Anlisis de manchas de sangre

1. 1. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 183 CAPTULO

10 MANCHAS HEMATICAS Autor: Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de
Toxicologa y Qumica Legal de la Asesora Pericial dependiente del Poder Judicial
de la Provincia de Buenos Aires. Introduccin Segn el diccionario, se entiende por
mancha a una seal que una cosa hace en un cuerpo, ensucindolo. Desde el
punto de vista forense, el estudio de las manchas de sangre reviste un gran inters ya
que a partir de stas, las tcnicas empleadas hoy en da permiten llegar a resultados
de gran certeza respecto de la persona a partir de la cual se origin la misma. 10.1
Bsqueda de las posibles manchas de sangre La misma deber ser sumamente
minuciosa ya que estas pueden encontrarse sobre cualquier superficie y lugar. En
primer lugar debe considerarse que una mancha de sangre reciente es de color rojo
brillante para, posteriormente, virar a un color pardo-rojizo y sin brillo. El proceso
de variacin de su aspecto depende de diversos factores entre los cuales podemos
mencionar la luz, la temperatura, la humedad y el soporte sobre el cual se encuentra
asentada. En ese sentido, el color de la misma es una caracterstica de sumo inters
ya que sobre superficies oscuras, por ejemplo, la bsqueda suele complicarse y aqu
hay dos elementos que resultan de utilidad: el empleo de luz con diferentes ngulos
y la luz ultravioleta, aunque sta ltima no es aconsejable dado las alteraciones que
la misma puede ocasionar a nivel del material gentico. Otra posibilidad, la
constituye el empleo de las reacciones de orientacin, las cuales veremos ms
adelante. 10.2 Recoleccin de las muestras Un tema de vital importancia en este
tipo de estudios lo constituye este paso, ya que de una correcta toma de muestra en
el lugar del hecho dependern los resultados obtenidos. Un dato a tener en cuenta
ser el tipo de superficie sobre el cual se encuentra asentada la mancha y as, por
ejemplo, sobre una superficie absorbente ser fuertemente retenida mientras que
sobre una superficie pintada o un mosaico pulido ser fcil de desprender. En
cualquiera de los dos casos, una posibilidad para su obtencin ser embeber un
papel de filtro o una tela blanca de algodn con solucin fisiolgica (S.F) o agua
destilada, colocndolo sobre la mancha y presionando con cuidado. Posteriormente,
el elemento utilizado se deja secar en corriente de aire. Para acelerar este proceso,
 puede utilizarse un secador de pelo, aunque esta operacin debe hacerse con sumo
cuidado a fin de evitar ocasionarle daos a ciertos componentes de la mancha que
podran, posteriormente, complicar (cuando no imposibilitar) su anlisis. En el caso
de tratarse de una superficie pulida, una alternativa consiste en raspar la superficie
con ayuda de un bistur, colectando el material sobre un papel. Cuando se trate de
prendas manchadas tres precauciones son fundamentales: A No doblar las prendas
hmedas ya que podran mancharse zonas que no lo estaban. B Dejarlas secar en
condiciones similares a las expuestas anteriormente. C Una vez secas, las prendas
deben ser envueltas preferentemente en papel madera y en forma separada. Vale
aclarar que cuando el soporte de la mancha es tal que el mismo puede ser remitido
al Laboratorio, este es el camino a seguir guardando siempre las precauciones ya
enunciadas. Cualesquiera sea el caso, su pronta remisin una vez obtenida la
muestra es el procedimiento indicado.
2. 2. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 184 10.3 Estudio
de las manchas de sangre Una vez recepcionado el material en el laboratorio, el
mismo se procesar segn el siguiente orden: 1 Descripcin de las condiciones de
remisin. 2 Descripcin de los elementos motivo de pericia. 3 Reacciones de
orientacin. 4 Reacciones de certeza. 5 Determinacin de especie. 6
Tipificacin: Investigacin del grupo sanguneo, isoenzimas , sistema HLA, ADN
Descripcin de las condiciones de remisin: La descripcin de las condiciones en
las cuales las muestras llegan al laboratorio resulta un paso de sumo inters ya que
el mismo debe cumplir ciertos requisitos, entre los cuales pueden mencionarse el
que se encuentren correctamente rotulados y bajo condiciones de inviolabilidad, ya
sea mediante lacre o bien precintos adecuados a tal efecto. Descripcin de los
elementos motivo de pericia: La descripcin de los elementos debe ser tal que en la
misma se destaquen aquellas caractersticas que permitan su identificacin. Las
manchas, en la medida de lo posible, debern ser ubicadas y en ese sentido,
resulta de suma utilidad acompaar la descripcin con un esquema o figura de cada
elemento en los cuales se indique la posicin de las diferentes manchas. En este
paso, al igual que en el precedente, son sumamente ilustrativas las fotografas.
