UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTN TARAPOTO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

DEPARTAMENTO ACADMICO AGROSILVO PASTORIL

INFORME DE PRCTICAS PRE PROFESIONALES

OBTENCIN DE CALLOS EMBRIOGNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia

volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

UNSM T.

PRESENTADO POR:

Est: JUAN CARLOS GUERRERO ABAD

TARAPOTO PER

2006
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTN TARAPOTO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

DEPARTAMENTO ACADMICO AGROSILVO PASTORIL

AREA DE BIOLOGA

INFORME DE PRCTICAS PRE PROFESIONALES

OBTENCIN DE CALLOS EMBRIOGNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia

volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

UNSM T.

Ing. M.Sc. Armando D. Cueva Benavides Blgo.Msc. Winston Franz Ros Ruiz

REVISOR ASESOR

Ing. Henri Delgado Haya Est. Juan Carlos Guerrero Abad

CO ASESOR PRCTICANTE

TARAPOTO PER

2006
 DEDICATORIA

A Dios por la maravillosa vida

A mis queridos padres Crecencio Guerrero y

Mara Luisa Abad, por que han sido

el bastn de mis pasos como estudiante.

A mis queridos y

traviesos hermanos: Maria,

Gladis, Roger, Alexander

 AGRADECIMIENTO

x A la Universidad Nacional de San Martn por permitirme realizar mis

practicas pre profesionales.

x Al Blgo. M. Sc. Winston F. Ros Ruiz, por brindarme su apoyo como

asesor en el presente trabajo.

x De una manera muy especial al Ing. Henri Delgado Haya, por brindarme su

gran apoyo incondicional y el empuje a ser investigador.

x Al Blgo. Marco Len Martnez, por ser el iniciador de la idea del presente

trabajo.

x A mis queridos compaeros de laboratorio, para Melissa Castro Snchez,

Engels Padilla Gmez, Mike Anderson Corazn Givin, Flor Gonzles

Dvila, Salvith Ortiz Ramrez, quienes de alguna manera me brindaron su

apoyo y valiosas recomendaciones.

 RESUMEN DEL INFORME

La presente prctica pre profesional se llevo acabo en el Laboratorio de Tejidos

Vegetales de la Universidad Nacional de San Martn Facultad de Ciencias

Agrarias. Busco el adiestramiento en el manejo de tcnicas del cultivo In Vitro,

que consista en el uso y manejo adecuado de materiales, equipos y reactivos

aplicados en diferentes reas, paralelo a ello se desarrollo a manera de

investigacin una metodologa de regeneracin artificial para la especie

Plukenetia volubilis L.

Es por ello que se realizaron ensayos en Embriognesis somtica, para determinar

una posible ruta de regeneracin en tejidos cultivados a nivel In Vitro. Inicindose

de esa manera con la introduccin de embriones de semillas de Sacha Inchi a

condiciones In Vitro, con la finalidad de obtener brotes terminales sanos. Obtenidos

los brotes terminales en las plantas cultivadas, estos fueron cultivados e inducidos

a un medio de cultivo (M&S a concentracin total con vitaminas B5,

suplementado con 20 g/l de sucrosa, 2,5 g/l de phytagel, 5 mg/l de ANA, 2 mg/l de

BAP, 1 mg/l de KIN, 100 mg/l de myo-inositol y 10 mg/l de cido ctrico), dando

origen a la formacin de callos no diferenciados en forma desordenada.

Para el proceso del desarrollo, maduracin y germinacin de la formacin callosa,

se subcultivo los callos formados alrededor del explante, a un medio de cultivo

(M&S a media concentracin, suplementado con 3,5 g/l de agar + 4 g/l de carbn

activado + 20 g/l de sucrosa + 0,4 mg/l de Tiamina HCl. + 0,5 mg/l de cido

nicotnico), que genero la emergencia de primordios foliares.

 NDICE

Contenido Pg.

I. INTRODUCCIN... 01

II. OBJETIVOS... 02

III. ANTECEDENTES.. 03

3.1 Caractersticas del Cultivo 03

3.1.1. Origen y Distribucin. 03

3.1.2. Clasificacin botnica 03

3.1.3. Morfologa General.. 04

3.1.4. Condiciones Edafoclimaticas para su cultivo. 06

3.1.5. Plagas y enfermedades. 07

3.2. Cultivo de Tejidos Vegetales. 08

3.2.1 Generalidades... 08

3.2.2 Medios de Cultivo 09

3.2.3 Tcnicas de cultivo In Vitro.. 11

3.2.3.1. Regeneracin de Plantas

(Organognesis y Embriognesis)... 11

3.2.3.2. Factores que influyen la

embriognesis somtica.. 14

IV. ACTIVIDADES DESARROLLADAS...17

4.1. Reconocimiento de reas, equipos, reactivos

y materiales del laboratorio de cultivo de tejidos

vegetales de la UNSM T... 17

 4.1.1. reas del laboratorio... 17

4.1.2. Equipos del laboratorio.. 22

4.1.3. Materiales y reactivos 25

4.2. Callognesis en Sacha Inchi. 27

4.2.1. Formulacin y preparacin

de medios de cultivo 28

4.2.2. Protocolos para la preparacin

de medios de cultivo. 29

4.2.3. Seleccin y recoleccin del material vegetal... 31

4.2.4. Preparacin del material vegetal. 32

4.2.5. Procesos para la introduccin de embriones.. 32

4.2.6. Inicio al proceso de la generacin de

callos embriognicos.. 39

V. CONCLUSIONES.. 42

VI. RECOMENDACIONES. 43

VII. LITERATURA CONSULTADA 44

ANEXOS 47

1. Composicin del medio de cultivo de la

primera formulacin (Germinacin de embriones). 48

2. Composicin del medio de cultivo de la

segunda formulacin (Estimulacin a la callognesis).. 49

3. Composicin del medio de cultivo de la

tercera formulacin (Maduracin y

Germinacin de embrioides).. 50
4. Terminologas. 51

5. Abreviaturas 52

6. Diagrama de flujo... 53
 NDICE DE FOTOS

N de Fotos Descripcin Pg.

Foto N 01 Muestra prensada acc. acchilla 03

Foto N 02 Planta acc. Pacchilla 04

Foto N 03 Disposicin de hojas 04

Foto N 04 Hoja 04

Foto N 05 Disposicin de flores 05

Foto N 06 Inflorescencia 05

Foto N 07 Frutos inmaduros 05

Foto N 08 Fruto maduro 05

Foto N 09 Semillas 06

Foto N 10 Almendras 06

Foto N 11 Hormigas 07

Foto N 12 Atrofiamiento 07

Foto N 13 Diabrotica en sacha inchi 07

Foto N 14 Phytium sp.. 08

Foto N 15 Meloydogine spp. 08

Foto N 16 Colletrotrichum sp. 08

Foto N 17 rea de lavado de materiales 18

Foto N 18 rea de preparacin de medios 19

Foto N 19 rea de siembra y transferencia 19

Foto N 20 rea de incubacin 20

Foto N 21 Aclimatacin Fase I 21

Foto N 22 Aclimatacin Fase II 21

Foto N 23 Biblioteca 21

Foto N 24 Computadora 21

Foto N 25 Olla autoclave 22

Foto N 26 Balanza analtica 22

Foto N 27 Destilador 23

Foto N 28 Peachimetro 23

Foto N 29 Refrigerador 24

Foto N 30 Materiales de vidrio 25

Foto N 31 Materiales de de metal 26

Foto N 32 Reactivos 27

Foto N 33 Preparacin de medios de cultivo 28

Foto N 34 Seleccin del material vegetal 31

Foto N 35 Escarificacin 32

Foto N 36 Cmara hmeda 32

Foto N 37 Preparacin de soluciones desinfectantes 33

Foto N 38 Retiro de testa 35

Foto N 39 Almendras 35

Foto N 40 Preparacin del rea de siembra 36

Foto N 41 Desinfeccin con 1,5% de NaOCl 37

Foto N 42 Enjuague 37

Foto N 43 Excisin de almendras 38

Foto N 44 Desarrollo In Vitro de plantas 39

Foto N 45 Inicio de callogensis 40

Foto N 46 Callo no diferenciado 40

Foto N 47 Germinacin de embrioides 41

 I. INTRODUCCIN

La Regin San Martn esta ubicada dentro del llano Amaznico del Per,

albergando una gran biodiversidad de especies vegetales promisorias intactas a la

