CONSUMO DE OXGENO POR POS FERMENTACIN DE LEVADURA EN VINO: FACTORES QUE

AFECTAN SU VELOCIDAD Y EXTENSIN EN CONDICIONES ENOLGICAS.

Volker Schneider, Jonas Mller, y Dominik Schmidt3
Resumen
Las las de levadura de vino pos fermentado muestran propiedades antioxidantes basadas en su
capacidad de consumir oxgeno disuelto. La capacidad de consumo de oxgeno de las las de levadura
suspendidas obtenidas despus de las fermentaciones con seis cepas de levadura seca activas
comerciales se investig en vinos modelo, blanco y rojo utilizando sensores de oxgeno basados en
fluorescencia que operan de forma no destructiva. En la solucin modelo, se mostr que la tasa de
consumo de oxgeno de las las de levadura dependa de su cantidad, cepa de levadura, dixido de
azufre y temperatura. Es ligeramente ms bajo en vinos rojos que en blancos. Est fuertemente
disminuido por los niveles actuales de dixido de azufre libre, excluyendo as el uso complementario
de ambos como antioxidantes en el vino. Sin embargo, en 25 vinos blancos muestreados
aleatoriamente producidos en condiciones comerciales, la tasa y el alcance del consumo de oxgeno
durante los primeros seis meses de post fermentacin no tuvieron una correlacin significativa con
ninguno de estos factores que interactan, por lo que es difcil predecir el efecto antioxidante real de
las las de levadura. En estos vinos, las las de levadura consumieron del 0 al 47% del oxgeno disuelto.
Aunque la capacidad total de consumo de oxgeno de las las de levadura no es un factor limitante en
las condiciones vitivincolas comerciales, su consumo de oxgeno avanza a un ritmo limitado que
reduce pero no puede evitar totalmente la oxidacin qumica concomitante del vino.
Palabras clave: vino, las de levadura, oxgeno disuelto, oxidacin, dixido de azufre, consumo de
oxgeno
I. Introduccin
Al final de la fermentacin alcohlica, las clulas de levadura comienzan a autorizarse. La autolisis de
levaduras es un proceso lento caracterizado por la hidrlisis de los biopolmeros intracelulares por las
enzimas de levadura activadas tras la muerte celular. Como resultado, los compuestos citoplsmicos
y de la pared celular se liberan en el vino con diversas consecuencias enolgicas y sensoriales. Con
el objetivo de hacer un uso deliberado de este proceso, envejecer en las las se ha convertido en un
concepto enolgico para perseguir objetivos estilsticos especficos. Este concepto se basa en la
suposicin de que, despus de la fermentacin primaria, los las consisten predominantemente de
clulas de levadura. Se hace una distincin entre las ligeros que permanecen en suspensin y las
pesadas que se depositan en el fondo del recipiente.
Las mano protenas extradas de las las de levadura contribuyen al volumen del paladar y disminuyen
la astringencia de los taninos, mejorando as la sensacin en la boca y la estructura. Tambin pueden
contribuir a la estabilidad de las protenas y los bitartratos. Los steres, nucletidos, pptidos y
aminocidos liberados de las las de levadura pos fermentacin proporcionan precursores del sabor y
mejoran la complejidad del sabor (1,2). Algunos de estos compuestos amino, como el glutatin y la
cistena, pueden ayudar a proteger contra la oxidacin (3). Las clulas de levadura absorben el
fdcvoxgeno disuelto (DO), retirndolo de las reacciones de oxidacin (4) Sin embargo, cuando las las
de levadura se dejan demasiado tiempo y se compactan en el fondo del recipiente de envejecimiento
en condiciones anaerbicas, pueden comenzar a producir compuestos voltiles de azufre que afectan
negativamente el sabor (5). La acumulacin de compuestos de levadura en el vino se interrumpe
mediante la eliminacin de la levadura por filtracin, mientras que el mantenimiento de la levadura en
suspensin al agitar las las acelera su liberacin.
En su formato tradicional, el envejecimiento de las las se lleva a cabo en vinos blancos almacenados
en barriles durante varios meses a ms de un ao. Durante este perodo, se evita que las las que se
dejan despus de la fermentacin se sedimenten mediante agitacin peridica denominada
btonnage, o enrollando los barriles. Btonnage, como se practica tradicionalmente, estimula la
disminucin del dixido de azufre libre y la absorcin del oxgeno atmosfrico debido a la eliminacin
del tapn y el proceso de agitacin, Sin embargo, el bantenaje no es intrnsecamente oxidativo ya que
la oxidacin se amortigua mediante la absorcin de DO por levadura (4) y la liberacin de aminocidos
reductores (3). El rgimen de agitacin, la cantidad de levadura y el control de SO 2 determinan si el
envejecimiento en las heces es ms reductivo u oxidativo (6).
La tasa de absorcin de DO de la levadura durante el envejecimiento en las de levadura se cuantific
en 0,003 a 0,011 mg / (L h) por 109 de clulas de levadura del segundo al sexto mes de
envejecimiento a 14 C (4). Las tasas iniciales de consumo de DO y su decaimiento gradual e irregular
durante el envejecimiento del vino fueron fuertemente dependientes de las cepas de levadura, con 11
a 100% de la tasa inicial de consumo de DO restante despus de cuatro meses de envejecimiento (4).
