UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

Facultad de Ingeniera Ambiental

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA
FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE HIGIENE Y SEGURIDAD INDUSTRIAL

NUMERACION DE COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES FECALES POR EL

METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) EN MUESTRAS AMBIENTALES
SOLIDAS O ALIMENTOS Y NUMERACION DE ENTEROBACTERIAS POR EL
METODO DE RECUENTO EN PLACA.

SEPTIMO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL- BO-112

JIMENEZ CASTILLO GONZALO RODRIGO 20162701I

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTN MARTNEZ VILA

Lima, Per
27 de Setiembre de 2017
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NDICE

1. RESUMEN ............................................................................................................. 3
2. INTRODUCCIN ................................................................................................... 3
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 4
OBJETIVOS GENERALES .......................................................................................... 4
OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................................ 4
4. MARCO TERICO................................................................................................. 4
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ..................................................................... 6
6. RESULTADOS ....................................................................................................... 9
7. CONCLUSIONES ................................................................................................ 10
8. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 10
9. FUENTES DE INFORMACIN ............................................................................ 11
10. ANEXOS ................................................................. Error! Bookmark not defined.
11. APNDICE ........................................................................................................... 14

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1. RESUMEN

En el presente laboratorio se procedi a realizar la preparacin de la muestra, que en este

caso fue carne molida, esta preparacin consisti en la dilucin de la muestra en agua
peptonada (AP) obtenindose as concentraciones de 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001.

Se dej incubada por 48 horas a 35C para posteriormente analizarla. Esto se realiz con
el fin de que posteriormente se encuentre los coliformes totales y los coliformes fecales en
la muestra.

Tambin se llev a cabo la siembra por difusin de la muestra con el agar bilis rojo violeta
(ABRV) y se dej en incubacin por 48 horas a 35Cpara posteriormente poder analizar la
muestra tanto cualitativamente como cuantitativamente.

2. INTRODUCCIN

La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos

microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, aunque algunos
pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia,
respectivamente. La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del
tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las
heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante en la materia
fecal, los coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la microbiologa de
alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas. Como los coliformes
tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes
fecales. Esta prctica se refiere a coliformes totales. El uso de los coliformes como
indicador sanitario puede aplicarse para: La deteccin de prcticas sanitarias deficientes
en el manejo y en la fabricacin de los alimentos. La evaluacin de la calidad
microbiolgica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo
sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal. Evaluacin de la eficiencia de
prcticas sanitarias e higinicas en el equipo. La calidad sanitaria del hielo y los distintos
tipos de agua utilizados en las diferentes reas del procesamiento de alimentos. La

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demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas o
diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).

3. OBJETIVOS

OBJETIVOS GENERALES

Evidenciar la presencia y realizar el recuento de coliformes totales y coliformes fecales por

el mtodo del mtodo del nmero ms probable (NMP).

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Manejar el mtodo del nmero ms probable (NMP) y su correcta interpretacin en el

anlisis microbiolgico.
Realizar el recuento directo de enterobacterias y coliforme por medio de placas de agar
cristal violeta, rojo neutro bilis lactosa (VRBA).

4. MARCO TERICO

Coliformes totales: Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y

constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su
aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se
caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas,
ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin
comprendida entre 30-37C.

Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo

<<coliforme>> forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin
en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Una elevada proporcin de los coliformes que existen el los sistemas de distribucin no se
debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en

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las conducciones. Dado que es dificil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas
contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario

Coliformes fecales: Los coliformes fecales son coliformes totales que adems fermentan
la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas
entre 44 y 45C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden
principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran ndices de contaminacin fecal.
Pero el verdadero ndice de contaminacin fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen
fecal es seguro. Desde el punto de vista metodolgico Escherichia coli es el Coliforme s
es positivo a la prueba del Indol.
Mtodo del nmero ms probable (NMP): es una estrategia eficiente de estimacin de
densidades poblacionales especialmente cuando una evaluacin cuantitativa de clulas
individuales no es factible. La tcnica se basa en la determinacin de presencia o ausencia
en rplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos
presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de
este mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es)
en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del
patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla
probabilstica.
Muestras: Parte o cantidad pequea de una cosa que se considera representativa del total
y que se toma o se separa de ella con ciertos mtodos para someterla a estudio, anlisis
o experimentacin.
Enterobacterias: Las enterobacterias (orden Enterobacteriales y nica
familia Enterobacteriaceae) son bacterias Gram negativas que contiene ms de
30 gneros y ms de 100 especies que pueden tener morfologa de cocos o bacilos. Los
miembros de este grupo forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes)
y de otros rganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden
vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos. Sucumben con relativa facilidad a
desinfectantes comunes, incluido el cloro.
Recuento en placas: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del
alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el
mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas
del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie,

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aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa.
Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal
o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones
progresivamente ms diludas de la muestra.

Agar violeta cristas- rojo neutro- bilis -lactosa (VRBA): El agar biliado-rojo neutro-cristal
violeta o medio VRBA es un medio de cultivo de microorganismos, tanto selectivo ,como
diferencial ,que se usa para la identificacin y enumeracin de coliformes. Est formado
por cierto nmero de componentes que favorecen el crecimiento bacteriano,y por otros
componentes que dotan a este medio de sus caractersticas diferenciales y selectivas.