investigacin, capaces de poder generar alternativas a la problemtica de la

alimentacin, la medicina, la artesana, etc. Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.),

es una oleaginosa oriunda del Per, por ser utilizada desde nuestro incanato como

un sustituto alimenticio y encontrarse en forma silvestre conviviendo con las

comunidades nativas y zonas rurales de la Regin San Martn.

En la actualidad Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L.), tiene una gran perspectiva

para la produccin y exportacin de aceites a los mercados europeos por contener

cidos grasos esenciales como los Omega 9, Omega 6 y Omega 3 esenciales en la

nutricin alimenticia.

El Cultivo de Tejidos Vegetales es una herramienta de la biotecnologa de gran

utilidad, aplicada en aquellas especies vegetales que puedan ejercer la

totipotencialidad celular, que no es ms que la capacidad que tiene una clula

vegetal en dar origen a un nuevo individuo bajo ciertas condiciones fsicas y

qumicas que se les brinda a nivel In Vitro. La embriognesis somtica es una

eficiente forma de multiplicacin clonal, que consiste en cultivar clulas o tejidos

somticos bajo la induccin de ciertas concentraciones hormonales (auxinas,

citoquininas y/o giberelinas), generando un proceso de multiplicacin celular, que al

ser acondicionados a medios de cultivo enriquecidos dan origen a la formacin de

embriones sin tener que pasar obligatoriamente por la unin de clulas gameticas

(sexuales).
 II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Desarrollar un protocolo para la obtencin de callos embriognicos en

Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L), a partir de pices meristematicos,

en el Laboratorio Cultivos de Tejidos Vegetales de la UNSM Morales

2006.

2.2. Objetivos especficos:

Adiestramiento en los procesos y tcnicas del cultivo In Vitro.

Establecer embriones de sacha inchi a condiciones In Vitro.

Acondicionar brotes terminales que permitan la obtencin de callos a

partir de plntulas cultivas In Vitro.

Analizar y publicar los resultados obtenidos.

 III. ANTECEDENTES

3.1. CARACTERSTICAS DEL CULTIVO

3.1.1. ORIGEN Y DISTRIBUCIN.

Segn Valles (1991), menciona que el Sacha Inchi (P. volubilis

L.) es una planta voluble, trepadora y semileosa. Fue descrita en

1753. Botnicamente pertenece a la Familia Euforbiacea. Esta

distribuida en el trpico latinoamericano desde el sur de Mxico,

Indias Occidentales, la Amazonia y el Acre de Bolivia. En nuestro

pas se ha recolectado en Madre de Dios, Huanuco, Oxapampa, San

Martn, Rodrguez de Mendoza, Ucayali (Pucallpa, Contamana y

Requena), Putumayo, Iquitos, Junn, Cuzco y Caballococha.

3.1.2. CLASIFICACIN BOTNICA

Arvalo (1996), menciona la clasificacin botnica del sacha inchi

como se muestra en la (Foto N 01)

ORDEN : Euphorbiales

FAMILIA : Euphorbiaceae

GENERO : Plukenetia

ESPECIE : volubilis L.

Foto N 01: Muestra prensada acc. pacchilla

3.1.3. MORFOLOGA GENERAL

La Planta se caracteriza

por ser:

Voluble, perenne,
semileosa con
crecimiento indeterminado,
como se muestra en la
(Foto N 02)

Foto N 02: Planta acc. pacchilla

Las Hojas son:

Foto N 03: Disposicin de Hojas Foto N 04: Hoja

Alternas, acorazonadas, aseruladas, trinervadas con una nervadura

central dirigida al pice acuminado (fotos N 03 y 04), as mismo en

la base del limbo presenta 2 glndulas laterales (albergando en las

maanas gotitas de azucares orgnicos) y una pequea proyeccin

intermedia denominada estipela (muy variable en los diversos

ecotipos).
Con respecto a las Flores, estas son:

Foto N 05: Dispos. de flores Foto N 06: Infloresc.

Hermafroditas monoicas, las flores masculinas son pequeas,

blanquecinas y dispuestas en racimos, en la base del racimo y

lateralmente se encuentra una, dos y hasta tres flores femeninas, en

las flores femeninas se aprecia que el nmero de estigmas es igual al

nmero de ovarios como se muestran en las (fotos N 05 y 06).

Foto N 07: Fruto Foto N 08: Fruto maduro

Los frutos son cpsulas dehiscentes, distribuidos en lculos, el

nmero de lculos esta en funcin a la variabilidad gentica de sacha

inchi, presentando cuatro, cinco y hasta siete lculos (fotos N 07 y

08).
 La Semilla.

Foto N 09: Semillas Foto N 10: Almendras

Tiene forma ovalada de color marrn-oscura, abultada hacia el centro

y aplastada hacia los costados (foto N 09), al abrir la testa de la

semilla observamos la almendra de color blanco que esta protegido

por una pelcula blanquecina (foto N 10).

3.1.4. CONDICIONES EDAFOCLIMATICAS PARA SU CULTIVO

Altitud.

Sacha Inchi se adapta desde los 100 a 2000 msnm (Manco, 2005).

Registrndose as mismo las mejores semillas (> 12mm) a

plantaciones establecidas desde los 600 m.s.n.m.

Clima.

Manco (2005), menciona que los parmetros de temperaturas

adaptables a esta planta esta entre 10 y 36C, temperaturas altas

son desfavorables por que ocasiona aborto en flores y la

conformacin de semillas pequeas.

Luz.

Uno de los factores ecolgicos importantes en esta especie es la luz,

mientras mas luz reciba la cubierta vegetal mayor es la poblacin de

brotes, flores y frutos.

Suelo.

Valles (1991), menciona que se adapta a suelos cidos con

contenidos muy significativos en aluminio, as mismo prospera en

reas pobladas por shapumba (Pteridium aquilinun) y Cashucsha

(Imperata brasiliensis).

Para tener un buen suelo en la produccin de Sacha Inchi, este

debe tener un nivel de fertilidad que va de medio a alto, que tenga un

buen drenaje y una buena profundidad.

Agua.

La disponibilidad del agua al inicio es importante en el marco de la

siembra directa y dentro del transplante si se hace mediante

viverizacin, es indispensable tambin en su etapa de giamiento y

dentro de la floracin y fructificacin, al efectuar los riegos tratar de

hacer a su capacidad de campo y no encharcarlos para evitar el

riesgo de favorecer condiciones que permiten elevar altas

poblaciones del Nematodo del nudo (Meloidogyne spp.).