Reacciones de orientacin: Las reacciones de orientacin, tal como su nombre lo
 indica, de ser positivas solo expresan la posible presencia de sangre, adquiriendo un
valor definitivo cuando resultan negativas, situacin esta derivada de su gran
sensibilidad. Las mismas aprovechan la actividad peroxidsica del grupo hemo, la
cual se pone en evidencia mediante el empleo de H2O2 y reactivos orgnicos que
pasarn de una forma incolora a otra coloreada o bien luminiscente. Podemos
representar lo antedicho de la siguiente manera: H2O2 + peroxidasa H2O + O O +
Reactivo reducido Reactivo oxidado (coloreado o luminiscente) Debemos tener en
cuenta que diversas sustancias poseen una actividad similar a la del grupo hemo y
de all su inespecificidad. Entre ellas podemos mencionar las peroxidasas de origen
vegetal y las sales de cobre y nquel. Entre los numerosos reactivos utilizados para
la realizacin de esta prueba, mencionaremos los siguientes (Fig. 10.1): Ensayo de
Adler: Emplea bencidina disuelta en cido actico o bien en una mezcla de etanol y
el mencionado cido. En caso de ser positivas dan color azul o azul-verdoso. Su
sensibilidad es de 1: 250.000. Un dato de inters y que ha hecho que la misma caiga
en desuso es la actividad carcinognica de la bencidina. El reactivo se prepara en el
momento de usar disolviendo 0,01 a 0,05g. del mismo en 10 ml de cido actico
glacial. Ensayo de Pierre Medinger: Utiliza como reactivo la leucobase del verde
de malaquita. De ser positiva origina un color verde intenso. Es un reactivo que ha
resguardo de la luz posee una aceptable estabilidad. Su sensibilidad es del orden de
1:100.000. Se prepara disolviendo 1g. de leucobase en 50 ml de cido actico
glacial, adicionando a continuacin 150 ml de agua destilada. Guardar en frascos de
color caramelo.
3. 3. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 185 Reactivo
de Kastle Meyer: Emplea fenolftalena reducida en medio alcalino originando, de
ser positiva, el clsico color rosado rojizo de este colorante. Posee dos ventajas
dignas de mencin y que lo transforman en un reactivo altamente recomendable: su
notable sensibilidad (1:1.000.000) y que el medio alcalino elimina muchas de las
interferencias que afectan a estos ensayos. El reactivo se prepara disolviendo en un
matraz 20g. de KOH en 100 ml de H2O destilada, a los cuales se adiciona a
continuacin 2g. de fenolftalena y 20g. de zinc en polvo. Se coloca un refrigerante
a reflujo y se calienta hasta decoloracin. Alcanzado este punto se filtra en caliente
 recogiendo el lquido en frascos de color caramelo conteniendo zinc en polvo. Un
detalle a tener en cuenta, es que la gran sensibilidad de este reactivo requiere de
material estrictamente limpio para su preparacin y conservacin. Cualesquiera sea
el reactivo a emplear, se puede proceder tal como se detalla a continuacin: a) A
gotas de un macerado obtenido de la mancha en estudio en S.F. o agua destilada, se
adicionan gotas del reactivo y a continuacin gotas de H2O2 al 30%. La aparicin
del color correspondiente, segn el caso, indica una reaccin POSITIVA. b) Una
pequea muestra obtenida del material en estudio se coloca en una cpsula de Petri,
y se le adicionan gotas del reactivo y a continuacin gotas de H2O2 al 30%. La
aparicin del color correspondiente al reactivo empleado indica una reaccin
POSITIVA. La secuencia indicada para el agregado de los reactivos es importante
ya que en algunos casos, en forma previa a la adicin del H2O2, ya se produce la
aparicin del color propio del indicador, situacin esta que nos permite diferenciar
una mancha supuestamente de sangre de otra que no lo es. En tal sentido, el
cemento es un material que produce este tipo de fenmeno. Fig. 10.1: formas
qumicas de las leucobases y sus formas coloreadas. Finalmente, no podemos dejar
de mencionar el ensayo del luminol (5-amino-2,3- dihidroftalazino-1,4-diona) el
cual manifiesta una reaccin positiva mediante la aparicin de quimioluminiscencia.
Resulta de suma utilidad para la localizacin de manchas no visibles en superficies
grandes (por ejemplo pisos), las cuales se rocan con el reactivo. Posee una
sensibilidad de 1:5.000.000 y una elevada especificidad aunque la misma no es
total. Para su empleo se deben preparas dos soluciones: Solucin A: 0,1g de luminol
y 0,5g de NaCO3H se disuelven en 50 ml de agua destilada y se colocan en un
recipiente no metlico. Solucin B: Disolver 1,4g de perborato de sodio tetrahidrato
en 50 ml de agua destilada y colocar en un recipiente similar al anterior.