En trabajos posteriores, el consumo de oxgeno por las levaduras no viables se atribuy a una va
mayoritariamente no respiratoria que utiliza el oxgeno para la oxidacin de los lpidos de membrana
(7,8) y ergosterol (9) que conduce a la produccin de perxidos lipdicos y productos finales
desconocidos, lo que confirma los hallazgos anteriores sobre la levadura de cerveza (10). Estas
reacciones dependen del NADPH (11) y se suspenden despus de la pasteurizacin (4). Cuando se
agrega oxgeno en exceso durante la fermentacin alcohlica, la reactividad de las las de levadura
hacia la disminucin del oxgeno debido a la degradacin del esterol dependiente del oxgeno (12). Se
demostr que la respiracin solo interviene en la absorcin de oxgeno por las las de levadura durante
las primeras tres semanas despus de la fermentacin (4) ya que el 99% de las clulas de levadura
mueren dentro de las dos semanas posteriores a la fermentacin (13). Contrariamente a estos
estudios, trabajos anteriores han demostrado que durante la oxigenacin de cultivos sumergidos de
postfermentacin Clulas de S. cerevisiae, el oxgeno tambin se usa para la formacin de
acetaldehdo mediante la actividad del etanol deshidrogenasa unida a la levadura (14,17). Adems,
se observ un aumento de la concentracin de acetaldehdo cuando los vinos de mesa blancos sin
filtrar se sometieron a una absorcin involuntaria de oxgeno durante el trasiego y el almacenamiento,
lo que requiri, en ltima instancia, mayores adiciones de SO2 para unirlo (18).
Aunque la mayora de estas investigaciones se llevaron a cabo en el contexto del envejecimiento del
barril, la capacidad de la fermentacin posterior a la lea para consumir DO sugiere que pueden actuar
como un agente reductor de una manera ms general. Su consumo de DO se recuper durante el
almacenamiento y las operaciones de la bodega protegeran los constituyentes del vino contra la
oxidacin qumica. La evidencia histrica confirma que los las de levadura retrasan el tostado de los
vinos blancos expuestos al oxgeno atmosfrico en ausencia de dixido de azufre libre. Por lo tanto,
el objetivo de este estudio es proporcionar datos extensos sobre la tasa y el grado en que el DO
presente en el vino es consumido por cantidades variables de las de levadura suspendidas en
comparacin con los vinos filtrados, el efecto de algunos parmetros tcnicos sobre la velocidad de
esta reaccin, su importancia en condiciones prcticas de vinificacin,
II. Materiales y mtodos
Evaluacin de la biomasa de levadura y el nmero de clulas
Las las de levadura suspendidas se cuantificaron mediante mediciones nefelomtricas de turbidez
usando un turbidmetro Hach 2100Q (Loveland, CO, EE. UU.) Calibrado con estndares de formazina
primaria y expresado en unidades de turbidez nefelomtrica (NTU). Las medidas nefelomtricas de
turbidez de las diluciones en serie en la solucin modelo de suspensiones de levadura obtenidas
despus de la fermentacin de un jugo de uva filtrado produjeron una curva de correlacin que mostr
linealidad por debajo de 40 NTU con R = 0.9995. En consecuencia, todas las mediciones de muestra
se llevaron a cabo despus de la dilucin con solucin modelo a menos de 40 NTU para medir en el
rango lineal. La turbidez de la muestra original luego se calcul a partir del factor de dilucin. En un
segundo paso, las suspensiones de levadura se usaron para contar clulas en un hemocitmetro
Fuchs-Rosenthal (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) despus de una dilucin adecuada de 10 a 40 NTU.
Se realiz el conteo celular de 40 cuadrados de unidades en cada una de las ocho gotas y se calcul
el nmero medio de clulas por ml. Los nmeros de clulas de levadura de las diluciones seriadas se
correlacionaron con las lecturas de NTU. La correlacin produjo 6.3 104 clulas por ml por 1 NTU.
Brind la base para convertir las concentraciones de levadura reportadas en NTU en este trabajo.
III. Vinos y levaduras
El consumo de oxgeno por las clulas de levadura se estudi en solucin modelo y en los vinos de
los que se originaron. Los vinos y las heces de levadura se obtuvieron de las bodegas locales. La
vinificacin se realiz utilizando procedimientos estndar, con la excepcin de que el jugo se aclar a
menos de 20 NTU de turbidez residual usando enzimas pectolticas, seguido de la adicin de 2 g / L
de bentonita de tres a cinco horas ms tarde, sedimentacin, flotacin o filtracin. En estas condiciones
de zumos de uva altamente clarificados, los slidos de los vinos resultantes consistan
predominantemente (> 98%) de clulas de levadura. Despus de la clarificacin, se inocularon los
diferentes jugos que contenan 200 a 220 g / L de azcar inicial con 20 g / hL de cepas de levadura
seca activas disponibles comercialmente. Las fermentaciones y el posterior almacenamiento entre 8
y 15 C se llevaron a cabo en tanques de acero inoxidable. No se aadi oxgeno durante la
fermentacin. Las cepas de levadura utilizadas para la inoculacin y ms investigacin fueron Lalvin
CY 3079 (Lallemand, Montreal, Canad), Lalvin EC 1118 (Lallemand), Lalvin RC 212 (Lallemand),
Fermicru VB 1 (Oenobrands, Montpellier, Francia), Coleccin Cpage Sauvignon (Oenobrands ) y
SIHA Riesling Yeast (Eaton, Langenlonsheim, Alemania).