3.1.5. PLAGAS Y ENFERMEDADES

Plagas.

Las plagas ms visibles son indaneros, diabrticas, grillos

cortadores, hormigas azucareras, etc. Como se observa en las

fotos (N 11, 12 y 13).

Foto N 11: Hormig. Foto N 12: Atrofiam. Foto N 13: Diabrotica

Enfermedades.

La enfermedad ms saltante es el nemtodo del nudo asociado a

Fusarium spp. Que aniquila a la planta durante su periodo de

produccin, tambin existen otras enfermedades como se muestra

en las imagines (fotos N 14, 15 y 16).

Foto N 14: Phytium sp. Foto N 15: Meloydogine spp. Foto N 16: Colletrotrichum sp.
3.2. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

3.2.1. GENERALIDADES.

Ruiz (2003), define al cultivo de tejidos In Vitro, en su acepcin

amplia como un grupo heterogneo de tcnicas mediante los cuales

un explante (parte separada de un vegetal, clulas, tejidos,

embriones, etc) con potencialidad de diferenciacin, se cultiva bajo

condiciones aspticas, en presencia de un medio de cultivo

constituido por macro y micronutrientes, vitaminas y hormonas que

se incuban a condiciones ambientales controladas.

El cultivo de tejidos vegetales, es una tcnica de propagacin de las

plantas que se halla a disposicin del cultivador, pero no es

ampliamente usado debido a su poca difusin (Mejia, 1994).

Roca Y Mroginski (1991), mencionan que la investigacin en

cultivos de tejidos vegetales incluye un rango amplio, desde la

investigacin bsica sobre los procesos fisiolgicos ocurridos in

vitro, hasta llegar a las investigaciones aplicadas y al desarrollo de

tecnologas en la propagacin clonal o en el mejoramiento gentico

de plantas.

Las tcnicas de cultivos In Vitro han contribuido no solo a un mejor

entendimiento de los eventos de diferenciacin celular, si no a un

mejor aprovechamiento de tales eventos en la explotacin ms

eficiente de las plantas

 Al igual que otros mtodos de multiplicacin vegetativa o asexual,

los individuos descendientes de una planta madre cultivada in vitro

son clones, es decir copias genticamente iguales entre ellas e

idnticas a la madre. En plantas propagadas por semilla la

descendencia no es clonal, pues cada semilla tiene su propia base

gentica que resulta de la recombinacin de genes de ambos

progenitores (Roca y Miroginski, 1991).

3.2.2. MEDIOS DE CULTIVO

Krikorian (1991), Menciona que el crecimiento de las clulas y

tejidos cultivadas a nivel In Vitro, requieren de compuestos

orgnicos e inorgnicos dispuestos en diversas concentraciones de

macro y microsales, compuestos carbonados, vitaminas, hormonas,

aminocidos, etc. participando en una forma responsable y activa en

el crecimiento de los explantes introducidos a nivel In Vitro.

Barrera (2004), Mediante una prueba de ensayos, concluy que el

mejor medio de cultivo que manifest mejores resultados en el

crecimiento de embriones de Plukenetia volubilis estaba

formulado a base de sales a concentracin total de M&S

(Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 0,4 mg/l de tiamina,

0,5 mg/l de cido nicotnico, 20 g/l de sucrosa, 2 g/l de carbn activo

y 2,5 g/l de gel rite todo esto ajustado a un pH = 5,8. Manifestando

como recomendacin la suplementacin de compuestos

antioxidantes debido a la presencia de fenolizacin en un 40%.

Para el caso de embriognesis somtica se ha utiliza el medio

desarrollado por (Murashige et al, 1962). Debido a la concentracin

alta de sales es muy benfica en el proceso de la embriogenesis

somtica (Litz, R. & Jarret, R. 1991).

Wertherell (1984), ha demostrado que es posible aumentar el

potencial embriognico en zanahoria utilizando concentraciones

altas de sacarosa (2% a 3% hasta 12%), el nitrgeno suministrado

como nitrato o como in amonio es esencial en el desarrollo y

maduracin de los callos, mencionado en (Litz, R. & R. Jarret.

1991)

Roca et al (1991), comprobaron que el medio de cultivo que

regener plantas de Stylosanthes sp. contena sales M&S

(Murashige y Skoog, 1962) y Vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968),

suplementado con 1mg/L de ANA y 1 mg/L BAP.

Roca y Mroginski (1991), mencionan que el empleo de sustancias

antioxidantes como el cido ascrbico, L Cistena,

Polvinilpirrolidona), puede ser efectivo para el cultivo de explantes

que muestran altos contenidos de polifenoles.

3.2.3. TECNICAS DE CULTIVO IN VITRO.

Dentro de las tcnicas de cultivo in vitro tenemos:

Micropropagacin vegetal

Regeneracin de plantas (embriognesis y organognesis)

Cultivo de meristemas

Cultivo de suspensiones de clulas vegetales

Cultivo de protoplastos

Cultivo de anteras

Cultivo de vulos y embriones

3.2.3.1. REGENERACIN DE PLANTAS (embriognesis y

Organognesis).

Haberlandt (1902), propuso que todas las clulas de los

vegetales tienen la capacidad de poder formar plantas

completas, quiere decir que estas plantas tienen un grado

de totipotencialidad (Krikorian et. al., 1969)

Litz (1991), menciona que la regeneracin directa de

plantas (organognesis) y la regeneracin indirecta a partir

de callos (embriognesis somtica), se ha utilizado como

una alternativa a la propagacin de plantas y debido a la

diferente fisiologa de los vegetales no se ha podido

generalizar por que existe muy poca estabilidad gentica

en el cultivo de los callos (en su forma, estructura y

viabilidad.)
Embriognesis Somtica.

La Embriognesis somtica comprende la formacin de

un embrin a partir de una clula diferente a un gameto o

al producto de la unin de gametos, siendo conocida en la

naturaleza como una forma de apomixis, la cual recibe el

nombre de embrionia adventicia (Merkle et al, 1995).

Los embriones somticos formados son: estructuras

bipolares con un eje radial apical que no poseen conexin

vascular con el tejido materno. Estas estructuras bipolares

son capaces de crecer y formar plantas completas y

normales (Gmez, 1998).

Segn Boner (1965), dos condiciones tienen que ser

satisfechas para que ocurra la embriognesis:

a) Las clulas especializadas tienen que estar separadas

del tejido adyacente, tal que sea una clula simple.

b) Las clulas especializadas tienen que estar rodeadas de

un medio de cultivo que contenga los nutrientes

necesarios para el crecimiento del embrin (Halperin,

1995)
El desarrollo de un sistema experimental para la

regeneracin de plantas va embriognesis somtica

incluye los siguientes pasos:

Induccin de los embriones somticos.

Proliferacin

Desarrollo de los embriones somticos

Maduracin

Germinacin y conversin en plantas

Induccin

Segn Parrot 1993, la induccin del estado embriognico

incluye la induccin de los mismos mecanismos genticos

que conllevan a la embriognesis cigtica. Contrariamente

a los embriones cigticos los embriones somticos no

contienen un nuevo grupo de genes sino que poseen la

misma combinacin gentica de la planta fuente de

explante. El empleo de la auxina es la mejor manera de

inducir la formacin de clulas embriognicas desde

clulas somticas. La induccin de la divisin celular como

una respuesta a esta auxina puede resultar en un callo con

crecimiento desorganizado o bien en un crecimiento

polarizado coordinado para la formacin de un embrin"

(Gmez 1998).
Desarrollo

El estadio temprano o pre globular de los embriones

somticos son fcilmente reconocidos generalmente por el

contenido de citoplasma denso y la ausencia general de

vacuolizacin (Krikorian, 1995). Durante esta fase las

auxinas son inhibitorias para el desarrollo de los

agregados celulares embriognicos a embriones

(Halperin, 1995).