4. 4. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 186 En el
momento de emplear, volmenes iguales de ambas soluciones se colocan en un
rociador no metlico. Debemos recordar que el luminol reacciona con el hierro del
grupo hemo y, por lo tanto, podra reaccionar con otros metales de modo similar.
Una vez preparada la mezcla, la misma es estable de 60 a 90 minutos y de all que
resulte conveniente hacerlo en pequeas cantidades. Si bien se han detectado
sustancias interferentes, en general, la intensidad, duracin y color de estos falsos
positivos no se corresponden con aquellos de la sangre diluda. Un dato interesante
lo constituye la estabilidad de las soluciones y su relacin con la temperatura y as
se ha observado que se obtiene buenos resultados cuando los reactivos se conservan
separados durante 28 das a 18C o 4C, disminuyendo este perodo a 21 das si la
temperatura asciende a 37C. Reacciones de certeza: Son aquellas que nos
permiten afirmar que una mancha es de sangre o bien descartar esa posibilidad. Casi
la totalidad de los estudios de este tipo se basan en la identificacin del grupo hemo
de la hemoglobina. La excepcin la constituye la bsqueda de los elementos formes
de la sangre, tal como los glbulos blancos y/o rojos, hecho este que no es comn
en laboratorios forenses. Entre las diversas tcnicas que se han descripto, podemos
mencionar las siguientes: Cristales de Teichman: Se basa en la obtencin de los
cristales de hematina o hemina. La misma se realiza dejando caer una gota de un
macerado de la mancha en agua destilada o S.F. en el centro de un portaobjetos la
que se lleva a sequedad calentando sobre un mechero en forma suave (la
temperatura no debe superar los 60C.), repitiendo la operacin (gota-secado) de
dos a tres veces (Fig. 10.2). Se cubre con un cubreobjetos y luego, por capilaridad,
se adiciona cido actico glacial (al que debe adicionarse ClNa en una
concentracin igual al 0.1% en caso de haber preparado el macerado con agua
destilada) y a continuacin calentar de manera algo ms enrgica a la anterior.
Repetir la operacin una vez y luego observar al microscopio. La observacin de
cristales de color castao a castao claro y con forma de prismas alargados a
rmbicos, indica una reaccin positiva. Una modificacin digna de ser mencionada
es la de Bertrand, para la cual se emplea el siguiente reactivo: Cl2Mg 1g., agua
destilada 1 ml, glicerol (30% v/v) 5g. y cido actico glacial 20 ml. La tcnica se
desarrolla de manera similar a la anterior pero ahora observaremos cristales algo
ms pequeos. Fig. 10.2: Cristales de Teichman. Cristales de Takayama: Se basa en
la obtencin de los cristales de piridino-hemocromgeno. El hemocromgeno es un
derivado obtenido por la desnaturalizacin y reduccin consecutiva de la
hemoglobina o de la oxihemoglobina, la cual posteriormente con una base origina
 las formas cristalinas tpicas de este derivado. El reactivo a emplear est formado
por 5 ml de una
5. 5. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 187 solucin de
glucosa al 10%, 10 ml de HONa al 10%, 20 ml de piridina y agua destilada en
cantidad suficiente para 100 ml Se procede de modo similar al descripto
precedentemente, aunque el calentamiento deber ser suave luego del agregado del
reactivo. Posteriormente observar al microscopio. La presencia de cristales de color
rosado y con forma de helechos, pinceles o espinas indica reaccin positiva. Otra
tcnica de suma utilidad es aquella que emplea la cromatografa en placa delgada, la
cual se basa en la obtencin de Rf iguales para un extracto de la mancha en estudio
y otro preparado a partir de una muestra de sangre (dilua 1:1000 en S.F.). Como
reactivo revelador se puede emplear una solucin de leucobase del verde de
malaquita en etanol al 1% adicionado de cido actico a una concentracin final del
0.5% (preparada en el momento) y H2O2 al 6%. Como fase estacionaria puede
utilizarse silicagel G y como fase mvil el solvente formado por metanol : cido
actico : agua destilada en la relacin 90 : 3 : 7. Cargar la cuba cromatogrfica con
la mezcla y aguardar no menos de 30 minutos antes de colocar la placa. Se siembran
las muestras a estudiar, el testigo y se desarrolla el cromatograma. Luego se retira la
misma de la cuba y se lleva a 100C durante 5 minutos, operacin esta que permite
la destruccin de las peroxidasas de origen vegetal pero mantenindose aquella de la
sangre. Luego rociar la placa con el reactivo del verde de malaquita y a
continuacin con el H2O2. La reaccin se considera positiva si se observa la
aparicin de manchas de color verde de Rf 0,7 a 0,8. 10.4 Determinacin de especie
Una vez confirmada la presencia de sangre se procede a la determinacin de la
especie de la misma, con el objeto de establecer si es humana o no. Estas reacciones
adquieren una particular importancia en ciertos casos como, por ejemplo, de