Ensayos de consumo de oxgeno disuelto
La solucin modelo contena 13% (en volumen) de alcohol en agua destilada. Despus de la adicin
de 8 g / L de cido tartrico, el pH se ajust a 3.5 usando NaOH al 10%.
Para controlar el consumo de levadura disuelta (DO) en solucin modelo, se extrajo levadura de vinos
blancos jvenes despus de la fermentacin a sequedad (<2 g / L de azcar) y antes de la aparicin
de la fermentacin malolctica (<0,2 g / L de cido lctico) Se muestrearon partes alcuotas de vino
de 750 ml en botellas purgadas con nitrgeno y se centrifugaron (4 min, 3000 x g). La suspensin de
levadura obtenida se lav y diluy en la solucin modelo a las concentraciones deseadas segn se
determin midiendo la turbidez nefelomtrica de las suspensiones. Las mediciones de consumo de
oxgeno comenzaron inmediatamente despus de la dilucin, ya que se ha demostrado que el
almacenamiento de levaduras en soluciones acuosas da como resultado valores incrementados
debido a los cambios fisiolgicos de las clulas (10).
Para controlar el consumo de DO de levadura en vinos sin filtrar, se tomaron muestras de 750 ml de
los tanques de almacenamiento en diferentes momentos y se dividieron en dos alcuotas. Se us una
alcuota para la medicin del consumo de DO sin tratamiento adicional. La otra alcuota se aclar por
centrifugacin y filtracin a travs de una membrana de 0,6 m (modelo 11305; Sartorius, Gttingen,
Alemania) para servir como una referencia sin levadura en las mediciones de consumo de DO. Para
la evaluacin del efecto de la matriz del vino en el consumo de DO por levadura, los vinos filtrados en
forma estril se complementaron con lechada de levadura a las concentraciones deseadas.
Monitoreo de la cintica del consumo de oxgeno
El oxgeno disuelto se determin mediante un mtodo no invasivo de extincin de luminiscencia
utilizando un medidor de oxgeno de fibra ptica de canal nico Fibox 3 Trace junto con sensores de
oxgeno luminiscentes PSt3 (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Alemania). La sonda
Fibox 3 mide el tiempo de cada de la luminiscencia de los puntos del sensor de luminforo montados
dentro de un vaso de vidrio transparente. El sensor de luminforo se excita con una luz monocromtica
modulada de intensidad sinusoidal entregada por la fibra ptica. Su tiempo de cada provoca un retraso
de tiempo en la seal de luz emitida por el luminforo. El tiempo de cada disminuye en presencia de
oxgeno. Por lo tanto, la excitacin del sensor genera una respuesta proporcional a la cantidad de OD
alrededor del sensor.
Los puntos de mini sensor sensibles al oxgeno se encolaron con silicona en las posiciones centrales
en la pared interna de matraces de 100 ml, lo que les permiti estar en contacto con el lquido. Luego,
los matraces se llenaron hasta el borde con una solucin modelo o vino previamente suministrado con
oxgeno atmosfrico a una concentracin de saturacin cercana (aproximadamente 7 mg / L) mediante
agitacin intensa. Posteriormente, los matraces se sellaron con tapones roscados provistos de un
revestimiento de cono de plstico que garantiza la exclusin de cualquier burbuja de aire en la interfaz
entre el lquido y la tapa interna. Las condiciones de almacenamiento y tratamiento de muestras
complementarias se especifican en la seccin Resultados. Se obtuvieron lecturas DO de los lquidos
sin abrir los matraces, apuntando la fibra ptica de transferencia de luz en los puntos del sensor a
travs del vidrio. Las mediciones se realizaron con una velocidad de grabacin de un punto de lectura
por tres segundos. Las lecturas se tomaron como vlidas cuando la desviacin estndar fue <2%,
despus de lo cual se calcul la media. El rango de medicin DO fue de 0 a 22 mg / L con un lmite de
deteccin de 0.015 mg / L. La calibracin manual se aplic utilizando los datos de calibracin por lotes
obtenidos del fabricante.
La agitacin recurrente de los matraces cerrados evit la sedimentacin de las las, imitando as las
condiciones de almacenamiento ms reales. Las lecturas de DO fueron realizadas peridicamente
hasta agotarse (0.2 mg / L), y los datos de OD se trazaron en funcin del tiempo. De acuerdo con la
forma y la ecuacin de las curvas obtenidas, la interpretacin de los datos se realiz de dos maneras
diferentes: en las soluciones modelo, la pendiente lineal de la curva proporcion la tasa de consumo
de oxgeno (OCR) en mg / (L h) de levadura directamente. En vinos reales que muestran una forma
de curva lineal, el OCR de la levadura se obtuvo mediante la sustraccin del OCR de un blanco filtrado.