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Materiales:

Licuadora.
Balanza analtica.
Carne molida.
15 Tubos de ensayo.
Placas Petri esteriles.
Agar VRBA.
Mechero bunse.
Esptulas.
Pipetas bacteriolgicas de 1ml y 10ml.
Agua peptonada.
Bao mara
Incubadora
Asa de inoculacin o de siembra
Medios de cultivo:

Caldo Lauril Sulfato Triptosa o Caldo Lauril Sulfato de Sodio(LST o

CLSS)
Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa (Caldo Brila)
Agar ENDO o Agar EMB

Procedimientos:

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Pesar 10 gr de muestra, y tener listo 15 tubos de ensayos con 9 ml de caldo lauril de
sodio para sembrar por triplicado en cada uno y tener aparte 4 tubos de ensayo con
9ml de agua peptonada (A.P.) en cada uno, en la balanza analtica para luego ponerlo
en la licuadora con 90 ml de agua peptonada (A.P.) durante 2 a 2.5 minutos.

Luego sacar un mililitro de la solucin con una pipeta de 10 y verter en el primer tubo y
en los 3 tubos de ensayo con caldo lauril de sodio siendo este el de concentracin 0.1,
sacar 1 ml de este ltimo tubo con una pipeta de 1 y echarlo en el siguiente tubo de
ensayo y el otros 3 tubos de ensayo que contienen caldo lauril de sodio obteniendo una
solucin de 0.01 de concentracin y as sucesivamente.

Al final obtenemos obtendremos concentraciones diferentes (0.1, 0.01, 0.001, 0.0001,

0.00001).

De los 5 tubos de ensayo con agua peptonada con la muestra se colocara 1ml en 5
placas petris y se realizara la siembra por difusin con agar VRBA.

Tanto las 5 placas Petri con los 15 tubos de ensayo se llebaran a imcubar por 48 horas a
temperatura 35C.

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6. RESULTADOS

COLIFORMES:

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

LTS 3 2 2 1 1

BRILA 3 2 2 1 0

E.C. 2 2 1 1 0

COLIFORMES TOTALES:15x102 NMG/gr

COLIFORMES FECALES:200 NMG/gr

ENTEROBACTERIAS:

10-2 10-3

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ROJAS(LACTOSA +) 62 22

BLANCO(LACTOSA -) 20 3

#TOTAL DE ENTEOBACTERIAS:82x102

COLIFORMES:62x102
LACTOSA (-):20x102

7. CONCLUSIONES

La presencia de Enterobacteriaceae o bacterias coliformes indican en los alimentos:

Un inadecuado procesamiento y/o recontaminacion post

procesamiento,frecuentemente a partir de alimentos muy contaminados,
equipos sucios o maniuleo no higienico.
Unas condiciones favorables para la multiplicacin de un amplio rango de
organismos patgenos y toxicogenicos.

8. RECOMENDACIONES

El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada
prctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo.
En las zonas de trabajo estar prohibido comer, beber o manipular lentes de
contacto.

Se recomienda que los materiales a utilizar estn previamente esterilizados.

Se recomienda al momento de usar las pipetas, realizar la operacin al lado de un
mechero para as conservar su esterlilidad.
Tener cuidado en el manejo de los materiales y a si evitar una contaminacin de
mayor nivel.

El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estndares tcnicos y de seguridad

propios de un laboratorio de Microbiologa.

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9. FUENTES DE INFORMACIN

analisis microbiolgicos. (2004).

p://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf.

CCAYAC-M-004. (2006). Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica.

J.L., K. J. (2001). Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and

Safety Indicators. Washington.

10. ANEXOS

Se licua la muestra con AP.

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Se esterilizan las herramientas a Se realiza la siembra por

utilizar. difusin.

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NUMERACION DE COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES

FECALES POR EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

Se mezcla 10 gr de la
muestra de carne con
90 ml de agua
peptonada, lo cual
ser la concentracin
101

Se echa 1 ml
de la
concentracin
a 3 tubos de De lo anterior
ensayo con 10 se echa 1ml
ml de caldo, a otros 3
siendo su tubos de
concentracin ensayo con De lo
de esta mezcla 10 ml de anterior se
de 101 caldo, echa 1ml a
formndose otros 3 tubos
De lo
concentraci de ensayo
anterior se
n de 102 con 10 ml de
echa 1ml a
caldo, De lo anterior
otros 3 tubos
formndose se echa 1ml
de ensayo
concentraci a otros 3
con 10 ml de
n de 103 tubos de
caldo,
ensayo con
formndose
10 ml de
concentraci
Se lleva a incubar por caldo,
n de 104
48 horas a 35C- 37C formndose
concentraci
Anotar los tubos que n de 105
presentan gas( prueba
presuntiva).

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APNDICE

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COLIFORMES TOTALES

-Formacion de colonias rojas

rodeadas de halos rojos o colonias
mucoides rojo-rosadas o colonias
con brillo metalico en Agar ENDO

si aparecen
INTERPRETAC Se selecciona si solo una
resultados + en
ION DE DATOS la dilucin mas dilucin
la dilucin
alta (menor presenta tubos
Para dar una siguiente a las 3
cantidad de la + , elegir 3
combinacin de seleccionadas,
muestra )en la diluciones
tubos + sumar el
que resulten sucesivas de
teniendo en nmero de
todos los tubos modo que el
cuenta las 3 tubos +
+ y los 2 resultado +
diluciones de la presentes en
subsiguientes o corresponde a
muestra de esta dilucin al
se emplea las 3 la dilucin del
NMP resultado de la
ultimas. medio.
dilucin anterior

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RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS POR EL METODO DE

RECUENTO EN PLACA

Se mezcla 10 gr de la
muestra con 90 ml de
agua peptonada, lo
cual ser la
concentracin 101

Se obtienen 5 diluciones de 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001

Se les deposita 1ml de cada

concentracin en 5 placas
Petri diferentes

Se le agrega agar VRBA y se

realiza la siembra por difusin se
deja reposar por 7 minutos y se
vuelve a agregar 10 ml del agar
VRBA.
Se lleva a incubar por 48
horas a 35C-37C.

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COLONIAS ROJAS Lactosa positivas

COLONIAS BLANCAS Lactosa negativas

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