homicidio en los cuales se ha empleado un arma blanca, ya que de ser positivas, por
un lado indican la presencia de sangre humana y, por otro, habilitan la investigacin
de parmetros conducentes a la identificacin del individuo del cual procede la
sangre encontrada. De ser negativas, en cambio, debern tenerse en cuenta una serie
de factores de importancia: en primer lugar deber evaluarse la posibilidad del uso
 de antisueros contra diversas especies animales ya que esta constituye, en la
mayora de los casos, la nica manera de constatar que la sangre no es humana. Por
otro lado, debern tenerse en cuenta las condiciones de la mancha en estudio ya que
su antigedad, presencia de hongos, putrefaccin etc., son elementos que pueden
sugerir la degradacin de los elementos especficos a determinar. Tambin deber
considerarse la cantidad de material a estudiar ya que no puede descartarse que la
misma resulte insuficiente para las reacciones a practicar. En lo que respecta a la
determinacin en s, uno de los mtodos, abandonado en la actualidad, se basa en la
identificacin de los elementos formes de la sangre tales como glbulos rojos,
blancos y / o plaquetas. Hoy en da se emplean los mtodos que utilizan los
denominados sueros antihumanos, es decir, sueros capaces de reaccionar
especficamente con elementos de la sangre (protenas). Son reacciones de tipo
antgeno-anticuerpo y dado los notables adelantos realizados en materia de
anticuerpos monoclonales, los resultados obtenidos son altamente confiables. De
modo similar pueden emplearse antisueros capaces de reaccionar con sangre
procedente de otras especies, aconsejndose, especialmente, el uso de aquellos
contra animales domsticos o de campo como perro, gato, aves de corral, ganado
ovino, bovino, porcino, etc. 10.4.1 Ensayo de las precipitinas Como se mencion
anteriormente, estos anlisis consisten en una reaccin antgeno- anticuerpo
visualizndose la misma mediante la formacin de un precipitado (de all su
nombre) o bien, como ocurre con kits comerciales, por la aparicin de bandas
coloreadas.
6. 6. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 188 Entre las
condiciones que debe cumplir el antisuero a emplear pueden mencionarse:
esterilidad; que se encuentre libre de turbiedad, en ese sentido la presencia de la
misma hace desaconsejable su utilizacin; especificidad, es decir, debe reaccionar
con muestras procedentes de la especie animal contra la cual fue preparada.
Finalmente, puede destacarse el ttulo del antisuero como un dato de importancia
siendo aquel de 1:10.000 el aconsejado. En ese sentido, una forma de determinar el
ttulo del antisuero es la siguiente: preparar diluciones del suero a emplear en S.F.,
por ejemplo de 1:1.000 a 1: 32.000 en forma seriada. A continuacin, en tubos de
 hemlisis adicionar 50 l del antisuero en estudio y luego, con sumo cuidado a fin
de evitar que se mezclen, 100 l de las diferentes diluciones a ensayar y dejar en
reposo. La aparicin antes de los 20 minutos de un anillo en la interfase suero-
antisuero, indica una reaccin positiva siendo aconsejable la utilizacin de un fondo
oscuro e iluminacin adecuada a fin de lograr una mejor visualizacin (Fig.10.3).
Fig. 10.3: Reaccin de Precipitacin. As, la recproca de la ltima dilucin que a
temperatura ambiente produce una reaccin visible en el tiempo mencionado ser el
ttulo del antisuero. Preparacin de la muestra: Se realiza una dilucin empleando
Solucin fisiolgica siendo la concentracin adecuada de 1:1.000. A modo de
ejemplo puede estimarse que 1 cm2 de tela manchada debe eluirse en 1 ml de la
citada solucin. Tcnicas para la investigacin de especie: Mtodo del tubo: Se
procede tal como se indic anteriormente para la valoracin del antisuero, con la
salvedad que en lugar del suero diluido ahora colocamos 100 l del macerado de la
muestra en estudio. Una variante de esta tcnica es aquella que emplea capilares en
lugar de tubos. Para ello, uno de los extremos del capilar se sumerge en el antisuero
y a continuacin en el macerado. Luego se sella el otro extremo con plastilina o bien
con calor. En el ltimo caso deber procederse con sumo cuidado a fin de evitar
proyecciones. Tcnicas de difusin en agar: Una de las ventajas de sta tcnica
consiste en el escaso consumo de antisuero empleado al tiempo que permite el
procesamiento de un buen nmero de muestras en forma simultnea. Para su
realizacin se prepara una solucin de agar al 1-2% en agua destilada y a
continuacin con el auxilio de una pipeta se adicionan 5 ml de la misma sobre un
portaobjeto de modo tal de lograr una capa uniforme. Debemos aclarar que la
temperatura del agar debe ser prxima a aquella de su fusin y el agregado ser
lento y cuidadoso a fin de evitar que el mismo se derrame. Una vez formado el gel
de agar se procede a practicar orificios en el mismo pudiendo utilizar para ello un
sacabocado.
