzimtica = 0,590 0,461 = 0,129

Tubo 3:

Actividad enzimtica = 0,809 0,473 = 0,336

Tubo 4:

Actividad enzimtica = 0,808 0,516 = 0,292

Tubo 5:

Actividad enzimtica = 0,065 0,040 = 0,025

 Hidrlisis enzimtica de protenas 5

Experimento N3

TABLA N5 Efecto del pH sobre la enzima sobre la actividad de la pepsina

Reactivo 1 2 3 4
H2O (ml) 0,5 1,5 2,0 --
Solucin HCl 2,0 1,0 0,5 --
0,5 N (ml)
Solucin de 2,0 2,0 2,0 --
albmina (ml)

Solucin de -- -- -- 2,0
pepsina 1%
(ml)
Colocar los tubos de ensayo en un bao de hielo

Solucin de 0,5 0,5 0,5 --

pepsina 1%
(ml)
Mezclar bien

Leer rpidamente la absorbancia de los tubos a 450 nm utilizando como blanco

agua destilada. Anotar la absorbancia inicial (t=0)

Incubar a 37C por 20 minutos

Detener la reaccin colocando los tubos en el bao con hielo y leer la

absorbancia a 450 nm. Anotar la absorbancia final (t=20)

TABLA N6 Resultados de lectura de absorbancia en el t=0 y t=20

Tiempo 1 2 3 4
Absorbancia T=0 0,756 0,624 0,513 0,021
T=20 0,902 0,553 0,470 0,035
 Hidrlisis enzimtica de protenas 6

Clculos

Actividad enzimtica del tubo x = Absorbancia t=0 Absorbancia t=20

Actividad enzimtica del tubo x = D.O t=0 D.O t=20

Tubo 1:

Actividad enzimtica = 0,756 0,902 = -0,146

Tubo 2:

Actividad enzimtica = 0,624 0,553 = 0,071

Tubo 3:

Actividad enzimtica = 0,513 0,470 = 0,043

Tubo 4:

Actividad enzimtica = 0,021 0,035 = -0,014

 Hidrlisis enzimtica de protenas 7

Discusin
En la prctica para realizar la hidrlisis enzimtica de protenas se utiliz a una solucin de
albmina; siendo la albmina precedente del huevo, la albmina de huevo es una compleja
mezcla de protenas que contiene todos los aminocidos esenciales; es utilizada como
suplemento alimenticio, por s solo o mezclado con otros componentes. Para analizar la
hidrlisis enzimtica en in vitro, es necesario colocar a la protena y a la enzima en un ambiente
adecuado, en donde involucra la acidez del estmago, por ello se us una solucin de HCl 0,5 N
(ml), luego se aadi una solucin de pepsina 1% (ml), esto se debe a que la digestin qumica
de las protenas y pptidos es el proceso mediante el cual las proteasas hidrolizan estas
molculas en aminocidos libres, dipptidos o tripptidos que el intestino delgado puede
absorber. Cada enzima acta sobre un tipo de enlace peptdico especifico de acuerdo a la
naturaleza de los aminocidos, es decir, hidrofbico, con carga positiva o neutros aromticos. El
proceso inicia en el estmago donde el cido clorhdrico denatura las protenas desplegndolas
de manera que las proteasas tengan mayor acceso fsico a los enlaces peptdicos. Adems, el
cido clorhdrico activa la pepsina que rompe las protenas en pptidos; sin embargo, las
proteasas pancreticas son las principales responsables de la digestin proteica. La protelisis
gstrica no es esencial en la digestin de las protenas pero juega un papel muy importante ya
que se liberan aminocidos libres que estimula la secrecin de colecistoquinina por las clulas
endocrinas de duodeno y yeyuno y sta a su vez estimula la secrecin de proteasas pancreticas.
Los productos resultantes de la digestin de las protenas son aminocidos libres y
oligopptidos. Los oligopptidos son degradados por enzimas presentes en el borde en cepillo
del intestino delgado a aminocidos libres, di y tripptidos. Una adecuada digestin o absorcin
de las protenas aparece cuando la secrecin o la activacin de las proteasas pancreticas son
insuficientes como en el caso de la fibrosis qustica.