Sin embargo, en muchos vinos, el cambio de OCR en el tiempo se ajust mejor con una funcin
exponencial independientemente de la presencia o ausencia de levadura. Esto permiti calcular el
porcentaje y la cantidad absoluta de DO consumida por la levadura. Para ese propsito,a travs
de anlisis de regresin en dos funciones matemticas y normaliz ambas funciones al mismo punto
cero antes de integrarlas a lo largo del tiempo. La divisin de la integral de la alcuota no filtrada por la
integral del blanco filtrado proporcion el efecto de DO consumido en porcentaje que no pudo atribuirse
al efecto de la levadura sino a la oxidacin qumica de la matriz del vino. La parte restante correspondi
al efecto de la levadura en la disminucin general de OD expresada en porcentaje.
Capacidad total de consumo de oxgeno
La capacidad total de consumo de oxgeno de las suspensiones de levadura se midi en la solucin
del modelo en condiciones de posible suministro de oxgeno de hasta 80 mg / L, utilizando un ensayo
manomtrico estndar diseado originalmente para la evaluacin de la demanda biolgica de oxgeno
del agua (OxiTop , WTW, Weilheim, Alemania). Los volmenes definidos de suspensiones de
levadura lavadas a fondo se transfirieron a botellas de color mbar de 500 ml selladas hermticamente
con sensores de presin manomtrica. Las botellas se agitaron continuamente a 200 rpm y a 20 C
en una plataforma de agitacin magntica de 6 posiciones para asegurar el suministro constante de
oxgeno desde el espacio superior durante el experimento. La disminucin de la presin controlada se
relacion con el consumo de oxgeno que, a su vez, se grafic con el tiempo. Se utiliz un conjunto de
control que no contena levadura para corregir la absorcin de oxgeno de la matriz de la solucin
modelo. La desviacin estndar de la medicin fue 10% de las lecturas.
Anlisis qumicos
El acetaldehdo, el dixido de azufre libre, el cido lctico y el azcar residual se midieron
enzimticamente utilizando kits de prueba apropiados (R-Biopharm AG, Darmstadt, Alemania).
Anlisis estadstico
Todos los anlisis estadsticos se realizaron con el software R v. 3.2.1 (19). Los grficos se obtuvieron
utilizando el paquete 'ggplot2' (20); Se produjeron modelos de regresin lineal y no lineal utilizando el
paquete 'nls2' (21).
Resultados
Efecto de la concentracin de levadura en OCR
La solucin modelo se eligi para estudiar el efecto de la concentracin de levadura en su capacidad
para consumir DO. Por lo tanto, se evit cualquier interferencia de los componentes del vino oxidable.
Las concentraciones de levadura ensayadas fueron 5, 25, 50, 100, 200, 300 y 400 NTU. El consumo
de oxgeno en cada lote fue casi constante durante las pruebas, siguiendo una cintica de orden cero
que permiti expresar el OCR en mg / (L h) de oxgeno (fig. 1).
Figura 1 Tasa de consumo de oxgeno (OCR) de las cepas de levadura en la solucin modelo a 20 C
segn se ve afectada por la concentracin de levadura. Las levaduras se cosecharon y se ensayaron
una o tres semanas despus del final de la fermentacin alcohlica. (SO2) libre = 0 mg / L; N = 2;
NTU = nefelomtrico
Aunque todas las levaduras se cosecharon y se ensayaron dentro de un mes despus del final de la
fermentacin alcohlica, hubo notables diferencias en el OCR entre las cepas de levadura a
concentraciones determinadas. Sin embargo, estas diferencias deben considerarse con precaucin,
ya que podran verse afectadas por variables matriciales y tcnicas, as como por un consumo residual
y respiratorio de DO. Las tasas de consumo reproducibles requeran un mnimo de 50 NTU de
levadura. Por encima de ese nivel mnimo, el OCR vari de 0.27 a 2.09 mg / (L h).
Curiosamente, el OCR no siempre aumenta con el aumento de las concentraciones de levadura en
una forma proporcional, es decir, el OCR por clula disminuye a densidades celulares ms altas. En
estos casos, cuando el OCR se grafica contra NTU, la pendiente de la curva obtenida sugiere un
comportamiento de tipo Michaelis-Menten. Este patrn ha sido observado por otros autores (11) y se
cree que es causada por un impedimento estrico de difusin de oxgeno a nivel de partculas como
resultado de la presencia fsica de clulas de levadura, haciendo que la difusin de OD en el lquido
sea la etapa limitante de la velocidad. Sin embargo, dado que este comportamiento no pudo verificarse
en todo el conjunto de datos, se utiliz un modelo lineal de anlisis de regresin para probar el efecto
de la concentracin de levadura en el OCR. Como era de esperar, podra confirmarse que las
concentraciones de levadura elevadas conducen a un aumento de OCR (nivel de confianza del
99.9%). Esta tendencia general es vlida para todas las cepas de levadura en consideracin. Los
datos por debajo de 50 NTU se descuidaron ya que el lmite de cuantificacin no permiti mediciones
reproducibles.