Proliferacin

Uno de los ms poderosos aspectos de la embriognesis

somtica que permite su aplicacin en la propagacin

masiva y la transferencia de genes es la habilidad de los

cultivos embriognicos de muchas especies de plantas a

proliferar o multiplicarse indefinidamente (Merkle et al.,

1995). El factor ms fuerte asociado con la proliferacin

continua de las clulas embriognicas es la auxina. Sin

embargo parece ser que el efecto de esta fitohormona no

puede ser considerado independiente a la reduccin de la

concentracin de nitrgeno, existiendo una fuerte

evidencia de la interaccin entre ambos (Ram et al.,

1982/cit. por Gmez R., 1998). Adems el nivel de auxina

necesario para mantener la embriognesis repetitiva vara

de acuerdo a la especie (Merkle et al., 1995).

 Maduracin

La maduracin es el perodo en el que el embrin somtico

sufre expansin de sus clulas, y la acumulacin de

sustancias de reserva (Bewley y Black, 1985/cit. por

Gmez R., 1998). En esta etapa juega un papel

fundamental la presencia de nitrgeno en el medio de

cultivo, siendo necesario el suplemento con nitratos,

amonio, aminocidos y casena hidrolizada. Los

carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones

de 3-6% son esenciales, junto a bajas concentraciones de

oxigeno en el medio, lo cual permite una maduracin total

y evita la germinacin precoz (Merkle et al., 1995).

3.2.3.2. Factores Que Influyen En La Embriognesis Somtica

Explante

Litz & Jarret (1991), mencionan que virtualmente todos los

tejidos tienen la capacidad para formar callos, pero sin

embargo pocos son los explantes que manifiestan la

formacin de callos embriognicos, comnmente se han

utilizado explantes como cotiledones, hipocotilos,

embriones, pices caulinares, segmentos de tallos, hojas,

races, inflorescencias inmaduras que han dado origen a la

formacin de callos embriognicos.

Muchos factores influyen en la conducta del explante en el

medio de cultivo (Murashigue, 1962). Estos incluyen (1) el

rgano que esta sirviendo como la fuente de tejido, (2) la

edad fisiolgica y ontognica del rgano, (3) la estacin en

que el explante es obtenido, (4) el tamao del explante y (5)

las cualidades globales de la planta de la cual se ha

obtenido el explante (Thorpe & Patel, 1984/cit por Thorpe

et al., 1991).

Reguladores de Crecimiento

La presencia de 2,4-D, para la induccin y proliferacin de

embriones somticos puede afectar la estabilidad gentica

de las clulas embriognicas (Merkle et al, 1995).

El picloran es otro reactivo que se utiliza reemplazando al

2,4-D para inducir embriognesis, pudindose adicionar en

concentraciones de alrededor de 0.1 mg/l (Pliego Alfaro,

1988).

Segn Merkle et al, 1995, la incidencia de variacin

somaclonal podra aumentar al incrementarse la

concentracin de 2,4-D empleada en el medio y la duracin

a la exposicin a esta hormona.

Medio de cultivo

La induccin de embriognesis somtica requiere

usualmente no mas de 5 12.5 uM de amonio en el medio.

Niveles muy altos de amonio pueden inhibir la

embriognesis (Merkle et al., 1995).

Segn Ammirato (1983), la presencia de nitrgeno

reducido en el medio promueve la embriognesis, pero

existen algunos casos en que la adicin de aminocidos

disminuye la produccin de embriones (Von Arnold,

1987/cit por Fernndez Guijarro B. et al., 1995).

La importancia del abastecimiento de nitrgeno durante la

embriognesis puede ser un reflejo de los requerimientos

de nitrgeno por la continua sntesis de protenas, cidos

nucleicos y substancias de reserva (Merkle et al., 1995).

 IV. ACTIVIDADES DESARROLLADAS

4.1. Reconocimiento de reas, equipos, reactivos y materiales del

laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la UNSM T.

Es de vital importancia reconocer y conocer satisfactoriamente el uso y

manejo de los materiales, equipos, reactivos y como saber aplicarlos en el

trabajo In Vitro, teniendo como nica finalidad que el cultivador realice el

mejor trabajo a medida que lo ejecute, el conocimiento de la organizacin y

el manejo adecuado de los materiales y equipos resulta ser una eficaz causa

para obtener resultados satisfactorios a nivel de investigacin, pues el

conocimiento del correcto funcionamiento y aplicacin de los tems

mencionados anteriormente influye bastante en la duracin y permanencia

de los entes que integran el Laboratorio.

Para tal caso a continuacin se menciona algunas de las pautas que se

debe tener en cuenta en el reconocimiento y manejo de reas, equipos,

reactivos y materiales ms usuales el Laboratorio de Tejidos Vegetales.

4.1.1. reas del Laboratorio

El laboratorio de tejidos vegetales se organiza en una forma integral

mediante reas que permita facilitar el desarrollo dinmico y

sincronizado de la actividad que se este realizando.

rea de lavado y preparacin de materiales

En esta rea se efecta el lavado y la preparacin de materiales de

vidrio, plstico y metal provenientes de las reas de: siembra y

transferencia, preparacin de medios de cultivo, aclimatacin, y

aquellos frascos contaminados ya estriles (foto N 17).

Foto N 17: rea del Lavado de Materiales

rea de esterilizacin y preparacin de medios de cultivo.

Esta rea cumple funciones de preparacin y esterilizacin de medios

de cultivo, agua destilada, materiales de vidrio, etc. As mismo se

realiza la preparacin de soluciones stock, la calibracin del pH, el

dispensado y empaquetado de los frascos que contienen el medio de

cultivo, etc. Como se aprecia en la (foto N 18).

Conjuntamente a esta rea existen espacios para la estufa, el

refrigerador, y el destilador que son indispensables para el desarrollo

del trabajo antes mencionado.

 Foto N 18: rea de preparacin de medios de cultivo

rea de siembra y transferencia

En esta rea del laboratorio se realiza el trabajo de excisin,

inoculacin y transferencia de los explantes a los medios de cultivo.

Dado de que en este ambiente se necesita altos niveles de limpieza

ambiental es indispensable la instalacin de gabinetes de flujo

horizontal o vertical de aire filtrado bajo presin (cmara de flujo

laminar). (foto N 19)

Foto N 19: rea de siembra y transferencia

rea de incubacin

Los cultivos se incuban en gabinetes o cmaras de crecimiento. Esta

rea debe proporcionar condiciones fsicas controladas en T (20-

28C), iluminacin (1000 a 5000 lux) y una humedad relativa de (70%

a 80%). En ella se instalan estanteras metlicas distribuidas en forma

ordenada y en dimensiones variables y dentro de las funciones que

tiene el rea de incubacin es optimizar el desarrollo de los explantes

cultivados en los medios de cultivo dentro de sus condiciones

atribuidas (foto N 20).