Segn el resultado observado (TABLA N1), se pone a prueba la concentracin del sustrato con
respecto a la enzima, la relacin enzima-sustrato es el segundo factor con influencia sobre la
variable respuesta, esto se atribuye a que una mayor cantidad de enzima puede lograr una
mayor cantidad de enzima puede lograr una mayor y ms rpida conversin de sustrato a
producto, en este caso de protena a pptidos o aminocidos libres, sin embargo se debe tener
en cuenta que en procesos de hidrlisis este es uno de los factores a controlar y optimizar,
debido a que el uso excesivo de enzima es proporcional al costo del proceso; segn la grfica los
resultados no son los adecuados por lo que se infiere que hubo un mal manejo de los tubos
durante la reaccin.

Segn el resultado observado (TABLA N5), se puso a prueba los cambios de pH durante la
reaccin de hidrlisis, y as poder hallar el pH ptimo, si el proceso de hidrlisis no se controla,
el pH de la solucin cambiar despus del inicio de la hidrlisis debido a la formacin de grupos
aminos nuevos, los cuales son capaces de liberar o aceptar protones, dependiendo del pH de la
hidrlisis. A un pH bajo todos los grupos amino estn protonados y solamente parte de los
grupos carboxilo estn desprotonados, resultando en una captacin neta de protones por cada
enlace peptdico roto, causando un incremento del pH. A pH neutro y alcalino la hidrlisis resulta
en una disminucin de pH, pues todos los carboxilos estn desprotonados y solamente parte de
los grupos amino estn protonados. Teniendo un punto mximo donde se logra el mayor grado
de hidrlisis, debido a que las enzima son protenas y su estructura contiene cargas que afectan
su estructura, un cambio en el pH significa un cambio estructural de la protena, afectado el sitio
activo y obviamente la reaccin de hidrlisis.
 Hidrlisis enzimtica de protenas 8

Es importante conocer y profundizar sobre el tema de la hidrlisis enzimtica de las protenas,

ya que segn los estudios de investigacin Se sabe que la hidrlisis enzimtica de protenas
alimentarias libera pptidos que pueden exhibir diferentes actividades biolgicas. Entre los
diferentes grupos de pptidos bioactivos, destacan los pptidos inhibidores de la enzima
convertidora de la angiotensina (ECA). Los compuestos que inhiben esta enzima pueden facilitar
el control de la hipertensin arterial. Se han realizado ya algunos estudios con hidrolizados de
protenas alimentarias, y con los pptidos derivados de estas protenas que muestran actividad
inhibidora de la ECA, que han demostrado las propiedades antihipertensivas de estos
compuestos en animales y en pacientes hipertensos. Las protenas del huevo son una fuente de
nitrgeno muy importante en la dieta. Aunque se han estudiado menos que otras protenas
alimentarias, son tambin fuente de pptidos bioactivos que pueden modular la presin arterial.
En el momento actual se han descrito algunos pptidos con actividad vasodilatadora, y con
actividad inhibidora de la ECA, que provienen de la ovoalbmina hidrolizada con diferentes
enzimas.

Conclusin
Se desarroll tres experimentos, en los que se puso a prueba los efectos de la
concentracin sustrato-enzima, as como el cambio de pH, ya que stos cambios afectan
directamente a la hidrlisis enzimtica de las protenas; siendo la pepsina la enzima que
se activa en un medio cido, y as se hidroliza la protena hasta pptidos o aminocidos
para la absorcin de stas para el cumplimiento biolgico en los seres vivos.

Referencias Bibliogrficas
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hidrlisis enzimtica de protenas presentes en semillas de guandul (Cajanus cajan).
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HUEVO TRATADA CON PEPSINA SOBRE EL DESARROLLO DE HIPERTENSIN ARTERIAL
EN RATAS HIPERTENSAS. Cienc. Tecnol. Aliment. 2005 4(5), pp 368-372