Efecto de la temperatura en el OCR
Dado que el consumo de DO de las clulas de levadura se basa en la oxidacin de compuestos de
membrana de levadura complejos, se espera que dependa tambin de la temperatura. El efecto de la
temperatura en las cepas de levadura con concentraciones ajustadas a 200 NTU se evalu en la
solucin modelo a 20, 15 y 5 C. El consumo de DO sigui una cintica de orden cero para cada
temperatura (tabla 1).
tabla 1
Efecto de la temperatura en la tasa de consumo de oxgeno (OCR) por diferentes cepas de levadura
en solucin modelo a 20 C
El uso de un modelo de regresin lineal para examinar el efecto de la temperatura y las cepas de
levadura en el OCR muestra que la temperatura tiene una influencia significativa (nivel de confianza
del 99%). Este comportamiento se encontr de cada una de las diferentes cepas de levadura en un
grado variable, con niveles de confianza para las diferencias entre las cepas de levadura que van del
90 al 99%.
Bajo las condiciones de almacenamiento de vino fro, el OCR de las clulas de levadura disminuye
notablemente. Este efecto de temperatura est de acuerdo con los resultados de un estudio clsico
que muestra que las tasas de consumo de OD obedecen a la ecuacin de Arrhenius cuando la relacin
de la tasa de consumo a la temperatura se calcula como una constante cintica (22). Sin embargo, la
tasa de consumo de oxgeno de los vinos filtrados tambin avanza a una velocidad menor cuando la
temperatura disminuye (6). Por lo tanto, cuando las las de levadura y los compuestos de matriz de
vino oxidables compiten por DO en vinos reales, la contribucin porcentual de levadura al consumo
total de oxgeno no se ve necesariamente afectada por la temperatura.
Efecto del dixido de azufre libre en el OCR
Dado que la mayora de los vinos se almacenan con concentraciones variables de dixido de azufre
libre despus de la fermentacin, otra cuestin pertinente es si las adiciones de SO 2 tendrn algn
efecto en el OCR de las clulas de levadura posteriores a la fermentacin. Las mediciones de OCR
de las seis cepas de levadura suspendidas a 200 NTU en la solucin modelo enriquecida con
cantidades crecientes de SO2 mostraron un fuerte efecto supresor de SO2 (fig. 1). Con un pH de vino
promedio = 3.5, hay un lmite crtico alrededor de 20 mg / L de SO2 libre por encima del cual el OCR
de la levadura se vuelve casi insuficiente para tener algn efecto prctico. Agotamiento de DO por
reacciones con SO2 durante el curso del ensayo no puede explicar este comportamiento ya que
aumentara el OCR cuando aumenten las concentraciones iniciales de SO 2. La razn por la cual el
SO2 inhibe fuertemente la absorcin de DO por la levadura sigue siendo desconocida, pero la inhibicin
de las enzimas no identificadas por SO2 podra ser una causa.
Figura 2. Efecto de la SO2 libre en la tasa de consumo de oxgeno (OCR) de las cepas de levadura en
la solucin modelo a 20 C. Las levaduras se cosecharon dentro de las dos semanas posteriores al
final de la fermentacin alcohlica y se ajustaron a 200 unidades de turbidez nefelomtrica (NTU).
Boxplots
Efecto de la matriz de vino en OCR
Se investig el efecto de la matriz de vino (blanco vs. vino tinto) utilizando tres cepas de levadura (CE
1118, CY 3079 y Fermicru VB 1). Se agregaron cantidades definidas de levadura cosechada despus
de la fermentacin alcohlica a un vino blanco filtrado estril y tres vinos tintos diferentes (A, B y C)
sin ningn dixido de azufre libre. Despus de un mes de almacenamiento en condiciones
anaerbicas, los vinos se saturaron con oxgeno y se registr la disminucin de DO. Sigui un patrn
casi lineal comparable al de la solucin modelo. Para calcular el OCR neto de las levaduras, se corrigi
la disminucin global de DO para la unin qumica de oxgeno por los respectivos vinos sin agregarle
levadura, que sirvi como un blanco. Los resultados se dan en la
Tabla 2
Tabla 2
Efecto de la matriz del vino sobre la tasa de consumo de oxgeno (OCR) de la levadura suspendida
en vinos reales a 20 C, afectados por la concentracin de levadura
Nuevamente, el OCR no se mejora al aumentar las concentraciones de levaduras de forma lineal,
confirmando as los resultados obtenidos en la solucin modelo. Adems, para concentraciones de
levadura comparables, las figuras de OCR son del orden de las encontradas en la solucin modelo
(Fig. 1). Sin embargo, hay una clara tendencia hacia una disminucin de la OCR de levadura en los
vinos tintos en comparacin con el vino blanco. Probando la hiptesis de que la matriz de vino tinto da
como resultado una OCR ms baja que la matriz del vino blanco, se usaron t-tests pareados para las
tres series de experimentos. Las hiptesis fueron confirmadas para EC 1118, CY 3079 y Fermicru VB
1 en un nivel de confianza de 90, 99 y 95%, respectivamente.
