NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

Es importante que el estudiante desarrolle una actitud positiva y respetuosa hacia los
microorganismos y su trabajo con ellos. El mal manejo de una tcnica puede causar la
contaminacin en su prueba e infecciones en usted; en particular cuando se trabaja con
patgenos en potencia. En el laboratorio de microbiologa es necesario observar ciertas
normas que harn de su trabajo prctico, una labor efectiva y sin riesgo.
En cada clase prctica es obligatorio el uso de mandil blanco y limpio, cabello
recogido (seoritas).
Antes de la realizacin de una prctica debe leer cuidadosamente el o los
procedimientos a desarrollar.
Debe mantener la mesa de trabajo libre de materiales no necesarios.

Es prohibido fumar, comer o aplicar cosmticos mientras permanece en el laboratorio

de microbiologa.
Al inicio y trmino de cada trabajo prctico deber desinfectar cuidadosamente su
rea de trabajo.
Cuando manipule cultivos de microorganismos, trabaje siempre bajo la proteccin de
un mechero y sin corrientes de aire.
Esterilice instrumentos de metal (asas de siembra, pinzas, etc.)siempre antes y
despus de utilizarlos con microorganismos.
En caso de accidentes, tales como cortes en las manos, quemaduras, salpicaduras de
cultivos vivos o absorcin de material contaminado reprtelo inmediatamente al jefe
de prcticas de laboratorio.
Todo material utilizado en la prctica con posible contaminacin deber ser colocado
en recipientes especiales. Los papeles de desecho sern descartados en el tacho
disponible.
Al trmino de cada sesin de prcticas y antes de salir del laboratorio lvese las
manos con jabn y desinfctelas con alcohol.
Equipos y materiales para el Laboratorio de Microbiologa.
Gua de Laboratorio.
Guardapolvo blanco.
Gorros para uso en el laboratorio.
Barbijos.
Guantes de latex.
Cuaderno de laboratorio
Campo de tela y/o descartables
Dos juegos de lminas porta y cubre objetos (en estuche)
Un asa de siembra (o asa de Kolle)
Una pinza simple.
Lpiz marcador de vidrio
Encendedor o fsforos.
Papel toalla
Cinta Masking Tape.
Algodn
Alcohol.

PRCTICA N 1
AMBIENTE Y MATERIALES DE LABORATORIO

Objetivos:
Conocer las medidas de bioseguridad y reglas de trabajo en el laboratorio.
Reconocer los distintos materiales de laboratorios de microbiologa y comprender
sus utilidades, as como de los equipos.

Fundamento
 El ambiente de laboratorio
El laboratorio de microbiologa debe ser un ambiente aislado y protegido de
contaminacin ya sea fsica qumica o biolgica. En el laboratorio se debern de
ubicar las siguientes microbiolgicos, cubculo de anlisis, almacn y oficina.salas o
ambientes: Aula auditorio, sala de ejecucin de pruebas y anlisis

Los Materiales y Equipos

El material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende
fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado; evidentemente,
no se precisa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con un alto grado
de especializacin que en un laboratorio dedicado a la enseanza prctica
universitaria. Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele
encontrar en un laboratorio mnimamente dotado. Es importante, que los materiales
y equipos utilizados sean identificados por sus nombres, y puedan ser ubicados,
usados y guardados debidamente.

Materiales y Mtodos
Materiales.
Materiales de Vidrio
Deben poseer las siguientes caractersticas:
Poseer bajo coeficiente de dilatacin, de modo que resistan los cambios
bruscos de temperatura.
Deben ser de vidrio neutro, o con mnima cantidad de lcali libre de modo que
no intervengan en las reacciones.
Resistentes a la accin mecnica.
Transparentes y sin rayaduras de modo que permitan visualizar los eventos
que ocurren en su interior.
Materiales de acero.
 Son de alta resistencia fsica y viene a ser una mezcla de hierro, cromo, nquel,
bronce latn, carbn etc.
Materiales de arcilla.
Son resistentes a elevadas temperaturas.
Otros
Existen otros materiales de plstico, madera, goma y papel. Los que tienen
diferentes usos, contenedores, sujetadores o de sostn, dispensadores, etc.
Equipos
Uno de los factores que nos permiten obtener un resultado confiable en un Laboratorio de
Microbiologa, es la utilizacin de equipos e instrumentos que funcionen correctamente y
que de ese modo podamos asegurar la validez de los datos que nos reportan. Entre los
equipos indispensables utilizados en el laboratorio de microbiologa estn: las estufas,
autoclave, horno, centrfuga, microscopios, bao mara, balanzas y otros.

Mtodos

Los materiales son presentados y descritos de acuerdo a sus caractersticas, funcin y modo
de utilizacin.

Resultados
Se describen y dibujan los materiales y equipos de que fueron descritos anteriormente y que
son utilizados en el laboratorio de microbiologa.

Discusiones
Conclusiones

Cuestionario
Mencione cinco materiales y equipos de laboratorio, de uso imprescindible en
microbiologa, indicando la funcin de cada uno de ellos.
 Qu son las Campanas de seguridad biolgica, explique brevemente su diseo e
indique la funcin que cumplen en los laboratorios de microbiologa?
Qu funcin cumple el Horno Pasteur en los procedimientos microbiolgicos?

Bibliografa

PRACTICA N2
PREPARACIN DE MUESTRAS PARA OBSERVACIONES MICROSCPICAS

Objetivos:
Diferenciar y conocer las tcnicas de preparaciones de muestras para
observaciones microscpicas.
Aprender las tcnicas de preparacin: frotis, fijacin y coloracin ms utilizadas en el
estudio microscpico de cultivos bacterianos.

Marco Terico:
La observacin de microorganismos con microscopa ptica, en un laboratorio de
microbiologa, puede realizarse por diferentes procedimientos como son la observacin
directa de microorganismos in vivo o el tratamiento con colorantes mediante tincin
positiva y negativa, procesos dirigidos a incrementar el contraste y por consiguiente a
optimizar el resultado. Previo al desarrollo de una tcnica de tincin, el material a ser
observado debe ser fijado, es decir adherido a una lmina de vidrio sobre la cual ha de
realizarse la tincin. Si la preparacin no es fijada, la muestra tiende a perderse durante
los procedimientos de lavado. El procedimiento de fijacin mata al microorganismo,
coagula el protoplasma celular y provoca su adhesin a la lmina de vidrio .Un agente de
fijacin ideal preserva la estructura de la clula en la forma y posicin normal sin causar
la aparicin de otras estructuras no presentes en la clula viviente. Aunque el
calentamiento es el agente de fijacin ms comn, el alcohol y otros agentes qumicos
tambin pueden ser usados satisfactoriamente.
Materiales y Mtodos
 Materiales

Muestra con microorganismos.

Asa de Kolle
Lmina porta objeto
Mechero de alcohol

Azul de metileno
Piseta con agua
- Lmina cubre-objeto

Mtodos
Procedimiento para Observacin de Muestras in vivo

Tomar con la pipeta una gota de muestra conteniendo microorganismos

viables y colocar sobre la lmina porta objetos.
Colocar, realizando un ngulo de 45, el cubre-objeto o laminilla, sobre la
preparacin.
Colocar la preparacin sobre la platina y encender la lmpara del
microscopio, enfocando con el objetivo menor aumento (panormico)
bajando el condensador.
Cambiar los objetivos de menor a mayor secuencial mente hasta el objetivo
de 40X como mximo; simultneamente elevar el condensador suavemente.

Procedimiento para Fijacin de Muestras

Coloque una gota de agua sobre una lmina porta objeto completamente
limpia. Con ayuda del asa de Kolle coloque sobre la gota una pequea porcin
de la muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es
lquida, puede aplicarse directamente sin la gota de agua.
Distribuya la gota cargada con la muestra en la lmina hasta formar una
pelcula delgada.
Seque la lmina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del
mechero.
 Cuando la pelcula este seca, pase la lmina a travs de la llama del mechero
unas tres veces, cuidando que la pelcula este hacia arriba y que la lmina no
se recaliente. La sobre exposicin al calor puede alterar la forma y estructura
del microorganismo.