Foto N 20: rea de incubacin

rea de preaclimatacin

En este recinto las plntulas desarrolladas a nivel In Vitro y prximas

a aclimatarse, estn expuestas al medio ambiente, buscndose iniciar

los primeros pasos a la aclimatacin.

rea de Aclimatacin
Consta de dos etapas, una de ellas se trabaja a nivel de laboratorio y

la otra a nivel de vivero, dentro de la primera etapa se efectiviza los

procesos del lavado, desinfeccin y sembrado de las plntulas en

sustratos estriles, pasados algunos das en cmara hmeda se

procede con la segunda etapa que consiste en llevar aquellas

plntulas que estn en cmara hmeda a condiciones de vivero, con

la finalidad de criarlas (fotos N 21 y 22).

Foto N 21: Fase I Foto N 22: Fase II

rea de oficina

Constituida por materiales y mobiliarios como libros, escritorios,

catlogos, documentos, reportes y un sistema de cmputo que

permite la facilitacin del procesamiento de datos, redaccin y

publicacin de trabajos realizados en el laboratorio de tejidos

vegetales (fotos N 23 y 24).

Foto N 23: Biblioteca Foto N 24: rea de redaccin

4.1.2. Equipos del laboratorio

Los equipos del laboratorio son los componentes que ayudan en el

suceso de una actividad, tal es as que es importante su uso y manejo

adecuado. La Facultad de Ciencias Agrarias cuenta con los equipos

necesarios para realizar trabajos relacionados al rea de

biotecnologa.

Autoclave

Equipo que facilita la esterilizacin de

Medios de cultivo, Materiales de metal,

Materiales de Vidrio, Agua destilada, etc.

La esterilizacin se llevaba acabo

mediante vapor a una presin de 1

atmsfera o 15 psi con 121C de

temperatura por un lapso de 15 minutos,

propicindose la destruccin de bacterias,

Foto N 25: Olla autoclave
hongos y esporas. (Foto N 25)

Balanza Analtica

La balanza analtica permite pesar

reactivos con precisin (mg y g),

destinados a la preparacin de la

preparacin de soluciones stock,

medios de cultivo, etc. (foto N 26)

Foto N 26: Balanza analtica

Destilador

El destilador (foto N 27), proporciona agua

destilada qumicamente pura ajustandose

aproximadamente a un pH 7,0; el agua esta

destinada a la preparacin de medios de

cultivo, lavado de materiales de vidrio y metal,

esterilizacin de la misma en pequeos

volmenes para ser usada en la preparacin de

soluciones stocks, etc.

Foto N 27: Destilador
pH-metro

La foto N 28, muestra el pH-metro que

permite medir el grado de concentracin de

iones (H+ y/o OH-) en la preparacin de

medios de cultivo, consta de un tablero

digital y un electrodo sensible que sumergido

en la solucin de preparacin da como

resultado la lectura del pH

Foto N 28: peaachimetro

Refrigeradora

Es un equipo que proporciona una cmara de

fri, destinada a la preservacin bajo

temperaturas bajas de soluciones estoks,

vitaminas, hormonas, compuestos orgnicos

(agua de coco), agua destilada estril, etc.

(foto N 29)

Foto N 29: Refrigerador

 Cmara de Flujo laminar

Es un equipo que facilita las actividades de desinfeccin, excisin y

transferencia de explantes a los medios de cultivo, proporcionando un

ambiente asptico durante el proceso del trabajo. Para el uso es muy

importante llevar en una forma ordenada la integracin de los

materiales que se utilizan dentro de ella, facilitando as un espacio

mximo en la mesa de trabajo, es muy importante el uso de mandiles

y mascarillas y evitar en lo posible la salida continua de la cmara,

esto evitara tener bajos riesgos en contaminacin.

Microscopio compuesto

Este equipo es muy elemental en un laboratorio de Tejidos por que

permite la observacin de clulas vegetales, tales como semillas,

callos, tejidos, etc.

Estereoscopio

Es un equipo de fcil uso, prctico en la observacin de semillas,

yemas laterales, pices meristemticos. Facilita realizar cortes y

visualizar la morfologa y la estructura de rganos no sensibilizados a

simple vista. .

4.1.3 Materiales y Reactivos

El laboratorio de Tejidos Vegetales de la UNSM FCA, cuenta con

materiales y reactivos; dentro de los materiales estn aquellos

compuestos por metal, vidrio y plstico. Los reactivos son aquellos

compuestos que contienen sales macro(N, P, K, Mg, Ca) y micro (Cu,

Zn, Cl, I, Co, Mo, Mn, Fe, B, Na,), hormonas, vitaminas, etc.

Materiales de vidrio

Los materiales de vidrio estan compuestos por frascos de 15 onzas,

tubos de ensayo, placas petri, pipetas, probetas, vasos de precipitado,

frascos erlenmeyer, mechero, todos ellos graduados y dispuestos en

diferentes tamaos. (foto N 30)

Foto N 30: Materiales de Vidrio

Materiales de metal

El Laboratorio cuenta con materiales quirrgicos tales como pinzas,

mangos para bisturs, bisturs en diferentes nmeros, esptulas de

bronce y de acero inoxidable, tijeras, etc. (foto N 31)

Foto N 31: Materiales de metal

Reactivos

El Laboratorio tambin cuenta con reactivos e insumos qumicos que

se utilizan en base a la formulacin de los medios de cultivo, los

insumos estn contenidos en compuestos de: Sales minerales

formuladas por Murashige & Skoog (1962), cido ctrico, Myo-inositol,

Tiamina-Hcl, Piridoxina, Botina, cido nicotnico, cido Naftalen

actico, cido 2,4-Dicloro-fenoxi-actico, cido indol Actico, cido

indol Butrico, Bencil amino purina, Kinetin, Acido Giberelico,

Sucrosa, Fructuosa, Carbn activo, Agar, Phytagel, vitaminas, Agua

de coco (foto N 32).

Foto N 32: Reactivos

 Otros materiales.

Mascarillas, Rejillas, Alcohol a 96, Leja, Fsforo, Algodn, Bandejas,

Baldes, Papel toalla, Papel aluminio, clear plastic wrap, Carrito de

transporte, Detergentes, Mandiles, Toallas, Fibra de coco,

Hexagonales de plstico, magentas, tapas de tubos, Papel de

reciclaje, Hilo pabilo, Pizetas, propipeta, cmara digital, trpode, etc.

4.2. Callognesis en Sacha Inchi

4.2.1 Formulacin y preparacin de medios de cultivo

La preparacin de los medios de cultivo se hizo a base de tres

formulaciones , siguiendo un mismo protocolo de preparacin para

cada caso (foto N 33), variando las concentraciones de aplicaciones

M&S y adiciones de hormonas y vitaminas como se hace mencin a

continuacin.

Primera formulacin (Germinacin de embriones)

Formula de medio de cultivo utilizado en un litro para siembra:

M&S (Macro y microsales a concentracin total)* + 3,5 g de agar +

2 g Carbn activo + 0,5 mg cido nicotnico + 0,4 mg Tiamina-HCl +

20 g De Sucrosa, todo esto ajustado a un rango de pH: 5.7 5.8

Segunda formulacin (Estimulacin a la callogenesis)

Formula de medio de cultivo utilizado en un litro para siembra:

M&S (Macro y microsales a concentracin total)* + 2,5 g de phytagel

+ 100 mg de myo-inositol + 10 mg de cido ctrico + B5( Vitaminas a

 concentracin total)* + 30 gr. De sucrosa + 5 mg de ANA + 2 mg de

BAP + 1 mg de KIN, todo esto ajustado a un rango de pH: 5,7 5,8.