7. 7. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 189 En la figura
se detalla la distribucin de los mismos: Antisuero Muestra Muestra Antisuero La
cantidad de orificios en torno al central depender de la cantidad de muestra y de la
habilidad del operador pudiendo repetirse la formacin dos a tres veces por placa.
 Tanto el antisuero como las muestras pueden adicionarse mediante el empleo de
pipetas Pasteur o bien capilares con cuidado de no rebalsar los hoyuelos. Entre
muestra y muestra deber cambiarse el elemento usado o bien realizar un buen
enjuague del mismo con S.F. Finalizada la operacin se coloca la placa en cmara
hmeda y se lleva a estufa a 37C durante 24 hs. Luego se procede a la lectura de
los resultados siendo positivo aquellas en las cuales se observe un halo de
precipitacin entre la muestra y el antisuero (Fig. 10.4). La lectura deber hacerse
mediante el empleo de luz y fondo adecuado. Fig. 10.4: Mtodo de Outcherlony
Mtodo electrofortico: Esta tcnica nos permite efectuar el ensayo en forma rpida
y con resultados satisfactorios. Bsicamente, la tcnica puede explicarse de la
siguiente manera: el antisuero colocado en un orificio prximo al nodo es
enfrentado con un extracto sanguneo ubicado en un hoyuelo del lado del ctodo.
Los antgenos presentes en el extracto son fundamentalmente albmina y alfa y beta
globulinas, mientras que los anticuerpos presentes en el antisuero son
principalmente gamma globulinas. La electroforesis causa un movimiento andico y
al mismo tiempo un flujo endosmtico hacia el ctodo el cual se genera en el
movimiento del lquido en sentido contrario al de la migracin de la corriente. De lo
expuesto surge que mientras la corriente elctrica arrastra los antgenos del
extracto sanguneo hacia el nodo, las gamma globulinas lo hacen hacia el ctodo,
pero impulsadas por el flujo endosmtico. Sobre un portaobjeto limpio y
desengrasado vertir 2 a 2,5 cc de solucin de agar al 0,2 %. El agar a utilizar deber
ser grado electrofortico con baja electroendosmosis, propiedades de suma
importancia para la tcnica a emplear. Dejar 30 a 40 minutos a temperatura
ambiente y luego llevar a estufa a 65C por 90 minutos. A continuacin adicionar a
esta capa 4,5 ml de agar al 2% de modo tal que esta tenga un espesor de 2 mm.
Posteriormente practicar orificios en la capa de agar tal como se indic
anteriormente y segn la siguiente distribucin.
8. 8. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 190 Los
orificios deben tener un dimetro de 1.5 a 1.8 mm y separados, de a pares, una
distancia de 3 mm. Polo positivo (+) (-) Polo negativo Una vez completada la placa
colocar el antisuero de izquierda a derecha en los orificios de las hileras 1ra ., 3ra .,
5ta . y 7ma y las muestras en los orificios restantes, de modo tal que los lquidos
queden al ras pero sin rebalsar. A continuacin agregar el buffer en la cuba
electrofortica y colocar el portaobjetos debiendo quedar las columnas con el
antisuero del lado del nodo. Una vez ubicada la placa hacer con papel absorbente
los puentes correspondientes entre las mismas y los electrodos. Efectuar la corrida
electrofortica segn las siguientes condiciones: 150 voltios 20 minutos
(aproximadamente 15 mAmp). La aparicin de un halo de precipitacin entre la
muestra y el antisuero indica una reaccin positiva. Una vez ledos los resultados,
puede revelarse la placa de la siguiente manera: Sumergir el portaobjetos en
solucin de ClNa 1 M durante una noche y luego lavar con agua durante 5 minutos
(para tal operacin, la placa se sumerge en una cuba conteniendo agua destilada
dejndola el tiempo mencionado). A continuacin secar o bien colocar papel de
filtro Whatman N1 sobre el gel y llevar a 60C. Esta operacin deber ser efectuada
con sumo cuidado a fin de no daar el gel. Retirar el papel siendo conveniente que
se encuentre hmedo. Concluida esta operacin se expone la placa a la accin de la
solucin colorante (ver ms adelante) durante 5 minutos. Transcurrido ese lapso,
eliminar el exceso de esta solucin con solucin de lavado (ver ms adelante),
dando por concluida esta operacin cuando se observa la aparicin de bandas de
color azul sobre un fondo claro. De producirse precipitados inespecficos se
aconseja diluir el o los extractos. Reactivos: Agar al 0,2 % y 2% en agua