Procedimiento de Tincin Simple

En esta coloracin se utiliza un solo colorante para observar principalmente la

forma y el ordenamiento de las clulas bacterianas. Y sigue el siguiente
procedimiento:

Hacer frotis.
Fijar a la llama del mechero.
Adicionar el colorante azul de metileno por 10 minutos. No secar.
Lavar con agua. Secar
Adicionar una gota de aceite de inmersin y observar con objetivo de
inmersin. (100X)

Resultados
Esquematice el resultado de su observacin microscpica de los microorganismos in vivo, a
mediano y mayor aumento. (cinco tipos de microorganismos).

Descripcin: Descripcin:

Esquematice el resultado de su observacin microscpica coloreado con azul de metileno.

Descripcin: Descripcin:

Discusiones
Enumera al menos 5 tipos de microorganismos observados en la muestra de agua
como organismos vivientes, precisando sus caractersticas ms resaltantes.
Calcule los tamaos de los organismos observados y antelos en forma precisa,
compare los tamaos entre ellos.
Describe los tipos de movilidad que observ en el examen en fresco
 Describa lo que observ en la secrecin interdentaria, coloracin simple con Azul
de Metileno.

Conclusiones
VII.Cuestionario
Describa cuatro microorganismos diferentes a los que observ en la muestra de
aguas estancadas.
Indaga sobre los diferentes tipos de movilidad de los microorganismos

Cmo adquieren coloracin los microorganismos, cuando usamos las tcnicas

de tincin?
VIII. Bibliografa

Objetivo

PRCTICA N3
MORFOLOGA Y AGRUPACIN BACTERIANA

Observar las diferentes formas, tamaos y agrupaciones que presentan los

microorganismos aplicando un mtodo simple de tincin.

Fundamentos
La tincin simple construye una tcnica sencilla y directa que a travs del uso de un
colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno.
Los colorantes bsicos, los cales se utilizan comnmente para teir microorganismos, difieren
en el grado de reactividad con las clulas. El azul de metileno reacciona con las clulas
cargadas negativamente a la tasa ms baja, tomando de 20 a 30 segundos para teir
apropiadamente una preparacin microbiana. El cristal violeta es ms reactivo y
generalmente requiere slo 10 segundos. El carbol fucsina es un colorante an ms reactivo y
generalmente requiere solo 15 segundos. Su reactividad es tan grande que ciertamente
puede dificultar una tincin apropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante
materia orgnica.

Materiales y Mtodos
Materiales

Lminas fijadas de microorganismos

Aceite de inmersin
Colorantes bsicos:
Azul de metileno
Cristal violeta
Carbolfucsina
Papel secante
Piseta de agua
Soporte para tincin

Procedimiento
Coloque las lminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tincin.
Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que acten por un tiempo de 30
segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta; y 5 segundos
para la carbolfucsina.
Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lmina con la piseta de
agua.
Seque las lminas al aire o dentro del papel secante
Examine las preparaciones teida bajo el objeto de inmersin (100 150 x) de un
microscopio compuesto.
Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamao,
forma y agrupaciones que se presenten.
 RESULTADOS

Esquematice el resultado de su observacin microscpica de los microorganismos

coloreados y montados en lo referente a su morfologa, tipos de agrupacin y su
relacin a la coloracin de Gram y Azul de Metileno.

En la coloracin simple Azul de Metileno cuantos y que tipos morfolgicos vio en la

secrecin interdentaria?

DISCUSIONES
CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
Cules son las asociaciones ms frecuentes en las bacterias?
En que rango de tamao se definen las bacterias?
Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?
Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?
Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes
empleados?

PRCTICA N4
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA

Objetivo
Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram la existencia de dos
grupos principales de bacterias.
Distinguir a travs de dos tcnicas de tincin diferencial la presencia de endosporas
bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.
 Fundamento

Tincin diferencial Gram

Los microorganismos no slo difieren qumicamente de su entorno, sino tambin muestran
diferencias fsicas y qumicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan reaccionar
diferencialmente ante un procedimiento de tincin. La tincin diferencial por lo tanto, nos
permite distinguir entre grupos de microorganismos. En particular, la tincin de Gram, es la
ms utilizada de las tcnicas de tincin diferencial para distinguir entre dos grupos de
bacterias: Gram positivas y Gram negativas.

La diferencia entre estos dos tipos de clulas radica en la variacin de capas que conforman
sus paredes. La pared de la gram-positivas es principalmente una gruesa capa de
peptidoglucano, mientras que las gram-negativas la pared es una multicapa formada por una
capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de protena y lipopolisacrido. La
diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante los reactivos utilizados en la
tincin Gram, permite la diferenciacin en la coloracin final.

La tincin de Gram requiere de cuatro soluciones: Un colorante bsico, Un mordiente, un

agente decolorante y un contraste (otro colorante bsico).

Las propiedades de los colorantes bsicos ya fueron discutidas previamente. Un mordiente

es una sustancia que incrementa la afinidad entre la clula y el colorante, es decir ayuda a la
fijacin del colorante en la estructura de inters. Ejemplos de mordientes son cidos, bases,
sales metlicas, y yodo. Bajo la accin de un mordiente una clula se tie ms intensamente y
es ms difcil decolorarla. Un agente decolorante es una sustancia que retira el colorante de
una estructura teida. Algunas clulas teidas se decoloran ms rpidamente que otras, y
est variacin en la tasa de decoloracin es la que diferencia tipos de bacterias cuando la
tincin Gram y otras tinciones diferenciales se usan. El contraste es un colorante bsico de un
color diferente al usado inicialmente. El propsito de su aplicacin es da a las clulas
decoloradas un color contraste con el inicial. Aquellas clulas que no se decoloran
rpidamente retienen el color del colorante bsico inicial, mientras que las clulas que se
decoloran fcilmente toman el color del contraste.

La tincin Gram se resume en lo siguiente: El primer paso es teir la preparacin

intensamente con un colorante bsico, preferentemente el cristal violeta. Esto es seguido de
por un tratamiento de las clulas teidas con un mordiente, por ejemplo, un compuesto
iodado como el lugol. La preparacin luego es tratada con un agente decolorante como el
alcohol o alcohol-cetona. Las clulas que retienen el colorante bsico despus de la
decoloracin son llamadas gram positivas, y aquellas que son decoloradas son gram-
negativas, y pueden ser reteidas con un contraste como la safranina.

Figura 1.Tipos de Tincin Gram.

Materiales y Mtodos
Materiales
Cultivos jvenes de microorganismos (18-24horas): Bacillus sp; streptococcus sp;
Escherichia coli.
Colorantes bsicos: Cristal violeta; Safranina
Decolorante: Alcohol-cetona
 Lminas porta objeto
Mordiente : Lugol
Papel secante
Piseta de agua
Soporte para tincin
Asa de Kolle
Aceite de inmersin.

Procedimiento.
Prepare una lmina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados y
una lmina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli
Agregue cristal violeta y deje que acte por 30 segundos.

Enjuague con agua

Cubra la pelcula teida con lugol y deje que acte por 30 a 60 segundos.
Enjuague con agua.
Decolore con alcohol acetona. Para una pelcula delgada, la exposicin al
decolorante por 10-20 segundos es suficiente.
Enjuague con agua

Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos.

Enjugue con agua y seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
Examine cada muestra bajo el objeto de inmersin
Elabore los esquemas correspondientes.
 Figura 2. Procedimiento para hacer tincin Gram.