Este efecto matricial se ha explicado por una adsorcin parcial de polifenoles de vino tinto por
levaduras. Como consecuencia, estos fenoles interactan fuertemente con los componentes de la
membrana celular de la levadura responsable del consumo de oxgeno. Se supone que provocan un
colapso del espacio intermembrana citoplsmico, que reduce la accesibilidad y la reactividad del
oxgeno hacia los esteroles y los cidos grasos insaturados de la membrana celular. Las prdidas
mayores de reactividad general de oxgeno ocurren durante los primeros diez das de contacto de
levadura con polifenoles de vino tinto. Estas prdidas son irreversibles y tambin se observaron
despus de que los polifenoles solubles se hubieran separado de las clulas de levadura (8,23).
Contrariamente a estos hallazgos obtenidos en soluciones modelo con 3, 6 y 9 g / L de material fenlico
extrado del vino tinto, el impacto de los fenoles de vino tinto en el OCR de levadura en condiciones
ms realistas de vinos tintos estndar (aproximadamente 2 g / L de los fenoles totales) parece bastante
insignificante.
Capacidad total de consumo de oxgeno
Se utilizaron tres cepas de levadura (EC 1118, CY 3079 y Fermicru VB 1) suspendidas en
solucin modelo a una concentracin de 300 NTU para evaluar su capacidad total de absorcin
de oxgeno y su cintica de consumo utilizando el mtodo manomtrico a 20 C. Como se
muestra en la Fig. 3, el trazado de la absorcin de oxgeno frente al tiempo produjo curvas
cncavas que mostraban un aumento casi lineal del oxgeno consumido al principio, seguido
de una transicin a un estado estacionario que indicaba la reduccin de los recursos de
absorcin de oxgeno de la levadura despus de 45 a 55 h y 40 a 60 mg / L de DO consumido.
Estos resultados indican que incluso concentraciones menores de clulas de levadura
suspendidas correspondientes a aprox. 50 NTU (3.15 106 clulas / mL) sera suficiente para
consumir una concentracin de saturacin de DO. En condiciones de vinificacin industrial, la
capacidad total de consumo de oxgeno de las las de levadura no es un factor limitante para
proteger el vino contra la oxidacin.
Fig. 3
La capacidad total de consumo de oxgeno y la cintica del consumo se muestran a travs del
oxgeno disuelto (DO) consumido por las clulas de levadura suspendidas en una solucin
modelo de 300 unidades de turbidez nefelomtrica (NTU) un mes despus de la fermentacin
alcohlica. Las barras de error indican el
Efectos combinados de concentracin de las, edad y SO2 libre en vinos reales.
En un ensayo no estructurado, se obtuvieron muestras de 25 vinos blancos sin filtrar producidos en
condiciones comerciales y fermentadas con las cepas de levadura utilizadas en este estudio. Las
muestras se dividieron en dos partes alcuotas, una de ellas contena la levadura original y la otra se
filtr para servir como un blanco. Despus del suministro de oxgeno por aireacin, la disminucin de
DO en ambas alcuotas a 20 C se grafic con el tiempo. La concentracin de levadura en los vinos
oscil entre 8 y 310 NTU, dixido de azufre inicial libre de 0 a 57 mg / L, y la edad de los vinos de 2 a
26 semanas despus de la fermentacin alcohlica.
Los diagramas de disminucin de OD obtenidos fueron cercanos a funciones lineales o exponenciales
dependiendo del vino individual. Ambos patrones han sido reportados por otros autores (24,25). En la
mayora de los vinos filtrados, sin embargo, las parcelas tomaron la forma de una curva ms o menos
convexa que se ajustaba a una funcin exponencial negativa. Corresponden a una cintica de reaccin
de primer orden que indica un cambio del OCR a lo largo del tiempo y que representa la unin qumica
exclusiva de DO. En los vinos sin filtrar que contenan levadura, tanto el consumo de DO por la
levadura y el consumo de DO debido a la unin qumica se acumularon a un total, que an mostraba
un orden de reaccin global cercano a uno que podra representarse mejor mediante una ecuacin
exponencial. Fig. 4 da un ejemplo. En estas condiciones, no se obtuvieron valores de OCR realizables
ya que cambian durante todo el perodo de prueba de acuerdo con la concentracin instantnea de
DO (10). En cambio, el tratamiento matemtico de las ecuaciones de ambas curvas, tal como se
describe en la seccin Materiales y mtodos, proporcion el porcentaje y la cantidad absoluta de DO
consumida por la levadura, y la parte restante corresponde a la DO consumida por la oxidacin qumica
de la matriz del vino.
Fig. 4 Consumo exponencial de oxgeno disuelto (DO) en un vino blanco (43 mg / L de SO2 libre) con
levadura suspendida (Fermicru VB 1, 50 NTU) y despus de la filtracin, 8 semanas despus de la
fermentacin
La DO consumida por la levadura oscil entre 0 y 47% (datos no mostrados). Se observaron las
tendencias del gran impacto de la concentracin de levadura y SO2 libre en el consumo de DO por
levaduras, lo que confirma los resultados obtenidos en la solucin modelo. Sin embargo, al utilizar los
anlisis multivariados, ninguno de los parmetros probados (cepa de levadura, concentracin de
levadura, vino, edad y concentracin de SO2 libre) mostr influencia significativa en la tasa de consumo
de OD por levadura, expresada como el coeficiente de velocidad de reaccin de cintica de primer
orden. La combinacin y la interaccin de los diversos parmetros no permiten una prediccin
confiable de la reactividad de la levadura hacia DO en un vino dado.