Tercera formulacin (Maduracin y germinacin de embriodes)

Formula de medio de cultivo utilizado en un litro para siembra:

M&S (media concentracin en macro y microsales)* + 3,5 g de agar +

2 g de carbn activado + 20 g De sucrosa + 0,8 mg de Tiamina HCl.

+ 1,0 mg de cido nicotnico

Foto N 33: Preparacin de medios de cultivo

 4.2.2. Protocolos para la preparacin de medios de cultivo.

Protocolo del medio de cultivo para la germinacin de

embriones y embroides.

9 Lavar y enjuagar con agua destilada frascos de 15 onz.

9 Colocar en un vaso precipitado de 1L. 500 ml de agua destilada.

9 Agregar los Stocks A, B, G, C, D, E, F*, de acuerdo a los

requerimientos de cada la formulacin.

9 Agregar vitaminas.*

9 Agregar la sucrosa

9 Agregar el carbn activo.

9 Enrazar a 1L. de solucin.

9 Medir el pH

9 Agregar el gelificante *

9 Dispensar 50 ml de medio de cultivo a cada frasco de 15 onz.

9 Tapar y amarrar con papel aluminio y papel reciclado los frascos

de 15 onz.

9 Autoclavar los frascos a 1 atm por 15 minutos, a una temperatura

de 121 C.

9 Agitar suavemente y dejar enfriar al medio ambiente.

9 Rotular y almacenar en el rea de incubacin o refrigerador.

* Las descripciones se muestran en los anexos.(anexo 1 y anexo 3)

 Protocolo del medio de cultivo para la formacin de callos

9 Lavar y enjuagar con agua destilada tubos de ensayo de

25x150mm.

9 Colocar en un vaso precipitado de 1L. 500 ml de agua destilada.

9 Agregar los Stocks A, B, G, C, D, E, F*, de acuerdo a los

requerimientos de la formulacin.

9 Agregar (vitaminas, hormonas, antioxidantes).*

9 Agregar la sucrosa

9 Enrazar a 1L. de solucin.

9 Medir el pH

9 Agregar el gelificante *

9 Dispensar 15 ml de medio de cultivo a cada tubo de ensayo.

9 Tapar con papel aluminio y con una tapa de plstico a los tubos de

ensayo.

9 Autoclavar los tubos de ensayo, a 1 atm por 15 minutos, dentro

de una temperatura de 121 C.

9 Agitar suavemente y dejar enfriar al medio ambiente.

9 Rotular y almacenar en el rea de incubacin o refrigerador.

*Las descripciones se muestran en los anexos.(Anexo 2)

4.2.3. Seleccin y recoleccin del material vegetal

La seleccin y coleccin del material vegetal se hizo de la

accesin pacchilla, ubicada en el distrito de Cacatachi a unos 5

Km carretera Fernando Belaunde Terry, partiendo desde la

ciudad de Tarapoto.

Se procedi a colectar en forma manual los frutos maduros y

secos (foto N 34), para luego ser llenados en una bolsa de

polipropileno y trasladados al laboratorio.

Foto N 34: Seleccin del material vegetal

4.2.4. Preparacin del material vegetal.

Obtenidos los frutos se procedi a:

Separar las cpsulas del fruto.

Escarificar las cpsulas hasta obtener las semillas de color

marrn.( foto N 35)

Desinfectar las semillas con una concentracin de 1,5% de NaOCl

por un lapso de 10 minutos.

Lavar, enjuagar con agua corriente y acondicionar en una placa

estril mediante una cmara hmeda por un lapso de 24 horas,

con el fin de hidratar los endospermos y facilitar los cortes.

(foto N 36)

Foto N 35: Escarificacin Foto N 36: Cmara hmeda

4.2.5. Procedimiento para la Introduccin de embriones - primera

formulacin (Germinacin de embriones)

Preparacin de frascos.

Para la preparacin de los frascos se procedi a:

9 Colocar 4 frascos de 15 Onz. en la mesa de trabajo.

9 Acondicionar un mechero en actividad.

9 Asperjar alcohol etlico de 96 en la parte interna del frasco.

9 Acercar la boca del frasco a la flama del mechero, con la finalidad

de que se ejecute la combustin interna del alcohol logrndose la

incinerizacin de microorganismos contenidos dentro del frasco.

9 inmediatamente tapar con papel aluminio.

9 Hacer esto con cada uno de los frascos y ponerlos a disposicin a

la recepcin de las soluciones desinfectantes y almendras.

Preparacin de la solucin desinfectante y tensoactiva

Para la preparacin de las soluciones desinfectantes se utilizo la

aplicacin de la ley de concentraciones.

Foto N 37: Preparacin de soluciones desinfectantes

 C1 x V1 = V2 x C2

Donde:

C1 = Concentracin inicial del NaOCl y/o Alcohol etlico.

V2 = Volumen inicial del NaOCl y/o Alcohol etlico.

C2 = Concentracin final de la solucin

V1 = Volumen final de la solucin.

Preparacin de 100 ml de NaOCl a una concentracin de 1,5%. (foto

N 37)

5,25% x X = 100 ml x 1,5%

X = 100 ml x 1,5%
5,25%

X = 28,57 ml de NaOCl aplicados a 71,43 ml de Agua destilada.

Nota.

El mismo procedimiento es para la preparacin de la solucin

tensoactiva y desinfectante del alcohol etlico al 70% y/o 70. Las

soluciones desinfectantes fueron albergadas en dos frascos de los

cuatro preparados anteriormente, debidamente tapados y rotulados.

Preparacin de las almendras

Despus del acondicionamiento de las semillas en cmara hmeda

por 24 horas se procedi a:

9 Lavar las semillas con agua corriente y agua destilada y

disponerlas sobre una placa petri estril.

9 Rociar la pinza y las manos con alcohol de 96, y dejarse secar al

medio ambiente.

9 Con la pinza retirar la testa de las semillas con la finalidad de

obtener las almendras de color blanquecino y ponerlas sobre una

placa estril (fotos N 38 y 39).

9 Terminada la obtencin de las almendras, disponerlas en uno

frasco de los cuatro preparados anteriormente.

9 Tapar y rotular con el papel aluminio.

Foto N 38: Retiro de testa Foto N 39: Almendras

Acondicionamiento de la cmara de transferencia

Para ejecutar la desinfeccin de las almendras se procedi a:

9 Desinfectar la mesa de trabajo.

9 Transportar e introducir dentro de la cmara a los tres frascos que

contienen las almendras, las soluciones desinfectantes. Y el

cuarto frasco como colector de los enjuagues realizados en el

proceso de desinfeccin.
9 As mismo trasportar, introducir y organizar en la cmara de

transferencia, 2 erlenmeyer de 150 ml conteniendo agua destilada

estril, 1 erlenmeyer vaci estril, medios de cultivo para

germinacin de embriones, pinzas (1 grande, 1 pequea), 2

mangos para bistur, 2 hojas de bistur N 10, placas petri (2

grandes, 1 pequea), reloj, plumn marcador, segmentos de clear

plastic wrap para envolver los frascos, mechero, frasco con

alcohol, aspersor. (foto N40)

9 Esterilizar las pinzas y los bisturs y colocarlos sobre los bordes de

las placas petri.

9 Dejar enfriar.

Foto N 40: Preparacin del rea de siembra

Desinfeccin de las almendras.