bidestilada / desionizada. Agar para inmunoelectroforesis Oxoid. Buffer gel pH
8,6 : Barbiturato de Sodio 7,00 g ; cido dietilbarbitrico 1,10 g; lactato de calcio
1,00 g y agua bidestilada csp. 1 l. Conservar a 4C. Gel de agar mezclar
volmenes iguales de agar al 2% y Buffer gel Buffer Cuba pH 8,6, barbiturato de
sodio 8,76g ; cido dietilbarbitrico 1,38g; lactato de calcio 0,38 g; agua bidestilada
csp 1 l conservar a 4 C. Solucin 1 M de cloruro de sodio. Solucin colorante,
0,10 g de negro amido 10 B y disolverlos en 100 ml de solucin de lavado, la que
est constituida por metanol: agua bidestilada: cido actico glacial en la relacin
40: 50:10. Una variante de esta tcnica emplea un buffer (pH 8,4) constituido por:
tricina ( sigma T- 0377) 4,5 g (0,025 M); tris base ( sigma T-1503) 9 g (0,074 M);
agua bidestilada csp 1 Lt. Tambin puede emplearse la siguiente mezcla: glicina
 (sigma G- 7126) 21,8 g ; tris base 4,5 g y agua bidestilada csp 1Lt . En esta tcnica
se emplea agar al 0,2 % pero, a continuacin, se utiliza una solucin de agarosa al
1% en uno de los buffer descripto previamente. El resto de la metodologa es
idntica a la ya detallada. Por otra parte, para este tipo de estudio hoy en da pueden
emplearse kit comerciales destinados al anlisis de sangre oculta en materia fecal,
los cuales ofrecen muy buenos resultados y poseen entre sus ventajas la velocidad
en la determinacin. As, por ejemplo, el Hem-check-1 (Veda Lab-France) emplea
una nica combinacin de anticuerpo monoclonal conjugado y
9. 9. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 191 anticuerpo
monoclonal en fase slida para identificar hemoglobina humana, realizndose el test
en tan solo 10 minutos. Esta determinacin es de carcter presuntivo. Investigacin
de grupo sanguneo: Una vez constatada la especie de la muestra de sangre en
estudio se procede a su tipificacin, pudiendo determinarse para tal fin el grupo
sanguneo (sistemas ABO, MN, etc.), patrn de isoenzimas, protenas polimrficas
y ADN. Con test de ste tipo, sin el anlisis de ADN, la probabilidad tpica que una
pieza especfica no pertenezca a un sospechoso particular est en el rango de 1:100
a 1:10.000 dependiendo de las protenas particulares y el nmero de las mismas
estudiadas. Por otra parte, el uso de ADN polimrfico puede resultar en
probabilidades tan bajas como 1:1019 que dos muestras cotejadas no sean de un
mismo individuo. Sistema ABO: En las manchas de sangre seca los glbulos rojos
en general estn destruidos, sin embargo, los antgenos responsables de la
especificidad de grupo mantienen su capacidad para reaccionar con los anticuerpos
especficos. Claro est que, en stas condiciones, las tcnicas de aglutinacin directa
no son aplicables. Pueden investigarse tanto las aglutininas (anticuerpos anti-A y
anti-B) como los aglutingenos A, B y O. Por ser las ms utilizadas se detallarn
aquellas tcnicas orientadas a detectar la presencia de los ltimos. Mtodo de
absorcin inhibicin: Esta tcnica puede utilizarse no solo en manchas de sangre,
sino tambin en otros fluidos biolgicos tales como saliva y semen. Bsicamente el
mtodo consiste en enfrentar la mancha en estudio con un antisuero de ttulo
conocido, al cual transcurrido un cierto tiempo se lo retitular. Una disminucin del
ttulo original indicar la presencia del antgeno investigado. As, si disminuye
 aquel correspondiente al suero anti-A, la muestra pertenecer al grupo A, si lo hace
en el anti-B ser B, y, si disminuyera en ambos, ser AB. De no observarse
disminucin en ninguno de los dos antisueros, la muestra sera O, aunque deber
confirmarse por otra metodologa dado que los aglutingenos podran estar
destruidos. Para la realizacin de la tcnica se procede de la siguiente manera:
Cortar 1 cm2 de tela manchada y dividirlo a la mitad, repitiendo esta operacin con
una zona de la tela no maculada la cual oficiar como blanco. A cada uno de los
trozos se los coloca en una policubeta tal como se indica en la siguiente figura:
Muestra Blanco Blanco Muestra Adicionar a los dos primeros trozos de tela 2 gotas
de suero anti-A y a los dos ltimos una gota de suero anti-B. Dichos antisueros
debern ser previamente titulados y la dilucin a emplear debe ser tal, que se
produzca una aglutinacin visible hasta la ltima dilucin a realizar en esta
10. 10. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 192 tcnica. En