Tincin Diferencial cido-Resistente

La tincin cido-resistente es una tincin diferencial que mide en clulas teidas la
resistencia a la decoloracin mediante cido. La propiedad de cido resistencia en ciertas
micobacterias y actinomicetos est correlacionada con su salto contenido lipdico. Teir estas
bacterias requiere de un tratamiento de alta temperatura y la utilizacin de colorantes
fuertemente a fines.

El procedimiento consiste en teir con carbolfucsina caliente, decolorar con una solucin de
alcohol-cido y reteir con un contraste. Las bacteria cido en comparacin a otros
microorganismos y retienen el color del colorante inicial.
 Este tipo de coloracin es utilizada en el estudio y diagnstico de enfermedades
causadas por especies cido-resistentes como los de la tuberculosis, la lepra, y tambin para
la diferenciacin de estructuras resistentes como las endosporas bacterianas.

Tincin De Endosporas
Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada
endospora. A diferencia de la clula la endospora es una estructura resistente capaz de
sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de alta
temperatura o bajo la accin de agentes desfavorables, en condiciones extremas de alta
temperatura o bajo la accin de agentes qumicos.

Existen variadas tcnicas que se utilizan para la tincin de endosporas. Destacan entre
ellas la tcnica Drner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbol fucsina para
teir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tincin negativa; la espora se tie
de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo oscuro .La
tcnica se Schaeffer y Fulton emplea carbolfucsina para teir la espora, alcohol cido como
decolorante y verde malaquita como colorante de contraste; la espora

se tie de rojo y la parte vegetativa de verde. Ambas tcnicas emplean fenol y alta
temperatura como agentes coadyugantes para lograr la penetracin de la Fucsina en la
estructura de la espora.

Tcnica de Drner
Materiales
Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.

Aceite de inmersin
Asa de Klle
Bao de agua a 100C
Lmina porta objeto
 Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina.
Tubos con agua destilada estril.
Procedimiento.
Haga una suspensin concentrada del organismo en 2 3 gotas de agua destilada
contenida en un tubo pequeo de prueba.
Aada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua
hirviendo por 10 min.
Transfiera una gota de la suspensin de clulas hervidas en un recipiente con agua
hirviendo por 10 minutos.
Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lmina hasta
obtener una delgada pelcula.
Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.

Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersin.

Elabore los esquemas correspondientes.

Tcnica de Schaeffer y Fulton

Materiales.
Cultivo de 48 horas: Bacillus sp; Clostridium sp.

Aceite de inmersin
Asa de Klle
Lmina porta objeto
Mechero de alcohol
Pinzas
Soluciones colorantes: Carbolfucsina; verde malaquita.
Solucin decolorante: Alcohol cido.

Procedimiento
Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado.
 Agregue a la preparacin carbolfucsina hasta cubrirla totalmente.
Con ayuda de una pinza, caliente la lmina con el colorante hacindola pasar
ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de
vapores.
Mantenga esta condicin durante tres minutos , evitando que el colorante se seque o
entre en ebullicin
Lave con alcohol cido hasta que este resulte incoloro.
Enjuague con agua.
Cubra la preparacin con unas gotas de verde malaquita dejando que acte por dos
minutos.
Enjuague con agua.
Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersin.
Elabore los esquemas correspondientes.

RESULTADOS
1. Esquematice los resultados de la observacin realizada utilizando la tcnica de
coloracin Gram.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
Bajo qu circunstancia la tincin diferencial de Gram podra resultar errada?
Edad de la bacteria
Errores del operador.
Uso de antibioticos.
 A pesar de la gran utilidad de la tincion de gram, este metodo debe ser valorado con
precausion, ya que la reaccion puede variar segun la edad de las celulas (cultivos
viejos de bacterias gra positivos pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse
con gram negativos)y la tecnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado
se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian con bacerias gram
negativas ), es por esta situacion que junto a la muestra deberian teirse con bacterias
gram positivas.

Qu funcin cumple el lugol, en la coloracin Gram?

Implementa la afinidad del colorante primario con la celula, formando complejos

insoluble con este.
El lugol es un agente oxidante.

Podra usted variar el colorante primario y el de contraste obteniendo los mismos

resultados?
No ya que el colorante primario es cristal-violeta que su labor es teir a todas las
bacterias de morado y la constraste es la safrina que tie de rojo. Sin estas o el cambio
en aquellas varia
Cul es la influencia del pH? en la reaccin Gram?

Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas, sealando
su importancia.
Cul de los mtodos utilizados le permiti observar mejor las endosporas
bacteriana? A qu atribuye la diferencia?
Qu efecto producir el reemplazar el alcohol cido por otro decolorante como el
alcohol cetona?
Qu otros gneros de bacterias pueden formar endosporas?

Revise otras tcnicas de tincin de esporas y comprelas con las tcnicas usadas en
este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.

PRCTICA N5
PREPARACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO PARA ESTERILIZAR
 Objetivo:
Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilizacin como su posterior
utilizacin.
Comprender la importancia de la esterilizacin as como la proteccin de los
materiales contra la contaminacin microbiana.

Introduccin
Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales particulares. Al
preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe tenerse en
consideracin el proveer de las fuentes de energa, carbono, nitrgeno, fsforo, azufre y de
los factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulacin de los medios de cultivo
podemos distinguir entre medios definidos y complejos.

El medio definido Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento en la forma de

compuestos qumicos de concentracin conocida .Por ejemplo un medio definido para un
hetertrofo como Escherichia coli puede ser compuesto de NH4Cl, MgSO4, KH2PO4, Na2HPO4 y
glucosa. Otros elementos como fierro, manganeso y cobre estn generalmente presentes
como contaminantes de los compuestos qumicos en cantidades adecuadas para el
crecimiento.

El medio complejo Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de

microorganismos pero ellos estn contenidos en ingredientes crudos, es decir, que no todos
los componentes del medio ni sus concentraciones exactas son conocidas
.Ingredientes de este tipo son los extractos de la levadura, de carne, los hidrolizados de
protenas (peptona, tristona), que constituyen fuentes de polipptidos aminocidos,
vitaminas, algunos carbohidratos, etc.
De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden
clasificarse como:
Comunes: -Permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de microorganismos.
Ejemplo: Agar nutritivo, Caldo nutritivo, Agar gelatina, etc.
Especiales: -Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o
caractersticas bioqumicas determinadas. Pueden considerarse medios enriquecidos
o mejorados, selectivos y diferenciales.
Medios mejorados o enriquecidos: -Son aquellos a los que se les agrega determinadas
sustancias nutritivas (sangre, yema de huevo, suero, etc.) y con ello estimulan las
exigencias nutritivas de ciertos microorganismos. Ej. Agar sangre, Caldo selenito, etc.
Medios selectivos: -Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el
crecimiento de determinadas especies y sustancias que inhiben el crecimiento de
otras no deseadas. Ej .Agar salmonella Shigella, Agar Bismuto sulfito, etc.
Medios de diferenciacin: -Ponen de manifiesto algunas propiedades bioqumicas del
microorganismo, como formacin de gas, cambios en le pH, etc. Los cambios de pH se
evalan incorporando indicadores en el medio y se determinan de acuerdo al rango
en estudio. Ej. .Medios azucarados como: Caldo glucosado, Caldo Lactosado, Kligler,
etc.

Frecuentemente los medios selectivos y diferenciales se deben usar juntos para aislar e
identificar especies a la vez. Algunos medios tienen incorporados los ingredientes
convenientes para este doble propsito y resultan de gran utilidad y economa .Ej. .Agar
Manitol salado, Agar Mac Conkey, etc.