Para la desinfeccin de las almendras se procedi a:

9 Sumergir las almendras a la solucin con 70% de alcohol, por un

lapso de 10 segundos.

9 Desechar el alcohol al frasco colector y vaciar las almendras

dentro de una placa petri.

9 Con la ayuda de la pinza grande introducir las almendras una por

una al erlenmeyer estril.

9 Agregar al erlenmeyer la solucin desinfectante con 1,5% de

NaOCl y agitar por un lapso de 10 minutos (fotos N 41 y 42)

9 Desechar la solucin desinfectante al frasco colector.

9 Realizar tres enjuagues con agua destilada estril por un lapso

de 1 minuto, con la finalidad de liberar molculas de la solucin

desinfectante de la superficie de las almendras.

9 Disponer a las almendras desinfectadas sobre una palca estril.

Foto N 41: Desinfeccin con 1,5% de NaOCl/10 min. Foto N 42: Enjuague
Diseccin y separacin de embriones

Para este procedimiento se debe tener bastante cuidado de no

daar estructuras del embrin, situados en el interior de las

almendras, teniendo esto como recomendacin se procedi a:

9 Acondicionar una pequea lamina de agua destilada estril al

interior de una placa petri, para la recepcin de embriones con la

finalidad de evitar la deshidratacin de los mismos.

9 Con los dos bisturs realizar tres cortes, dos laterales y uno

superior teniendo como referencia al punto de crecimiento de la

raz, ubicado en la parte inferior de la almendra.

9 Con la ayuda de la pinza grande y un bistur destapar una tapa de

la almendra.

9 Con el bistur y con cuidado levantar el embrin y disponerlo

sobre la lmina de agua estril contenida en la placa petri. (foto

N 43).

Foto N 43: Excisin de almendras

 Siembra de embriones

Este procedimiento es bastante sencillo, pero se debe tener cuidado

en evitar la contaminacin en ellos.

Para efectuar una buena siembra se procedi a:

9 Destapar el frasco que contiene el medio de cultivo.

9 Con la ayuda de la pinza grande recoger y sembrar el embrin

acondicionndolo suavemente en la superficie del medio de

cultivo.

9 Posteriormente tapar, rotular tomando como datos la fecha de

siembra y transferirlo al rea de incubacin.

4.2.6. Inicio al proceso de la Generacin de callos embriognicos.

Para este proceso se indujo a la formacin de una masa callosa a los

brotes terminales obtenidos de plntulas In Vitro que fueron

desarrolladas por un lapso de 30 das. (foto N 44)

De igual manera a travs de subcultivos se indujo a la maduracin de

los callos provistos en la masa callosa, con la finalidad de obtener

callos maduros capaces de generar nuevas plntulas.

 Brote
Terminal

Foto N 44: Desarrollo In Vitro de plntulas de sacha inchi

Transferencia de brotes terminales a la segunda formulacin

(Estimulacin a la callogenesis)

Una vez seleccionados los frascos que contienen a las plntulas

de sacha inchi, estas fueron puestas con mucho cuidado sobre

una placa petri.

Luego se genero los cortes con la finalidad de separar los pices

terminales de la planta madre.

 Una vez separados los pices terminales y con la ayuda de una

esptula de bronce, se inoculo al interior del tubo de ensayo que

contena el medio de la segunda formulacin (foto N 45)

Luego se tapo y se rotulo los tubos de ensayo.

Masa
callosa
Callo

Foto N 45: Callognesis Foto N 46: Callo no diferenciado

Transferencia de Callos (Madurac. y Germinacin de embrioides)

Obtenida la formacin callosa a partir de los diez das alrededor

del explante, esta se transfiri a una placa petri y a partir de ella

se realizo las disecciones y se separo los callos albergados en los

explantes ( fotos N 45 y 46)

Despus de realizar la separacin y diseccin de los callos, con la

ayuda de una pinza se transfiri a la tercera formulacin del

medio de cultivo, acondicionndolos en una forma superficial.

 Los subcultivos de los mismos callos se hizo cada seis das con la

finalidad de poder obtenerse un mejor desarrollo. (foto N 47)

Foto N 47: Germin. de embrioides

 V. CONCLUSIONES

Se concluye que:

5.1. Se ha logrado el adiestramiento en el uso de las tcnicas In Vitro.

5.2. Para la primera formulacin (Germinacin de embriones), se

obtuvo plntulas con un excelente desarrollo, mostrando la mejor

conformacin de brotes terminales.

5.3. Los explantes inducidos con la segunda formulacin (Induccin a

la callognesis), obtuvo una buena formacin callosa.

5.4. Los callos introducidos para su diferenciacin celular al medio

(Maduracin y germinacin de embrioides), dio un resultado

muy esperado, mediante los subcultivos se obtuvieron primordios

foliares (Foto N 47).

5.5. Sacha Inchi tiene una totipotencialidad celular, que demuestra la

formacin de tejidos a partir de clulas somticas.

5.6. La aplicacin del protocolo mediante un trabajo de investigacin

en embriognesis somtica permitir obtener un procedimiento de

de multiplicacin clonal en Plukenetia volubilis L..

 VI. RECOMENDACIONES

6.1. Se recomienda realizar un trabajo de investigacin en

embriognesis somtica en Plukenetia volubilis L., a prueba de

diferentes fuentes y a diferentes concentraciones hormonales.

6.2. Realizar pruebas en la utilizacin de concentraciones variadas en

ANA y BAP, teniendo como parmetro de referencia a las

concentraciones utilizadas.

6.3. Para la introduccin de explantes vegetales (segmentos nodales,

pices meristemticos, fracciones de hojas) en sacha inchi se

recomienda utilizar 10 mg/L de Acido ctrico y 100 mg/L de mio-

inositol por que mostraron un buena respuesta ante el 40% de

fenolizacin que tiene sacha inchi.

 VII. LITERATURA CONSULTADA

1. AREVALO, G. 2005. Informes de Resultados de investigacin. Programa

Nacional de Investigacin en Recursos Genticos y Biotecnologia.

E.E El porvenir. Aos 1989 1995.

2. BARRERA, O. 2004. Practicas Pre Profesionales. Actividades Para la

Introduccin a Condicin In Vitro de Sacha Inchi (PLukenentia

volubilis L.), Realizado en el Laboratorio de Tejidos Vegetales.

Tarapoto Per. 59 60 p.

3. FERNANDZ-GUIJARRO, B; CELESTINO, C. & TORIBIO, M. 1995.

Influence of External Factors on Secundary Embriogenesis and

Germination in Somatic Embrios from Leaves of Quercus suber

Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Kliwer Academic Publisher.

41: 99-106. pp

4. GMEZ, R. 1998. Generalidades sobre la embriognesis somtica.

Resmenes del curso Internacional de Propagacin Masiva in

Vitro de Especies vegetales Instituto Biotecnologa de las Plantas.

Santa Clara Cuba. 134 p.

5. HALPERIN, W. 1995. In vitro embriognesis: some historical tissues

and unresolved problems. In: In vitro Embriognesis in plants.

(Ed.) Thorpe TA. Kluwer Academic, Dordrecht, Netherlands. 1-16.

pp

6. KRIKORIAN, A. 1991. Medios de Cultivo. Generalidades Composicin y

Formulacin. Departament of Biochimestry of New York EEUU.

42 p.

7. LITZ, R. & R. JARRET. 1991. Regeneracin de Plantas en el Cultivo de

Tejidos. Embriognesis Somtica. Tropical Research and

Educacin Center. University of Florida EEUU. 144 p.