Sntesis de acetaldehdo
El acetaldehdo total se midi despus del agotamiento completo de DO en los 25 vinos mencionados
anteriormente. Las diferencias en la concentracin de acetaldehdo entre las alcuotas filtradas y no
filtradas de cada vino no fueron significativas y no excedieron 3 mg / L (datos no presentados). Estos
resultados indican que el consumo de hasta 7.5 mg / L de DO por lilas de levadura posteriores a la
fermentacin de las cepas de S. cerevisiae analizadas en este estudio no provoca ningn aumento en
el contenido de acetaldehdo. Sugieren la ausencia de cualquier metabolismo respiratorio, lo que
apoya los hallazgos anteriores (7,10) que la OD se consume principalmente por la oxidacin lipdica.
Por otro lado, dado que la viabilidad de la levadura puede variar considerablemente en la prctica, no
se puede excluir que la respiracin contribuya al consumo de DO bajo diferentes condiciones
enolgicas.
Discusin
La capacidad de consumo de oxgeno de las clulas de levadura despus de la fermentacin se
conoce tanto en la industria del vino como en la de la cerveza durante un tiempo considerable. Sin
embargo, no est claro cmo se ve afectada por los parmetros enolgicos, y cunta DO se consume
realmente por las las de levadura en lugar de reaccionar con los constituyentes del vino intrnsecos
mediante la unin qumica, lo que conduce necesariamente a la oxidacin del vino.
Los las de levadura de vino suspendido pueden consumir hasta varias concentraciones de saturacin
de DO, con el grado exacto dependiendo principalmente de su cantidad. Su cintica de consumo de
DO vara entre un patrn lineal y una cintica de primer orden. A pesar de su considerable capacidad
total de consumo de oxgeno, que depende principalmente de la oxidacin lipdica (7,10), no pueden
consumir todo el oxgeno recogido por el vino. Nuestros resultados indican una unin qumica de
oxgeno concomitante por los constituyentes del vino oxidables.
La velocidad a la que las clulas de levadura consumen oxgeno, reportada como OCR, es un
parmetro esencial para evaluar el equilibrio entre las cantidades de DO consumidas por la biomasa
de levadura y por la matriz del vino, respectivamente. Se puede suponer que cuanto ms alta es la
OCR de las las de levadura, menos DO est disponible para la oxidacin qumica del vino. Sin
embargo, es imposible predecir hasta qu punto la levadura contribuye al consumo total de DO en
condiciones vitales comerciales por dos razones: en primer lugar, las combinaciones e interacciones
de parmetros enolgicos variables como la cepa de levadura, la concentracin, la edad, la matriz del
vino y el SO2 libre hacen que sea difcil predecir la velocidad a la que la DO consume la levadura como
tal; en segundo lugar, la tasa de unin qumica de DO a los fenlicos del vino es una variable
desconocida, lo que hace que sea imposible deducir el porcentaje de DO consumido por la levadura
de su OCR.
Se ha demostrado por primera vez que el dixido de azufre inhibe fuertemente las reacciones
involucradas en el consumo de oxgeno por las las de levadura, con niveles de ms de 20 mg / L de
SO2 libre en el pH del vino que lo hace casi sin sentido. Por lo tanto, los efectos antioxidantes de los
las de levadura y el dixido de azufre no pueden usarse de manera complementaria. En los vinos
almacenados con concentraciones relativamente altas de SO2 libre, la proteccin contra la oxidacin
de las las de levadura es menos beneficiosa que en los vinos con concentraciones bajas de sulfito.
Dado que el efecto antioxidante de las las de levadura se expresa ms cuando el SO2 libre es bajo o
ausente, son una valiosa herramienta de vinificacin cuando se producen vinos sin SO2 aadido.
Cuando los vinos se almacenan en tanques de acero inoxidable, la exposicin inadvertida al oxgeno
atmosfrico se produce durante las operaciones de la bodega, como bombeo, centrifugacin, filtracin,
picado, estabilizacin en fro y transporte de vino a granel. En estas condiciones, la magnitud de la
absorcin de oxgeno es altamente variable y vara de 0.1 a 3 mg / L en cada una de estas operaciones
(26,29). El almacenamiento debajo del espacio superior puede proporcionar cantidades adicionales
de oxgeno. Por lo tanto, se ha propuesto una filtracin retardada para hacer uso de la absorcin de
oxgeno por las las de levadura y mitigar el efecto perjudicial de la absorcin incontrolada de oxgeno
por los vinos blancos afrutados y sensibles al oxgeno (30). Sin embargo, la propiedad antioxidante de
las las de levadura se ve disminuida en gran parte por la presencia de SO2 libre.