Dependiendo de la tcnica de cultivo elegido, los medios mencionados anteriormente

pueden ser preparados como lquidos o slidos .Los medios mencionados anteriormente
pueden ser preparados como lquidos o slidos. Los medios lquidos contienen los
nutrientes y otros elementos en una solucin acuosa que generalmente recibe el nombre de
caldo; los medios slidos contienen adems un agente solidificante llamado agar que se
utiliza para dar parte del nombre del medio e identificarlo como slido. El agar es un
polisacrido complejo derivado de un alga marina y posee caractersticas muy tiles para
microbiologa. Muy pocos microorganismos degradan el agar de tal manera que an despus
de un periodo de crecimiento, el medio con agar se mantiene slido .El agar se funde a 90C
o al punto de ebullicin del agua y permanece en estado lquido hasta que la temperatura
desciende hasta aproximadamente 40C.

Una vez preparado el medio de cultivo lquido o slido debe ajustarse al pH adecuado,
disponerse en un recipiente de vidrio resistente al calor, (Tubo o matraz) y protegerlo con un
tapn de algodn o material plstico que permita el intercambio de gases y que impida el
ingreso de otros microorganismos. El medio de cultivo as dispuesto debe ser esterilizado en
autoclave a 121 C bajo 15 lb. de presin de vapor por 15 minutos. En caso de contener
ingredientes termolbiles, pueden emplearse otros mtodos de esterilizacin como la
filtracin.

Materiales y Mtodos
EJERCICIO 1

Objetivo.
Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes caractersticas para el cultivo de
microorganismos.

Materiales.
Medios de cultivo o ingredientes deshidratados
Agua destilada o desionizada
Algodn, gasa
Balanza
Erlenmeyers de 250 y 500 ml
 Esptulas
Lpiz marcador de vidrio
Papel indicador de pH
Papel aluminio y papel corriente no absorbente
Pipetas graduadas
Probetas de 100 ml
Tubos de ensayo

Procedimiento

Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %)

Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio
deshidratado suficiente para prepara 100ml de caldo nutritivo.
Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue
cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.
Mezcle la preparacin con movimientos giratorios hasta la completa disolucin.
Elabore tapones de algodn para 15 tubos.

Distribuya el medio lquido con una pipeta graduada a razn de 5 ml en cada

tubo.
Coloque los tubos los tapones de algodn evitando que queden flojos o muy
compactos.
Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envulvalos con papel,
identifquelos con el nombre del medio, la fecha de preparacin y el nombre de la
persona responsable en la elaboracin.
Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 C (15 lb. de presin)
durante 15 minutos.

Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %; agar, 1.5%)

 Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento
anterior con la correccin en el peso para la nueva cantidad solicitada y el
erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendr el medio).
Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en bao de agua a ebullicin hasta
que el medio luzca transparente a la luz.
Elabore tapones de algodn para unos 16 tubos.

Una vez licuado el medio, djelo enfriar ligeramente y distribyalos en los tubos
con una pipeta graduada .Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.
Repita los pasos 6, 7, 8 del procedimiento anterior.
El medio restante debe ser acondicionado para su esterilizacin junto a lo
anterior.

Agar Mac Conkey (peptona, 1.7 %; proteosa peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales
biliares,0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001
%)

Agar manitol salado (Extracto de carne 0.1 %; proteosa peptona, 1.0 %; NaCl, 7.5%;
manitol, 1.0%; agar, 1.5%, rojo fenol, 0.0025%)
Pese la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar 100 ml de cada
uno. Observando la formulacin de cada medio comprobar que los pesos a
realizar son distintos.
Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyer de 25. ml y llvelos a licuar en
bao de agua caliente hasta la completa disolucin del agar.
Elabore tapones de algodn para cada erlenmeyer.Luego de colocarlos cubra los
recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio,

fecha de elaboracin y el nombre de la persona responsable de su preparacin.

Esterilice en autoclave a 121 C por 15 min.
 Agar almidn (Peptona, 1%; K2HPO4 ,0.5 %; almidn, 0.3%; agar, 1.5%).
Pese cuidadosamente el almidn necesario para preparar 100 ml de medio.
Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen pequeo de agua
destilada que ha medido en la probeta.
Caliente el recipiente con el almidn agitando constantemente hasta su
disolucin.
Pese el resto de los ingredientes y agrguelos con la cantidad de agua destilada
restante.
Licue el medio al bao de agua cliente hasta la completa disolucin del agar. Deje
enfriar ligeramente y ajuste el pH.
Coloque en el Erlenmeyer un tapn de algodn a la medida, cubra con papel,
etiquete el material y esterilice a 121 C por 15 min.

Agar gelatina (Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%; gelatina, 0.4%; agar, 1.5%).
Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente para preparar 100
ml de medio.
Coloque los ingredientes en un esrlenmeyer de 250 ml y agregue agua destilada
medida en probeta.
Lleve el recipiente a licuar en bao de agua en ebullicin hasta la completa
disolucin del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0.
Acondicione su medio para esterilizacin como en los procedimientos anteriores.
Esterilice en autoclave a 121 C por 15 minutos.

EJERCICIO 2

Objetivo
Conocer los principios generales de la preparacin y tcnicas de esterilizacin de
diversos materiales y medios de cultivo, de uso en la microbiologa.
 Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en la aplicacin de los mtodos de
control microbiano.

Procedimientos:
Preparacin de materiales para su esterilizacin

Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua

corriente.
Dejar escurrir y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre un papel
toalla.
Elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces.

Envolver placas Petri, pipetas, tubos y matraces, siguiendo las indicaciones.

Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarn en un horno a 150C
durante 2 horas. Despus de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes nicamente
en rea asptica (cerca del mechero).
Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo con las siguientes
instrucciones:
Revisar que el agua en la autoclave est limpia y el nivel coincida con la marca
en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o aadir agua destilada.
Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento mximo. Con el uso
de guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la
autoclave y colocarla dentro.

Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y a que
salga el vapor por el orificio de purga, despus cerrarlo con la vlvula.
 Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 lbs /in2 de presin
y mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el
manmetro y regular el control de temperatura a valor medio o mnimo.
Apagar la autoclave y dejar que la presin baje al valor de cero. Quitar la
vlvula y con la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa,
desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificacin

Cerrar los tubos con tapn de rosca, los que contienen agar se colocarn en una
superficie inclinada para que el medio solidifique a una distancia aproximada de 1- 2
cm de la boca del tubo.
Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de
45-50C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la
mano sin quemarse.
Limpiar la mesa con solucin de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos
a una distancia de 50 cm. Verter entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres
cajas Petri en esta zona asptica. Dejar que los medios solidifiquen.

EJERCICIO 3
Objetivo
Comprobar y evaluar los procedimientos, como prcticas aspticas realizadas en los
anteriores ejercicios.

Prueba de esterilidad de materiales

Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante
minuto en zonas no aspticas y etiquetarlas.
 Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y PDA durante 1
minuto en zona asptica y etiquetarlas.
Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30C durante 24- 48
horas. Las cajas Petri se colocarn con la tapa hacia abajo.
Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparicin de turbidez, nata superficial y/o depsito de material en el fondo de los
tubos con medio lquido, as como la formacin de colonias microbianas en la
superficie de los medios slidos.

RESULTADOS
Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco
crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
Describir la morfologa de las colonias.
Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilizacin y manejo de los
materiales.
 DISCUSIONES
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO

Cules son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de

microorganismos?
Por qu no es necesario ajustar el pH en el caldo nutritivo y s lo es en el agar
almidn?
Determine la naturaleza qumica y la funcin nutritiva de cada uno de los
ingredientes que contienen los medios que ha utilizado.
Describa el autoclave y su forma de uso.
Qu otros mtodos de esterilizacin se emplean para los medios de cultivo?
Qu ventajas otorgan?

PRACTICA N 6
TCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Objetivo
Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento en medios de cultivos slidos para la
obtencin de cultivos puros de bacterias.
Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales y
selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.