8. MANCO, E.2005. Informes de Resultados de Investigacin. Programa

Nacional De Investigacin en Recursos Geneticos y Biotecnologa.

E.E. El Porvenir. Aos 1996-2005.

9. MEJIA, R. 1994. Propagacin comercial 312 especies de plantas por

cultivo in vitro. Agrobiotegnologia: Fundamentos y aplicaciones.

Lima-Per.

10. MERKLE, S.A; PARROTT, W.A. & FLINN, B.S. 1995. Morphogenic

Aspects of Somatic Embriogenesis, In: in Vitro Embriogenesis in

Plants.155-203 pp.
11. MURASHIGE, T. y F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth

and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-

497 pp.

12. PLIEGO ALFARO, F. & MURASHIGE, T. 1988. Somatic Embriogenesis in

Avocado (Persea americana Mill.). In Vitro. Plant Cell, Tissue and

Organ Culture. 12, 61-66. pp

13. ROCA, W., L. SZABADOS. 1991. Agentes Gelatinizadotes en el Cultivo de

Tejidos. Unidad de Investigacin en Biotecnologa. Centro

Internacional de Agricultura Tropical Colombia. 81 p.

14. ROCA, W y L. MROGINSKI 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura.

Fundamentos y aplicaciones. CIAT. 499 - 553 554 p.

15. RUZ A. 2003. Micropropagacin y determinacin cromosmica del gnero

Crotn productoras de ltex.

16. VALLES, R. 1991. Potencial agroalimentario Industrial del Sacha

Inchi para la selva alta. P.O. Box. 239. 1-8 p.

ANEXOS
Anexo N 01. Composicin del medio de cultivo de la primera formulacin

(Germinacin de embriones)

ITEM Composicin Concentracin Vol/L Unid

Macro y micro nutrientes( compuestos inorgnicos):
1 Stock A 20,00 ml
2 Stock B 20,00 ml
3 Stock G 20,00 ml
4 Stock C 5,0 ml
5 Stock D 5,0 ml
6 Stock E 5,0 ml
7 Stock F 5,0 ml
Vitaminas:
ac. Nicotinico 1000 ppm 0,50 ml
8 Tiamina 1000 ppm 0,40 ml
9 Sucrosa 2% 20g g
10 Agar 0,35% 3,50 g
11 Carbn Activ. 0,02% 2,00 g

pH : 5,7 - 5,8
Anexo N 02. Composicin del medio de cultivo de la segunda formulacin
(Estimulacin a la callognesis)

ITEM Composicin Concentracin Vol/L Unid

Macro y micro nutrientes( compuestos inorgnicos):
1 Stock A 20,00 ml
2 Stock B 20,00 ml
3 Stock G 20,00 ml
M&S
4 Stock C 5,0 ml
5 Stock D 5,0 ml
6 Stock E 5,0 ml
7 Stock F 5,0 ml
Vitaminas
8 Ac. Nicotinico 1000 ppm 1,0 ml
9 Tiamina 1000 ppm 10,0 ml
10 Piridoxina 1000 ppm 1,0 ml B5
11 Myo-inositol: 1000 ppm 100,0 ml
12 Sucrosa 3% 3,0% 30g g
13 Phytagel 0,25% 2,50 g
14 Ac. Ctrico 1000 ppm 10,0 ml
Hormonas:
BAP 1000 ppm 5,0 ml
ANA 1000 ppm 2,0 ml
KIN 1000 ppm 1,0 ml

pH : 5,7 - 5,8

M&S: Murashige y Skoog (1962).

B5: Gamborg etal., (1968).

Anexo N 03. Composicin del medio de cultivo de la tercera formulacin

 (Maduracin y Germinacin de embrioides)

ITEM Composicin Concentracin Vol/L Unid

Macro y micro nutrientes( compuestos inorgnicos):
1 Stock A 20,00 ml
2 Stock B 20,00 ml
3 Stock G 20,00 ml
4 Stock C 5,0 ml
5 Stock D 5,0 ml
6 Stock E 5,0 ml
7 Stock F 5,0 ml
Vitaminas
Ac. Nicotinico 1000 ppm 0,50 ml
8 Tiamina 1000 ppm 0,40 ml
9 Sucrosa 2% 20g g
10 Agar 0,35% 3,50 g
11 Carbn activo 0,02% 2,0 g

pH : 5,7 - 5,8
 TERMINOLOGAS

x Antioxidante.- Compuesto qumico que permite la captacin de fenoles y

polifenoles.

x pice.- Tejido meristematico que ocupa la parte Terminal del tronco, races

y ramas.

x Apomixis.- Produccin de descendientes en las estructuras sexuales

habituales, sin mezcla y segregacin de cromosomas.

x Callognesis.- Proceso fisiolgico que da origen a la formacin de callos

en una forma desordenada.

x Callo.- Estructura somtica no diferenciada.

x Clon.- Clula que posee carga gentica idntica a la clula madre.

x Cigote.- Es el producto de la unin de dos clulas sexuales diferentes

(masculinas y femeninas)

x Embriognesis somtica.- Tcnica de multiplicacin clonal, que permite

obtener embriones cigoticos sin tener que pasarse por la reproduccin

sexual.

x Embrioide.- Clula de ptimo desarrollo que permite la expresin de la

totipotencialidad mediante la generacin de un individuo.

x Embrin.- Planta esporoftica joven, que se encuentra retenida en el

gametofito o en la semilla.

x Explante.- Porcin de tejido vegetal adquirido de de cualquier parte de una

planta.

x Medio de Cultivo.- Compuesto enriquecido en sales macro y micro,, en

adicin de vitaminas, hormonas, antioxidantes proveen los requerimientos

nutricionales para su desarrollo.

x Meristemo.- Tejido no diferenciado, cuyas clulas son capaces de efectuar

una divisin celular activa y la diferenciacin de tejidos especializados.

x Organognesis.- Evento fisiolgico que permite la generacin de rganos a

partir de un tejido.

x Protocolo.- Procedimiento sincronizado y ordenado de tcnicas In Vitro

para lograrse un objetivo.

x Regeneracin.- Capacidad que expresan las clulas a la formacin de

nuevos individuos.

x Regeneracin Directa.- Ruta de la Embriognesis somtica que permite

obtenerse nuevos individuos a partir de rganos.

x Regeneracin indirecta.- Una de las rutas de la Embriognesis somtica

que permite la obtencin de nuevos individuos a partir de la formacin de

callos.

x Somtico.- Clulas diploides de los organismos.

x Totipotencialidad.- Capacidad de regeneracin de una clula.

 ABREVIATURAS

B5 : Gamborg etal., (1968).

M&S : Murashige y Skoog (1962)

BAP : 6 Bencil Amino Purina

ANA : Acido 1-Naphthal actico

KIN : 6 Furfurylaminopurine
Diagrama de flujo: ESTABLECIMIENTO DE UN LABORATORIO DE TEJIDOS
VEGETALES

ALMACN

BAO

LAVADO

PREPARACIN
OFICINA
ESTERILIZACIN

TRANSFERENCIA

INCUBACIN Observacin y
IN VITRO examen

Crecimiento In Vivo
Terapia y control
Fitosanitario

Crecimiento In Vivo
Cuarentena In Vitro (Casa de malla)

Diferentes reas de un laboratorio de tejidos - Tomado de Roca 1991