Cuando los vinos se almacenan en barriles estndar de 225 L, la cantidad de oxgeno que reciben
vara entre 10 y 45 mg / L por ao con un promedio de 20 mg / L por ao, disminuyendo con la edad
de los barriles (31,32) .Suponiendo una absorcin promedio de oxgeno de 0.05 mg / L por da en el
barril, se necesitara un OCR de levadura de 0.002 mg / (L h) para eliminar ese oxgeno a la velocidad
que disuelve en el vino si las clulas de levadura fueran el nico oxgeno receptor. Sin embargo, una
unin qumica simultnea y variable de oxgeno es inevitable. Aumenta con concentraciones
crecientes de SO2 libre y disminuye el efecto reductor ejercido por las las de levadura. Como
consecuencia prctica, el envejecimiento tradicional del vino blanco en condiciones semi-oxidativas
en barriles se lleva a cabo con bajas concentraciones de SO2 libre y altas cantidades de las de
levadura peridicamente resuspendidas por agitacin. El comportamiento redox durante el
envejecimiento tradicional del barril no se aplica a los vinos blancos afrutados generalmente
almacenados en tanques con mayores concentraciones de SO2 libre.
El suministro continuo de oxgeno comparable al envejecimiento en barriles tambin se produce
cuando los vinos tintos se someten a microoxigenacin en tanques. Las las de levadura compiten por
el oxgeno con los fenoles del vino tinto y dificultan el proceso de envejecimiento del vino (8). Este
hallazgo explica por qu los vinos tintos jvenes resisten ms consumo de oxgeno que los viejos
despus de la clarificacin. Sin embargo, estas relaciones se complican an ms por una adsorcin
parcial de los polifenoles en las membranas de las clulas de levadura, lo que reduce la reactividad
global de ambas levaduras y polifenoles hacia el oxgeno (23). Nuestros resultados indican que una
concentracin de levadura tpica de 100 NTU en vinos tintos jvenes puede consumir DO a razn de
0.1 a 1 mg / (L h) durante el primer mes despus de la fermentacin primaria (Tabla 2). Por lo tanto,
fueron solo un poco menos efectivos que en los vinos blancos, donde consumieron hasta el 47% del
DO total. Estos hallazgos indican que las las de levadura pueden consumir una cantidad sustancial
de DO provista durante la micro-oxigenacin y retirarla de las reacciones con fenoles de vino tinto
segn lo previsto por este tratamiento.
La cuantificacin de la biomasa de levadura es esencial para el correcto funcionamiento con las de
levadura. Las clulas de levadura suspendidas producen turbidez que vara en funcin de la cantidad
de clulas de levadura por unidad de volumen. A diferencia del recuento de clulas, la medicin de la
turbidez es un procedimiento fcilmente manejable implementado en muchas bodegas. Sin embargo,
a pesar de su factibilidad para evaluar las concentraciones de levadura en la cerveza (33) o despus
de la fermentacin de los jugos de uva filtrados, tiene algunas limitaciones cuando se aplica a los vinos
reales. No es factible despus de la fermentacin malolctica o en vinos obtenidos de jugos mal
clarificados debido a fuentes de turbiedad distintas de la levadura. En el caso de los vinos blancos, la
clarificacin estricta del jugo con enzimas pectolticas se considera un factor determinante para
determinar la calidad del vino. Se ha recomendado una turbidez de zumo residual de entre 50 y 100
NTU (34,35) Esta turbidez residual consiste predominantemente en partculas de tejido de fruta que
tienden a sedimentarse al final de la fermentacin primaria. En estas condiciones, el uso de
turbidmetros nefelomtricos puede permitir una evaluacin de la densidad celular de levadura
suspendida en los vinos blancos. Sin embargo, los procedimientos de calibracin apropiados deben
tener en cuenta la no linealidad de la curva de calibracin y para diferentes principios de medicin
(36,37).
Conclusiones
El concepto novedoso de controlar el consumo de DO en el vino que contiene las de levadura en
comparacin con el de una alcuota filtrada utilizado como un blanco permiti diferenciar con precisin
entre las cantidades de DO consumidas por las clulas de levadura y por la matriz del vino,
respectivamente. Las clulas de levadura posfermentacin aceleran significativamente la tasa de
consumo de DO en vinos blancos y tintos al consumir cantidades variables de DO. De este modo,
protegen el vino contra reacciones de oxidacin qumica hasta cierto punto sin producir acetaldehdo.
La tasa y el alcance de este consumo de oxgeno dependen de la cantidad de las de levadura
suspendidas, dixido de azufre libre, matriz de vino, temperatura, edad y cepa de levadura. Las
diversas combinaciones e interacciones de estos parmetros no permiten predecir el consumo de DO
y el efecto antioxidante de las las de levadura bajo condiciones de vinificacin comerciales. En el
mejor de los casos, se puede afirmar que este efecto aumenta con concentraciones crecientes de
clulas de levadura suspendidas, aunque no siempre de forma lineal. Por otro lado, el nivel de dixido
de azufre libre es de gran importancia, disminuyendo drsticamente la tasa de consumo de oxgeno
de las las de levadura y su capacidad para proteger el vino de la oxidacin. Por lo tanto, el dixido de
azufre y las las de levadura no actan como antioxidantes de manera complementaria. El uso de las
de levadura para prevenir la oxidacin es ms eficiente en vinos con bajo o libre de sulfitos.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen el apoyo tcnico provisto por Vino Kupljen, Jeruzalem, Eslovenia, para
confirmar las conclusiones de este estudio en condiciones de vinificacin comercial.
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