Fundamento
Para iniciar un cultivo de microorganismos es necesario que un nmero de clulas
(inculo) sea transferido (inoculado) a un medio fresco estril .Si se quiere cultivar
una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos, deben
emplearse tcnicas de aislamiento que permitan obtenerla en forma pura. Esto
involucra un proceso seriado de varias transferencias y la utilizacin de medios tanto
comunes como especiales, mayormente slidos, seleccionados de acuerdo a la
 naturaleza del microorganismo. La tcnica d cultivo por aislamiento pueden ser
realizada por:

Por estras, que consiste en diseminar los microorganismos en la superficie se un

medio slido dispuesto en placa Petri; si el inculo inicial se encuentra slido o en
polvo, es recomendable llevarlo a suspensin.
Por diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriada de la muestra o
del inculo inicial y disponer alcuotas de ellas en placas petri con medio. Las
colonias de varios microorganismos difieren en forma, tamao, color, consistencia,
por lo tanto su apariencia en cultivo es importante para propsitos de identificacin.
Por otro lado, si se tiene ya aislado un microorganismo, que se asume puro, desde
un medio agotado en nutrientes hacia un medio fresco. Las tcnicas de transplante
se realizan por lo general en tubos de ensayo con medios

lquidos o slidos, siendo la prctica ms comn de conservacin de cepas (de forma

aerbicas y anaerbicas facultativas), el realizar estras en tubos de agar inclinado.

En todo procedimiento de inoculacin la aguja o asa de Klle debe ser calentada al

rojo vivo por flameo antes y despus de la transferencia. El flameo destruye la
formas vivas en la superficie del filamento previniendo la contaminacin
.Durante la transferencia se debe sostener el tubo de trabajo en la mano izquierda
en posicin casi horizontal y retirar el tapn sostenindolo con los dedos anular y
meique de la mano derecha (asumir la posicin inversa en individuos no diestros).
La boca del tubo de trabajo (tanto del que se va tomar el microorganismo como del
que se va a recibirlo) debe ser flameada antes y despus de la transferencia. Aparte
de destruir los microorganismos en los bordes del tubo, el flameo crea corrientes
convectivas que disminuyen las probabilidades de contaminacin.
 Las tcnicas de cultivo de aislamiento y transplante nos permitirn obtener los
microorganismos en forma pura y en estado activo as como el estudio de sus
caractersticas de crecimiento, el primer registro de datos en la identificacin de
todo microorganismo.

Figura 1. a) siembra masiva; b) estra simple; c) estra con fin capilar.

Materiales y Mtodos
EJERCICIO 1. Tcnicas de Cultivo de Microorganismos: Caractersticas de crecimiento
en medio de cultivo.

Objetivo
Observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al trasplante en
medios de cultivo lquido y slido.

Materiales
Cultivo de Microorganismos de 18 horas.
Asa de kolle.

Mechero.

Tubos con agar nutritivo inclinado.

Tubos con agar nutritivo vertical.

Tubos con caldo nutritivo.

Procedimiento
Esterilice el asa de kolle por flameo a la llama.
Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al
mechero y obtenga una pequea porcin del cultivo con ayuda del asa de kolle.
Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.
Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores
introduzca el asa en el lquido para dejar el inculo. Homogenice la mezcla
girando el tubo entre las palmas de la mano.
Repita el procedimiento 1 para obtener ms inculo, pero usando esta vez
aguja de kolle.
Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inculo a
lo largo de una sola lnea descrita desde la base de la inclinacin hasta el
extremo.
Repita el procedimiento 1 para obtener inculo, usando nuevamente aguja de
kolle.

Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda
del medio.
Rotule los tubos sembrados y pngalos a incubar a 37 C por 24 horas.

Cumplido el tiempo de incubacin, evalu el crecimiento y anote sus

resultados en la hoja adjunta, segn lo siguiente:
RESULTADOS

Esquematice los resultados de sus observaciones.

Reporte los resultados anotando las caractersticas de los crecimientos
microbianos.

a) Crecimiento en estras sobre agar inclinado

Cantidad: Escasa, moderada o abundante
Distribucin en la superficie: Uniforme o irregular
Forma de crecimiento difuso, etc. Arborescente, equinulado, rizoide, filiforme.
Consistencia del crecimiento: Butiroso, viscoso, fibroso
Pigmentacin Coloracin del cultivo

b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda

Crecimiento: Limitado a la lnea de inoculacin o picadura.

Con propagacin fuera de la lnea de inoculacin.

Superficial o en profundidad o ambas a la vez.

c) Crecimiento en caldo nutritivo

Cantidad: - Escasa, moderada o abundante
Caldo Turbidez, aparicin de opacidad en el medio.

Apariencia o tipo: Sedimento, depsito de clulas en el fondo del tubo;

si el tubo se agita el sedimento se re-suspende el y no
disgregan aun si el tubo se agita.
Formacin de pelcula, masa de clulas en la superficie
del caldo.
Mucosidad, depsito de clulas que permanecen adheridas.

DISCUSIONES
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO
 Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un caracterstico
crecimiento tipo pelcula? Qu factores ambientales podran alterar la formacin
de una pelcula superficial?
Cundo utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de
crecimiento? Es preferible inocular con aguja de kolle y no con asa? Por qu?
Qu factores influyen en la abundancia del crecimiento en caldo, agar? inclinado y
agar vertical

EJERCICIO 2. Tcnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento en

placas

Objetivo
Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando
tcnicas de aislamiento.

Materiales
Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Serratia marceasen,
Bacillus sp., Escherichia coli, Mlcrococcus sp., Proteous sp.)
Asa de kolle, aguja de kolle

- Mechero
Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 C.
Placas petri estriles
Placas con agar nutritivo
Placas con Agar Mac Conkey

Procedimiento
Aislamiento por estras
 Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del
asa o aguja de kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere
todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia.
Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos
pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se
encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la
placa, as evitara mayor contaminacin. Con el asa cargada de inoculo, haga estrias
sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una ultima estra en un espacio
libre. Cierre la placa.
Esterilice el asa a la llama nuevamente.

Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.

Coloque las placas en incubaci6n a 37 C por 24 horas.
Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus caractersticas de forma,
elevacin, consistencia, bordes, etc. Diferencie las caractersticas de las colonias
desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

Figura 2. Aislamiento por estras.

Aislamiento por diluciones

Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del
asa de kolle retire inculo.
Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50 C y transfiera
aspticamente el inculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo
 cerrado mezcle el inoculo con el medio, hacindolo girar entre las palmas de las
manos.
Transfiera una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de
agar licuado. Repita la operacin anterior para obtener una mezcla homognea.
Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri estriles y rtelas
lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique cada dilucin.
Incube las placas a 37 C por 24 horas.

Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Haga un recuento de colonias, si

el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las caractersticas
diferenciales de las colonias observadas.

Figura 3. Aislamiento por diluciones.

Cuestionario
Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollado en estos ejercicios para
obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? Como podramos
comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias
aisladas?
Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?
Suponga que recibe una muestra de suelo y se le pide determinar el nmero total de
colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en diluciones
sucesivas para resolver el problema.
En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y que usos tiene?

De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?

 Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerobios?

PRCTICA N7 AISLAMIENTO
DE COLIFORMES

Objetivos
Familiarizarse con la tcnica de preparacin de muestras slidas.
Determinar la prueba positiva sobre la presencia de coliformes en la muestra.

Fundamento

Genero Escherichia.
Son enterobacterias, es decir bacterias en forma de bacilos, gram (-), de 2-4 m de largo, con
bordes redondeados, no esporulados. Su metabolismo es respiratorio y fermentativo. Este
gnero contiene ms de veinte gneros y ms de cien especies.

Por ser la entero bacterias gram (-), su envoltura celular est formada por: Membrana celular,
pared celular (contenida en el periplasma) y membrana externa, siendo sus componentes
individuales:

Fosfolpidos.

Peptidoglucano.
Lipopolisacrido.
Protenas de membrana externa.

Cpsula.