ese sentido digamos que los autores indican la dilucin de 1 / 32 como aquella a
emplear pero es aconsejable la titulacin previa a fin de evitar inconvenientes. A
continuacin se fragmentan las fibras con la ayuda de agujas de diseccin
comenzando siempre por el blanco. Luego de cada muestra es conveniente cambiar
las agujas o bien enjuagarlas. Luego colocar las placas en cmara hmeda y dejar
una hora a temperatura ambiente. Trascurrido ese lapso proceder a retitular los
antisueros. Para ello adicionar a cada hoyuelo de la policubeta una gota de S.F. y a
continuacin tomar una gota del antisuero en contacto con la muestra y adicionarlo
a la primera gota de S.F. Mezclarlas y pasar una gota de esta dilucin a la siguiente
concavidad procediendo de igual manera hasta la ltima de esta, de modo tal de
obtener diluciones seriadas al medio. Es conveniente practicar no menos de 7
diluciones para cada muestra. Proceder de igual manera con el blanco y el resto de
las muestras con la precaucin de enjuagar bien el material empleado entre muestra
y muestra. Posteriormente, adicionar a las diluciones de las muestras y blanco en las
que se investiga el aglutingeno A una suspensin de glbulos rojos A en S.F. al
1,5%. Es aconsejable lavar previamente los glbulos rojos 3 veces en S.F. previo a
la preparacin de la suspensin. Repetir la operacin para aquellas muestras y
blancos en las cuales se investiga el aglutingeno B, pero con una suspensin de
 glbulos rojos B. Completada esta operacin agitar con cuidado de no mezclar los
contenidos de las concavidades e incubar en cmara hmeda observando, o no, la
presencia de aglutinacin cada 10 a 15 minutos agitando en cada caso y por un
lapso de 30 minutos. La ausencia de aglutinacin en una de las muestras o una
disminucin de no menos de 3 concavidades del ttulo en esta respecto de su blanco
indica la presencia del aglutingeno investigado. Para facilitar la lectura es
aconsejable la utilizacin de un elemento de aumento como puede ser una lupa.
Como datos a tener en cuenta para obtener resultados confiables podemos
mencionar los siguientes: las muestras debern procesarse con guantes , no slo por
razones de seguridad sino porque, de ser secretor, por medio de la transpiracin se
transmitiran los aglutingenos propios al material investigado. Tanto el agregado
inicial de los antisueros como su posterior dilucin deben realizarse con sumo
cuidado ya que cualquier error puede traducirse en un resultado incorrecto. Mtodo
de absorcin elucin: Esta tcnica ofrece excelentes resultados y puede ser
empleada tanto para el sistema ABO como para el MN. Tambin puede utilizarse
para el estudio del sistema Rh aunque los resultados suelen no ser confiables y de
all que su realizacin sea desaconsejada por muchos autores. El fundamento de esta
tcnica es el siguiente: las muestras en estudio se ponen en contacto con antisueros
especficos a fin de formar los correspondientes complejos antgeno- anticuerpo.
Luego se elimina el exceso de anticuerpo, y se calienta a 50C a fin de romper el
inmunocomplejo de modo tal que los anticuerpos liberados pueden ponerse de
manifiesto mediante el agregado de una suspensin de glbulos rojos con los cuales
darn lugar a la tpica reaccin de aglutinacin. Para el estudio del sistema ABO se
procede de la siguiente manera: 1- Sobre una hoja de policarbonato de 10 x 15 cm y
1 mm de espesor se marcan cuadrados de aproximadamente 1,5 cm de lado. 2- Se
toman muestras de hilo de 2 a 5 mm de longitud y se adhieren a la placa por uno de
sus extremos mediante el empleo de, por ejemplo, acetato de celulosa. (ver figura).
M : Muestra Anti A Anti B Anti H Controles M Bl T
11. 11. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 193 Bl : Blanco
T : Testigo 3- Una vez seco el adhesivo adicionar a cada hilo una gota del antisuero
indicado en la columna respectiva. Para la dilucin a emplear valen las mismas
consideraciones hechas previamente. El hilo debe quedar totalmente sumergido en
el antisuero. 4- Incubar durante no menos de 3 hs. a 4 C en cmara hmeda siendo
aconsejable dejarlo toda la noche 5 -A continuacin lavar la placa con S.F. a 4 C
con ayuda de una piseta. Secar con papel de filtro con sumo cuidado y sumergir a
un recipiente con S.F. a 4 C durante 30 minutos con agitacin suave y constante.