Fimbrias.
El antgeno enterobacterial comn.
Fisiologa y estructura antignica
Esta bacterias crecen de manera abundante en medios de cultivo ordinario, a diferencia de
los streptococcus que requieren medios de cultivo complejos (Son bacterias exigentes). El
crecimiento se realiza entre temperaturas de 10C 46C, siendo el grado optimo 37C; la
mayor parte de la cepas son destruidas con calentamientos a 60C x 30 min.

El gnero Escherichia se caracteriza porque fermenta rpidamente diversos tipos de

azucares, como la lactosa, produciendo cido y gas. El principal cido formado por cido
lctico, y en cantidades menores cido actico y frmico junto con etanol.

Este gnero tiene una estructura antignica compleja, habindose detectado ms de 150
antgenos somtico o termoestables (lipopolisacridos), ms de 100 antgenos k termolbiles
(capsulares) y ms de 50 antgenos H (flagelares).

Este gnero produce as mismo enterotoxinas y hemolisinas. Las enterotoxinas median el

transporte de iones y de agua desde los tejidos hacia el lumen intestinal para originar una
secrecin neta que se manifiesta en forma de diarreas; existen dos tipos de enterotoxinas:
Toxina termolbil (TL) que provoca prdida de agua y electrolitos, y la toxina termoestable
(TS), que produce secrecin de agua y electrolitos, y es muy resistente al calor (Soporta 100C
x 10 min) Tambin produce hemolisinas, cuya produccin se relaciona con la virulencia, es
citxica para leucocitos.

Importancia del gnero Escherichia.

Dado que las especies de gnero Escherichia se hallan presentes como comensales en el
intestino humano y animal ,particularmente E. Coli, estos microorganismos son utilizados
como indicadores de contaminacin fecal, aunque no necesariamente indica que un alimento
est contaminado con heces, sino que indica una mala higiene en el procesamiento de los
alimentos.
Aunque existe la probabilidad de reemplazar las bacterias coniformes por los virus conocidos
como colifagos (que infectan los coliformes), que se hallan presentes constantemente en la
heces humanas, desages, aparte que su deteccin es fcil y rpida, de modo que la relacin
coliformes colifagos es muy estrecha, adems los colifagos tambin seran indicadores de
enterovirus en muestras contaminadas. Por ello se piensa que los colifagos podran ser una
alternativa frente a los coliformes

Materiales, reactivos y equipos

Materiales
Frasco para licuar.
Cucharilla.
Tubos de ensayo.
Pipeta 1 ml.
Papel craft.
Agar VRBA.
Alcohol.
Licuadora.
Estufa.

Procedimiento
Preparacin De Muestra Slida

Balanza mecnica.
Mechero Bunsen.
Matraz Erlenmeyer.
Placas petri.
Tapones de algodn.
 Solucin salina peptonada (ssp).
Muestras a analizar (suelo, aguas).

Cerca de un mechero Bunsen tomamos 10 g de la muestra y la depositamos en un

frasco para licuar estril.
Al frasco se le aade 90 ml SSp estril provenientes de un matraz el cual no ser
desechado.
Llevamos el frasco una vez tapado con los 10 g de muestra y los 90 ml de ssp a
licuar, el tiempo necesario hasta que todo se desmenuce y la mezcla quede
uniforme.
Retiramos el frasco y su contenido lo vaciamos al matraz del cual extrajimos los 90
al ssp.
Colocamos tapn de algodn. A esta mezcla la llamamos solucin madre (sm).

Preparacin del cultivo

De la SM o de la muestra original (en caso sea lquida de por s) extraemos con una
pipeta de 1 ml cerca del mechero 1 ml y lo depositamos en el tubo de ensayo con 9

ml SSP, lavamos la pipeta. Esta ser la dilucin 10-1.

Realizamos lo mismo con el tubo que contiene la dilucin 10-1 o -1: Extraemos 1ml
del tubo -1 y lo depositaos en otro tubo con 9 ml SSP. Lavamos la pipeta, y
tapamos el tubo con tapones de algodn. Siempre cerca del mechero.
Realizamos la tercera dilucin, no olvide lavar la pipeta.
 A cada placa agregamos una delgada lmina o capa de agar VRVA, esterilizando el
autoclave, uniformizamos el contenido de la placa movindola en crculos y
esperando que el agar solidifique: siembra por incorporacin.
Luego agregamos una segunda capa y protectora de agar VRBA a las mismas
placas(esta ya deberan estar rotuladas al agregar el 1 ml de la dilucin)
Se espera que solidifique, colocamos papel craf a las placas y rotulamos.
Incubamos las placas en la estufa a 37 C por 24 48 horas.
Contamos las colonias que estn en el fondo de las placas y no en las superficies.
RESULTADOS
DISCUSIONES
CONCLUSIONES

PRACTICA N8
OBSERVACIN E IDENTIFICACIN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS Y HONGOS
DEL MEDIO AMBIENTE

Objetivo
Observar el desarrollo de hongos misceleares y levaduriformes en sustrato de
diferente origen e identificar los gneros ms frecuentes.

Fundamento
Los hongos poseen caractersticas muy particulares que los hacen diferentes de las
plantas, ya que no elaboran su propio alimento mediante la fotosntesis como ellas sino
que viven a expensas de otros organismos, vivos o muertos. Tambin se diferencian de
los animales porque no poseen la capacidad de desplazarse o moverse sobre el medio
o superficie en que crecen. Constituyen un grupo de seres vivos que pueden estar
formados por una sola clula (unicelulares) o por muchas (pluricelulares).
Los hongos se originan a partir de esporas, que son clulas especializadas que tienen la
misma funcin que las semillas en las plantas. Cuando las esporas encuentran las
condiciones adecuadas de humedad, temperatura, luz y nutrientes, entre otras,
 germinan y producen hifas, que son unas estructuras filamentosas que constituyen la
unidad estructural fundamental de la mayora de los hongos.
Las hifas se ramifican y forman una masa algodonosa llamada micelio, que se extiende
sobre el medio o superficie (como tierra o madera, entre otros) y produce los cuerpos
fructferos. En realidad, el hongo lo constituye el micelio, y los cuerpos fructferos son el
equivalente de los frutos en un rbol. Los cuerpos fructferos son las estructuras que se
ven a simple vista sobre un sustrato, medio o superficie y su funcin es producir esporas
(que sern dispersadas por el agua, el viento, insectos u otros elementos), despus
de lo cual mueren. Los cuerpos fructferos son

estacionales y aparecen slo en ciertas pocas del ao, pero el micelio permanece
sobre el sustrato, incluso durante cientos de aos.
Los hongos juegan un papel muy importante dentro de sus hbitats naturales, ya que al
ser organismos descomponedores y reciclar gran cantidad de desechos orgnicos
pueden transformar la materia muerta, devolviendo al medio ambiente elementos y
sustancias asimilables por otros seres vivos como plantas y animales, lo cual permite el
flujo de energa y nutrientes a travs de los ecosistemas naturales.
Tambin forman asociaciones de beneficio mutuo (simbiosis) con las races de algunas
plantas; a esta asociacin se le llama micorriza. Como resultado, el hongo absorbe
carbohidratos de las races, que a su vez obtienen del hongo elementos qumicos como
nitrgeno y fsforo, necesarios para su crecimiento. Entre las algas y algunas especies
de hongos se da otro tipo de asociacin simbitica, ya que mediante sta se crean los
lquenes, que son organismos totalmente diferentes a las plantas y a los mismos
hongos.

Materiales Y Mtodos
Materiales
Material infectado (con evidencias de crecimiento de hongos)
Asa de Kolle o estilete
 Lminas porta y cubre objetos
Solucin colorante: azul de metileno

Procedimiento
Observacin macroscpica
Observe cuidadosamente cada sustrato infectado y determine el tipo de colonia que
desarrolla.
Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.

Observacin microscpica
Coloque una gota de azul de metileno en un porta objeto limpio y desgrasado.
Con ayuda del asa de Kolle en forma de gancho, extraiga una pequea cantidad de
micelio de una muestra y coloque en la gota de colorante.
Coloque sobre la preparacin la lmina cubre objetos.

Observe bajo el objetivo de 10 y 40 aumentos.

Reconozca las estructuras ms caractersticas del cuerpo vegetativo del hongo.
Elabore los esquemas que correspondan para cada observacin.
Con ayuda de lminas referenciales trate de identificar el o los gneros que observe.

EJERCICIO 1. Aislamiento de hongos del medio ambiente.

Objetivo
Aislar en medios de cultivos los diferentes gneros de hongos que frecuentan el
medio ambiente y determinar sus caractersticas.

Materiales
- Placas petri, con medios de cultivos para hongos (Agar sabouraud).

Procedimiento
 Elija u punto determinado en el ambiente que quiera evaluar.
Destape la placa petri exponiendo al medio de cultivo al aire (Se asume que las
esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposicin puede ser de
5 a 10 minutos. Vuelva a tapar la placa identifiquela con su nombre, grupo y lugar
muestreado.
Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.

En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 C por cuatro o cinco das.

Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripcin detallada de las
mismas.
RESULTADOS

DISCUSIONES
CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
Qu gneros de Hongos abundan frecuentemente en el medio ambiente?
Qu variaciones medio ambientales modificara sustancialmente la presencia de
hongos? Formule su respuesta tomando en cuenta modificaciones en cantidades y en
diversidades de especies.
Podran las especies de hongos patgenos estar presentes en el aislamiento de
hongos que usted realizo?

PRCTICA N9
DETERMINACIN DE BACTERIAS DEL AGUA

Objetivos
Determinar el nmero de unidad formadora de colonia en un mililitro de agua.
Identificar diferencias entre la flora microbiana del agua.
 Identificar las bacterias presentes en el agua y comparar sus requerimientos
nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.

Fundamento.
Bacteria de aguas continentales.
Entre la flora bacteriana del suelo y las aguas continentales hay ciertas relaciones y esto es
particularmente si se trata de aguas que estn constantemente expuestas a la contaminacin
del suelo. No obstante en las aguas y arroyos slo se pueden desarrollar de las bacterias del
suelo menos exigentes. En el caso de microorganismos patgenos ms frecuentemente
transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo, como tifoidea y clera,
cuyos agentes, eteolgicos de esta se encuentran en materias fecales y la orina de los
infectados.

Agentes patgenos de las aguas.

Las aguas residuales domsticas son portadores de bacterias y hongos patgenos
conservando su virulencia durante el tiempo, frecuentemente transportan bacteria intestinal,
como S. typi y S. Paratipi, ms caro es la presencia de Shigella y en pases tropicales abunda el
vibrin cholerae, aunque tambin suele encontrarse con frecuencia microbacterium
tuberculosis y esporas Clostridium patgeno.

Se pueden encontrar bacterias patgenas en mariscos procedentes de aguas contaminadas.

Entre los hongos patgenos se hallan la especie levaduriforme, Cndida albicans (productores
de la candidiasis).As mismo las aguas residuales transportan virus

de la especie humana como es la que produce la poliomilitis, virosis intestinal y gripe de

verano.
Tanto los virus como las bacterias de agua son ms resistentes en agua dulce que en agua de
mar.
Determinacin de la cantidad sanitaria.
Las investigaciones sanitarias de los sistemas productores de agua incluyen la infeccin de las
fuentes de agua sin tratar y sus condiciones que influyen en su calidad, las operaciones de la
planta purificadora y el mecanismo de distribucin del agua a los consumidores. Entre las
pautas microbiolgicas est la determinacin de microorganismos patgenos en las aguas
particularmente. Escherichia coli, otras coliformes fecales (como Clostridium faecalis,) y
clostridium prfringes, su presencia indica contaminacin fecal.

Entre las caractersticas de la E. Colli estn. Produccin de indol, produccin de cido,

produccin de acetil metil carbinol en medios con pectona glucosado y utilizacin de citratos
de sodio.

Materiales Y Mtodos
Materiales
Placas petri
Tubos de ensayo.
Matraz Erlenmeyer.
Muestra suelo.
Agar nutritivo
SSP
Solucin alcohol-cetona.
Aceite de inmersin.

Pipetas de 1 ml.
Gradillas para tubos de ensayos.
Esptulas

Agar VRBA
 Violeta de Genciana
Zafranina
Agua destilada.

Microscopio ptico.

Balanza mecnica.
Mechero
Estufa
-
3.2 Procedimiento

Preparacin de la solucin madre

En el platillo del abalanza colocamos un trozo de papel craft.
Con ayuda de una esptula depositamos 10 g de muestra (suelo frtil) sobre el papel.
Colocamos la muestra sobre el Erlenmeyer con 90 ml de SSP.

Agitamos y mezclamos la muestra con los 90 ml de SSP, hemos obtenido la solucin

madre o a 10-1(SM)

Preparacin de Soluciones e incubacin.

Tomar un ml de la SM y la colocamos en un tubo de ensayo con 9ml SSP. Esta dilucin
ser a la 1 con respecto a la SM o 2 , respecto, a los g/mm. Repetimos este
procedimiento extrayendo del tubo -1 un ml y lo colocamos en un tubo de ensayo
con 9 ml de SSP, esta dilucin ser a la 3, as continuamos hasta obtener la solucin
4.
De cada tubo con la dilucin extraemos 1ml con ayuda de la pipeta y lo depositamos
en una placa petri estril, comenzando desde el tubo ms diluido al menos diluido.
Por cada tubo se preparan 2 placas con 1 ml.
 Cuando todas las placas tienen 1 ml, en una colocamos una capa de agar nutritivo y en
la otra placa perteneciente a la misma dilucin agregamos una capa de agar VRBA,
homogenizamos y dejamos secar: siembra por incorporacin.
Luego agregamos una segunda capa del mismo agar a cada placa con el fin de
proteger el cultivo.
Rotulamos y envolvemos cada placa en papel craft.

Incubamos a 37 C x 24 48 horas.

Coloracin Gram y conteo

Luego de la incubacin extraemos las placas de la estufa y procedemos a contar el
nmero de colonias presentes en la placa del fondo de la placa, no aquellas que se
encuentran en las superficies.
Una vez realizado el conteo, con una asa de Kolle extraemos (hacemos un corte) en el
medio de cultivo una parte de la primera capa con el fin de extraer una muestra de
colonia, si es necesario tambin se perforar la segunda capa.
La muestra de colonia la colocamos y disolvemos en una lmina porta objeto
(previamente la lmina tiene gotas de agua destilada) con agua y procedemos a
realizar la tincin de Gram.
Colocamos la lmina coloreada al microscopio y observamos el resultado.

PRCTICA N10
DETERMINACIN DE BACTERIAS DEL SUELO

Objetivos
Determinar el nmero de unidad formadora de colonia en el suelo.
Identificar diferencias entre la flora microbiana del suelo.
Identificar las bacterias presentes en el suelo y comparar sus requerimientos
nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.
 Fundamento
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades de diversos
gneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hbitat con un solo gnero de
microorganismos. Por lo que para los estudios en que se requiera el conocimiento de un solo
organismo de esa comunidad (estudio autoecolgico), es necesario el aislamiento del
mismo. Obviamente se debe tener en mente que muchas reacciones fisiolgicas,
bioqumicas y hasta algunas morfolgicas, requieren de la presencia del resto de los
integrantes de la comunidad para que se expresen (estudios sinecolgicos).

Se han empleado una serie de mtodos para la propagacin de los microorganismos a

partir de clulas individuales. El cultivo en caja de Petri es un sistema sencillo y rpido
para el aislamiento de los microorganismos de una mezcla, permitiendo que a partir de una
clula o un conglomerado de clulas del mismo gnero y especie, se forme una colonia
(clona), que sea visible a simple vista. Los mtodos ms usados son: a) mtodo de la estra
cruzada y b) el mtodo del vaciado en placa.