6- Retirar la placa y secar con papel de filtro. 7- Agregar una gota de la suspensin
de glbulos rojos adecuada segn el antisuero utilizado. La misma se prepara en
S.F. con el agregado de albmina bovina al 0,3 % con una concentracin del 0,1 %.
Los glbulos rojos deben lavarse 3 veces con S.F. empleando sangre heparinizada.
Llevar a cmara hmeda y luego a estufa a 50 C durante 15 minutos. 8- Retirar de
la cmara hmeda y colocar la placa en un agitador de baja velocidad durante 30
minutos. 9- Observar la presencia o no de aglutinacin con ayuda de un
microscopio. As, de verificarse esta en la columna anti A, indica que esa muestra
corresponde al grupo A. En esta tcnica es aconsejable el uso de controles de los
grupos 0, A , B y AB. Si bien las tcnicas descriptas precedentemente son de suma
utilidad y ofrecen resultados confiables, la determinacin de grupo sanguneo se
puede efectuar mediante una serie de mtodos alternativos entre los cuales podemos
citar aquellas por inmunoensayo en fase slida, en la cuales uno de los reactantes se
fija a una fase slida dentro de las cuales el plstico constituye una de las ms
utilizadas. En tal sentido, tubos de 0,25 o 0,50 ml colocados en dispositivos
adecuados a tal efecto o bien policubetas del citado material constituyen una buena
alternativa. As, una metodologa de este tipo, es la siguiente: En un primer paso se
produce la inmovilizacin de los aglutingenos ABO presentes en la mancha a la
fase slida. Para tal fin, hilos de la tela manchada o bien gasa embebida en un
macerado de las manchas presente en un material diferente a una tela absorbente
(por ejemplo un cuchillo, una tela sinttica, etc), son colocados en las cubetas o
tubos por pares a fin de investigar la presencia de antgeno A en uno de ellos y el B
en el restante, cargndolo hasta las 2/3 partes de su capacidad con una solucin de
NH3 al 5%. Se maceran los hilos en la solucin y luego se los retira (la solucin
idealmente debe alcanzar una coloracin rojo-castao) y se los retira con el auxilio
de una pinza o un elemento adecuado a tal efecto. Luego incubar en estufa a 70C
 durante 15 minutos (sin cmara hmeda) y otros 20 minutos a 62C en idnticas
condiciones. Posteriormente lavar con solucin de ClNa 0.15 M o S.F. sumergiendo
a tal fin las policubetas en la misma y dejando en reposo durante 2 minutos. De este
modo se eliminan aquellas partculas no fijadas o dbilmente adsorbidas. A
continuacin las cubetas se cargan con los sueros anti-A y anti-B ya sea sin diluir o
diluidos 1:2 hasta las 2/3 partes de su capacidad incubando a 4C durante 40
minutos y con cmara hmeda. En este paso se producir la unin antgeno-
anticuerpo correspondiente. Cumplido el tiempo de incubacin se procede a
efectuar dos lavados consecutivos tal como se indicara anteriormente pero durante 5
minutos cada uno. Este paso tiene por objeto la eliminacin de aquellos anticuerpos
excedentes. Luego se procede a adicionar suspensiones de glbulos rojos al 2%
correspondientes al Grupo A y B segn corresponda y se incuba a 55C durante 15
minutos. Tal como hemos visto anteriormente, en esta etapa se produce la elusin
de los anticuerpos, de all que tanto la temperatura como el tiempo de incubacin
resulten de suma importancia. A continuacin colocar las cubetas en un agitador
mecnico durante 15 a 20 minutos. La agitacin no debe ser enrgica dado que de
otra manera se desorbe el material de la fase slida provocando aglutinacin de tipo
inespecfico, procediendo posteriormente a la observacin microscpica. Para tal
fin, se resuspende el depsito de los pocillos con ayuda de
12. 12. Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 194 una pipeta
Pasteur (con precaucin de no tocar las paredes de los mismos), colocar una gota de
cada uno en un portaobjetos y observar con objetivo de 10X. La presencia de
aglutinacin indica un resultado positivo para la presencia del antgeno en cuestin.
Por ltimo, en relacin a este tema, digamos que se han desarrollado numerosas
tcnicas de tipo electrofortico que permiten no solo la determinacin del grupo
sanguneo sino tambin el anlisis del polimorfismo del sistema ABO, las cuales no
sern expuestas en el presente captulo. Bibliografa Manchas de sangre. Captulo
IV. Tratado de Criminalstica. Tomo II. La Qumica Analtica en la Investigacin
del Delito. Editorial Policial, 1.983. Nuevas Aportaciones a la Medicina Legal del
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