El mtodo de la estra cruzada, es un mtodo cualitativo que permite trabajar un gran

nmero de muestras en corto tiempo y consiste en tomar una muestra con un
asa previamente esterilizada y colocarla sobre una superficie del medio de cultivo

slido que se encuentra en una caja de Petri, Posteriormente se trazan una serie de estras
pegadas al borde de la caja, esterilizando el asa al final de cada serie. El mtodo de
vaciado en placa, es un mtodo cuantitativo, ya que adems de aislar a los
microorganismos, en un cultivo puro (formado por un solo gnero y especie), nos permite
contar el nmero de organismos presentes en esa muestra. Esto es posible ya que a
partir de una muestra perfectamente medida se realizan una serie de diluciones, lo que
nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de dilucin, si
despus de sembrar la muestra en nuestro medio conocemos el nmero de colonias que
crecieron, podemos multiplicar este por la inversa de la dilucin y por la inversa de la
alcuota que sembramos, dndonos como resultado el nmero de unidades formadoras de
colonias (UFC) por unidad de volumen o masa de la muestra original.
Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo
condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra fuente
extraa a la que estamos analizando.

Materiales y Mtodos
Materiales
Muestra de Suelo.
5 pipetas de 1 mL estriles
Frasco de dilucin de 90mL con agua destilada estril
5 tubos con 9mL de agua destilada estril.
Agua destilada

Capsulas de porcelana
Pinzas

Mechero
Horno o incubadora
Asa bacteriolgica
Varilla acodada
Alcohol
Metanol
Succionador para pipetas
Cajas Petri con medio de cultivo para hongos y levaduras (Saboraud)

Procedimiento
Mtodo de la disolucin.
 Pesar 10g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella de
dilucin conteniendo 90mL de agua destilada estril.
Por medio de una pipeta de vidrio, tomar 1mL del sobrenadante de la botella de
dilucin, teniendo cuidado de no arrastrar sedimento y vaciar en condiciones de
esterilidad a un tubo de ensaye con 9mL de agua destilada estril. Agitar
perfectamente para homogenizar la muestra (figura 1).
A partir del tubo anterior, tomar 1 mL y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 mL de
agua destilada estril, agitar perfectamente.
Repita el punto tres, tomando siempre 1mL del ltimo tubo inoculado y vacelo a un
tubo nuevo con 9mL de agua destilada estril (figura 1).
Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres ltimos tubos 0.1mL y colocarlo en el
centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas para su identificacin.
Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez fra, distribuir
la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando sta y moviendo la varilla en un
sentido.
Colocar las cajas en una canastilla e incubarlas a 35 37 C durante 24 h.

Figura 1. Procedimiento para la preparacin de dilucin seriada.

Mtodo de estra cruzada.

 A partir del frasco de dilucin en que se realiz la primera dilucin del experimento
anterior, tomar una asada y colocarla en una porcin de la caja, trazando una
serie de estras que cubran aproximadamente 1 cm a partir de la orilla de la
caja.
Flamear el asa, dejar enfriar y trazar una nueva serie de estras a partir de un
extremo de las anteriores.
Repetir el paso anterior durante dos series de estras.
Trazar la ltima serie de estras abriendo esta hacia el centro de la caja.
Incubar a 35 37C durante 24 - 48 h.
Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7.

Figura 2. Procedimiento para la preparacin de estras cruzadas.

Transcurrido el tiempo de incubacin para las cajas utilizadas en ambos

mtodos, haga sus observaciones de morfologa colonial.

Determine las UFC/g de suelo seco de la muestra original.

Pesar una capsula de porcelana, registre el peso.
 Pesar aproximadamente 10 g de suelo en la capsula de porcelana, registre el peso.
Colquelos en el horno a 105 C por 48 hrs. Una vez concluido el tiempo de
secado enfrelo, pselo y registre el peso.
Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de suelo seco:

Determinacin del peso del suelo seco:

Determinacin del % de humedad del suelo:

Resultados
Discusiones
Conclusiones
Cuestionario
Desde el punto de vista prctico, qu ventajas y desventajas encontr al utilizar los
dos mtodos de aislamiento?
Qu caractersticas generales tienen las colonias bacterianas que las distinguen de
los hongos?
Por qu reportamos los resultados como UFC/mL g en la determinacin
cuantitativa de microorganismos en lugar de usar el trmino clulas/mL g?

PRCTICA N11

DETERMINACIN DEL NMERO MS PROBABLE (NMP) DE MICROORGANISMOS POR LA

TCNICA DE TUBOS MLTIPLES

OBJETIVOS
Evaluar la calidad sanitaria en muestras de agua mediante la bsqueda de
microorganismos coliformes totales.
Determinar la presencia de coliformes totales, por el mtodo de tubos mltiples
 FUNDAMENTO
El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente
sigue siendo ampliamente utilizado (Hurley y Roscoe, 1983). En un principio este
mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de
alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado
para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos,
sedimentos marinos y suelos contaminados.
La estimacin de microorganismos por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) es
muy adecuado para determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un
ambiente anaerobio dentro de los tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios ms
complejos como cmaras o jarras anaerobias.
El mtodo consiste en la estimacin del nmero de microorganismos viables a partir
de diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base hmeda
o 1 ml de agua; posteriormente, de tres o ms de las diluciones se inoculan tubos con
medio de cultivo con sustratos y aceptores de electrones especficos. En este mtodo
se asume que en las series de diluciones los microorganismos se encuentran
distribuidos al azar y que al menos un microorganismo generar crecimiento,
produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de color del medio, produccin
de algn metabolito especfico). Esta tcnica se basa en la estimacin de la densidad
bacteriana por el mtodo estadstico de mxima probabilidad, utilizando la teora de
las diluciones.

MATERIALES Y MTODOS
Materiales
3 Tubos con 9ml de agua destilada estril.
Pipetas estriles de 1 ml
Mechero Bunsen.
Agitador
 3 tubos para cada dilucin, 9 en total, con 10ml del medio de cultivo (BGBL)
Campanas de Durham
Pipetas de 1ml
Estufa

Procedimiento
Para preparar las diluciones, transferimos 1 ml, de la muestra a analizar a un tubo que

contiene 9ml de agua destilada estril. La que vendra a ser la dilucin 10 -1 dilucin
1/10.
De la dilucin 10-1 , tomamos 1 ml a otro tubo que contiene 9ml de agua estril, y esta

sera la dilucin 10-2 la dilucin 1/100.

Repetimos este proceso y obtenemos la dilucin 10-3, 1/1000.

Inoculamos 1ml de la dilucin 1/10, en cada uno de los 3 tubos pertenecientes a la

primera serie, con medio BGBL y campanas de Durham.
Inoculamos 1ml de la dilucin 1/100, en cada uno de los 3 tubos pertenecientes a la
segunda serie, con medio BGBL y campanas de Durham.
Inoculamos 1ml de la dilucin 1/1000, en cada uno de los 3 tubos pertenecientes a la
tercera serie, con medio BGBL y campanas de Durham.
Incubar las tres series a 37 C/24 h.

Pasado el tiempo de incubacin, si los tubos presentan turbidez y gas en la campana,

estos significan crecimiento y fermentacin de la lactosa con formacin de cido y
gas, respectivamente.

Finalizamos realizando la lectura del NMP, haciendo uso de las tablas para diluciones:
1/10; 1/100 y 1/1000.
 RESULTADOS
DISCUSIONES
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA

Madigan, M. 2006. Brock Biologa de los Microorganismos. 10 Edicin. Prentice Hall. Madrid,
Espaa.
Organizacin Mundial de la Salud. 2005. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3 Edicin.
Ginebra, Suiza.
Rojas, A. 2011. Conceptos y Prctica de Microbiologa General. Universidad Nacional de Colombia.